Maxwell CSC RNA FFPE Kit

Transkript

1 TEKNISK VEJLEDNING Maxwell CSC RNA FFPE Kit Brugsanvisning for produktet AS1360 Forsigtig: Håndter cartridges forsigtigt; kanterne af forseglingen kan være skarpe. BRUGSANVISNING FOR PRODUKTET AS Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Revideret 10/18 TM404

2 Maxwell CSC RNA FFPE Kit Al teknisk litteratur er tilgængelig på: Du er velkommen til at besøge vores websted, hvor du kan verificere, at du anvender den nyeste version af denne tekniske vejledning. Kontakt teknisk service hos Promega via , hvis du har spørgsmål om brugen af dette system: 1. Beskrivelse Produktkomponenter, opbevaringsforhold og symboler Tilsigtet anvendelse af produktet Begrænsninger i brugen Inden du går i gang A. Klargøring af FFPE prøver B. Forberedelse af Maxwell FFPE cartridges Instrumentprocedure Post-oprensning Fejlfinding Appendiks A. Etablering af et ribonukleosefrit miljø B. Reference Liste over ændringer The Maxwell CSC RNA FFPE Kit fås kun i bestemte lande. Dette produkt opfylder de grundlæggende krav i EU-direktiv 98/79/EF vedrørende medicinsk udstyr til in vitro diagnostik. 1. Beskrivelse Maxwell CSC RNA FFPE Kit benyttes sammen med Maxwell CSC instrumentet og er en nem metode til effektiv, automatisk oprensning af RNA fra humane FFPE (formalin-fikserede, paraffin-indkapslede) vævsprøver fra bryst, lunge eller tyktarm. Maxwell CSC instrumentet leveres med forprogrammerede oprensningsmetoder. Det er beregnet til brug med prædispenserede reagenscartridges og yderligere reagenser, der leveres med kittet, hvilket maksimerer enkeltheden og bekvemmeligheden. Instrumentet kan behandle op til 16 prøver på mindre end 60 minutter, og det oprensede RNA kan benyttes direkte i en lang række efterfølgende, forstærker-baserede applikationer så som RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

3 1. Beskrivelse (fortsat) Maxwell CSC RNA FFPE Kit oprenser nukleinsyre ved hjælp af paramagnetiske partikler, som giver en mobil fast fase, som optimerer prøvetagning, vask og oprensning af RNA. Maxwell CSC instrumentet er håndteringsinstrument for magnetisk partikel. Dette system muliggør effektiv binding af RNA til de paramagnetiske partikler i den første brønd i en prædispenseret cartridge og fører prøven gennem cartridgens brønde og omrører under behandlingen. Denne metode med magnetisk indsamling undgår normale problemer med håndteringssystemer til væsker så som tilstoppede spidser eller partiel overføring af reagenser, som medfører en suboptimal rensningsproces, som det er tilfældet for andre udbredte, automatiserede systemer. 2. Produktkomponenter, opbevaringsforhold og symboler PRODUKT STØRRELSE KAT.# Maxwell CSC RNA FFPE Kit 48 preps AS1360 Til in vitro diagnostik. Kun til professionel anvendelse. Tilstrækkelig til 48 automatiserede isoleringer fra FFPE prøver. Maxwell CSC cartridges er kun beregnet til éngangsbrug. 15 C 30 C 6010TB 48 Indhold: 25ml Mineral Oil 20ml Lysis Buffer 2 1ml Proteinase K 100µl Blue Dye 2 1ml MnCl 2, 0.09M 1ml DNase Buffer 3 vials DNase I (lyophilized) 48 Maxwell FFPE Cartridges 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) 25ml Nuclease-Free Water Opbevaringsforhold: Maxwell CSC RNA FFPE Kit opbevares ved omgivelsestemperatur (15 30 C). Rehydreret DNase I opbevares ved 10 til 30 C. Må ikke fryses og optøs mere end 10 gange. Sikkerhedsinformation: Reagenscartridges indeholder etanol og isopropanol. Disse stoffer er brændbare, skadelige og irriterende. Maxwell CSC cartridges er beregnet til brug med potentielt infektiøse stoffer. Brugerne skal bære korrekt beskyttelsesudstyr (f.eks. handsker og beskyttelsesbriller) under håndteringen af infektiøse stoffer. Brugerne skal overholde institutionens retningslinjer vedrørende håndtering og bortskaffelse af alle infektiøse stoffer, som anvendes med dette system. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

4 Forsigtig: Håndter cartridges forsigtigt; kanterne af forseglingen kan være skarpe. Supplerende information: Maxwell CSC RNA FFPE Kit komponenterne er beregnet til og kvalitetskontrolleret til at fungere sammen. Det frarådes at blande kit-komponenter fra forskellige kits. Brug kun de komponenter, der findes i det pågældende kit. Symbolforklaring Symbol Forklaring Symbol Forklaring Medicinsk udstyr til in vitro diagnostik Repræsentant 15 C 30 C Opbevares ved C Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Fabrikant Forsigtig Irriterende Karcinogen Indeholder tilstrækkeligt til n tests Conformité Européenne Advarsel. Biologisk betinget fare. Advarsel. Klemningsfare. Bestillingsnummer Lotnummer Må ikke genbruges Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

5 3. Tilsigtet anvendelse af produktet Maxwell CSC RNA FFPE Kit er beregnet til brug sammen med Maxwell CSC instrumentet og Maxwell CSC RNA FFPE oprensningsmetoden som et medicinsk udstyr til in vitro diagnostik (IVD) til at foretage automatisk isolation af RNA fra humane FFPE (formalin-fikserede, paraffin-indkapslede) vævsprøver fra bryst, lunge eller tyktarm. Det oprensede RNA er egnet til brug i forstærker-baserede in vitro diagnoseprocedurer. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er beregnet til brug ved en temperatur på C. Brug uden for dette temperaturinterval kan medføre suboptimale resultater. FFPE prøver, der er forberedt ved brug af 10% neutral-bufferet formalin kan benyttes til Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er ikke beregnet til brug som en del af en specifik diagnostisk test. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er kun beregnet til professionel brug. De diagnostiske resultater, som opnås ved brug af RNA, der er oprenset med dette system, skal fortolkes sammen med andre kliniske data eller laboratoriedata. 4. Begrænsninger i brugen Maxwell CSC RNA FFPE Kit er kun beregnet til brug med humane FFPE vævsprøver fra bryst, lunge eller tyktarm. Det er ikke beregnet til brug med ikke-ffpe vævsprøver, så som friske eller frosne vævsprøver, eller med FFPE vævsprøver fra andre steder end humant bryst, lunge eller tyktarm. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er ikke beregnet til brug med andre typer af prøver, herunder ikke-humane prøver, eller til oprensning af DNA. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er ikke beregnet til brug med vævsprøver, der er forberedt med andre fixativer end 10% neutral-bufferet formalin. Maxwell CSC RNA FFPE Kit præstationerne er evalueret ved at isolere RNA fra FFPE vævsprøver med størrelser fra 0,1 2,0mm 3.. Det er ikke beregnet til brug med prøver uden for dette interval. Brugeren er ansvarlig for etableringen af de ydelseskarakteristika, der er nødvendige for efterfølgende diagnostiske anvendelser. Der skal inkluderes kontroller i alle efterfølgende diagnostiske anvendelser, som gør brug af RNA, der er oprenset vha. Maxwell CSC RNA FFPE Kit. 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

6 5. Inden du går i gang Materialer, som skal leveres af brugeren mikrocentrifuge pipetter og pipettespidser til forberedelse af prøver og overføring af prøver til på forhånd fyldte reagenscartridges 1,5 2,0 ml prøveglas til inkubering af prøver (f.eks. Microtubes, 1,5 ml; Cat.# V1231) varmeblokke indstillet til 56 C og til 80 C (Bemærk: Varmeblokken skal indstilles til den påkrævede temperatur. Varmeblokkens temperatur skal måles med et kalibreret termometer. Kontroller, at temperaturen er nøjagtig inden for termometrets fejlmargin). FFPE-prøver med et samlet vævsvolumen på 0,1 2,0mm 3 ; tykkelsen af sektionen må ikke overstige 5 µm (Bemærk: Prøverne skal opbevares ved rumtemperatur [15 30 C].) barberblade (Bemærk: Vær forsigtig ved brug af barberblade til at skrabe prøver af objektglasset). Om nødvendigt rekonstitueres et lyfoliseret hætteglas med DNase I med 275 µl nukleasefrit vand. Vend hætteglasset for at skylle DNase I af undersiden af låget, og omryst det forsigtigt; brug ikke en vortex-mixer. 5.A. Klargøring af FFPE prøver Forbehandling af sektionsprøver 1. Placer sektionen i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Hvis der benyttes vævssektioner på objektglas, skrabes sektionen af glasset med et rent barberblad. 2. Tilsæt 300 µl mineralolie til vævsglassene. Kør glasset i vortex-mixeren i 10 sekunder. 3. Opvarm prøverne til 80 C i 2 minutter. Placer prøverne ved rumtemperatur, mens masterblandingen forberedes. 4. Forbered en masterblanding af lysisbufferen, proteinase K og blåt farvestof som vist herunder: Reagens Mængde/reaktioner Reaktioner (antal der skal behandles + +1) Total Lysisbuffer 224 µl n µl (n+1) Proteinase K 25 µl n+1 25 µl (n+1) Blåt farvestof 1µl n+1 1 µl (n+1) 5. Tilsæt 250 µl af masterblandingen til hvert prøveglas, og kør dem i vortex-mixeren i 5 sekunder. 6. Centrifuger prøveglassene ved 10,000 g i 20 sekunder for at separere lagene. Hvis der kan ses en kugle i vandlaget (det nederste, blå lag), omrøres forsigtigt for at opløse kuglen. Lad begge faser forblive i glasset. 7. Placer prøveglassene i en varmeblok på 56 C, og inkuber dem i 15 minutter. 8. Placer prøveglassene i en varmeblok på 80 C, og inkuber dem i 1 time. 9. Fjern prøveglassene fra varmeblokken, og lad prøverne afkøle til rumtemperatur i 15 minutter. Mens prøverne afkøles, forberedes DNase blandingen som beskrevet i trin 10. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

7 5.A. Klargøring af FFPE prøver (fortsat) 10. Klargør en blanding af MnCl 2, DNase buffer og DNase I i den rækkefølge, der angives herunder: Reagens 1 Mængde/reaktioner Reaktioner (antal der skal behandles + +1) Total MnCl 2, 0,09 M 26 µl n+1 26 µl (n+1) DNase buffer 2 14 µl n+1 14 µl (n+1) DNase I 3 10 µl n+1 10 µl (n+1) 1 Hvis reagenserne i DNase blandingen tilsættes enkeltvis til prøveglassene, skal de tilsættes i den rækkefølge, der er vist herover. Ibland hver enkel reagens ved grundig pippettering, inden næste reagens tilsættes. 2 Opbevar DNase buffer ved C; det kan bundfælde, hvis det opbevares ved lavere temperaturer. Hvis bufferen indeholder bundfald,: opløs bundfaldet igen ved at opvarme til 56 C i 2 minutter efterfulgt af kortvarig kørsel i vortex-mixer for at blande. 3 Opbevar resterende rekonstitueret DNase I ved 30 til 10 C. 11. Tilsæt 50 µl DNase blanding til hvert prøveglas. Omrør ved at pipettere 10 gange. 12. Inkuber prøveglasset i 15 minutter ved rumtemperatur (15 30 C). 13. Centrifuger prøveglassene ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge i 5 minutter. 14. Overfør straks den blå væskefase til brønd nr. 1 i en Maxwell CSC cartridge. Se afsnit 5.B. om forberedelse af cartridges. 5.B. Forberedelse af Maxwell FFPE cartridges 1. Skift handsker inden håndtering af Maxwell CSC cartridges, CSC/RSC plungers og elueringsrør. Cartridges placeres på Maxwell CSC bakken uden for instrumentet, og bakken med cartridges og prøverne føres derpå ind i instrumentet til oprensning. Placer de cartridges, der skal benyttes, i Maxwell CSC bakken (fig. 2). Placer hver enkel cartridge i bakken med brønd nr. 1 (den største brønd i cartridge) længst væk fra elueringsrørene. Tryk cartridge ned og klik den fast. Kontroller, at begge ender af cartridge er helt på plads i bakken. Træk forsigtigt forseglingen tilbage, således at hele forseglingen fjernes fra toppen af cartridge. Sørg for at fjerne al forseglingstape og eventuelt tilbageværende klæbemiddel fra cartridge. Forsigtig: Cartridges skal håndteres forsigtigt. Kanterne af forseglingen kan være skarpe. 2. Anbring én plunger i brønd nr. 8 i hver cartridge. Bemærk: Der må kun bruges de plungers, der følger med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Plungers til Maxwell 16 LEV og SEV Kits er ikke kompatible med Maxwell CSC instrumentet. 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

8 3. Placer et tomt elueringsrør på elueringsrørpladsen for hver enkel cartridge i Maxwell CSC bakken. Bemærk: Der må kun bruges de elueringsrør, der følger med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Andre elueringsrør er muligvis ikke kompatible med Maxwell CSC instrumentet og kan påvirke RNA oprensningen. 4. Tilfør 50 µl nukleasefrit vand til bunden af hvert elueringsrør. Elueringsrørene skal forblive åbne under RNA oprensningen. Bemærk: Der må kun bruges det nukleasefrie vand, der følger med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Brug af andre elueringsbuffere kan evt. påvirke RNA oprensningen. Forberedelse af Maxwell FFPE cartridges 1. Anbring cartridges centralt på bakken, hvis du behandler færre end 16 prøver. 2. Tør spild af prøver eller reagens på Maxwell CSC bakken af som angivet i Maxwell CSC Instrument Manual. Anvend ikke blegemiddel på instrumentets dele Bindingsopløsning 2. Magnetiske partikler 3. Vaskeopløsning 4. Vaskeopløsning 5. Vaskeopløsning 6. Vaskeopløsning 7. Tom 8. Tom 11339TC Brugertilsætning til brønde 1. Forbehandlede prøver 8. CSC/RSC plunger Fig. 1. Maxwell CSC cartridge Denne illustration viser indholdet i en cartridge. En prøve af forberedt FFPE tilføres brønd nr. 1, og der placeres en plunger i brønd nr TB Fig. 2. Opsætning og konfiguration af Maxwell CSC bakke. Der tilsættes nukleasefrit vand til elueringsrørene som angivet. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

9 6. Instrumentprocedure Maxwell CSC RNA FFPE metoden kan downloades fra the Promega websiden: resources/tools/maxwellcscmethod. Se Maxwell CSC Methods Installation Technical Manual #TM401 for mere detaljeret information. Hvis du har mistanke om, at instrumentet kan være forurenet med RNase, renses instrumentet inden processen med en opløsning af sæbe så som Steris LpH. Følg anvisningerne i afsnittet Rengøring og vedligeholdelse i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. 1. Tænd for Maxwell CSC instrumenter og tablet-pcen. Instrumentets brugerinterface starter automatisk, og instrumentet gennemfører en selvkontrol og sætter alle bevægelige dele tilbage til udgangspositionen. 2. Vælg Start på hjem-skærmbilledet. 3. Scan eller indtast metode-stregkoden på Maxwell CSC RNA FFPE Kit mærkaten for automatisk at vælge den metode, der skal køre (fig. 3). Bemærk: Maxwell CSC RNA FFPE Kit metode-stregkoden kræves for at køre RNA oprensning på Maxwell CSC instrumentet. Kittets mærkat indeholder to stregkoder. Metode-stregkoden er vist i fig. 3. Hvis stregkoden ikke kan scannes, kontakt Promega Technical Services TA Fig. 3. Kit-mærkat, der viser den metode-stregkode, der skal scannes. Den røde ramme angiver den metodestregkode på mærkaten, der skal scannes for at starte en oprensningsprocedure. 4. Vælg de positioner i cartridges, der skal behandles (se Maxwell CSC Instrument Operating Manual), og indscan eller indtast manuelt de nødvendige informationer til sporing af prøverne. Fravælg evt. ubenyttede positioner. Vælg Fortsæt, når al information om prøverne er indlæst. 5. Verificer på tablet-pcen, at prøverne er påfyldt brønd nr. 1 i cartridges (som angivet i afsnit 5 A), at cartridges er indført i instrumentet, at elueringsrør med 50 μl nukleasefrit vand er isat og er åbne, og at plungers er placeret i brønd nr Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

10 6. Placer Maxwell CSC bakken med de forberedte cartridges på Maxwell CSC instrumentets platform. Kontroller, at bakken er anbragt således i Maxwell CSC instrumentet, at elueringsrørene er tættest på døren. Bakken kan kun være i instrumentet, når den vendes på denne måde. Kontroller at du har vendt bakken korrekt, hvis du har svært ved at anbringe bakken på platformen. Kontroller, at bakken står vandret på instrumentets platform. Bemærk: Hold Maxwell CSC bakken i siderne for at undgå at cartridges flytter sig fra deres plads i bakken. Advarsel: Klemningsfare. 7. Bekræft, at alle anførte forberedelser er udført, og tryk på Start for at lukke instrumentets dør og starte processen. 8. Maxwell CSC instrumentet starter oprensningsproceduren med det samme. Skærmen viser de udførte trin og den omtrentlige tid, der er tilbage af processen. Bemærk: Hvis processen standses, inden den er afsluttet, vasker instrumentet partiklerne af plungers og skubber plungers ned i brønd nr. 8 i cartridge. Prøverne går tabt. Forsøg ikke at oprense prøver igen, for hvilke instrumentproceduren blev afbrudt. 9. Når den automatiske oprensning er udført, vil tablet-pc-skærmen vise en meddelelse om, at metoden er afsluttet, End of Run (Proces afsluttet). Afslutning af processen 10. Følg skærminstruktionerne efter afslutning af metoden for at åbne døren. Kontroller, at plungers befinder sig i brønd nr. 8 i cartridges, når processen er afsluttet. Tag bakken ud af instrumentet, og tag de eluerede prøver ud af bakken. Hvis ikke alle plungers er fjernet fra plunger bar: Følg informationerne på skærmen for at foretage Clean-Up-proceduren for en afbrudt proces, eller vælg Clean-Up proceduren fra indstillingsskærmbilledet for en korrekt afsluttet proces for at fjerne de resterende plungers. 11. Tilluk og tag elueringsrørene med RNA ud af instrumentet straks efter afslutningen af processen for at forhindre fordampning af eluaterne. Tag Maxwell CSC bakken ud af instrumentet. Bemærk: Tag fat i bakkens sider, når den fjernes fra instrumentets platform. Sørg for at fjerne prøverne fra instrumentet, inden instrumentets UV-saniteringsprotokol køres, for at undgå at beskadige den oprensede nukelinsyre. RNA-prøver kan opbevares natten over ved 30 C til 10 C, eller under 60 C til længere tids opbevaring. 12. Fjern cartridges og plungers fra Maxwell CSC bakken, og bortskaf dem som farligt affald i henhold til din institutions procedurer. Cartridges, plungers og elueringsrør er beregnet til engangsbrug. Maxwell CSC cartridges, CSC/RSC plungers og elueringsrør må ikke genbruges. 7. Post-oprensning Verificer, at udbyttet og renheden af den oprensede RNA prøve opfylder de krav, der stilles af den efterfølgende diagnoseprocedure, inden den benyttes i den pågældende procedure. Kittets præstationer er evalueret på basis af oprensningen af forstærkningsbart RNA. Andre midler til kvantificering som absorbens eller binding af fluorescerende farvestof vil ikke nødvendigvis korrelere med forstærkning (1). Absorbensresultater for FFPEprøver kan overestimere udbyttet; vi anbefaler at benytte mere specifikke metoder til at bestemme udbyttet (1). Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

11 8. Fejlfinding Kontakt venligst det lokale Promega-filialkontor eller -distributør, hvis du har spørgsmål, som ikke behandles her. Kontaktinformation kan findes på: Symptomer Koncentrationen af RNA i eluatet er lavere end forventet (En typisk FFPE sektion bør give et udbytte af forstærkningsbar RNA afhængigt af vævsstørrelse, cellularitet, forholdene ved formalinfiksering og håndtering). Årsager og kommentarer Kittets præstationer er evalueret ved at isolere RNA fra FFPE vævsprøver med størrelser fra 0,1 mm 3 til 2,0 mm 3. Det er ikke konstrueret til prøver uden for dette interval. Brug sektioner, der ligger inden for dette interval. Kittet er beregnet til brug med humane FFPE vævsprøver fra bryst, lunge eller tyktarm. Det er ikke beregnet til brug med ikke-ffpe vævsprøver, så som friske eller frosne vævsprøver, eller med FFPE vævsprøver fra andre steder end humant bryst, lunge eller tyktarm. Inkubationstider og -temperaturer er kun testet for humant væv fra bryste, lunge og tyktarm. Brug kun humant væv fra bryst, lunge og tyktarm. Kittet er ikke beregnet til brug med vævsprøver, der er forberedt med andre fixativer end 10% neutral-bufferet formalin. Kontroller, at der ikke er brugt et alternativt fixativ. Der kan være tilsat RNaser under behandling eller kvantitation af prøverne. Se afsnit 9 for information om etablering af et ribonuklease-frit miljø. Den benyttede prøve var fra farvet objektglas eller sektion. Der garanteres ikke for farvede objektglas eller sektioner. Gentag oprensningen med ufarvet objektglas eller sektion. Kittets præstationer er evalueret på basis af oprensningen af forstærkningsbart RNA. Andre midler til kvantificering som absorbens eller binding af fluorescerende farvestof vil ikke nødvendigvis korrelere med forstærkning. Brug en forstærknings-kvantiteringsmetode til at evaluere udbyttet. 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

12 8. Fejlfinding (fortsat) Symptomer Kvaliteten er lavere end forventet. (Eluatet indeholder stærkt fragmenteret RNA eller inhibitorer for efterfølgende processer). DNA-forekomst i eluater. (Eluaterne er forurenet med DNA, som kan forstyrre efterfølgende tests.) Årsager og kommentarer Formalin-fixering og efterfølgende crosslink tilbageføring vil fragmentere RNA. Hvis RNA er fragmenteret inden ekstraktionsoprensningen, vil der blive oprenset fragmenteret RNA med dette kit. Gentag processen med en tilstødende sektion for at konstatere, om der er problemer med den valgte sektion eller med processen. Nogle forstærknings-tests er særdeles følsomme over for tilstedeværelsen af inhibitorer. Kontroller af efterfølgende tests bør identificere tilstedeværelsen af en forstærkningsinhibitor i eluatet. Det er brugerens ansvar at verificere kompatibiliteten af dette produkt med alle efterfølgende tests. DNase blandingen, der blev tilsat prøven, giver et overskud af DNase aktivitet, når det bruges sammen med FFPE-vævsprøver med størrelser fra 0,1 mm 3 til 2,0 mm 3. Den er ikke beregnet til prøver uden for dette interval og er muligvis ikke optimal. Brug sektioner, der ligger inden for dette interval. Utilstrækkelig omrøring af DNase blandingen i prøven under forberedelse af processen kan medføre ufuldstændig nedbrydning af DNA. Sørg for at blande DNase blandingen omhyggeligt i prøven. Hvis komponenterne i DNase blandingen tilsættes enkeltvis til prøven, skal de tilsættes i den rækkefølge, der er anført i afsnit 5.A, trin 10. Desuden skal hver enkel komponent iblandes omhyggeligt, når den tilsættes. Tilsætning af komponenterne i en anden rækkefølge eller ufuldstændig blanding kan inaktivere DNase. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

13 9. Appendiks 9.A. Etablering af et ribonukleosefrit miljø Ribonukleaser er særdeles vanskelige at inaktivere. Vær omhyggelig med at undgå introduktion af RNase aktivitet til RNA-prøverne under og efter isolering. Dette er særlig vigtig, hvis der kun findes en begrænset mængde udgangsmateriale. Følgende bemærkninger kan bidrage til at forebygge utilsigtet kontamination af prøverne med RNase. 1. To af de mest almindelige kilder til kontamination med RNase er brugerens hænder og bakterier eller sporer på luftbårne partikler. For at undgå kontamination fra disse kilder skal der benyttes aspetiske teknikker ved håndtering af de reagenser, der følger med dette system. Brug altid handsker. Skift altid handsker, hvis der kan være forekommet kontakt med ribonukleaser. 2. Brug altid sterilt, engangs plastudstyr til håndtering af RNA. Disse materialer er generelt fri for RNase, og de kræver ikke forbehandling for at inaktivere RNase. 3. Ikke-sterilt glasudstyr og plastudstyr skal behandles inden brugen for at sikre, at det er fri for RNase. Glasudstyr skal varmebehandles ved 200 C natten over, og plastudstyr skal skylles omhyggeligt med 0,1N NaOH, 1 mm EDTA efterfulgt af RNase-frit vand. Kommercielt tilgængelige produkter til fjernelse af RNase kan også benyttes i henhold til fabrikantens anvisninger. 4. Opløsninger, som ikke leveres sammen med systemet, behandles ved at tilsætte 0,1 % dietyl-pyrokarbonat (DEPC) i et stinkskab. De inkuberes natten over med omrøring ved rumtemperatur i stinkskabet. Autoklaveres i 30 minutter for at fjerne ethvert spor af DEPC. Forsigtig: DEPC mistænkes for at være et karcinogen, og det må kun benyttes i i et stinkskab. DEPC reagerer hurtigt med aminer og kan ikke bruges til at behandle Tris buffere. Bemærk: For alle efterfølgende processer er det afgørende, at man fortsætter med at beskytte RNAprøverne mod RNaser. 9.B. Reference 1. Bonin, S. et al. (2010) Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 457, Liste over ændringer Der er foretaget følgende ændringer i version 10/18 af dette dokument: 1. Opdateret til at indeholde kravene i EU IVD direktiv (98/79/EF). 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18

14 Promega Corporation. Alle rettigheder forbeholdes. Maxwell er et registreret varemærke tilhørende Promega Corporation. Produkterne kan være dækket af anmeldte eller udstedte patenter eller kan have visse begrænsninger. Du er velkommen til at besøge vores hjemmeside for yderligere information. Alle priser og specifikationer kan ændres uden forudgående varsel. Produktfordringer kan ændres. Kontakt teknisk service hos Promega eller gå ind i Promegas online-katalog for at få de mest aktuelle informationer om Promega-produkterne. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Toll Free in USA Fax TM404 Revideret 10/18