Holdbarhed af citratstabiliseret plasma efter

Transkript

1 Professionsbachelorprojekt 2012 Bioanalytikeruddannelsen VIA University College Aarhus Holdbarhed af citratstabiliseret plasma efter centrifugering på StatSpin Express 2: Et holdbarhedsstudie for koagulationsanalyserne; International normalised ratio, fibrinogen, aktiveret partiel thromboplastin tid og antithrombin Holdbarhed af citratstabiliseret plasma efter highspeed centrifugering på StatSpin Express 2 Udarbejdet af Tina Enggård Holm (110610) i perioden 8. oktober december 2012 K-vejleder: Bioanalytikerunderviser Anne Jaritz-Nielsen, Klinisk Biokemisk Afdeling, Hospitalsenheden Vest, Region Midtjylland I-vejleder: Lektor Troels Wind, VIA University College Aarhus, Bioanalytikeruddannelsen Antal tegn: tegn

2 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet som det afsluttende produkt på modul 14 på bioanalytikeruddannelsen, VIA University College Aarhus. Forsøgets praktiske del er udført på Klinisk Biokemisk Afdeling Regionhospitalet Holstebro, Hospitalsenheden Vest, Region Midtjylland, og i samarbejde med bioanalytikerstuderende Mette Thing Langkilde. Projektet henvender sig til bioanalytikerstuderende, undervisere og andre med interesse for koagulationsområdet på Klinisk Biokemisk Afdeling. Tak til Linda Ø. Henriksen, kemiker, Klinisk Biokemisk Afdeling, Hospitalsenheden Vest, Region Midtjylland, for vejledning til tilrettelæggelse af forsøgsdesign, samt for vejledning i den efterfølgende databehandling. I forbindelse med indsamling af prøvemateriale til projektet skal lyde en stor tak til bioanalytikere på Klinisk Biokemisk Afdeling, som har været meget behjælpelige og gode samarbejdspartnere igennem udførslen af projektets praktiske del. Tak til afdelingens øvrige personale, særligt de med tilknytning til koagulationen, som har været behjælpelige med forefaldne spørgsmål. Tina Enggård Holm 19.december 2012 Side 2 af 57

3 Resumé Baggrund: På Klinisk Biokemisk Afdeling i Holstebro afhænger holdbarhedstiden, for koagulationsanalyserne international normalised ratio (INR), fibrinogen, aktiveret partiel thromboplastin tid (APTT) og antithrombin (AT), af, hvilken centrifuge, der er anvendt. Ved særligt akutte situationer anvendes centrifugen StatSpin Express 2 (4440G i 2 minutter), hvorefter holdbarheden for INR, fibrinogen, APTT og AT er 1 time, mens holdbarheden ved rutinecentrifugering (2200G i 10 minutter) er hhv. 24 timer, 48 timer, 4 timer og 4 timer. Dette problematiserer proceduren ved efterbestillinger, idet bioanalytikeren er nødsaget til at tjekke hvilken centrifuge, som er anvendt til den pågældende prøve. Det ønskes derfor undersøgt, hvorvidt holdbarheden af INR, fibrinogen, APTT og AT efter centrifugering på StatSpin Express 2 kan forlænges, så kun én holdbarhedstid er gældende for hver af de respektive analyser. Materialer og metode: Til projektet blev der indhentet i alt 92 natrium-citrat glas fra indlagte og ambulante voksne patienter. Prøveglas blev centrifugeret på StatSpin Express fra Iris Sample Processing ved 4440G i 2 minutter, og derefter straks analyseret på apparatet STA-R Evolution fra Diagnostica Stago. INR og fibrinogen blev analyseret igen 1 time, 8 timer og 24 timer efter centrifugering. APTT og AT blev analyseret igen 1 time og 4 timer efter centrifugering. De opnåede analyseresultater blev vurderet i henhold til kritisk forskel, biasmål og en fastsat klinisk relevant grænse. Derudover er der udført en to-sidet variansanalyse uden gentagelser ved et signifikansniveau på 5%. Resultater: De opnåede analyseresultater i forsøget viser, at INR, fibrinogen og APTT er holdbare efter henstand i hhv. 24 timer, 24 timer og 4 timer. Visse punkter afviger fra de fastsatte acceptgrænser, men pga. niveau og diagnostisk betydning vurderes de som acceptable. For AT viser resultaterne en stigende tendens omkring niveau 0,8 arb. enhed efter henstand i 4 timer. Konklusion: Det kan ikke endeligt, på baggrund af forsøget resultater, konkluderes at nye holdbarhedstider for INR, fibrinogen, APTT og AT efter centrifugering på StatSpin Express 2 kan implementeres. Dette skyldes manglende analyseresultater i flere vigtige niveauer, og holdbarheden kan derfor ikke vurderes i disse niveauer. Side 3 af 57

4 Indholdsfortegnelse 1. Introduktion Formål Problemformulering Målformulering Teoretisk afsnit Vasokonstriktion Den primære hæmostase Den sekundære hæmostase Relaterede koagulationsanalyser P-Fibrinogen P-koagulationsfaktorer (APTT) P-koagulationsfaktorer II, VII, X (INR) Inhibitorer af hæmostasen Relateret koagulationsanalyse P Antithrombin Måle og analyseprincipper Clottest Kromogentest Materialer og metode Metode Forsøgsdesign Dataindsamling Databearbejdning Litteratursøgning Etiske overvejelser Materialer Prøvemateriale Reagenser Utensiler Apparatur Kontrolmateriale Resultater Side 4 af 57

5 3.1. Kontroller Acceptgrænser INR Fibrinogen APTT AT Diskussion Kontroller Analyserne INR Fibrinogen APTT AT Metode Evaluering af StatSpin Express Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag 1: Resultater af godkendelseskontroller Bilag 2: Resultater INR Bilag 3: Resultater Fibrinogen Bilag 4: Resultater APTT Bilag 5: Resultater AT Bilag 6: CV% på STA-R Side 5 af 57

6 1. Introduktion På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) i Holstebro er der det seneste år (december november 2012) blevet analyseret koagulationsanalyser, hvoraf analyserne rekvireres enten som fremskyndet-, haste- eller rutineprøver. For analyser, der er rekvireret som fremskyndet, skal der foreligge svar senest 3 timer efter prøvetagning, og for hastprøver skal svaret foreligge senest 1 time efter prøvetagning (31). Inden for denne tidsperiode skal prøven modtages, centrifugeres og derefter analyseres. På KBA i Holstebro centrifugeres fremskyndet-, haste- og rutineprøver på Eppendorf Centrifuge i 10 minutter ved 2200G (rutinecentrifugering). Derefter analyseres prøverne på apparatet STA-R Evolution, fra firmaet Diagnostica Stago. Holdbarheden for koagulationsprøver efter rutinecentrifugering er oplyst i tabel 1.a. Disse holdbarheder er angivet i KBA s retningsliner, og for international normalised ratio (INR), aktiveret partiel thromboplastin tid (APTT) og antithrombin (AT) stemmer holdbarheden overens med de anbefalinger, som Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) har opstillet for koagulationsanalyser (1). Holdbarheden for fibrinogen bygger derimod på et lokalt holdbarhedsforsøg udført på KBA Holstebro. Analyse INR Fibrinogen APTT AT Holdbarhed efter rutinecentrifugering, ikke afpipetteret 24 timer 2 døgn 4 timer 4 timer Tabel 1.a: Oversigt over holdbarheden for INR, Fibrinogen, APTT og AT efter rutinecentrifugering. Der er dog situationer, hvor svar senest inden for en time ikke er tilstrækkeligt, og derfor foreligger der på KBA en særlig procedurer for disse prøver, som er af høj prioritet. Det handler om trombolysepatienter, hvor der skal foreligge svar hurtigst muligt, men senest inden for minutter efter prøvetagning (22), samt ved patienter hvor der er en mistanke om dyb vene trombose (DVT) og endeligt ved særligt akutte situationer. Proceduren lyder, at disse prøver centrifugeres på StatSpin Express 2 fra firmaet Iris Sample Processing i 2 minutter ved 4440G og analyseres straks derefter på STA-R Evolution. Da KBA i Holstebro er akkrediteret skal alle nye metoder og apparater valideres før ibrugtagning. Dette er også sket med StatSpin Express 2, hvor et forsøg har påvist, at parallelle resultater på rutinecentrifugen og StatSpin Express 2 lever op til acceptkriterierne 60 minutter efter centrifugering (23). Forsøget er ikke udført i et længere tidsinterval end 60 minutter, Side 6 af 57

7 hvilket betyder, at KBA på nuværende tidspunkt arbejder ud fra retningslinjen om at prøver, der er centrifugeret på StatSpin Express 2, har en holdbarhed som følgende: Analyse INR Fibrinogen APTT AT Holdbarhed efter centrifugering på StatSpin Express 2, ikke afpipetteret 1 time 1 time 1 time 1 time Tabel 1.b: Oversigt over holdbarheden for INR, Fibrinogen, APTT og AT efter centrifugering på StatSpin Express 2. Det forekommer, at der efterbestilles koagulationsanalyser, hvormed holdbarhedsproblemstillingen opstår. Vigtige diagnostiske og terapeutiske beslutninger er baseret på resultatet af koagulationsprøver, og derfor er kvaliteten af disse prøver vigtig for at få et pålideligt resultat (1). Holdbarheden er en af de præanalytiske faktorer, som har betydning for kvaliteten af analyseresultatet. Derfor er det nødvendigt for bioanalytikeren at vide, hvilken centrifuge der er blevet anvendt til den prøve, hvorpå der er en efterbestilling. Den eneste måde dette kan afgøres, er ved at køre prøven ud af apparatet, idet prøver, som er centrifugeret på StatSpin Express 2, får påsat et klistermærke med en notits om dette. Denne procedure er tids- og ressourcekrævende. Bioanalytikeren har i den daglige arbejdsgang utroligt mange bolde i luften, og derfor kan det forekomme, at denne vigtige kvalitetssikringsprocedure forglemmes, og man risikerer, at analysere på materiale hvis holdbarhed er overskredet. KBA Holstebro ønsker derfor at undersøge, hvorvidt den nuværende holdbarhed på 1 time kan forlænges, således at den stemmer overens med holdbarheden på rutinecentrifugerede prøver, uden at det er på bekostning af kvaliteten af analyseresultatet. Et tilsvarende forsøg er udført for koagulationsanalysen P-Fibrin D-Dimer, hvor der blev påvist en overensstemmelse mellem holdbarheden på prøver, som er centrifugeret på StatSpin Express 2 og prøver centrifugeret på rutinecentrifugen (23). Hvis projektets resultater viser, at bioanalytikeren ligeledes kun skal forholde sig til én holdbarhed for INR, fibrinogen, APTT og AT, vil det lette proceduren for efterbestillinger, og det vil samtidig bidrage til at nedbringe risikoen for præanalytisk fejl. Studier viser, at 64% af fejl i analyseresultater skyldes præanalytiske faktorer (2), og derfor er det relevant at se på mulighederne for at ændre procedurer, således at bidraget til præanalytiske fejl nedsættes, uden at det påvirker kvaliteten af analyseresultatet. Side 7 af 57

8 1.2. Formål Dette projekt har til formål at undersøge om analyserne INR, fibrinogen, APTT og AT er holdbare efter henstand i hhv. 24 timer, 24 timer, 4 timer og 4 timer efter centrifugering på StatSpin Express Problemformulering Igennem et kvantitativt projekt ønskes undersøgt, hvilken konsekvens det har for holdbarheden på analyserne INR, fibrinogen, APTT, og AT, at prøverne centrifugeres på StatSpin Express 2 ved 4440G i 2 minutter og derefter analyseres på STA-R Evolution Målformulering - Den praktiske udførsel: o Vi vil indhente natrium-citrat glas fra patienter og centrifugere dem på StatSpin Express 2 i 2 minutter ved 4440G og efterfølgende analysere prøverne på STA-R Evolution. o Vi vil foretage dobbeltbestemmelse på alle prøverne til tiden 0. Efterfølgende foretages der enkeltbestemmelser fordelt på tidspunkterne, som er angivet i tabel 1.4.a: Tiden 0 1 time 4 timer 8 timer 24 timer INR X (dobbeltbestemmelse) X X X Fibrinogen X (dobbeltbestemmelse) X X X APTT X (dobbeltbestemmelse) X X AT X (dobbeltbestemmelse) X X Tabel 1.4.a: Oversigt over hvilke tidspunkter de forskellige analyser analyseres i forsøget, hvor tiden 0 er straks efter endt centrifugering. o Vi vil indhente minimum 20 analyseresultater for alle analyserne o Vi vil køre godkendelses og langtidskontroller dagligt og efter vedligehold - Behandling af resultater: o Jeg vil kontrollere godkendelseskontroller ud fra følgende Westgard kontrolregler: 1 3S, 2 2S, 4 1S, R 4S. Dette har til formål, at dokumentere accept af vores analyseresultater på STA-R Evolution. o Jeg vil beregne differensen mellem resultatet til tiden 0 og resultater for de øvrige tider for alle prøver. Side 8 af 57

9 o Jeg vil udføre en to-sidet variansanalyse uden gentagelser. Dette har til formål at afgøre, om stikprøverne kommer fra en population med fælles middelværdi eller ej. o Jeg vil opstille alle resultaterne for hver analyse i ét XY-plot, med analyseresultatet som funktion af tiden. Disse har til formål at visualisere resultaterne over tid. o Jeg vil opstille resultaterne i et differensplot med resultatet til tiden 0 ad X- aksen og differensen ad Y-asken. Dette har til formål at visualisere resultaterne, samt muliggøre en vurdering af andelen af positive differencer og negative differencer. I differensplottet indtegnes den kritiske forskel, som er beregnet for hver analyse. I differensplottet indtegnes biasmål, som er fastsat ud for KBA s krav til analysekvalitet. I differensplottet indtegnes de fastsatte klinisk relevante grænser, som er fastsat af afdelingens overlæge Kaj O. Pedersen Teoretisk afsnit Koagulationsområdet på KBA arbejder med analyser, som har til formål at udrede patientens hæmostatiske respons, hvilket omfatter de processer, som hindrer spontan blødning, og de som standser blødninger efter beskadigelse af blodkar. Det hæmostatiske respons involverer et samarbejde mellem endotelceller, thrombocytter og en lang række koagulationsfaktorer, som cirkulerer rundt i blodet i inaktiv form (3). Processen kan opdeles i tre trin: Vasokonstriktion Den primære hæmostase Den sekundære hæmostase Det er vigtigt, at de forskellige trin i hæmostasen er nøje reguleret, og at de kun aktiveres, når kroppen reelt har brug for det. I tilfælde, hvor der er ubalance i det hæmostatiske respons, vil et for effektivt respons medføre en risiko for dannelsen af patologiske blodpropper (thrombose eller thrombofili), mens et utilstrækkeligt respons kan resultere i katastrofale blødninger (hæmoragisk diatese) (4,5). Side 9 af 57

10 Vasokonstriktion Når blodkarret beskadiges kontraherer de glatte muskelceller i karvæggen straks. Denne mekanisme har til formål at mindske blodtabet, samt at reducere blodgennemstrømningen i det beskadiget sted. Den reducerede blodgennemstrømning muliggør en kontaktaktivering af thrombocytter og koagulationsfaktorer i blodbanen (3) Den primære hæmostase Dette respons indtræder få minutter efter karlæsion. Responset har til formål at danne et ustabilt aggregat af thrombocytter på karvæggen, og den forløber i tre faser; adhæsion, aktivering og aggregation af thrombocytter. Adhæsion sker ved, at thrombocytter har en lang række receptorer (glykoproteiner (GP)) på sin overflade, som kan binde til komponenter, der blotlægges ved karbeskadigelse. Denne adhæsion bevirker, at thrombocytten aktiveres, og dette medfører: Formændring af thrombocytten (5). Sekretion af en række substanser fra granula, som dels bidrager til en positiv feedback på thrombocytaktiveringen, og dels har betydning for koagulationsprocessen (3,5). At GP IIb/IIIa udtrykkes på overfladen af thrombocytten. (5). Fibrinogen har to bindingsteder for GP IIb/IIIa, således at der kan opstå brodannelse mellem thrombocytterne, og der kan blive dannet et thrombocytaggregat (5). Denne proces fortsætter, indtil der er opbygget et tilstrækkeligt thrombocytaggregat (trombe), som tætner det beskadiget blodkar (4). Dog er dette aggregat meget ustabilt og løsrives let af blodgennemstrømning. For at stabilisere aggreagatet igangsættes den sekundære hæmostase (5) Den sekundære hæmostase Dette respons indtræder i løbet af 1-2 timer efter karlæsion. Responset omfatter aktivering af koagulationskaskaden, som er skitseret i figur a. Dette respons har til formål at stabilisere den dannede trombe ved dannelse af et netværk, bestående af fibrinpolymer, omkring aggregatet. Som det fremgår af ordet, forløber koagulationskaskaden som en kædereaktion, hvor én faktor aktiveres og derefter virker enzymatisk på den næste faktor, som aktiveres og får en enzymatisk funktion osv. (5). Kaskaden kan aktiveres ad to forskellige veje; ad det interne- eller det eksterne system. Centralt for begge systemer er aktivering af faktor X, således der dannes faktor X a. Dette sker i fællessystemet, hvor det interne og det eksterne system mødes (5). Aktiveringen af faktor X er centralt for kaskaden, da X a er i stand til at omdanne prothombin (faktor II) til thrombin (faktor II a ). Thrombin er essentiel Side 10 af 57

11 for dannelsen af fibrinnetværket, der skal omslutte den dannede trombe for at stabilisere denne. Thrombin har en proteolytisk virkning på fibrinogen, således at der dannes fibrinmonomer, som er i stand til at polymerisere. (5). Bindingerne mellem disse fibrinpolymer stabiliseres yderligere vha. enzymet transglutaminase, som danner peptidbindinger i fibrinnettet (5). Der er således blevet dannet et uopløseligt netværk af fibrin omkring tromben, så den bliver stabil og ikke løsrives at blodgennemstrømningen (3). Figur a: Skitsering af den sekundære hæmostase (5) En forudsætning for at der kan dannes disse fibrinmonomer er tilstedeværelsen af fibrinogen i blodbanen. Fibrinogen cirkulerer rundt i blodbanen, og udskilles fra aktiverede thrombocytter (6), og koncentrationen af dette molekyle kan undersøges i laboratoriet via analysen P-Fibrinogen. Som skrevet kan den sekundære hæmostase aktiveres ad to forskellige veje, som er illustreret i figur a. Aktivering ad den interne vej udløses, når faktor XII kommer i kontakt med fremmede overflader fx kollagen ved karlæsion eller glas ved prøvetagning (4,5). I det interne system er det faktor IX a som aktiverer fællessystemet under kompleksdannelse med faktor VIII a, Ca 2+ og pladefaktor III (5). Funktionen af det interne system undersøges i laboratoriet vha. analysen P-koagulationstid (APTT). Side 11 af 57

12 Aktivering ad den eksterne vej udløses, når faktor VII kommer i kontakt med vævsthromboplastin (vævsfaktor III), som frigives fra celler i karvæggen eller fra vævet omkring blodkarret. Faktor VII a vil i kompleks med Ca 2+ og vævsfaktor III aktivere faktor X i fællessystemet (5). Funktionen af det eksterne system undersøges i laboratoriet vha. analyse P-koagulationfaktor II, VI, X (INR) Relaterede koagulationsanalyser Alle koagulationsanalyser analyseres på plasma, og det er derfor nødvendigt at centrifugere prøverne, hvormed blodkomponenterne separeres på basis af komponenternes vægt (7). Formålet med centrifugering er at opnå thrombocytfrit plasma, som kan anvendes til analyse. Ifølge anbefalingerne fra CLSI er en plasmafraktion med et thrombocyttal under 10x10 9 /L (10.000/µL) målet for en effektiv centrifugering (1). P-Fibrinogen Denne analyse har til formål at bestemme koncentrationen af fibrinogen i patientplasma. Analysen rekvireres bl.a. ved blødningssymptomer og i forbindelse med udredning af dessemineret intravaskulær koagulation (DIC) (8). Fibrinogenanalysen indgår ikke den yderst akutte fase, hvorfor den normalvis ikke vil blive centrifugeret på StatSpin Express 2. Referenceintervallet for P-Fibrinogen er: Alder Referenceinterval år 5,5-12,0 µmol/l Tabel a: Referenceinterval for P-Fibrinogen (32) Fibrinogen fungerer som at akut-fase-protein, og der ses derfor forhøjede værdier ved akutte infektioner. Derudover kan der også ses meget forhøjede værdier ved nefrotisk sygdom, hvor der foregår en øget proteinsyntese som kompensation for tab af proteiner gennem urinen (6). Nedsatte værdier af fibrinogen vil almindeligvis være et resultat af øget forbrug eller nedsat syntese af proteinet. Nedsat værdi pga. øget forbrug kan bl.a. ses ved DIC, og nedsat værdi pga. nedsat syntese kan skyldes leverdefekt (6). P-koagulationsfaktorer (APTT) Denne analyse har til funktion at give et billede af den samlede funktion af faktorer i det interne- og fællessystemet. Analysen tester for følgende faktorer: XII, XI, IX og VIII i det interne system samt faktor X, V, II (prothrombin) og fibrinogen i fællessystemet. Det undersøges, om disse faktorer er til stede i blodet i tilstrækkelig mængde til at forårsage koa- Side 12 af 57

13 gulation af blodet (6). APTT indgår i analysepakken for thrombolysepatienter, og derfor anvendes StatSpin Express 2 til centrifugering i disse tilfælde. Svaret på analysen skal foreligge hurtigt, idet det er dokumenteret, at behandling inden 3 timer efter symptomernes opståen har den største effektivitet på opløsning af tromben (9). APTT rekvireres derudover bl.a. til udredning af evt. faktormangel, til kontrol af heparinbehandling (forudsat at der ikke behandles med lavmolekylært heparin) samt til diagnostik og vurdering af graden af DIC (6). Referenceintervallet for P-Koagulationsfaktorer (APTT) er: Alder Referenceinterval 0-16 år sek år sek. En APTT-værdi som ligger indenfor referenceområdet udelukker tilfælde af alvorlig faktormangel, dvs. en tilstand hvor faktorerne er under 30-50% af det normale (6). Forhøjede værdier ses bl.a. ved mangel på en eller flere af de faktorer, som indgår i det interne eller fællessystemet samt ved overdosering af antikoagulans (heparinbehandling) (6,8). Lave værdier tillægges i litteraturen ingen klinisk betydning. P-koagulationsfaktorer II, VII, X (INR) Denne analyse har til formål at undersøge den samlede funktion af det eksterne og fællessystemet ved aktivitetsbestemmelse af faktorerne II (prothrombin), VII og X. Syntesen af disse tre faktorer samt faktor IX er afhængige af tilstedeværelsen af vitamin-k. Patienter med øget risiko for thrombofili kan behandles med vitamin-k-antaginoster, hvilket nedsætter koncentrationen af funktionsdygtige faktor II, VII og X og dermed koagulationsevnen. INR-analysen er derfor især egnet til behandlingskontrol af patienter, som er i behandling med vitamin-k-antagonister (6). INR indgår også i analysepakken for trombolysepatienter, idet INR > 1,4 rel. tid. er en kontraindikation for udførelse af thrombolyse (19). Derudover rekvireres INR også ofte præ-operativt, hvor INR-værdien skal ligge inden for et acceptabelt interval, således at man sikrer, at patientens hæmostatiske funktion, forud for det operative indgreb, er tilstrækkelig (6). I så fald et operativt indgreb er af livsvigtig karakter, og INR-værdien ligeså, vil prøven blive centrifugeres på StatSpin Express 2. Referenceintervallet for P-koagulationsfaktorer (INR) er: Tabel b: Referenceinterval for P-Koagulationsfaktorer (APTT) (33) Side 13 af 57

14 Alder Referenceinterval 0 30 d: 1,0-1,4 rel. tid 30 d 200 år: < 1,2 rel. tid Tabel c: Referenceinterval for P- Koagulationsfaktorer (INR) (34) INR-værdien bestemmes ved beregning og standardisering af forholdet mellem koagulationstiden for patientens plasma og koagulationstiden for normalt plasma (6): Høje INR-værdier, dvs. lav aktivitet af faktor II, VII og X kan skyldes leverskade, K- vitamin mangel eller overdosering af vitamin-k-antagonister. Lave INR-værdier kan ikke tillægges nogen specifik betydning (8) Inhibitorer af hæmostasen For at der ikke sker uhensigtsmæssig hæmostase, er der, under normale omstændigheder, inhibitorer til stede i blodbanen, som hæmmer det hæmostatiske respons. Visse inhibitorer dannes i leveren og cirkulerer rundt i blodbanen, og andre udskilles fra intakte endotelceller (4). Der findes en lang række inhibitorer, hvoraf den vigtigste hæmmer af den sekundære hæmostase er proteinet antitrombin (AT), som produceres i leveren (5). Den er især i stand til at binde sig til og inaktivere trombin og faktor X a, hvilket hæmmer fibrindannelsen effektivt (6). Bindingshastigheden for AT er lav, men tilstedeværelsen af heparin eller lignende polysakkarider virker katalytisk på bindingshastigheden med en faktor~1000 (6). In vivo findes der på overfladen af endotelceller heparansulfat, som har samme virkning som heparin. Dette er hensigtsmæssigt, da AT således hindrer unødvendig koagulation ved intakte endotelceller. Udover ovennævnte funktioner virker AT også, dog med mindre effekt, på faktorerne IX a, XI a og XII a i det interne system (5) Relateret koagulationsanalyse P Antithrombin Denne analyse har til formål at bestemme aktiviteten af AT i patientplasma. Analysen rekvireres bl.a. ved udredning af patienter, som gentagende gange har haft thromboemboliske episoder. Bestemmelsen af AT-aktiviteten bør ikke bestemmes i den akutte fase (6), og derfor vil prøver til bestemmelse af AT-aktiviteten ikke rekvireres som yderst haste og centrifugeres dermed ikke på StatSpin Express 2. Derudover rekvireres AT også ved mis- Side 14 af 57

15 tanke familiær AT-mangel, ved mistanke om DIC eller ved leversygdom (6). Referenceinterval for P-Antithrombin er: Alder Referenceinterval 0 30 d 0,50 0,90 arb. enhed 30 d 16 år 0,85 1,30 arb. enhed > 16 år 0,80 1,20 arb. enhed Klinisk har værdier over referenceintervallet ingen betydning, det er derimod omkring den nedre grænse for referenceintervallet, som er interessant set ud fra et klinisk perspektiv. Lave værdier kan ses både ved arvelig og erhvervet AT-mangel (6). Erhvervet AT-mangel kan bl.a. ses som et resultat af levercirose eller ved DIC (8) Måle og analyseprincipper STA-R Evolution er et fuldautomatisk apparat konstrueret til at måle koagulationanalyser in vitro. Det er i stand til at udføre tre forskellige analysemetoder; immunologisk, kromogen og clottest (24), hvoraf de to sidstnævnte er relevante for de analyser, som dette projekt omhandler Clottest Clottesten bruges til at måle APTT, INR og fibrinogen. Princippet bygger på clotdetektion vha. en stålkugle og et magnetfelt. I kuvetten er der tilsat en stålkugle, og ved målepositionen dannes der, vha. to motoriseringsspoler, et magnetfelt, som får stålkuglen til at svinge fra pol til pol. Denne opstilling er illustreret i figur a. Kuglens udsving ændres som et resultat af ændring i prøvematerialets viskositet under reaktionen (se figur b). Når der registreres en ændring af stålkuglens udsving tre gange i forlængelse af hinanden, stoppes målingen (24). Denne måling i sekunder omsættes derefter til en koncentration vha. standardkurve for de respektive analyser. Tabel a: Referenceinterval for P-Antithrombin (35) Figur a: Skitsering af måleprincippet ved clottest. 1: modtagerspole til måling. 2: sendespole til måling. 3: motoriseringsspole. 4: kugle. 5: kuvette (24). Figur b: Skitsering af hvorledes kuglens udsving ændres som et resultat af øget viskositet af plasma (24). Side 15 af 57

16 Hvorledes reaktionen i kuvetten forløber, og medfører ændringer i plasmaets viskositet, er i det følgende beskrevet for de forskellige analyser. Fibrinogen: Fibrinogen-reagenset indeholder titreret kalcium-trombin af human oprindelse med en specifik heparin inhibitor. Dette reagens indeholder et overskud af thrombin, således at der kan dannes fibrinpolymer ved spaltning af fibrinogen. Denne spaltning af fibrinogen til fibrinpolymer resulterer i, at plasma bliver mere viskøs (jf. teoriafsnit 1.5.3) (10,21). INR: INR-reagenset indeholder tromboplastin (vævsfaktor III) samt bovint plasma, som indeholder overskud af faktor V og fibrinogen. Reagenset indeholder hverken faktor II, VII eller X. Det betyder, at koagulationstiden kun afhænger af patientplasmaets indhold af faktorerne II, VII og X. INR-reagenset indeholder også Ca 2+, som bevirker, at plasma recalcificeres (11,20), således at koagulationskaskadens eksterne system kan forløbe, hvilket resulterer i at plasma bliver mere viskøs (jf. teoriafsnit 1.5.3). APTT: APTT-reagenset indeholder thrombocyt-substitut fra kaninhjernevæv i bufferet medium. Denne thrombocyt-substitut består af cephalin, som er et fosforlipid med hæmostatiske egenskaber. Derudover indeholder reagenset også en partikulær aktivator (silica). Reagenset udgør således tilsammen en overflade, som kan aktivere faktor XII og dermed aktivere det interne koagulationssystem. Efter præaktivering med APTT-reagens recalcificeres plasma ved tilsætning af CaCl-reagens, og koagulation vil begynde, og det resulterer i, at plasma bliver mere viskøs (jf. teoriafsnit 1.5.3) (12,6) Kromogentest Denne test anvendes til at måle aktiviteten af AT i patientplasma. Analyseprincippet forløber som en koblet reaktion, der består af to trin. Første trin består i, at ATIII Thrombin reagenset tilsættes. Dette reagens indeholder heparin og overskud af thrombin. AT, som er tilstede i patientplasma, vil danne et kompleks med heparin, og dette kompleks er i stand til at binde og inaktivere en del af det tilsatte thrombin. Ved andet trin tilsættes ATIII Substrat reagenset. Dette reagens indeholder et farveløst peptid-substrat. Den mængde thrombin, som er i overskud, er stadig aktiv og dermed i stand til at hydrolysere det tilsatte substrat. Denne hydrolyse af substratet medfører, at der frigøres et farvet produkt. Mængden af det Side 16 af 57

17 farvede produkt måles fotometrisk ved en bølgelængde på 405 nm (13), og måleprincippet er illustreret i figur a (24). Figur a: Skitsering af måleprincippet ved kromogentest, hvor I 0 er lyset fra lyskilden og I p det forstyrrende lys. Der anvendes λ=405 nm (24). 2. Materialer og metode 2.1. Metode Forsøgsdesign Det anvendte forsøgsdesign blev opstillet med det formål, at kunne belyse en kvantitativ undersøgelse baseret på 21 analyseresultater for INR, 23 analyseresultater for fibrinogen, 21 analyseresultater for APTT og 20 analyseresultater for AT. Valget af metode bidrager til det rette udgangspunkt, for at kunne vurdere holdbarheden af prøverne, efter at de er centrifugeret på StatSpin Express 2. Prøvetagning blev foretaget af bioanalytikere fra KBA, og tiden fra prøvetagning til centrifugering var maksimum 30 minutter. Prøverne blev centrifugeret på StatSpin Express 2 ved 4440G i 2 minutter i en fast vinkel. Efter centrifugering blev prøverne straks sat på STA-R Evolution og analyseret. Tiden 0 antages således som tiden straks efter centrifugering. Prøverne blev analyseret til tidspunkterne, som ses i nedenstående skema: Tiden timer 8 timer 24 timer time INR X (dobbeltbestemmelse) X X X Fibrinogen X (dobbeltbestemmelse) X X X APTT X (dobbeltbestemmelse) X X AT X (dobbeltbestemmelse) X X Tabel a: Oversigt over tidspunkterne hvor de forskellige analyser analyseres i forsøget, hvor tiden 0 er straks efter endt centrifugering. Side 17 af 57

18 Disse tidspunkter for måling blev fastsat i samarbejde med kemikeren, som er tilknyttet koagulationsspecialet, samt på baggrund af de nuværende retningslinjer for holdbarheden på koagulationsanalyser som KBA Holstebro anvender (25). Fibrinogen køres senest 24 timer efter centrifugering, til trods for at dens holdbarhed ved rutinecentrifugering er bestemt til 2 døgn. Dette argumenteres ud fra det faktum, at alle koagulationsprøver kasseres efter 24 timer (24), hvorfor analyse til senere tidspunkter end 24 timer ikke er relevant. I mellem målingerne blev prøverne opbevaret i oprejst position på apparatet, som har stuetemperatur. Som udgangspunkt blev alle fire analyser kørt på hver prøve. Efterhånden, som der tegnede sig et billede af de opnåede analyseresultaternes værdier, fastsatte vi grænser for, hvilke værdier vi manglede. Dernæst valgte vi at screene de prøver, som vi modtog. For de prøver, hvis værdi til tiden 0 lå i det område, som vi eftersøgte, analyserede vi videre på. Der var fastsat en minimumsgrænse på 20 patientprøver for hver analyse. Da vi gerne ville opnå at præsentere værdier i alle niveauer, blev det nødvendigt at medtage flere end 20 patientprøver for INR, fibrinogen og APTT. StatSpin Express 2 har kapacitet til 4 prøver pr. kørsel, og hvor det var muligt, blev fire prøver centrifugeret samtidig og analyseret straks derefter, og disse fire prøver vil således have den samme tid 0. Reagenser blev fremstillet og opbevaret efter angivne forskrifter (24). Gennemgående for alle analyserne gælder følgende betingelser: Der blev ikke foretaget reagensskift under kørsel af ét prøvenummer Der blev ikke skiftet apparatur For at sikre reliabiliteten og validiteten af vores analyseresultater, blev der udført daglige kontrolkørsler samt efter vedligehold Dataindsamling Dataindsamlingen er foregået i perioden fra d. 10. oktober 2012 til og med d. 24. oktober 2012 på Regionshospitalet Holstebro. Prøvematerialet blev indsamlet i tæt samarbejde med afdelingens bioanalytikere. Prøverne blev indsamlet ved venepunktur, udtræk fra A-kateter og central vene kateter (CVK). Kravet til prøvetagning og prøvemateriale til projektet var Side 18 af 57

19 ligestillet med kravene, der stilles i den daglige rutine. Disse krav omfatter, at der anvendes natrium-citrat glas, som fyldes før øvrige glas (14). Det er et krav, at prøveglasset fyldes korrekt, således at der opnås en fortynding med antikoagulans på 1:9, samt at blodet løber til prøveglasset i et godt flow (14). Hvis blodet løber langsomt kan det resultere i, at koagulationssystemet aktiveres under prøvetagning, hvilket visuelt ses ved hæmolyseret plasma (14). Patientprøver, hvor graden af hæmolyse i plasma overstiger 0,06 mmol/l, afvises og kasseres. Laga et al. påviser, på baggrund af et en lang række parallelle målinger, en signifikant forskel mellem hæmolyserede prøver og ikke-hæmolyserede prøver på hhv. INR- og APTT-værdier (15), og dette er bl.a. grunden til, at hæmolyserede prøver ikke accepteres hverken i rutinen eller i vores forsøg. Efter endt fyldning skal prøveglasset straks vendes godt (ca. 10 gange), men forsigtigt, for at sikre, at prøvemateriale blandes godt med antikoagulans (14). Derudover forventes det, at prøvetager har fulgt de generelle retningslinjer, der er udarbejdet for blodprøvetagning (26,27). På KBA foreligger der klare retningsliner for indsamling af prøvemateriale til metodeudvikling, som omfatter kvalitetssikring, eksamensopgaver mm. Disse retningslinjer lyder: Som hovedregel er det tilladt at tage ekstra blod uden at informere patienten, når det anvendes til ovennævnte formål (læs metodeudvikling), til i forvejen bestilte analyser (20) Prøvematerialet til projektet blev både indsamlet fra patienter, hvorpå der i forvejen var rekvireret koagulationsprøver, men for at sikre en tilstrækkelig mængde prøver, blev der også indsamlet prøver fra patienter, hvorpå der ikke var rekvireret koagulationsprøver. Til dette var der, forinden projektet start, indhentet tilladelse fra ledende overlæge på KBA, Annebirthe Bo Hansen, under forudsætning af, at patienten blev informeret om et ekstra prøveglas til kvalitetssikringsprojekt på KBA, samt at prøveglas anonymiseres. Dette blev praktiseret ved, at bioanalytikeren blot noterede prøvetagningstidspunktet på glasset, og ved modtagelse i laboratoriet fik disse prøver påsat et nummer, som var udarbejdet særligt til projektet. For at opnå repræsentative data ønskede vi at præsentere resultater i lavt normal og højt niveau inden for alle analyserne. For at opnå dette benyttede vi resultaterne af koagulationsanalyser, som var kørt i rutinen den pågældende dag. Ved fund af interessante værdier, blev det undersøgt i Labka (KBA s informations- og planlægningssy- Side 19 af 57

20 stem) om denne patient skulle havde taget prøver senere igen, og mulighederne for at tage et ekstra glas fra denne patient til projektet Databearbejdning For at belyse hvorvidt analyseresultaterne ændrer sig over tid, anvendes forskellige statistiske metoder, som omfatter både beskrivende- og intereferensstatistik. Databehandlingen blev foretaget i excel. Som det fremgår af tabel a blev der foretaget dobbeltbestemmelse til tiden 0. Fremover i opgaven anvendes gennemsnittet af dobbeltbestemmelsen, som værende resultatet til tiden 0. Differenserne mellem resultatet til tiden 0 og resultater til de øvrige tider blev beregnet for alle analyseresultaterne, og visualiseret i et differensplot med resultatet til tiden 0 ad X-aksen og differenserne til de respektive tider af Y-aksen. Til at give et visuelt billede af analyseresultaterne over tid, blev resultaterne plottet ind i et X/Y-plot med analyseresultatet som funktion af tiden. Til at belyse om der er signifikant forskel mellem middelværdierne til de forskellige tider inden for hver analyse, blev der udført en to-sidet variansanalyse uden gentagelser. Denne statistiske metode havde til formål at acceptere eller forkaste den opstillede H 0 hypotese, som lyder: H 0 : stikprøverne kommer fra en population med fælles middelværdi Hvortil den alternative hypotese lyder: H: stikprøverne kommer fra en population med forskellig middelværdi Variansanalysen blev udarbejdet med et signifikansniveau på α = 0,05. Ved udarbejdelse af variansanalysen for APTT blev resultaterne af patient prøve nr. 24 udeladt. Denne eksklusion argumenteres med, at analyseresultatet efter 4 timer ligger uden for måleområdet, og der eksisterer derfor ikke et reelt tal, som kan anvendes til denne statistiske metode. Deslige blev resultaterne for patient prøve nr. 24 ekskluderet i differensplottet med selvsamme argument som ovenfor, samt ud fra det faktum, at den lille ændring, som er observeret over tid, i et så højt niveau ikke vil medføre nogen klinisk relevans. Side 20 af 57

21 Som belæg for at diskutere resultaterne fastlægges følgende acceptgrænser hvor hver analyse: kritisk forskel, beregnes ud fra følgende formel: Ligning 1 Idet usikkerheden på analyseresultaterne i dette forsøg er kun behæftet med analytisk variation er CV% ana den eneste faktor, som multipliceres på de 2,77. Biasmål, som er fastsat ud fra KBA s krav til analysekvalitet (29) En klinisk relevant grænse, som er fastsat af KBA s overlæge Kaj O. Pedersen med udgangspunkt i vores opnåede analyseresultater Litteratursøgning Søgning efter primærlitteratur, med relevans for dette emne, er fundet ved at anvende databasen Pubmed. Der er anvendt følgende søgestrategier: Fritekstsøgning MeSH søgning Kædesøgning For søgningerne er opstillet følgende kriterier: Inklusionskriterier Litteratur på engelsk, dansk og norsk Litteratur for perioden Eksklusionskriterier Dyreforsøg Tabel a: Oversigt over anvendte inklusions- og eksklusionskriterier ved litteratursøgning. Eksempler på søgeord: Søgeord til MeSH søgning: Centrifugation, time, Blood Coagulation Tests, Blood Specimen Collection Søgeord til fritekst søgning: coagulation assay/testing, pre-analytic, centrifugation, Etiske overvejelser Som det fremgår af afsnittet omkring dataindsamling, foreligger der klare retningsliner for indsamling af prøvemateriale til denne slags metodeudviklingsprojekter. Idet vi udførte koagulationsanalyser på patienter, hvor der i forvejen ikke var rekvireret koagulationsana- Side 21 af 57

22 lyser, kunne vi risikere at opnå informationer, som patienten ikke i forvejen var kendt med. I KBA s retningslinjer står der: Ved uventede unormale fund orienteres KBA's overlæge straks, og vedkommende vil derefter blive kontaktet (28) I det prøveglassene blev anonymiseret var vi ikke i stand til at koble et resultat med en patient, og således udgik vi dette etiske dilemma Materialer Prøvemateriale Til projektet er modtaget i alt 92 blodprøvetagningsglas (2,7 ml glas indeholdende 0,109 M Natrium-citrat fra producenten BD Vacutainer ), hvortil anvendt prøvetagningsmetode er venepunktur, udtræk af A-kateter eller CVK. Prøvemateriale er indhentet fra indlagte og ambulante voksne patienter Reagenser Alle reagenser er fra Diagnostica Stago S.A.S APTT: AT: STA - PTT Lot nummer: ,025 M CaCl 2 : INR Fibrinogen Lot nummer: STA - Stachrom AT III Lot nummer: STA - Owren koller: Lot nummer: STA - SPA+: Lot nummer: STA - Owren koller: Lot nummer: STA - Fibrinogen: Lot nummer: Side 22 af 57

23 STA - Owren koller: Lot nummer Derudover anvendes Desorb-U, som vaskereagens ved alle analyserne. Lot nummer: Utensiler 2,7 ml blodprøvetagningsglas indeholdende 0,109 M Natrium-citrat fra BD Vacutainer Apparatur StatSpin Express 2 fra Iris Sample Processing, Cϵ mærket produkt. Varmeblok fra Techne DB-2D (Temperatur 37 C) til optøning af kontroller STA-R Evolution (KBA har to apparater, hhv. STA-R 1 og STA-R 2, og STA-R 2 er anvendt til dette forsøg) Kontrolmateriale OKP 167: Unormal frysetørret kontrol plasma Godkendelseskontrol for: INR. Langtidskontrol for: APTT, AT og fibrinogen OKP 167 Lot nummer: Lot nummer: Target SD Target SD INR 2,69 rel. tid 0,135 2,63 rel. tid 0,13 Tabel a: Target og spredning (SD) for OKP 167 ved INR. Scandinorm: Frysetørret normalt plasma Godkendelseskontrol for: APTT, AT og fibrinogen. Langtidskontrol for: INR Scandinorm Lot nummer: Target SD APTT 35,05 sek. 1,35 AT 0,836 rel.stofk. 0,044 Fibrinogen 2,3 g/l 0,12 Tabel b: Target og spredning (SD) for Scandinorm APTT, AT og Fibrinogen Side 23 af 57

24 3. Resultater I nedenstående afsnit præsenteres forsøgets resultater. Rådata for kontrolkørsler ses i bilag 1 og rådata for de respektive analyser ses i bilag Kontroller I figur 3.1.a 3.1.e ses, hvorledes godkendelseskontrollerne har fordelt sig i forsøgsperioden. Figur 3.1.a: Resultater af godkendelseskontrol (OKP 167, Lotnr.:10404) for INR i forsøgsperioden Figur 3.1.b: Resultater af godkendelseskontrol (OKP 167, Lotnr.:12036) for INR i forsøgsperioden Figur 3.1.c: Resultater af godkendelseskontrol (scandinorm) for Fibrinogen i forsøgsperioden Side 24 af 57

25 Figur 3.1.d: Resultater af godkendelseskontrol (Scandinorm) for APTT i forsøgsperioden Figur 3.1.e: Resultater af godkendelseskontrol (Scandinorm) for AT i forsøgsperioden 3.2 Acceptgrænser Forud for beregning af den kritiske forskel er CV% ana bestemt ud fra resultatet af langtidskontroller på STA-R 2 i perioden januar 2012 september 2012 (se bilag 5). Deraf er følgende CV% ana fastsat: Analyse CV% ana i niveau 1 CV% ana i niveau 2 INR 1,60 % 1,80 % Fibrinogen 2,0 % 2,2 % APTT 2,70 % 4,1 % AT 6,9 % 3,6 % Tabel 3.2.a: Oversigt over CV% ana INR, Fibrinogen, APTT og AT i niveau 1 og niveau 2 bestemt ud fra langtidkontroller kørt på STA-R 2. Side 25 af 57

26 Ud fra ligning 1 og ovenstående CV% ana værdier beregnes den kritiske forskel for hver af de fire analyser. Dette giver følgende grænser, defineret som kritisk forskel: Analyse Niveau Kritisk forskel INR [0-1,835[ 4,432 % (enhed: rel. tid) [1,835-4,9[ 4,986 % Fibrinogen (enhed: µmol/l) APTT (enhed: sek.) AT (enhed: arb. enhed) [0-1,915[ 5,52 % [1,915-33[ 6,094 % [0-50,55[ 7,73 % [50,55-90[ 13,41 % [0-0,63[ 18,005 % [0,63-1,4[ 6,260 % De ovenstående intervaller er fastsat på baggrund af kontrollernes niveau, hvorpå CV% er udregnet, se bilag 5 Tabel 3.2.b: Oversigt over den beregnede kritiske forskel for hver af de fire analyser i to niveauer De anvendte biasmål er fastsat ud fra KBA s krav til analysekvalitet (29) og er for analyserne som følgende: Analyse Biasmål % INR ± 4,5 Fibrinogen ± 7,2 APTT ± 3,4 AT ± 6 Tabel 3.2.c: Biasmål i procent for INR, Fibrinogen, APTT og AT. De kliniske relevante grænser, som overlæge Kaj O. Pedersen har fastsat er som følgende: Analyse Klinisk relevant grænse ifg. Overlæge Kaj O. Pedersen INR 0,5 rel. tid Fibrinogen 2 µmol/l APTT 2 sek. AT 0,1 arb. enhed Tabel 3.2.d: Oversigt over de klinisk relevante grænser for INR, Fibrinogen, APTT og AT som overlæge Kaj O. Pedersen har fastsat på baggrund af resultaterne af dette projekts forsøg. Side 26 af 57

27 3.3. INR Resultaterne for INR er opstillet i nedenstående tabel 3.3.a og figur 3.3.b og 3.3.c Tabel 3.3.a viser resultatet for variansanalysen ved α=0,05, hvor F angiver teststørrelsen, mens K krit angiver den acceptable størrelse af F, for det kan medføre accept af H 0 for INR. ANAVA Variationskilde SK fg MK F P-værdi F krit Kolonner 0, , , , , Tabel 3.3.a: Resultat af variansanalysen for INR I figur 3.3.b er INR-resultaterne for 21 patientprøver plottet med analyseresultatet som funktionen af tiden. Figur 3.3.b: XY-plot med INR-resultater fra 21 patientprøver ved måling til tiden 0 og efter henstand i hhv. 1, 8 og 24 timer. Side 27 af 57

28 I figur 3.3.c er de beregnede differenser (fremgår af bilag 2) efter henstand i hhv. 1, 8 og 24 timer plottet i et differensplot, med differensen ad Y aksen og analyseresultatet til tiden 0 ad X-aksen. Kritisk forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse er indtegnet i differensplottet. Figur 3.3.c: Differensplot hvor de beregnede differenser efter henstand i hhv. 1, 8 og 24 timer er plottet ind. Derudover er kritisk forskel (niveau 1: ±4,43%; Niveau 2: ±4,99%), biasmål (±4,5%) og den fastsatte klinisk relevante grænse (±0,5 rel, tid) indtegnet Fibrinogen Resultaterne for fibrinogen er opstillet i nedenstående tabel 3.4.a og figur 3.4.b og 3.4.c Tabel 3.4.a viser resultatet for variansanalysen ved α=0,05, hvor F angiver teststørrelsen, mens K krit angiver den acceptable størrelse af F for det kan medføre accept af H 0 for fibrinogen. ANAVA Variationskilde SK fg MK F P-værdi F krit Kolonner 4, , , , , Tabel 3.4.a: Resultat af variansanalysen for fibrinogen Side 28 af 57

29 µmol/l Tina E. Holm Professionsbachelorprojekt 2012 I figur 3.4.b er fibrinogen-resultaterne for 23 patientprøver plottet med analyseresultatet som funktionen af tiden. Fibrinogen 40 Prøve nr Prøve nr. 3 Prøve nr. 4 Prøve nr Prøve nr. 6 Prøve nr. 7 Prøve nr Prøve nr. 9 Prøve nr Prøve nr. 11 Prøve nr. 12 Prøve nr Prøve nr. 14 Prøve nr. 15 Prøve nr Prøve nr. 18 Prøve nr. 19 Prøve nr Prøve nr. 21 Prøve nr Gennemsnit ved tiden 0 1 time 8 timer 24 timer Tiden Prøve nr. 44 Prøve nr. 66 Prøve nr. 70 Figur 3.4.b: XY-plot med Fibrinogen-resultater fra 23 patientprøver ved måling til tiden 0 og efter henstand i hhv. 1, 8 og 24 timer. Side 29 af 57

30 I figur 3.4.c er de beregnede differenser (fremgår af bilag 3) efter henstand i hhv. 1, 8 og 24 timer plottet i et differensplot, med differensen ad Y-aksen og analyseresultatet til tiden 0 ad X-aksen. Kritisk forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse er indtegnet i differensplottet. Figur 3.4.c: Differensplot for Fibrinogen, hvor de beregnede differenser efter henstand i hhv. 1, 8 og 24 timer er plottet ind. Derudover er kritisk forskel (niveau 1: ±5,54%; Niveau 2: ±6,09%), biasmål (±7,2%) og den fastsatte klinisk relevante grænse (±2 µmol/l) indtegnet APTT Resultaterne for APTT er opstillet i nedenstående tabel 3.5.a og figur 3.5.b og 3.5.c Tabel 3.5.a viser resultatet for variansanalysen ved α=0,05, hvor F angiver teststørrelsen, mens K krit angiver den acceptable størrelse af F for det kan medføre accept af H 0 for APTT. ANAVA Variationskilde SK fg MK F P-værdi F krit Kolonner 0, ,121 0, , , Tabel 3.5.a: Resultat af variansanalysen for APTT Side 30 af 57

31 I figur 3.5.b er APTT-resultaterne for 21 patientprøver plottet med resultatet som funktionen af tiden. Figur 3.5.b: XY-plot med APTT-resultater fra 21 patientprøver ved måling til tiden 0 og efter henstand i 1 og 4 timer. Side 31 af 57

32 I figur 3.5.c er de beregnede differenser for APTT (fremgår af bilag 4) efter henstand i 1 og 4 timer plottet i et differensplot, med differensen ad Y-aksen og analyseresultatet til tiden 0 ad X-aksen. Kritisk forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse er indtegnet i differensplottet. Figur 3.5.c: Differensplot for APTT, hvor de beregnede differenser efter henstand i 1 og 4 timer er plottet ind. Derudover er kritisk forskel (niveau 1: ±7,73%; Niveau 2: ±13,41%), biasmål (±6,8%) og den fastsatte klinisk relevante grænse (±2 sek.) indtegnet. Prøve nr. 24 er ekskluderet fra differensplottet AT Resultaterne for AT er opstillet i nedenstående tabel 3.6.a og figur 3.6.b og 3.6.c Tabel 3.6.a viser resultatet for variansanalysen ved α=0,05, hvor F angiver teststørrelsen, mens K krit angiver den acceptable størrelse af F for det kan medføre accept af H 0 for AT. ANAVA Variationskilde SK fg MK F P-værdi F krit 4, , , Kolonner 0, , Tabel 3.6.a: Resultat af variansanalysen for AT Side 32 af 57

33 I figur 3.6.b er AT-resultaterne for 20 patientprøver plottet med resultatet som funktionen af tiden. Tiden Figur 3.6.b: XY-plot med AT-resultater fra 20 patientprøver ved måling til tiden 0 og efter henstand i 1 og 4 timer. Side 33 af 57

34 I figur 3.6.c er de beregnede differenser for AT (fremgår af bilag 5) efter henstand i 1 og 4 timer plottet i et differensplot, med differensen ad Y-aksen og analyseresultatet til tiden 0 ad X-aksen. Kritisk forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse er indtegnet i differensplottet. Figur 3.6.c: Differensplot for AT, hvor de beregnede differenser efter henstand i 1 og 4 timer er plottet ind. Derudover er kritisk forskel (niveau 1: ±18%; Niveau 2: ±6,26%), biasmål (±12%) og den fastsatte klinisk relevante grænse (±0,1 arb. enhed) indtegnet. 4. Diskussion 4.1. Kontroller Kontrolkørslerne danner baggrund for reliabiliteten af vores resultater i dette projekt, og ligeledes gør de i rutinekørslen. Kontrolkørslerne kan antages, som en metode til at overvåge om analyserne fungerer, som de skal, dvs. om de lever op til de fastsatte acceptgrænser. Kontrolkørslerne har således til formål at opdage, hvis der er skred i resultat i forhold til den sande værdi. Eventuelle skred kan skyldes flere årsager; tekniske fejl på apparatet, reagens, kalibrering mm. Kontrolresultaterne fremgår af figur 3.1.a-3.1.e, og disse resultater er vurderet ud fra Westgards kontrolregler 1 3S, 2 2S, 4 1S, R 4S, hvoraf 1 3s betegnes som forkastelsesregel, mens de øvrige betegnes som advarselsregler. Med reglerne vurderes det, Side 34 af 57

35 hvor meget kontrolresultatet afviger fra den værdi, som er fastsat, som den sande værdi (target) for kontrollen til de respektive analyser. KBA fastsætter target og spredning (analysens usikkerhed) på kontrollerne ved at foretage 20 bestemmelser fordelt på 20 dage (30). Resultaterne er således bestemt under forskellige betingelser; over flere dage, af forskellige bioanalytikere, forskellige reagenskit, forskellige laboratorier (Herning og Holstebro) og både på STA-R 1 og STA-R 2 på begge laboratorier. Deraf bliver spredningen et udtryk for laboratoriereproducerbarhed, som udtrykker usikkerheden, der er behæftet med metoden, dvs. alle analyseresultater på patientprøver vil også være behæftet med denne usikkerhed. Der er kørt kontrolkørsler på alle fire analyser hver morgen, og derudover er der kørt kontrol på APTT efter vedligehold og ved opfyldning af APTT-reagens, som det kræves ifølge forskriften (24). Target og SD for hver af analyserne ses i afsnit Kontrolresultaterne for INR (lot nummer 10404) accepteres, idet ingen af resultaterne overskrider de anvendte Westgard kontrolregler. Kontrolresultaternes fordeling tyder hverken på en højere eller lavere tendens i forhold til target. De tre kontrolresultater for INR på lot nummer ligger ligeledes inden for kontrolreglerne og antages derfor som tilfredsstillende. Kontrolresultaterne fibrinogen accepteres, da ingen af resultaterne bryder med Westgards kontrolregler. Alle kontrolresultaterne ligger på den samme side af target, hvilket antyder, at der er en tendens til, at metoden systematisk måler for højt i forhold til target. Kontrolresultaterne for APTT accepteres, da ingen af kontrolmålingerne bryder med Westgards kontrolregler. Kontrolresultaterne fordeler sig med en overvægt under target, men kontrolmålingernes fordeling tyder ikke på en systematisk lavere tendens i forhold til target. Kontrolresultaterne for AT accepteres, idet ingen af målingerne bryder med Westgards kontrolregler. Kontrolresultaternes fordeling tyder hverken på en højere eller lavere tendens i forhold til target. Ud fra de ovennævnte accepterede kontrolresultater kan de opnåede resultater til projektet accepteres og anvendes til videre diskussion. Side 35 af 57

36 4.2. Analyserne I de følgende afsnit diskuteres resultaterne for de respektive analyser. Diskussionen af de fire analyser er opbygget omkring samme udgangspunkter; XY-plot, differensplot, variansanalyse, kritisk forskel, biasmål og en fastsat klinisk relevant grænse. Grænsen for kritisk forskel refererer til den afvigelse, der kan forklares med analytisk variation. Biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse er to kvalificerede bud på en metode til at diskutere, hvorvidt evt. afvigende punkter har en klinisk relevans. Disse to grænser er fastsat på baggrund af forskelligt empiri; biasmål er en udregnet faktor ud fra biologisk variation (29), mens den fastsatte klinisk relevante grænse er fastsat af KBA s overlæge Kaj O. Pedersen med udgangspunkt i de opnåede analyseresultaterne fra dette forsøg. Begge bud på den klinisk relevante grænse er medtaget i diskussionen, men ud fra det faktum, at de fastsatte klinisk relevante grænser er fastsat med udgangspunkt i vores analyseresultater, vurderes disse grænser, som værende det bedste redskab til at vurdere den kliniske relevante betydning af de observerede differenser. Disse ovenfor nævnte grænser bidrager til at vurdere kvaliteten af vores analyseresultater, men acceptkriterierne anvendes ikke helt firkantet, således at overskridende punkter absolut medfører en konklusion om, at analysen ikke er holdbar til den givne tid. Overskridende punkter vurderes derfor bl.a. i relation til det niveau, som de befinder sig i, og om hvorvidt ændringen får betydning ud fra et diagnostisk perspektiv. I diskussionsafsnittet anvendes skrivemåden t=0, t=1, t=4, t=8 og t=24, hvor tallet refererer til det antal timer efter centrifugering, som analysen er udført ved INR Vurderingen af holdbarheden af INR bygger på resultater fra 21 patientprøver. Ud fra XYplottet i resultatafsnittet (figur 3.3.b) fremgår det, hvorledes analyseresultaterne placerer sig ved t=0, t=1, t=8 og t=24. Af plottet fremgår det, at målingerne omkring niveau 1 rel. tid ligger meget kompakt, og den enkelte prøve er derfor svær at vurdere. Ingen af prøverne i dette niveau laver dog store udsving ved nogen af tiderne, det betyder, at koncentrationerne for disse prøver omkring niveau 1 rel. tid holder sig rimelig stabil over tiden. Der ses større udsving på prøverne jo højere vi bevæger os op i niveau, og det betyder, at koncentrationerne i disse niveauer ikke holder sig så stabile. Det fremgår, at fire prøver (prøve nr. 12, 14, 23, 67) udvikler sig med samme mønster, hvor der ses et stort fald ved t=8 og derefter en stigning til t=24. Udover disse fire prøver vurderes de øvrige prøveresultaters forløb over tid ikke at kunne pålægges nogen tendens. Differensplottet (figur 3.3.c) tyde- Side 36 af 57

37 liggør dog, at der er tale om en faldende tendens over tid, idet alle differenserne, på nær tre, fordeler sig på den positive side af X-aksen. Symbolerne, som refererer til differenserne til de forskellige tider, fordeler sig ikke ens i forhold til hinanden for alle prøverne, hvilket modsvarer en eventuel tendens i differenserne til de forskellige tider. Det tydeliggøres også af XY-plottet, at der mangler prøver, som repræsenterer INR-værdi i niveau 2-3 rel. tid, som er det terapeutiske niveau for patienter i behandling med vitamin-kantagonister (34). Derudover mangler der også én, eller flere, prøver med INR-værdi omkring 5 rel. tid, da der på baggrund af blot én prøve ikke kan vurderes, om der ses en tendens i dette høje niveau. Resultatet af variansanalysen (tabel 3.3.a) for INR medfører en forkastelse af H 0 hypotesen idet F>F krit. Det betyder, at testen har påvist, at der er signifikant forskel på middelværdierne i populationerne t=0, t=1, t=8 og t=24. I differensplottet er indtegnet den kritiske forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevant grænse for INR. I nedenstående tabel fremgår, hvorledes overskridende punkter til de forskellige grænser fordeler sig: Grænse Kritisk forskel Biasmål (±4,5%) Klinisk relevant Tiden grænse (±0,5 rel. tid) t=1 time 3 punkter 2 punkter 0 punkter t=8 timer 10 punkter 10 punkter 2 punkter t=24 timer 7 punkter 7 punkter 0 punkter Tabel a: Oversigt over hvorledes punkter som overskrider de fastsatte grænser fordeler sig for INR. Alle punkterne fremgår ikke visuelt på differensplottet, da nogle differenser overlapper hinanden. Ud af 19 punkter, som overskrider biasmål, fører det til ændring af diagnose ved én prøve, idet værdien efter t=8 ligger under i normalområdet (<1,2 rel.tid), mens den sande værdi giver en INR-værdi over 1,2 rel. tid. For de to punkter, som overskrider den fastsatte klinisk relevante grænse, vil det medføre diagnostisk betydning for det ene punkt (samme som nævnt ved biasmål). Referenceintervallet for INR er < 1,2 rel. tid, og dette niveau er derfor interessant set ud fra et klinisk perspektiv. Af differensplottet fremgår det, at omkring dette niveau overskrider ingen punkter den fastsatte klinisk relevante grænse på 0,5 rel. tid, og ligeledes vurderes prøverne at holde sig stabile omkring dette niveau. Dermed kan det, på Side 37 af 57

38 baggrund af forsøgets analyseresultater, vurderes, at analyseresultater i dette klinisk interessante område holder sig stabil efter henstand i 24 timer efter centrifugering på StatSpin Express 2. I de øvrige niveauer ses flere afvigende prøver, men disse accepteres set i henhold til det niveau de befinder sig i samt evt. diagnostisk ændring. Dog kan dette forsøg ikke bekræfte, at det samme er gældende i det terapeutiske niveau (2-3 rel. tid), pga. manglende analyseresultater, og dette niveau er af stor vigtighed for patienter i behandling med vitamin-k-antagonister, da deres behandling monitoreres ud fra deres målte INR-værdi (6) Fibrinogen Vurderingen af holdbarheden af fibrinogen bygger på analyseresultater fra i alt 23 patientprøver. Ud fra XY-plottet (figur 3.4.b) fremgår det, hvorledes analyseresultaterne placerer sig ved t=0, t=1, t=8 og t=24. Resultaterne fordeler sig forholdsvis jævnt i lav-, normal- og høj niveau, med en overvægt at målinger inden for referenceintervallet. Dette var dog forventet, eftersom der blev analyseret på prøver, hvor fibrinogen ikke var rekvireret. Kurverne krydser hinanden tilfældigt, hvilket, ud fra en visuel vurdering, afviser en evt. systematisk udvikling over tid. I differensplottet (figur 3.4.c) tydeliggøres, hvorledes differenserne til de forskellige tider fordeler sig. Ved t=1 fordeler positive og negative differenser sig med hhv. 8 og 15, hvoraf der vurderes, ikke at være en tendens i ændringen af fibrinogenkoncentrationen efter 1 time. Ved t=8 fordeler positive og negative differenser med hhv. 2 og 21, hvilket tyder på, at der efter 8 timer ses en stigende tendens i fibrinogenkoncentrationen. Ved til t=24 fordeler positive og negative differenser sig med hhv. 8 og 15, og der observeres derfor ingen tydelig tendens i udviklingen af fibrinogenkoncentrationen efter 24 timer. Der ses deslige heller ingen systematik i, hvorledes symbolerne for de respektive tider fordeler sig for den enkelte prøve, hvilket underbygger, at der ikke ses nogen tendens over tid mht. ændring af fibrinogenkoncentrationen. Resultatet af variansanalysen (tabel 3.4.a) for fibrinogen medfører en forkastelse H 0 hypotesen, og betydningen af dette er tilsvarende som beskrevet for INR. I differensplottet er indtegnet den kritiske forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevant grænse for fibrinogen. I nedenstående tabel fremgår, hvorledes overskridende punkter til de forskellige grænser fordeler sig: Side 38 af 57

39 Grænse Kritisk forskel Biasmål (±7,2%) Klinisk relevant Tiden grænse (±2 µmol/l) t=1 time 4 punkter 2 punkter 0 punkter t=8 timer 11 punkter 8 punkter 1 punkter t=24 timer 11 punkter 8 punkter 2 punkter Tabel a: Oversigt over hvorledes punkter som overskrider de fastsatte grænser fordeler sig for Fibrinogen. For de 18 punkter, som overskrider biasmål, vil differenserne medføre diagnostisk betydning i 2 tilfælde til t=8 og i 3 tilfælde til t=24, hvor alle værdier går fra værende indenfor referenceintervallet til liggende over øvre grænse af referenceintervallet. Hvis der isoleret kun vurderes på de tre punkter, som overskrider den fastsatte klinisk relevante grænse på 2 µmol/l, så vil disse differenser medføre diagnostisk betydning for alle punkterne, hvoraf to refererer til samme prøve. For disse gælder det deslige, at værdierne går fra værende inden for referenceområdet til liggende over øvre grænse. Det fremgår, af differensplottet, at de punkter, som har størst afvigelse til kritisk forskel og biasmål ligger i niveau omkring 12 µmol/l, som er den øvre grænse af referenceintervallet for fibrinogen. Dog tyder dette ikke på at være en gældende tendens i dette niveau, da det, af differensplottet, fremgår, at øvrige punkter omkring dette niveau ligger inden for acceptgrænserne. Som det fremgår, af ovenstående, fordeler antallet af overskridende punkter som nogenlunde ens til t=8 og t=24, og intet tyder derfor på at der sker en tendens i mellem disse tidspunkter. På baggrund af analyseresultaterne for fibrinogen i dette forsøg vurderes kvaliteten af analyseresultatet at være acceptabelt efter henstand i 24 timer efter centrifugering på StatSpin Express 2. Dette argumenteres ud fra det faktum, at kun tre punkter falder uden for den fastsatte kliniske relevante grænse APTT Vurderingen af holdbarheden for APTT bygger på resultater fra 20 patientprøver (hvoraf resultater fra patientprøve nr. 24 ekskluderet, jf databearbejdning). Ud fra XYplottet (figur 3.5.b) fremgår det, hvorledes analyseresultaterne fordeler sig til t=1 og t=4. I XY-plottet er samtlige 21 patientprøver plottet ind, for at illustrere, hvor meget prøve nr. 24 skiller sig meget ud fra øvrige analyseresultater. Vi modtog ikke flere prøver med en APTT-værdi i tilsvarende niveau, og én prøve i dette niveau er ikke grundlag nok for at kunne vurdere holdbarheden på prøver i dette høje niveau. Derudover skiller prøve nr. 9 sig også ud med den markante stigning ved t=1 for derefter at falde tilsvarende markant Side 39 af 57

40 ved t=4. Udover prøve nr. 9 og 24 forløber de øvrige resultater over tid ikke med nogen bemærkelsesværdig tendens, og visuelt vurderes det derfor, på baggrund af XY-plottet, at prøverne holder sig forholdsvis stabile, særligt i det lave niveau. I differensplottet (figur 3.5.c) fremgår det, at ved t=1 fordeler de positive og negative differenser sig hhv. 11 og 8 og for t=4 hhv. 8 og 12, hvilket viser en jævn fordeling af differenserne omkring X-aksen, og der er således ingen overbevisende tendens i udviklingen af APTT-værdien over tid. Symbolerne inden for den enkelte prøver fordeler sig heller ikke systematisk for alle prøverne, og dette understøtter, at der ikke ses en tendens i udviklingen APTT over tid. Resultatet af variansanalysen (tabel 3.5.a) for APTT medfører en accept af H 0 hypotesen idet F<F krit. Det betyder, at testen ikke har kunnet påvise en signifikant forskel mellem middelværdierne i populationerne til t=0, t=1 og t=4. Testen påviser dog ikke, at populationerne er ens, men på baggrund af variansanalysens resultat kan det ikke afvises, at H 0 er sand, og derfor fører resultatet af variansanalysen til accept af H 0 hypotesen. I differensplottet er indtegnet den kritiske forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse for APTT. I nedenstående tabel fremgår det, hvorledes overskridende punkter til de forskellige grænser fordeler sig: Grænse Kritisk forskel Biasmål (±6,8%) Klinisk relevant Tiden grænse (±2 sek.) t=1 time 1 punkter 1 punkter 7 punkter t=4 timer 2 punkter 4 punkter 7 punkter Tabel a: Oversigt over hvorledes punkter som overskrider de fastsatte grænser fordeler sig for APTT. For APTT gælder det, modsat de øvrige analyser, at biasmål og den fastsatte kliniske relevante grænse er lavere end den kritiske forskel, hvorfor det også er relevant at kigge på de punkter, som ligger inden for den kritiske forskel. Den fastsatte kliniske relevante grænse er særligt interessant omkring niveau 38 sekunder, da det er den øvre grænse af referenceintervallet for APTT, som er interessant set med ud fra et klinisk perspektiv. Som det fremgår af graferne, er vores resultater ikke særligt repræsentative til at vurdere udviklingen omkring niveau 38 sekunder, da antallet af prøver i dette niveau er lavt. De nævnte punkter, som overskrider biasmål og den klinisk relevante grænse på 2 sekunder ligger ikke placeret omkring niveau 38, og en ændring på over 2 sekunder i disse niveauer er ikke af afgørende klinisk betydning. Kun for ét af de Side 40 af 57

41 overskridende punkter medfører differensen en diagnostisk ændring, idet værdien ved t=4 ligger inden for referenceintervallet, mens resultatet til t=0 ligger under nedre grænse af referenceintervallet. Idet at den nedre grænse ikke tillægges nogen specifik klinisk betydning, accepteres dette ene punkt. På baggrund af de resultater, som er opnået for APTT i dette forsøg, vurderes resultaterne til t=1 og t=4 at være acceptable. Dette argumenteres ud fra det faktum, at de afvigende punkter ikke befinder sig i et niveau, som er af klinisk relevans. Dog er resultaterne fra vores forsøg ikke i stand til optimalt at belyse udviklingen omkring det kliniske interessante niveau på 38 sekunder. For APTT gælder det, at analyseresultaterne efter henstand i 1 og 4 timer accepteres både ud fra den anvendte statistiske metode og ud fra den visuelle og kliniske vurdering. Dette er modsat de forrige analyser (INR og fibrinogen), hvor der ikke er overensstemmelse mellem resultatet af den statistiske metode og den visuelle og kliniske vurdering AT Vurderingen af holdbarheden for AT bygger på analyseresultater fra i alt 20 patientprøver. Ud fra XY-plottet i resultatafsnittet (figur 3.6.b) fremgår det, hvorledes analyseresultaterne placerer sig ved t=1 og t=4. Det fremgår, at kurverne ikke forløber med identisk mønster, og visuelt vurderes der derfor, ikke at være en systematisk tendens i udviklingen af ATkoncentration over tid. Vi modtog ingen prøver, hvor AT-resultatet lå over øvre grænse af referenceintervallet, så derfor kan dette projekt ikke belyse udviklingen af ATkoncentrationen i dette høje niveau. Med det faktum at AT-koncentrationer i det høje niveau ikke pålægges nogen klinisk betydning, vurderes forsøget alligevel at være brugbart til at vurdere holdbarheden af AT med et repræsentativt grundlag. Af differensplottet (figur 3.6.c) fremgår det, at ved t=1 fordeler positive og negative differenser sig med hhv. 6 og 14, mens de ved t=4 fordeler sig med 4 positive og 16 negative differenser. Heraf kan der udledes, at der ved t=4 er en mere udbredt stigende tendens mht. AT-koncentrationen. Resultatet af variansanalysen (tabel 3.6.a) for AT medfører en forkastelse af H 0 hypotesen. Det betyder, at testen har påvist, at der er signifikant forskel på middelværdierne i populationerne t=0, t=1, t=4. I differensplottet er indtegnet den kritiske forskel, biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse for AT. Det fremgår, modsat de omtalte forrige analyser, at den kritiske forskel Side 41 af 57

42 er større i det lave niveau end i det høje niveau for AT. Det betyder, at metoden ved niveau op til 63 arb. enhed (ifølge vores fastsatte intervaller) er behæftet med en mindre præcision, og dermed en større spredning og en større CV%. I nedenstående tabel fremgår det, hvorledes overskridende punkter til de forskellige grænser fordeler sig: Grænse Kritisk forskel Biasmål (±12%) Klinisk relevant grænse Tiden (±0,1 arb. enhed) t=1 time 5 punkter 1 punkter 1 punkter t=4 timer 9 punkter 5 punkter 5 punkter Tabel a: Oversigt over hvorledes punkter som overskrider de fastsatte grænser fordeler sig for AT. Som det fremgår af teoriafsnittet, er det den nedre grænse af referenceintervallet (0,8 arb. enhed), som er interessant set ud fra et klinisk perspektiv. Ud fra differensplottet ses der en stærk stigende tendens omkring niveau 0,8 arb. enhed ved t=4. De ovenstående punkter, som overskrider biasmål, ligger, med udtagelse af ét punkt til t=4, omkring niveau 0,8 arb. enhed. At de overskridende punkter i høj grad er koncentreret omkring det klinisk interessante niveau, vurderes at være af særlig interesse. Den klinisk fastsatte grænse er fastsat til 0,1 arb. enhed, og den skal forstås således, at en ændring på ±0,1 ved niveau 0,8 arb. enhed kan have en klinisk betydning for patienten. I det høje niveau vil en ændring på 0,1 arb. enhed ikke medføre en betydning for patienten. De 6 punkter, som overskrider den klinisk relevante grænse på 0,1 arb. enhed, er de tilsvarende, som overskrider biasmål, dvs. flertallet ligger omkring niveau 0,8 arb. enhed, og er derfor af stor relevans. Ved en vurdering af hvorvidt de overskridende punkter ændrer diagnostisk betydning, kan det konkluderes, at dette er tilfældet for 1 punkt ved t=1 og 1 punkt ved t=4. Disse to differenser refererer til samme prøve, og resultatet bevæger sig fra værende under referenceintervallet (0,75) til værende inden for referenceintervallet efter henstand i 1 og 4 timer (0,88). På baggrund af de analyseresultater for AT, som er opnået i dette forsøg, vurderes der at være en påfaldende tendens omkring niveau 0,8 arb. enhed. Fire ud af syv punkter (57%) i dette niveau falder uden for biasmål og den fastsatte klinisk relevante grænse efter henstand i 4 timer. Dog medfører det kun diagnostisk ændring for én af prøverne, hvilket vil anses som acceptabelt for vores forsøg. Det er derimod tvivlsomt, hvorvidt det kan konkluderes, at analysekvaliteten er acceptabel efter henstand i 4 timer efter Side 42 af 57

43 centrifugering på StatSpin Express 2 pga. den tendens, som der observeres omkring niveau 0,8 arb. enhed Metode På KBA i Holstebro anvendes samme materialer og metode, som er anvendt ved dette kvalitetssikringsprojekt. Dette giver derfor god anledning til at anvende projektets resultater, som belæg for at vurdere holdbarheden af hver analyse. En stor udfordring ved forsøgsdesignet var at opnå analyseresultater i alle niveauer for hver analyse. Som det fremgår af resultaterne, er alle niveauer ikke repræsenteret for alle analyserne, og forsøget er derfor ikke i stand til fuldt ud at belyse, hvorvidt holdbarheden er afhængigt af, hvilket niveau analyseresultatet befinder sig i. Under prøveindsamling er der ikke skelnet mellem prøvemateriale udtaget fra venepunktur, A-kateter eller CVK. Denne faktor kunne have været dokumenteret, således projektet kunne bevise, om der er en sammenhæng mellem prøvetagningsmetode og holdbarheden. Metoden tager desuden heller ikke højde for de forskellige biologiske tilstande, som patienterne kan befinde sig (behandling med vitamin-k-antagonister, heparin behandling etc.), og metoden er således ikke i stand til at påvise, om der er en sammenhæng mellem biologiske grupper og holdbarheden. Prøveindsamling blev foretaget af afdelingens personale, og vi har derfor ikke haft indflydelse på de præanalytiske faktorer, som er knyttet til prøvetagningsproceduren. Det forventes dog, at prøvetager har fulgt de gældende retningslinjer for prøvetagningsproceduren, og det antages derfor, at de præanalytiske faktorer ved prøvetagning er uden relevans for forsøgets resultater. Gennem projektet blev yderligere præanalytiske variabler holdt så konstante som muligt, såsom at alle analyseresultater på ét prøvenummer er analyseret på samme reagenskit, samt at der under forsøget ikke blev skiftet apparat. Dette havde til formål at opnå et forsøgsdesign, hvor den eneste varierende faktor for den enkelte prøve var tiden. Dog blev der udført daglig vedligehold af apparatet mellem målinger på ét prøvenummer, men ud fra det faktum at dagligt vedligehold er med til at opretholde kvaliteten af analyseresultaterne, antages dette som acceptabelt for forsøget. Der blev valgt at foretage dobbeltbestemmelse til t=0, og dette valg blev taget for at øge sikkerheden for en korrekt sand værdi til t=0. Dobbeltbestemmelsen har således ikke noget formål set ud fra et statistisk perspektiv, da alle resultater er af lige stor vigtighed i forbindelse med udarbejdelse af variansanalysen. Signifikansniveauet for variansanalysen Side 43 af 57

44 blev fastsat til α = 0,05 (5%). Med valget af dette signifikansniveau betyder det, at vi accepterer, at der er 5% risiko for, at resultatet af variansanalysen fører til forkastelse af H 0 hypotesen, selvom den er sand (type 1 fejl). Som det fremgår af ovenstående diskussion af analyserne, kan der diskuteres, hvorvidt variansanalysen er et brugbart redskab til at vurdere vores analyseresultater. Mht. INR og fibrinogen medfører resultatet af variansanalysen en forkastelse H 0 hypotesen, men resultaterne af analyserne vurderes som acceptabelt ud fra et klinisk perspektiv. Dette illustrerer i høj grad statistikkens betydning kontra den kliniske vurdering i dette projekt Evaluering af StatSpin Express 2 CLSI har opskrevet anbefalinger til centrifugering af koagulationsprøver, som omfatter, at koagulationsprøver centrifugeres ved 1500G i minimum 15 minutter (1). Det betyder, at ved anvendelse af StatSpin Express 2 til centrifugering af koagulationsprøver, efterfølges de anbefalinger, som CLSI beskriver, ikke. Det er dog ikke ensbetydende med at brugen af StatSpin Express 2 ikke accepteres, så længe det kan dokumenteres, at prøvematerialet lever op til de anbefalinger, der stilles. En af de anbefalinger som CLSI har angivet til centrifugeringen er, at der opnås en plasmafraktion med et thrombocyttal under 10x10 9 /L (10.000/µL). Dette projekt har ikke påvist, hvorvidt centrifugering på StatSpin Express 2 resulterer i et acceptabelt thrombocyttal i plasmafraktionen. Andre studier har dog undersøgt, hvorledes centrifugeringskraften og tiden kan ændres, og stadig medføre et acceptabelt thrombocyttal. Ingen fundne studier har dog evalueret thrombocyttallet ved netop en centrifugeringskraft på 4440G i 2 minutter, og det er derfor ikke muligt at bekræfte, at StatSpin Express 2 opfylder anbefalingerne fra CLSI. Et østrigsk studie af Demeski et al. har undersøgt thrombocyttallet efter centrifugering ved 3000G, 4000G og 3100G i hhv. 10, 3 og 10 minutter. Studiet konkluderer, at natrium-citrat glas, som er centrifugeret i 3 minutter ved 4000G, ikke lever op til anbefalingerne fra CLSI (16). Sættes dette studie i relation til dette bachelorprojekt, giver det en begrundet anledning til at undersøge, hvorvidt en centrifugeringskraft på blot 440Gmere i kun 2 minutter kan nedbringe thrombocyttallet tilstrækkeligt. Et andet studie har undersøgt thrombocyttallet i plasmafraktionen efter centrifugering ved 4000G i 1 minut (7). Af studiets resultater kan det konkluderes, at centrifugeringstiden i alt fald ikke kan nedsættes yderligere end de nuværende 2 minutter, da studiets resultater påviser, at thrombocyttallet i plasmafraktionen overskrider 10x10 9 /L ved centrifugering ved 4000G i 1 minut (7). Ingen af de omtalte studier omtaler dog thrombocyttallets interferens på holdbarheden af analyserne, så hvorvidt det reelt har en betydning, Side 44 af 57

45 for dette projekts egentlige formål, er tvivlsomt. Thrombocyttallet refererer derimod til korrektheden på analyseresultatet, da der er påvist en sammenhæng mellem thrombocyttallet i plasma og surface-activated clotting time (SACT), som anses for at være en pålidelig markør til at vurdere kvaliteten af prøvematerialet til koagulationsanalyser (16). Det er påfaldende, at et studie af Lippi et al. påpeger, at det frafrådes, at centrifugere koagulationsprøver ved en centrifugeringskraft på over 2000G, da det er påvist, at denne høje centrifugeringskraft kan medføre analytisk interferens i form af hæmolyse og aktivering af thrombocytter (17). Det skal i den forbindelse pointeres, at også rutinecentrifugen anvender en centrifugeringskraft over denne anbefalede grænse på 2000G, dog kun med en afvigelse på 200G mens StatSpin Express 2 afviger med 2440G. Et andet studie af Kao et al. har dog påvist, at der er god korrelation mellem INR- og APTT-resultater på prøver, som er centrifugeret over 2000G og på prøver, som er centrifugeret under 2000 g (7). Prøverne blev i studiet centrifugeret ved 1500G i 15 minutter og ved 3700G i 1 minut og derefter blev INR og APTT målt, og resultaterne viste ingen signifikant forskel mellem analyseresultaterne (7). Studiet af Kao et al. konkluderer således, at en centrifugeringskraft over 2000G ikke interfererer på analysesvaret. Det tydeliggøres dermed, at der i litteraturen ikke er entydige resultater af centrifugeringskraften og centrifugeringtidens interferens på resultater af koagulationsanalyser. StatSpin Express 2 centrifugerer prøverne ved en fast vinkel, hvilket CLSI samt studiet af Kao et al. fraråder, idet man risikerer remixing af thrombocytter og plasma, når prøverne transporteres i lodret position (1,7). Kao et al. dokumenter yderligere, at prøver, som er centrifugeret ved fast vinkel, skal analyseres senest 10 minutter efter endt centrifugering for at undgå, at remixing interferer analysesvaret (7). Dette stiller således spørgsmålstegn ved, hvorvidt de observerede differenser i dette forsøg skyldes enten analytisk variation eller en ændring som resultat af naturligt henfald/metabolisme eller som et resultat af remixing. Modsat rutinecentrifugen er StatSpin Express 2 ikke temperaturreguleret, og CLSI anbefaler, at koagulationsprøver centrifugeres ved stuetemperatur (1). Idet at temperaturen ikke nøje kan kontrolleres under centrifugering på StatSpin Express 2, udgør det en risiko for at koagulationsprøverne, under centrifugering, udsættes for anden temperatur end stuetemperatur. Ud fra det faktum at koagulationsprøver er meget sensitiv overfor temperaturpåvirkning (7), anses dette deslige, som en mulig interfererende faktor ved brug af StatSpin Express 2 til centrifugering af koagulationsprøver. Side 45 af 57

46 5. Konklusion På baggrund af præsenterede og diskuterede resultater har det været muligt at besvare den opstillede problemformulering, hvoraf følgende kan konkluderes angående holdbarheden af prøvematerialet efter centrifugering på StatSpin Express 2. For INR kan det konkluderes, at kvaliteten af analyseresultaterne er acceptable efter henstand i 24 timer. I henhold til referenceintervallet for INR, som er <1,2 rel. tid, kan det, på baggrund af forsøgets resultater, konkluderes, at analyseresultaterne holder sig meget stabile i dette niveau. Dog muliggør resultaterne af dette forsøg ikke en konklusion om, at det samme er gældende for INR i det terapeutiske niveau (2-3 rel. tid) for patienter i behandling med vitamin-k-antagonister, da prøveantallet i dette niveau er for lavt. Forsøgets resultater for fibrinogen bidrager til en konklusion om, at kvaliteten af analysesvarene er acceptable efter henstand i 24 timer. Resultaterne, som er opnået i dette forsøg for APTT, vurderes at være acceptable efter henstand i 4 timer. Forsøget danner dog ikke et repræsentativt grundlag for at vurdere analysekvaliteten omkring niveau 38 sekunder, som er det klinisk interessante niveau for APTT. Resultaterne for AT efterlader et tvivlsspørgsmål om, hvorvidt kvaliteten af analysesvaret kan accepteres efter henstand i 4 timer, grundet en påfaldende stigende tendens omkring det klinisk interessante niveau på 0,8 arb. enhed. Slutteligt kan det således konkluderes, at på baggrund af de opnåede resultater, vurderes der at være en acceptabel overensstemmelse mellem holdbarheden for INR, fibrinogen og APTT efter centrifugering på hhv. rutinecentrifugen og på StatSpin Express 2. Dog dækker de opnåede analyseresultater ikke alle niveauer, og derfor kan denne overensstemmelse ikke konkluderes, at være gældende i alle niveauer. 6. Perspektivering Projektet ønskedes udført med henblik på at undersøge mulighederne for at lette proceduren for bioanalytikeren i forbindelse med efterbestillinger på koagulationsprøver, hvilket også vil kunne minimere risikoen for præanalytiske fejl. Holdbarheden af prøvemateriale er en essentiel del af bioanalytikerens viden for at opretholde kvalitet i laboratoriearbejdet, herunder at sikre kvaliteten af de analysesvar, som afgives. Projektets resultater kan således virke, som et diskussionsgrundlag for implementering af nye holdbarhedstider for analyserne INR, fibrinogen, APTT og AT. I laboratoriet har en viden om analysernes holdbarhed og evt. implementering af nye holdbarhedstider, for de nævnte analyser, en betydning for den logistiske og praktiske tilrettelæggelse i laboratoriet. Implementering af de hold- Side 46 af 57

47 barhedstider, som er bestemt i dette projekt, vil kunne lette proceduren ved efterbestillinger af INR, fibrinogen og APTT, da ingen af de opnåede analyseresultater i forsøget, vurderes som uacceptable for de respektive analyser. Dog stiller forsøget spørgsmålstegn ved holdbarhedstiden for AT efter centrifugering på StatSpin Express 2, hvilket gør, at bioanalytikeren fortsat skal forholde dig til to holdbarhedstider ved efterbestilling af AT. På baggrund af forsøgets resultater, vurderes der at være en påfaldende tendens omkring niveau 0,8 arb. enhed for AT, men hvorvidt denne tendens er kritisk eller ej, konkluderes ikke endeligt. Denne usikkerhed mht. AT gør, at det kunne være relevant at udvide forsøget for AT, således at holdbarheden vurderes på baggrund af flere målinger, så det dermed sikres, at der ligger tilstrækkeligt med viden og erfaring til grund for at implementere en ny holdbarhedstid for AT efter centrifugering på StatSpin Express 2. Ligeledes kunne det også være relevant at udvide forsøget for INR og APTT, således at man opnår resultater, der kan bidrage til en optimal vurdering af holdbarheden i de niveauer, som er af særlig klinisk betydning. Pga. manglende resultater i de nævnte niveauer, vurderes dette projekt ikke som værende tilstrækkeligt argument til at implementere nye holdbarheder i hverdagen. Dette projekt anses derimod som et udgangspunkt for yderligere undersøgelse af problemstillingen. Bioanalytikernes fagforening, dbio, fremlægger en artikel i foreningens fagblad, hvori der udtales, at bioanalytikere i dag arbejder hurtigere og mere intenst end nogensinde. Opgaverne bliver mere koncentrationskrævende, og samtidig øges kravene om kvalitets- og kontrolforanstaltninger (18). Med det øgede arbejdspres stilles der store krav til bioanalytikerens evne til at kunne rumme mange arbejdsopgaver, hvorfor det er forståeligt, at visse procedurer, såsom den der refereres til i dette projekt, kan forglemmes midt i mængden af mange opgaver. Det er derfor relevant at undersøge, hvilke belastende arbejdsopgaver, som kan filtreres væk for bioanalytikeren, således der ikke bruges ressourcer på unødvendige områder. Dette projekt medfører ikke, i dets nuværende form, at bioanalytikeren blot skal forholde sig til én holdbarhedstid for de respektive analyser. Dog bidrager projektets resultater til en formodning om, at analysekvaliteten for INR, fibrinogen og APTT er acceptabelt efter henstand i hhv. 24 timer, 24 timer og 4 timer, og i så fald at dette kan endelig bekræftes af yderligere undersøgelse eller vurdering af andet kompetent personale, vil det alt andet lige lette proceduren væsentligt for bioanalytiken. Det vil i så fald betyde, at bioanalytikeren kun mht. efterbestilling på AT skal forholde sig til to holdbarhedstider. Ud fra mit kendskab til koagulationsområdet er hyppigheden af efterbestilling på AT meget lille, hvorfor det vil være en problemstilling, som sjældent vil blive aktuel. Side 47 af 57

48 7. Litteraturliste (1) Adcock DM, Hoefner DM, Kottke-Marchant K, Marlar RA, Szamosi DI, Warunek DJ. H21-A4: Collection, transport, and processing of Blood Specimens for Testing Plasmabased Coagulation Assay and Molecular Haemostasis Assay; Approved Guideline - Fourth Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute 2003;23(35). (2) Sultan A. Five-minute preparation of platelet-poor plasma for routine coagulation testing. East Mediterr Health J 2010 Feb;16(2): (3) Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE. Chapter 22: Platelets, blood coagulation and heamostasis. Haematology. Fifth edition ed.: Blackwell Publishing; p (4) Sand O, Sjaastad ØV, Haug E, Bjålie JG. Menneskets anatomi og fysiologi. 2. udgave ed. København: Gads forlag; (5) Karle H, Birgens H. Hæmatologi. 5. udgave ed. København: Munksgaard Danmark; (6) Lyngbye J. Klinisk Biokemi. Lyngbyes laboratoriemedicin. 2.th ed. København: Nyt nordisk forlag arnold busck; p. 48. (7) Kao C, Shu L, Yen W. Evaluation of a High-speed Centrifuge with Rapid Preparation of Plasma for Coagulation Testing to Improve Turnaround Time J Biomed Lab Sci 2010;22(1):23. (8) Kjærsgaard E, Jørgensen N, Hippe E. Laboratorieundersøgelser - deres kemiske og kliniske betydning. 4.th ed. Copenhagen: Fadl; (9) Widimsky P, Budesinsky T, Vorac D, Groch L, Zelizko M, Aschermann M, et al. Long distance transport for primary angioplasty vs immediate thrombolysis in acute myocardial infarction. Final results of the randomized national multicentre trial--prague-2. Eur Heart J 2003 Jan;24(1): (10) Diagnostica Stago S.A.S. Indlægsseddel fra STA-FIBRINOGEN reagenskittet. (11) Diagnostica Stago S.A.S. Indlægsseddel fra STA-SPA+ reagenskittet. (12) Diagnostica Stago S.A.S. Indlægsseddel fra STA-PTT reagenskittet. (13) Diagnostica Stago S.A.S. Indlægsseddel fra STA-STACHROM ATIII reagenskittet. (14) Favaloro E, Funk D, Lippi G. Pre-analytical Variables in Coagulation Testing Associated With Diagnistic Errors in Haemostasis. LabMedicine 2012;43:1. (15) Laga AC, Cheves TA, Sweeney JD. The effect of specimen hemolysis on coagulation test results. Am J Clin Pathol 2006 Nov;126(5): Side 48 af 57

49 (16) Dimeski G, Solano C, Petroff MK, Hynd M. Centrifugation protocols: tests to determine optimal lithium heparin and citrate plasma sample quality. Ann Clin Biochem 2011 May;48(Pt 3): (17) Lippi G, Salvagno GL, Montagnana M, Manzato F, Guidi GC. Influence of the centrifuge time of primary plasma tubes on routine coagulation testing. Blood Coagul Fibrinolysis 2007 Jul;18(5): (18) Hansen AL. Hjernen har brug for luft. 2007, dbio. (19) Dansk selskab for apopleksi (dsfa) (set december 2012). Tilgængelig fra URL: E-dok dokumenter: Følgende er fra: Hospitalsenheden Vest, Region Midtjylland. Dokumenthåndbog Klinisk Biokemisk Afdeling: (20) Analysefortegnelse for P-Koagulationsfaktor (INR) (set december 2012). Tilgængelig fra: URL: (21) Analysefortegnelse for P-Fibrinogen (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (22) Blodprøvetagning udenfor morgenrutinen (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (23) Afprøvning af centrifugen StatSpin Express 2 (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (24) Apparaturvejledning STA-R Evolution RHL (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (25) Prøvemateriale til KBA HEV (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (26) Prøvetagning af veneblod (set december 2012). Tilgængelig fra URL: Side 49 af 57

50 (27) Blodprøvetagning på patienter med drop/kateter (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (28) Prøvematerialer til metodeudvikling mm. (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (29) Mål for analysekvalitet-acceptkriterier samt korrigerende handling koagulation (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (30) QC vejledning STA-R Evolution RHL (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (31) Prøvefordeling i dagtiden (set december 2012). Tilgængelig fra URL: Følgende er fra: Hospitalsenheden Vest, Region Midtjylland. Laboratoriehåndbog Klinisk Biokemisk Afdeling: (32) P-Fibrinogen (det december 2012). Tilgængelig fra URL: (33) P-koagulationsfaktorer (APTT) (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (34) P-koagulationsfaktorer 2,7,10 (INR) (set december 2012). Tilgængelig fra URL: (35) P-Antithrombin (Thrombinmetode)(set december 2012). Tilgængelig fra URL: Side 50 af 57

51 Bilag 1: Resultater af godkendelseskontroller INR Materiale OKP 167 Lotnummer Target 2,69 rel. tid SD 0,135 Dato Værdi (rel. tid) Bemærkninger 10/ ,72 Samme reagens. Prøve nr. 11/ , kørt på dette. 11/ ,68 Samme reagens. Prøve nr. 12/ , kørt på dette. 15/ ,69 Samme reagens. Prøve nr. 16/ , kørt på dette. 17/ ,64 Samme reagens. Prøve nr. 18/ , kørt på dette. INR Materiale OKP 167 Lotnummer Target 2,63 rel. tid SD 0,13 Dato Værdi (rel. tid) Bemærkninger 22/ ,68 Samme reagens. Prøve nr. 23/ , kørt på dette. 24/ ,72 Fibrinogen Materiale Scandinorm Lotnummer Target 2,3 g/l SD 0,12 Dato Værdi (g/l) Bemærkninger 10/ ,32 Samme reagens. Prøve nr. 11/ , kørt på dette. 11/ ,42 Samme reagens. Prøve nr. 12/ , kørt på dette. 15/ ,38 Samme reagens. Prøve nr. 16/ , kørt på dette. 17/ / ,38 2,40 Samme reagens. Prøve nr kørt på dette. Side 51 af 57

52 APTT Materiale Scandinorm Lotnummer Target 35,05 sek. SD 1,35 Dato Værdi (sek.) Bemærkninger 10/ ,9 10/ ,9 Samme reagens. Prøve nr. 10/ , kørt på dette. 10/ ,0 11/ ,3 11/ ,8 12/ ,9 12/ ,9 15/ ,4 16/ ,0 16/ ,0 17/ ,8 17/ ,2 17/ ,2 18/ ,6 18/ ,5 Samme reagens. Prøve nr kørt på dette. Samme reagens. Prøve nr kørt på dette. Samme reagens. Prøve nr kørt på dette. AT Materiale Scandinorm Lotnummer Target 0,836 rel. stofk. SD 0,044 Dato Værdi (rel. stofk.) Bemærkninger 10/ ,85 Prøve nr kørt på dette. 11/ ,83 12/ ,80 Samme reagens. Prøve nr. 15/ , kørt på dette. 16/ ,81 16/ ,82 17/ ,86 Samme reagens. Prøve nr. 18/ , kørt på dette. 22/ ,81 Prøve nr kørt på dette Side 52 af 57

53 Bilag 2: Resultater INR Alle værdier har følgende enhed: rel. tid Side 53 af 57

54 Bilag 3: Resultater Fibrinogen Alle værdier har følgende enhed: µmol/l Side 54 af 57