Spm. A: Hvad viser data i Figur 1?

Transkript

1 Opgave 1 Leptin er et plasma proteinhormon der primært produceres af og secerneres fra fedtceller (adipocytter). Leptin, der er kodet af ob (obecity) genet, er 16 kda stort. Leptins fysiologiske funktion er at regulere kropsvægt og energiforbrug. Den følgende opgave vil fokusere på aspekter af den molekylære mekanisme, der regulerer leptin syntese og sekretion. For at undersøge effekten af glukokortikoid hormon (Dexamethasone) og insulin på adipocytter blev der fremstillet de i Figur 1 viste northern blots. A B Figur 1: A, northern blot på RNA oprenset fra frisk isolerede rotte adipocytter der har været stimuleret in vitro i 2 timer med (+) eller uden (-) 100 nm insulin eller 100 nm Dexamethasone (Dex). Endvidere er vist resultatet af et northern blot, hvor adipocytterne har været stimuleret i 2 timer med både 100 nm insulin og 100nM Dexamethasone. Søjlediagrammet angivet en kvantificering af det viste northern blot. Den relative mængde ob transkript er angivet i arbitrære enheder efter normalisering til β-actin mrna mængden. B, kvantificering af den secernerede mængde leptin efter stimulering af adipocytter i 2 timer med (+) enten 100 nm insulin, 100 nm Dexamethasone eller begge. Resultaterne fra ustimulerede celler er angivet med (-). * og ** angiver at resultaterne er statistisk signifikante i forhold til kontrollerne (- insulin og Dexamethasone). Spm. A: Hvad viser data i Figur 1? For at få yderligere information omkring den molekylære mekanisme bag regulering af leptin ekspression blev de i Figur 2 viste forsøg lavet. C/EBPδ mrna 1

2 vides at have en meget kort halveringstid. Actinomycin D (Act.D) i den anvendte koncentration stopper transkriptionen øjeblikkeligt. A B Figur 2: A, frisk isolerede rotte adipocytter blev inkuberet i 30 minutter i vækstmedium uden (-) eller med (+) 500 nmol/l Actinomycin D. Dernæst blev vækstmediet erstattet af medium indeholdende 100 nm insulin (I), 100 nm dexamethasone (D) eller hverken (C) insulin eller Dexamethasone. Efter 2 timer blev der isoleret RNA fra alle adipocytter og fremstillet det viste northern blot med en ob specifik probe, en C/EBPδ specifik probe og en β-actin specifik probe. Den relative mængde ob mrna (ob mrna/β-actin mrna) opnået ved kvantificering af northern blottet er vist som et søjlediagram. B, mængden af leptin der blev secerneret til vækstmediet under den i A beskrevne 2 timers stimulation med insulin, Dexamethasone eller under de ustimulerede omstændigheder blev bestemt immunologisk. *, ** angiver at de markerede resultater er statistisk signifikante i forhold til kontrollen (C i fravær af Actinomycin). Spm. B: Hvad viser data i Figur 2? Spm. C: Beskriv rationalet bag anvendelse af en C/EBPδ specifik probe i northern blottet i Figur 2. For at undersøge hvorledes sult og insulin påvirker adipocytterne, blev der fremstillet de i Figur 3 og 4 viste eksperimenter. 2

3 Figur 3: Adipocytter blev isoleret fra rotter, der havede sultet (starved) eller ikke sultet (fed) i 12 timer. Adipocytterne blev dyrket in vitro under sultende og ikke-sultende omstændigheder. Det intracellulære niveau (tissue leptin content) af leptin i de frisk isolerede adipocytter samt den over 3 timer secernerede leptin (leptin release in 3h) under in vitro dyrkning blev bestemt for både sultende og ikke-sultende adipocytter.**, angiver at resultatet er statistisk signifikant i forhold til situationen med ikke-sultede celler. Den gennemsnitlige intracellulære koncentration af leptin og den gennemsnitlige secernerede mængde leptin er angivet over hver søjle som ng leptin per 10 7 celler +/- spredning. 3

4 A B C Figur 4: A, friske adipocytter fra rotter der har sultet i 12 timer (starved) eller ikke har sultet (fed) blev dyrket i 2 timer med insulin eller uden insulin. Der blev høstet en portion celler umiddelbart før insulin tilsætning (sorte søjler). Resten af cellerne blev delt i to; den ene portion (stribede søjler) blev tilsat insulin og dyrket videre i to timer. Den anden portion (hvide søjler) blev ikke tilsat insulin, og dyrket videre i to timer. Der blev isoleret RNA fra alle adipocytter, og der blev fremstillet et northern blot med en leptin specifik probe. Leptin båndet er vist med en pil. Endvidere blev RNAet separeret i en agarosegel og mængden af 18S RNA kvantificeret. Søjlediagrammet under northern blottet angiver mængden af leptin RNA normaliseret til mængden af 18S RNA i de forskellige adipocytceller. Den relative leptin RNA mængde er angivet over hver søjle. B, frisk isolerede adipocytter fra sultede (starved) eller ikke-sultede (fed) rotter blev dyrket in vitro med (skraverede søjler) eller uden (hvide søjler) insulin i en time. Herefter blev adipocytter dyrket i medium med [ 35 S]-methionin/cystein i 45 minutter. Leptin i vækstmediet og i adipocytterne blev immunoprecipiteret med et anti-leptin antistof. Immunoprecipitatet blev separeret ved SDS-PAGE og analyseret ved PhosphorImage analyse. Det øverste billede viser resultatet af et sådant forsøg. Resultatet fra kvantificering af flere PhosphorImage analyser er vist i søjlediagrammet som middelværdi +/- spredning. Mængden af syntetiseret leptin protein er angivet i arbitrære enheder. C, resultat af et forsøg udført som under B, blot er der immunoprecipiteret med et anti-lpl antitof. LPL (lipoprotein-lipase) proteinet vides at være udtrykt uafhængigt af sult og afhængigt af insulin. 4

5 Spm. D: Hvad viser data i Figur 3 og 4? Cytoplasmatiske ekstrakter fra adipocytter isoleret fra rotter, der havde sultet i 12 timer eller fra rotter der ikke havde sultet, blev separeret i 10-50% sukrosegradienter. Gradienterne blev separeret i 14 fraktioner af hver 1 ml hvis UV absorption ved 260 nm blev bestemt. Endvidere blev der isoleret RNA fra 12 af disse fraktioner. RNAet blev revers transkriberet til cdna, som blev PCR amplificeret med leptin specifikke primere. Resultaterne af disse forsøg er vist i Figur 5. Figur 5: A, agarose gelelektroforese af RNA isoleret fra 1 ml fraktioner udtaget fra sukrosegradient-fraktioneret cytosol fraktioner fra adipocytter isoleret fra rotter, der har sultet i 12 timer (starved) eller fra ikke-sultende rotter (fed). Positionerne af 18S og 28S RNA er angivet med pile. B, absorptionen ved 260nm i de 14 udtagne fraktioner fra sultede (starved) eller ikke-sultede (fed) rotter. Pile angiver at kun fraktion 2 til 13 er anvendt til den videre analyse (hvor de kaldes fraktion 1-12).C, resultat af PCR amplifikation af revers transkriberet RNA fra de forskellige sukrose-gradient-fraktioner fra adipocytter fra sultede (starved) eller ikke sultede (fed) rotter. D, kvantificering af blottet fra C. Det er angivet, hvor stor en procentdel af den samlede mængde leptin mrna, der findes i hver fraktion. Spm. E: Hvad viser data i Figur 5? 5

6 Adipocytter fra rotter, der havde sultet i 12 timer, blev dyrket in vitro i 3 timer i fravær eller tilstedeværelse af insulin. Cytosolfraktioner fra disse celler blev separeret i 10-50% sukrosegradienter. Resultaterne af disse forsøg er vist i Figur 6. Figur 6: Adipocytter fra rotter, der havde sultet i 12 timer, blev dyrket i 3 timer in vitro i tilstedeværelse af insulin (insulin) eller i fravær af insulin (basal). Cytosolfraktioner fra disse adipocytter blev separeret i 10-50% sukrosegradienter ved ultracentrifugering. B, gradienterne blev opdelt i 14 fraktioner, og absorptionen ved 260nm blev bestemt i hver fraktion. Pile angiver, at kun fraktionerne fra 2 til 13 blev anvendt i den videre analyse (hvor de kaldes 1-12). A, agarose gelektroforese af RNA indholdet i de undersøgte 12 fraktioner. Positionen af 18S og 28S RNA er angivet. C, resultatet af PCR amplifikationer af cdna fremstillet ved revers transkription af RNA i de enkelte fraktioner. Der er brugt leptin specifikke primere til amplifikationen. D, den procentvise fordeling af leptin mrna i de undersøgte 12 fraktioner. Spm. F: Hvad viser data i figur 6? Der blev fremstillet en række reporterkonstruktioner baseret på vektoren pgl3, Figur 7. Strukturen af disse reporterkonstruktioner er vist i Figur 8. Endvidere er vist resultaterne opnået efter transient transfektion af adipocytter med de forskellige reporterkonstruktioner. Alle transfektioner er lavet som co-transfektioner med plasmidet prl-tk, som konstitutivt udtrykker et andet luciferasegen (fra Renilla) end reporterkonstruktionerne. Aktiviteterne af de to luciferaseproteiner kan måles i det samme celleekstrakt uafhængigt af hinanden. 6

7 Figur 7: pgl3 control, der er anvendt til de i Figur 8 viste reporterkonstruktioner, indeholder en stærk SV40 promoter og enhancer, samt et SV40 poly-adenyleringssignal, der sikrer korrekt processering af luciferase mrnaet. De 5 UTR og 3 UTR fragmenter fra leptin cdna, der er indsat i vektoren, sidder mellem SV40 promotoren og luciferase cdnaet s 5 ende henholdsvis mellem luciferase cdnaet s 3 ende og SV40 poly-adenyleringssignalet. 7

8 Figur 8: A, strukturen af 3 UTR af leptin mrna, med angivelse af et element (UUAUUUAUU i mrnaet) som er konserveret mellem mus (M) og menneske (H). Nukleotider i 3 UTR er angivet relativt til det første nukleotid efter TAG termineringskodon. Endvidere er udstrækningen af de 3 UTR fragmenter, der er brugt til fremstilling af reporterkonstruktionerne i B angivet. Hele leptin 5 UTR, som er 56 bp langt, er brugt til de konstruktioner, der indeholder 5 UTR sekvens. C og D angiver resultaterne fra transient transfektion af adipocytter med de i B viste plasmider. Alle luciferaseaktiviteter er normaliseret til den samme transfektionseffektivitet (luciferase aktivitet fra reportergenet/luciferase aktivitet fra den konstitutivt udtrykte Renilla luciferase). I E er vist resultaterne for transficerede adipocytter stimuleret med insulin eller ikke stimulerede (basal). Endvidere er angivet resultatet af agarosegel-elektroforese af PCR amplificeret luciferase cdna fremstillet ved revers transkription af total RNA isoleret fra samtlige transient transficerede adipocytter. Mock, angiver celler der ikke har været transficeret. Spm. G: Hvad viser data i figur 8? 8