Adipøse stamcellers påvirkning på immunsystemet

Transkript

1 Adipøse stamcellers påvirkning på immunsystemet Stamceller dyrket i konditioneret medium tilsat dag 6 Udarbejdet af projektgruppe 418, 4. semester MedIS/Medicin 2013 Aya Stephanie Suganuma Alberts, Elisabeth Sophie Bech, Michael Gade, Sara Boelt Søgård Larsen og Line Koldsø Meincke 1

2 Titel: Adipøse stamcellers påvirkning på immunsystemet Projektperiode: 22/ / Projektgruppe: 418 Udarbejdet af: Aya Stephanie Suganuma Alberts Line Koldsø Meincke Sara Boelt Søgård Larsen Hovedvejleder: Lektor Ralf Agger Bivejledere: Lektor Trine Fink Ph.d.-studerende Romana Maric Ph.d.-studerende Simone Riis Antal sider: 92 inkl. bilag Antal bilag: 15 Antal oplag: 8 Elisabeth Sophie Bech Michael Gade Abstract Former studies have observed immunosuppressive characteristics of mesenchymal stem cells. In recent years, research on the properties of adipose stem cells has shown equivalent findings, particularly their inhibitory abilities on dendritic cells and its regulatory features regarding the immune response. To further study these immunomodulating effects, an experiment was conducted to establish whether adipose stem cells have an effect on dendritic cells through soluble factors in a conditioned medium added on day 6 and the extent of it. Monocyte-derived dendritic cells were cultured in vitro in human adipose stem cells, human embryonic kidney cells and standard medium respectively and the expression of specific cell surface markers were analyzed through flow cytometry. Except for a modest effect on the expression of the monocyte marker CD14, the results showed no altering on monocyte differentiation or on maturation of dendritic cells, thus suggesting the need of cell-cell interaction to obtain the immunosuppressive qualities desired for therapeutic use. 2

3 Forord Projektet Adipøse stamcellers påvirkning på immunsystemet er skrevet af 5 MedIS/medicinstuderende på Aalborg Universitet som et obligatorisk semesterprojekt på 4. semester i foråret Projektet er en del af et større projekt, hvor problemformuleringen lyder: Kan det påvises, at humane adipøse stamceller har en effekt på udvikling og modning af monocytderiverede dendritiske celler gennem udskilte faktorer i et konditioneret medium, og hvilket omfang har denne effekt i så fald? Projektet tager udgangspunkt i resultater fra dyrkning af celler i laboratoriet, både gruppens egne resultater og de andre delgruppers. På baggrund af resultaterne fra alle grupper, samt ved sammenligning med tidligere studier, ønskes det belyst, om humane adipøse stamceller har en effekt på modningen af dendritiske celler. Projektgruppen ønsker at rette en tak til lektor Ralf Agger og bivejlederne lektor Trine Fink, ph.d.- studerende Romana Maric og ph.d.-studerende Simone Riis for god vejledning i laboratorierne. Slutteligt vil vi takke laborant Brita Holst Jensen for god vejledning i forbindelse med dyrkning af cellerne samt analyse af resultaterne. Rapportens indhold er frit tilgængeligt, men offentliggørelse (med kildeangivelse) må kun ske efter aftale med forfatterne. 3

4 Indholdsfortegnelse Indledning... 6 Introduktion... 8 Stamceller... 8 Embryonale stamceller... 8 Voksne stamceller... 9 Kilder til stamceller Stamcelleterapi Diabetes mellitus Parkinsons sygdom Adipøse stamceller Dendritiske celler Modning og aktivering af dendritiske celler Aktivering af T- og B-celler Mesenkymale stamcellers effekt på dendritiske celler Adipøse stamcellers effekt på dendritiske celler Problemafgrænsning Metode og materialer Introduktion Materialeliste Donor Celler Kemikalier og antistoffer Materialer Celledyrkning Cellekultur Farvning af celler Flowcytometri Antistoffer og isotypekontrol Markører i forsøget PCR og qpcr Laboratoriesikkerhed Resultater og resultatbehandling qpcr Diskussion

5 qpcr Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag Bilag 1. Stamcellers differentiering Bilag 2. Areal og mængder Bilag 3. Laboratorieprotokol (25/ og 29/ ) Bilag 4. Laboratorieprotokol for trypsinering af celler (30/ ) Bilag 5. Dag 0: Oprensning af PBMC fra fuldblod (01/ ) Bilag 6. Dag 2: Tilsætning af medium + cytokiner Bilag 7. Dag 6: Tilsætning af RP10 medium, cytokiner og konditioneret medium Bilag 8. Dag 7: Høst af celler + flowcytometri Bilag 9. qpcr Bilag 10. Resultater fra gruppe 406: Tilsat konditioneret medium dag Bilag 11. Resultater fra gruppe 408: Celler dyrket i co-kultur Bilag 12. Resultater fra gruppe 414: Celler dyrket i transwell inserts Bilag 13: Resultater fra gruppe 418, celler tilsat konditioneret medium dag Bilag 14. Kemisk arbejdspladsvurdering: Trypanblåt Bilag 15. Analysebrugsanvisning

6 Indledning Hos det normale voksne menneske udgør fedtvæv (adipøst væv) op mod 20 % af legemsvægten, og tilsvarende er lipidmængden af betydelig størrelse. Taget i betragtning, at lipid har stor evne til oplagring af energi, er der således mulighed for høj metabolisk omsætning, men ikke blot af denne grund er fedtvæv interessant. Med opdagelsen af fedtvævs sekretion af adipokiner såsom leptin 1 er der opstået et forskningsmæssigt potentiale for det humane adipøse væv og dets cellepopulationer, som har vist sig at bestå af nogle relativt heterogene celler af både differentierede og udifferentierede typer (Gimble et al). Humant fedtvæv er således rigt på multipotente stroma- og stamceller, som er i stand til at proliferere og dernæst differentiere til en række mesenkymale celletyper såsom adipocytter, myocytter, osteocytter og chondrocytter, men det er også påvist, at de kan differentiere til både endodermale og neuroektodermale celler såsom β-celler og neuroner (Cignarelli et al). Humant fedtvæv er dermed meget dynamisk, hvilket også afspejles af, at vævet udviser cellebiologiske forandringer i tilfælde af patologiske tilstande såsom diabetes (Gimble et al). De adipøse stamceller er endvidere interessante, idet de secernerer en lang række cytokiner og vækstfaktorer med parakrine funktioner, som bl.a. omfatter immunmodulerende virkninger (Gimble et al; Cignarelli et al). Adipøse stamceller antages således at kunne nedregulere specifikke immunforsvarsceller, hvilket bl.a. involverer de dendritiske celler, der er antigenpræsenterende og væsentlige for den endogene regulation af T-lymfocytternes inflammatoriske aktivitet (Gimble et al; Cignarelli et al; Ivanova-Todorova E et al). Sådanne effekter sandsynliggør, at stamcellerne bl.a. vil kunne anvendes på en hensigtsmæssig immunmodulation som led i en allogen transplantation (Gimble et al; Cignarelli et al; Ivanova-Todorova E et al). I forbindelse med allogen transplantation er der risiko for, at transplantatet kan blive afstødt af immunsystemet. For at mindske afstødningen vil man måske kunne anvende adipøse stamceller til at hæmme de dendritiske celler, som ellers vil kunne være med til at afstøde et transplantat. Det er således muligt, at humane adipøse stamceller har et terapeutisk potentiale i fremtidens cellebaserede behandlingsstrategier. Humant fedtvævs mesenkymale stamceller hæmmer specifikt differentieringen af dendritiske celler, og der er tale om en mere potent hæmning end den, der afstedkommes af knoglemarvens mesenkymale stamceller (Ivanova-Todorova E et al). Dette er blevet påvist i et studie, hvor man undersøgte effekten vha. cellekulturer bestående af dendritiske celler i co-kultur med henholdsvis mesenkymale eller adipøse stamceller. Dermed kunne man sammenligne de dendritiske cellers nedregulerende effekt af knoglemarvsderiverede henholdsvis fedtvævsderiverede stamceller (Ivanova-Todorova E et al). 1 Leptin: Plasmakoncentrationen af leptin er udtryk for den samlede fedtvævsmasse (Geneser, s. 245) 6

7 Overordnet set tyder det på, at adipøse stamceller udøver potente, immunsupprimerende virkninger på humane dendritiske celler, hvormed den dendritiske celle-medierede aktivering af immunforsvaret hæmmes, hvilket er særligt tydeligt i forhold til T-lymfocytterne (Ivanova-Todorova E et al; Ehlers C et al; Gupta M et al; Peng W et al). I denne gruppe, som udgør en del af en større forsøgsrække, tilsigtes det undersøgt og belyst, hvordan adipøse stamceller kan modulere immunsystemets celler, herunder om de specifikt påvirker dendritiske celler i et konditioneret medium. Til kontrol af effekten sammenlignes med andre forsøgsrækker, og den mulige effekt evalueres gennem flowcytometri samt PCR, som tillader en bestemmelse af dendritiske cellers ekspression af markører og nøgleproteiner. 7

8 Introduktion Stamceller Under udviklingen af et foster sker en samtidig udvikling af en række celler i kroppen, der tager udgangspunkt i stamceller. Under fødslen kendes de som embryonale stamceller, der er med til at færdigudvikle fosteret og dets forskellige celler. Senere findes de voksne stamceller, der hjælper med regeneration af ødelagt væv, og slutteligt findes humane embryonale germceller, der er forstadiet til kønsceller og kan isoleres fra kønskirtelanlægget i 5-8 uger gamle fostre (Vermehren, 2006). Stamceller har tre væsentlige egenskaber. Dels er de udifferentierede, hvilket betyder, at de endnu ikke har udviklet sig til en bestemt celle. Ydermere er de i stand til at forny sig selv ved proliferation, hvor hver deling fører til to nye datterceller. Slutteligt kan bestemte påvirkninger få cellen til at dele sig asymmetrisk, hvor den ene celle differentieres til en anden celle, mens den anden celle vil forblive en stamcelle (Vermehren, 2006). Embryonale stamceller Som allerede anført rubriceres stamcellerne i forskellige kategorier, herunder embryonale stamceller. Den første stamcelle bliver dannet, når oocytten og spermatozoen smelter sammen og danner zygoten. Denne kan udnytte alle informationer i arvemassen og udvikles til et embryon. Stamcellen benævnes da totipotent, hvor alle celler dannes til embryonet og desuden placenta, fosterhinde og navlestreng (Vermehren, 2006). Ved befrugtningen dannes en celle, der gennem mitoser differentierer sig til 4 celler, 8 celler, 16 celler etc. Ca. 4 dage efter befrugtningen foldes cellerne, hvorefter der dannes en tydelig afgrænsning mellem to celletyper, trofoblast og embryoblast. Trofoblasten danner den ydre cellemasse i embryonet, hvor embryoblasten danner den indre masse og hele denne samling af celler kaldes blastocysten. Embryoblasten videredifferentieres til epiblast samt hypoblast, hvor hypoblasten ikke indgår i dannelsen af fosterets væv. Epiblasten giver derimod ophav til dannelse af de tre kimlag, kaldet ektoderm, mesoderm og endoderm; desuden giver den også ophav til dannelse af oocytter eller spermatozoer. Når disse lag er dannet, vil stamcellerne til dels være specialiserede, eftersom de forskellige kimlag er ophav til forskellige derivater i det færdigudviklede individ. Derfor skal en isolation af embryonale celler fra blastocystens indre cellema s- se ske inden differentieringen til de tre kimlag. Embryonale stamceller, der benyttes til forskning i Danmark, er overskudsæg fra in vitro fertilisation (IVF). Det er således de embryoner, der er vurderet uegnede til nedfrysning, eller embryoner, der har været nedfrosset, men grundet lovgivningen skal destrueres. Anvendelsen af disse stamceller godkendt af donorerne. 8

9 De embryonale stamceller er overordnet karakteriseret ved forskellige egenskaber. Hvis de er placeret i en petriskål/kulturdyrkningsflaske med dyrkningsmedium tilsat, vil de i princippet dele sig uendeligt, i modsætning til mange funktionsspecifikke celler i den voksne organisme (fraset tilfælde med visse mutationer). Det betragtes, at når cellerne deler sig, vil alle kloner 2 af denne celle udgøre det, der benævnes en embryonal stamcellelinje. At cellerne kan blive ved med at dele sig skyldes den høje telomeraseaktivitet. Telomerase er et funktionelt enzym, som muliggør at kromosomernes telomerer kan bevare deres længde, hvorimod de ved normale mitoser afkortes. Dette forklarer også hvorfor andre celler i kroppen aldres, idet de ikke har mulighed for at beholde samme mitoseaktivitet. Der gælder dog, at cancerramte celler kan fortsætte delingen ukontrolleret, bl.a. fordi der er sket en telomerasemutation. De embryonale stamceller er at betegne som pluripotente, da de in vitro, og ved de rette signaler, er i stand til at udvikle sig til alle specialiserede celletyper. Voksne stamceller Voksne stamceller dækker over stamceller, som kan isoleres fra fostervæv, navlestrengsblod, børn og vok s- ne. I alle organer menes der at være voksne stamceller, og disse kan i et omfang ikke blot danne nye celler, men også gendanne celler, som er gået tabt i væv. Hos børn og voksne er stamcellerne lokaliseret mellem andet cellevæv, omend i et meget lille antal. Disse celler har bevaret evnen til at forny sig selv gennem hele livet, men dog ikke i så høj grad som embryonale stamceller kan under den somatiske embryogenese 3, fordi telomererne forkortes hos voksne stamceller under hver celledeling. En egenskab ved voksne stamceller er, at de i flere år kan være passive uden at undergå celledeling, men hvis de bliver påvirket af forskellige signaler kan en differentiering opstå, som umiddelbart er til de celler, som stamcellerne befinder sig imellem. En sådan differentiering vil typisk ske, hvis der opstår vævsskade, og der derfor skal ske en genopretning af vævene. Voksne stamceller menes at forekomme i alle kroppens væv, i nogle væv mere velkendt end andre. At udtage og anvende stamceller fra knoglemarven er relativt let tilgængeligt, og man begyndte allerede for 40 år siden at eksperimentere med det (Vermehren, 2006). Det er kendt, at knoglemarven indeholder flere forskellige typer stamceller, hvoraf kan nævnes de hæmatopoetiske stamceller (HSC), der er multipotente og kan differentiere til multipotente lymfoide og myeloide stamceller og dermed alle typer blodceller. I knog- 2 En celleklon er en population af identiske celler, der alle er opstået ud fra samme celle ved mitose. En enkeltcelle isoleres og kan ved efterfølgende dyrkning danne udgangspunkt for pågældende klon. Klonen kan efterfølgende være udgangspunkt for en ren cellelinje sv.t. en kultur bestående af én celletype. I forsøget med vævsdyrkning antages det, at vi arbejder med en ren cellelinje (Geneser s. 42) 3 Fosterudvikling 9

10 lemarven findes også multipotente mesenkymale stamceller (MSC), der kan danne knogle-, brusk-, fedt- og vævsceller. HSC bruges ved knoglemarvstransplantation, bl.a. i behandlingen af patienter med leukæmi. Ligeledes anvendes MSC også i forbindelse med fx knoglebrud og behandling af bruskskader i led (Vermehren, 2006). Kilder til stamceller Stamceller har som beskrevet forskellig oprindelse. Forskere mener, at stamceller, især embryonale og voksne stamceller, i fremtiden kan have stor betydning for behandling af sygdomme såsom diabetes type I og Parkinsons sygdom. Kønsceller fra embryoner er derimod omfattet af mere vanskelige aspekter, specielt i etisk sammenhæng, eftersom de skal udtages fra embryonet, når det er 5-8 uger gammelt, og dette kan kun lade sig gøre ved spontane eller provokerede aborter. Forskere undersøger nye muligheder for at finde andre og bedre kilder til stamceller. Forskere fra USA har påvist, at pulpa fra mælketænder muligvis kan være en rig kilde til stam- og progenitorceller 4. Når børn taber tænderne, er stamcellerne stadig i live kort tid efter, og derfor kan der være et potentiale heri (Vermehren, 2006). Figur 1: Billedet illustrerer visse stamcellers differentieringsmuligheder Ved at bruge hæmopoietiske stamceller fra navlestrengen opnås en række fordele, idet disse er nemmere at høste. Specielt antages det, at flere i fremtiden kan få gavn af blodet i navlestrengen kontra blod fra knoglemarven, idet T-cellerne endnu ikke er modne (eftersom barnets immunforsvar ikke er fuldt udviklet ved fødslen, og der behøver således ikke være helt samme match ved brug af stamceller fra navlestrengen). 4 Når stamceller differentierer sig asymmetrisk, bliver én til en stamcelle, og én til en progenitorcelle. En progenitorcelle er begyndt at specialisere sig og kan kun differentiere i bestemte retninger (Vermehren, 2006, s. 101) 10

11 Ved transplantationer er der risiko for, at recipientens immunforsvar vil lave en immunologisk reaktion, hvor MHC-molekyler (se afsnit om dendritiske celler) præsenterer antigener for T-cellerne, hvorefter recipientens T-celler kan angribe det transplanterede organ. Igen vil man ved brug af hæmopoietiske stamceller fra navlestrengen kunne mindske dette, netop fordi T-cellerne i navlestrengen vil være umodne. En anden mulighed kan være at anvende de adipøse stamceller, eftersom de antageligt har en hæmmende effekt på dendritiske celler, hvorved et immunrespons kan nedsættes. Stamcelleterapi Aktuelt forskes der meget i, hvad stamcellerne kan bruges til, fx potentiel kurativ effekt på sygdomme, der ellers er at betragte som kroniske. For nuværende er der indikation for, at flere af disse lidelser kan behandles med stamcelleterapi, og her fremhæves diabetes mellitus og Parkinsons sygdom som eksempler. Diabetes mellitus I dag lider et stort antal individer verden over af diabetes mellitus (type I eller II). Afhængig af grundlidelse kan der behandles med antidiabetika i form af insulin eller β-cellestimulerende midler. Der forskes i, om de voksne stamceller kan have en effekt på diabetespatienter, men fremadrettet stiller det store udfordringer, idet en tilstrækkelig mængde af disse stamceller skal være tilgængelige. De skal endvidere under dyrkning in vitro være i stand til både at dele sig og bevare evnen til differentiering til de ønskede celletyper, fx β-celler. Der er dog også andre problemstillinger forbundet med dette, herunder kontrol af den hastighed, hvormed insulinen secerneres. Forskere fra University of Florida har forsøgt at dyrke humane celler samt museceller fra pancreas med konklusionen, at celler fra mus kunne danne ø-lignende strukturer. Efterfølgende var det via cellemarkører muligt at identificere de forskellige celler, der producerer insulin (β-celler), glukagon (α-celler) og somatostatin (δ-celler) samt pancreatisk polypeptid (PP-celler). Herefter lykkedes det forskerne at indsætte de nydannede Langerhanske øer 5 i mus med diabetes, hvilket resulterede i en markant symptomlindring. Måske vil det i fremtiden være muligt at transplantere disse til diabetespatienter med tilsvarende virkning. Parkinsons sygdom Neuroner, astrocytter og oligodendrocytter dannes fra samme neurale stam- eller progenitorceller. De neurale stam- eller progenitorceller kan under forskellige kirurgiske indgreb isoleres fra hippocampus samt væggen i lateralventriklerne (Vermehren, 2006). Efter isolationen af stamcellerne kan de dyrkes og opformeres in vitro, hvorefter de tænkes genplaceret cerebralt med kurativ intention ved Parkinsons sygdom. Eksempler på operationer hvor stamcellerne kan isoleres, er i forbindelse med epilepsi, traumer eller under invasiv be- 5 Endokrine øer fordelt i pancreas, bestående af fire celletyper 11

12 handling af hydrocephalus 6. Det er dog et kriterium, at cellerne skal kunne opbevares i min. 2 år og selvstændigt kunne differentiere til de ønskede celletyper. Forskere har påvist, at celler fra humane fostre kan forøge antallet op til 10 mio. gange, men neurale stamceller fra voksne synes at have begrænset levetid, hvilket er et problem i nævnte sammenhæng (Vermehren, 2006). Adipøse stamceller Fedtvævets stamceller opstår fra multipotente, mesenkymale stamceller, som efter en tidlig differentiering (omkring føtalmåned) giver ophav til en population af unipotente, adipøse stamceller, der også kaldes adipoblaster. Disse adipoblaster indgår således fedtvævets stamceller, som i sidste ende giver oprindelse til de unilokulære 7 mature fedtceller (Geneser, 2011). I starten minder adipoblaster så meget om fibroblaster, at det er vanskeligt at skelne rent morfologisk. På dette tidlige stadie i føtallivet prolifererer adipoblasterne, hvorefter de begynder at differentiere til præadipocytter, der er umodne celler uden lipidindhold, men de indeholder fedtcellemarkører såsom enzymet lipoproteinlipase 8 (Geneser, 2011). Præadipocytter videredifferentierer til immature fedtceller, der besidder hele det nødvendige apparat til syntese og nedbrydning af lipider i form af triglycerider. De immature fedtceller akkumulerer efterhånden flere og flere lipiddråber i cytoplasmaet, og cellen vokser i omfang for til sidst at lade lipiddråberne smelte sa m- men til én stor dråbe. Cellekernen displaceres til periferien af fedtcellen, der er blevet matur og unilokulær. Differentieringen fra præadipocytstadiet til fedtcelle reguleres af faktorer som bl.a. væksthormon og glukokortikoider (Geneser, 2011). Idet hverken de immature eller mature fedtceller kan undergå mitose, opstår nye fedtceller fra præadipocytters modning til fedtceller. Præadipocytter kan undergå mitoser i føtallivet og lige efter fødslen, til og med de første leveår, hvorefter der ikke sker yderligere mitoser, hvorfor barnets dannede antal præadipocytter er statisk. Under udviklingen er der altså en grænse for, hvor mange fedtceller man kan have, men når individer alligevel kan blive tiltagende adipøse skyldes det ikke et øget antal fedtceller, men derimod hypertrofi af den enkelte fedtcelle 9 (Sand, 2007). Ud over de normale unilokulære fedtceller findes også multilokulære fedtceller, som udgør det brune fedtvæv. Disse dannes også ud fra de multipotente, mesenkymale stamceller, som differentierer til unipotente adipoblaster, der senere differentierer til multilokulære fedtceller. De multilokulære fedtceller indeholder 6 Dilaterede hjerneventrikler grundet øget mængde cerebrospinalvæske 7 Cellen indeholder én stor lipiddråbe, som udfylder cytoplasma 8 Lipoproteinlipase er et enzym, der nedbryder lipoproteinet i fedtceller. Enzymet findes i bl.a. fedtceller og endothelceller i kapillærers karvæg 9 Sv.t. øget lipidindhold i den enkelte celle 12

13 mange mitokondrier iblandt de mindre lipiddråber, og det er mitokondriernes cytokromindhold, der giver dette fedtvæv sin brune farve 10. De adipoblaster, som danner multilokulære fedtceller er runde og dermed morfologisk forskellige fra ovenstående (unilokulære) adipoblaster, der tilnærmelsesvis er tenformede, mere aflange og kantede (Geneser, 2011). I forhold til dette projekt er det særligt relevant, hvorvidt de adipøse stamceller har en immunmodulerende effekt. I immunsystemet findes både en adaptiv og en innat del, som hver har sit speciale og indhold af forskellige celler; fælles for begge er, at de indeholder både cellulære og humorale komponenter. En hyppigt forekommende celletype er dendritiske celler, som genkender mikroorganismer på deres generelle mønstre. Dendritiske celler Dendritiske celler (DC) er en gruppe immunceller, der er i stand til at initiere det primære immunrespons 11. De har oprindelse i pluripotente hæmopoietiske stamceller, hvoraf de fleste er af myeloid oprindelse. DC kan inddeles i flere forskellige typer afhængig af, hvilket væv de befinder sig i. I vævene kan DC ved påvirkning af fremmede antigener bevæge sig til lymfeknuderne, hvor de præsenterer det fremmede antigen for T-cellerne. Herunder nævnes forskellige DC i vævene kort: Langerhanske celler: De Langerhanske celler findes i epidermis og er meget rige på MHC II-molekyler. De antigener, som bliver præsenteret i huden, vil blive præsenteret for de Langerhanske celler, hvorefter de vil vandre til lymfeknuderne og præsentere antigenerne for T-celler. Slørceller: Slørceller findes i den afferente lymfe. Deres navn kommer af, at disse DC har karakter af slørlignende lameller. Slørcellerne er DC, som vandrer op gennem den afferente lymfe til lymfeknuderne. Interdigiterende celler: De interdigiterende celler findes i de områder af lymfoidt væv, hvor T-celler er dominerende. Interdigiterende celler er ligesom de andre DC rige på MHC II. Man mener, at disse celler står for en meget stor del af den totale antigenpræsentation til organismens T-celler. DC er antigenpræsenterende celler, der har mønstergenkendende receptorer og derudover mange overflademolekyler tilfælles med makrofager og monocytter; bl.a. har de Fc-receptorer, som bruges til antigenoptag. De defineres ofte fænotypisk ved deres mangel på markører; det kan være CD3 T-celler, da der ikke kendes nogen entydig markør for dem (Agger, 2011). DC er vanskelige at isolere fra blod og væv, men de kan dog dyrkes i to typer af grundkultur. Den ene type er hæmopoietiske stamceller, som ved tilsætning af granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM- 10 Brunt fedtvæv forekommer kun hos fostret 11 når kroppen første gang møder antigenet (Lindskog, 2004) 13

14 CSF) og TNF-α kan udvikle sig til DC. Humane DC dyrkes oftest ud fra den anden type grundkultur, CD14 + monocytter 12, som isoleres fra blod, hvorefter de dyrkes i ca. en uge sammen med GM-CSF og IL-4 13, hvorved monocytterne udvikler sig til umodne DC (Agger, 2011). Modning og aktivering af dendritiske celler De fleste dendritiske celler (DC) er umodne og mangler de accessoriske signaler CD40, CD54 og CD86, der er nødvendige for aktivering af T-celler. Derimod har de en veludviklet evne til at optage antigener, og de er i stand til også at præsentere antigener, dog i langt mindre grad end andre antigenpræsenterende celler. De forskellige mekanismer for dette inkluderer fagocytose, makropinocytose og receptor-medieret-endocytose (Banchereau, 1998). De umodne DC har en middelhøj ekspression af intracellulær major histocompatibility complex (MHC) I og II (Agger, 2011), se figur 2. Ved eksponering for patogener, fx lipopolysakkarid (LPS) eller bakterielt DNA, eller cytokiner, fx GM- CSF, modnes de dendritiske celler og mister gradvist evnen til at optage antigener. Dog har IL-10 blokerende effekt på modningen 14 (Banchereau, 1998). Modne DC er karakteriseret ved en høj ekspression af overflade MHC I og II samt forskellige costimulatoriske molekyler, der kan være CD80 og CD86. Herved fungerer DC som stimulator for aktivering af T-celler. Modne DC producerer IL-12, som får T-celler til at differentiere sig til interferon-γproducerende 15 Th1-celler. Ved tilstedeværelse af IFN-γ aktiveres makrofager, og ved tilstedeværelse af IL- 12 stimulerer de differentieringen af T-celler til dræberceller (Banchereau, 1998). Således promoverer Th1- celler effektiviteten af makrofagernes drab på inficerede celler. 12 Alle monocytter har CD14 + som overfladereceptor, nogle har også CD Fællesbetegnelse for en stor del af de leukocytsyntetiserede cytokiner (Agger, 2011, s. 470) 14 Secerneret fra itreg 15 Proteiner, der produceres i celler som følge af kontakt med virusnukleinsyre eller andet artsfremmede dobeltstrenget RNA. Ved kobling til en anden celle inhiberer de virusmultiplikation i denne celle (Agger, 2011, s. 470) 14

15 Figur 2: Modning af DC: Kolonnen til venstre viser de faktorer, der indvirker på modningen, og kolonnen til højre viser de forskellige fasers egenskaber (Banchereau, 2000) Aktivering af T- og B-celler Dendritiske celler (DC) er den mest potente aktivator af T-celler. For at CD4 + T-celler kan aktiveres, skal de genkende et antigen, der er bundet til MHC II udtrykt på en DC og samtidig modtage et signal fra CD4- molekylet. Herpå vil CD40L, udtrykt på T-cellen, opregulere CD80 og CD86, udtrykt på DC. Afhængig af dendritiske cellers cytokinproduktion, kan den naive T-celle differentieres til Th1, Th2, Th17 eller itreg. CD8 + T-celler aktiveres ved binding til antigen på MHC I og kræver samme co-stimulatoriske signaler. Dog differentierer de sig hovedsageligt kun til Tc-celler (Agger, 2011). For at en B-celle kan differentieres til en plasmacelle og secernere immunoglobuliner (Ig) kræves tre aktiveringssignaler. Det første opnås ved krydsbinding mellem en B-celle-receptor og et antigen. Når T-cellen er aktiveret vil den reagere med CD40, der er udtrykt på B-cellen, og derved give den det co-stimulatoriske signal, der aktiverer B-cellen. Når B-cellen er aktiveret, vil den udtrykke cytokinreceptorer samt opregulere ekspressionen af CD80 og CD86, der signalerer T-cellen til at secernere cytokiner. Disse får B-cellen til at 15

16 proliferere og differentiere til en plasmacelle, der efterfølgende producerer antistof. Hvilken Ig-klasse, der produceres, afhænger af de T-cellen secernerede cytokiner (Agger, 2011). Mesenkymale stamcellers effekt på dendritiske celler Det er påvist, at mesenkymale stamceller (MSC) har en suppressiv effekt på monocytters differentiering til dendritiske celler (DC). Dette kan måles ved lavere ekspressioner af co-stimulanterne CD80 og CD86, der er nødvendige for modningen af DC. Den suppressive effekt sker ved en øgning af sekretionen af IL-10, et antiinflammatorisk cytokin, der inducerer anergi og apoptose i Th2-celler. Ydermere har chemokinerne CCL-3 og CCL-4 ikke kunnet måles i supernatanten af DC co-kultiveret med MSC. Disse chemokiner secerneres normalt af DC ved rekruttering af T-lymfocytter, og fraværet af dem indikerer den suppressive virkning af MSC på immunsystemet (Ivanova-Todorova, 2009). For at undersøge, om MSCs suppressive effekt begrænser sig til monocytdifferentieringen, eller også indvirker på andre aspekter, undersøgtes dennes effekt på differentierede DC (Jiang, 2005). Resultaterne viste, at umodne DC differentieres til CD14-celler eller forbliver umodne, samt at modne DC udtrykte væsentligt mindre HLA-DR, CD1a, CD80 og CD86. MSC nedregulerer IL-12 sekretionen, som er et cytokin af betydning for modningen af DC og derved kan inducere anergi og tolerance i T-celler. Forringelsen af T-celleproliferationen korrelerer med målingen af en øget IL-10 produktion (Jiang, 2005). MSC virker inhiberende på umodne dendritiske cellers endocytotiske egenskaber, og dermed påvirker MSC alle de dendritiske cellers stadier: Differentiering, modning, og aktivering. Dette kan ske ved både cellecelle kontakt og indirekte kontakt gennem cytokiner (Zhang, 2004). Disse påvirkninger kan potentielt være anvendelige i organtransplantationer og terapier til autoimmune sygdomme. Adipøse stamcellers effekt på dendritiske celler Adipøse stamceller (ASC) virker mere inhiberende på DC sammenlignet med MSCs inhiberende effekt. Den inhiberende effekt sker via øget IL-10 sekretion, der ligeledes kan påvises ved lavere ekspression af CD80 og CD86 (Ivanova-Todorova, 2009). Maksimal hæmning af lymfocytproliferationen opnås ved tilsætning af stamceller initialt i dyrkningen; dog spiller antallet af adipøse stamceller også ind på den inhibitoriske effekt (Puissant, 2005). Som det er tilfældet med MSC forventes det, at ASC kan anvendes med henblik på inducering af tolerance ved fx transplantationer. 16

17 Problemafgrænsning Dette projekt er en del af en større undersøgelse, der samlet fokuserer på problemstillingen, om humane adipøse stamceller har en effekt på immunsystemet, mere specifikt i form af teorien om en nedregulerende effekt på dendritiske celler (DC). Hvis det er tilfældet, vil evnen til et immunrespons være svækket svarende til en immunsuppression. Hovedprincippet tager udgangspunkt i co-kultivering af humane adipøse stamceller og humane DC. Forsøget vil i dette delprojekt, jf. metodeafsnit, hovedsageligt bestå i dyrkning DC i et konditioneret medium 16, og der vil sideløbende blive dyrket stamceller og kontrolceller. Det vil være aktuelt at kunne påvise, hvorvidt de humane adipøse stamceller gennem secernering af eventuelle faktorer i det anførte medium har en effekt på de dendritiske celler, og om der således er en immunsupprimerende virkning. Under arbejdet i laboratoriet vil flere metoder blive anvendt: Monocytisolering, celledyrkning, flowcytometri samt PCR. Effekten på de dendritiske celler evalueres ved undersøgelse af ekspressionen af nøgleproteiner, udført ved hjælp af flowcytometri, og resultaterne beskrives efterfølgende. Projektgruppens resultater sammenlignes med tre andre delprojekters resultater, så der også i sammenhæng kan drages konklusioner. Hvis det kan påvises, at humane adipøse stamceller har en nedregulerende effekt på immunsystemet, vil der være forskellige overvejelser i forhold til brugen af disse i terapeutisk sammenhæng samt mulige perspektiver. Ud fra ovenstående betragtninger opstilles følgende problemformulering: Kan det påvises, at humane adipøse stamceller har en effekt på udvikling og modning af monocytderiverede dendritiske celler gennem udskilte faktorer i et konditioneret medium, og hvilket omfang har denne effekt i så fald? 16 Konditioneret medium er et medium, hvori andre celler har været dyrket 17

18 Metode og materialer I følgende afsnit beskrives en række metoder, der er inddraget i projektet med henblik på at besvare den opstillede problemformulering. Derfor introduceres gruppens projekt, herunder hvilke undersøgelser, der er foretaget, samt metoderne, der er anvendt. Desuden følger en beskrivelse af forsøg, der er opsat for at indsamle data og resultater til behandling af problemformuleringen. Introduktion Som nævnt i indledningen udgør gruppens forsøg en del af et større forsøg med i alt fire delforsøg, hvor denne gruppe har lavet forsøg med konditioneret medium tilsat dag 6, og metodeafsnittet vil derfor tage udgangspunkt i dette. Dog vil resultaterne senere i rapporten blive sammenlignet med tre andre delforsøg. I ét delforsøg dyrkes dendritiske celler (DC) sammen med humane adipøse stamceller (ASC) hhv. humane embryonale nyreceller (HEK-celler) i co-kultur med mulighed for direkte celle-celle kontakt. I et andet delforsøg er DC og ASC hhv. HEK-celler dyrket i transwell inserts, hvilket betyder, at cellerne er adskilte, og der er således ikke mulighed for direkte celle-celle kontakt. I det sidste delforsøg til sammenligning er der ligheder med denne gruppes opstilling, blot er konditioneret medium tilsat dag 0. Ved alle forsøgene er de samme kontrolceller benyttet, og de anvendte stamceller er også fra samme donor, hvilket har den betydning, at der ikke er variation i kvaliteten af cellerne. Der anvendes kontrolceller til delforsøgene for at vurdere, at effekten af differentieringen specifikt skyldes ASC. Figur 3: Billedet viser opstillingen af brøndbakken brugt ved konditioneret medium 18

19 Materialeliste Donor Bloddonorerne er raske individer ansat på biomedicinsk afdeling på AAU, aktuelt en 34-årig kvinde. Celler Human embryonic kidney cells (HEK-celler): Disse celler er af cellelinien HEK293 og oprenset i 1970 erne. Disse er immortaliseret og stabilt transfekteret 17 med grønt fluorescerende protein (GFP) 18. De adipøse stamceller ASC21 er fra privathospitalet Grymer, hvor donor er en 52-årig ikke-medicineret mand med BMI 28; manden er ikke-ryger. Kemikalier og antistoffer Skemaet illustrerer kemikalier og antistoffer, der er anvendt i forsøget: Produkt Firma Katalognummer RPMI 1640 Lifetechnologies Lymfoprep Medinor/Axis-Shield PBS Lifetechnologies EDTA L-Glutamin Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 GM-CSF Peprotech IL-4 Perprotech LPS BSA Sigma-Alrich A2153 Transwell Sigma-Aldrich CLS EA Trypanblåt Sigma CD80-PE-Cy5 Beckton Dickinson HLA-DR-APC-H7 BD Bioscience CD86-PE Beckton Dickinson Transfektere: At indføre DNA i en celle, fx ved (mikro-)injektion, 18 set 27/

20 CD83-APC Beckton Dickinson CD14-FITC Fisher Scientific MA NaCl Sigma S9888 Tabel 1: Angivet i tabellen ses kemikalier brugt til forsøget samt producent og katalognummer For korrekt håndtering af kemikalierne er der lavet APV samt analysebrugsanvisning (bilag 14 og 15). Materialer I det følgende er listet materialer til celledyrkningen: - T75 kulturflaske - Pipetboy med tilhørende stripetter - Eppendorfrør - 6-brøndsbakke - 15 ml polypropylen rør (TPP) - 50 ml polypropylen rør (TPP) - 10 µl pipette, 100 µl pipette og 1000 µl pipette samt dertilhørende pipettespidser - Engangsplastpipette - Lang kanyle - Engangssprøjte - Sterilfiltre - FACS-rør Celledyrkning Celler og væv kan dyrkes uden for organismen, nærmere betegnet in vitro. Dette kræver dog et dyrkningsmiljø sv.t. in vivo, hvor en række parametre skal være opfyldt. Ved celledyrkning anses temperaturen for at være en vigtig faktor, og derfor dyrkes cellerne ved en ideel temperatur på 37,0 C. Hvis temperaturen blot er få grader højere, vil cellerne degenerere ved at undergå nekrose. Ved for lav temperatur i miljøet kan cellerne potentielt overleve i en længere periode; op til flere dage ved fx 4 C (Chemnitz et al, 1990). For at cellerne kan proliferere under gode forhold, er osmolariteten af dyrkningsmediet ydermere af afgørende betydning. Den hensigtsmæssige værdi er ca. 300 mosm pr. liter opløsning. Når cellerne dyrkes in vitro tilsættes uorganiske stoffer som Na +, K + og Fe(II) med henblik på at holde en stabil osmolaritet; desuden har cellerne brug for disse stoffer (Chemnitz et al, 1990). 20

21 Ved celledyrkningen skal ph-værdien optimalt være i intervallet 7,2-7,4, hvor organismen har de bedste forhold. Hvis ph-værdien enten falder til under 6,8, eller stiger til over 7,8, vil cellerne dø inden for 24 timer, igen ved at undergå nekrose. Cellerne har i øvrigt behov for vitaminer, der bl.a. har virkning på cellevækst og cellespecialisering, altså hvilken funktion cellerne får efter endt differentiering. Celler bliver oftest dyrket i næringsmedium tilsat serum. I serum er der bl.a. proteiner og/eller polypeptider fungerende som vækstfaktor for cellerne. Der er flere forskellige typer serum, hvor føtalt kalveserum anses for at være det bedste. Den mængde serum, der anvendes, er typisk 5-10 % af mediets volumen. For at cellerne skal få den rette næring, indgår der i de fleste dyrkningsmedier glukose eller andre sukkerarter, som kan omdannes til mælkesyre uden brug af oxygen, og dette muliggør, at cellen kan dyrkes uden oxygen i længere tid (Chemnitz et al, 1990). Når cellerne dyrkes med oxygen, skal denne bestå af en luftblanding med 5 % kuldioxid (CO 2 ). De 5 % CO 2 medvirker til opretholdelse af ph-værdien og fungerer som et buffersystem, som er med til at få mediet til at skifte farve. Gul farve indikerer surt medium, og en mere violet farve indikerer basisk medium. For at forebygge infektioner og forhindre kontaminering tages en række forholdsregler. Bl.a. skal alt være rent, og visse redskaber skal være sterile. Det sterile arbejde foregår i en LAF-bænk udstyret med filtre i bund og top, der sikrer, at gennemstrømmende luft er steril. Desuden er der luftstrøm ved arbejdsåbningen for at undgå sammenblanding af luften i LAF-bænken og den omgivende luft (Chemnitz et al, 1990). Til næringsmedium tilsættes antibiotika med henblik på at bekæmpe eventuelle infektioner. For det meste bruges penicillin G, der kan dræbe bakterier i livlig formering. Penicillin G er virksomt mod gram-positive stave og kokker samt gram-negative kokker. Alternativt bruges flere forskellige slags antibiotika i kombination, idet nogle typer kun nedbryder gram-positive og andre kun gram-negative bakterier. Der kan fx anvendes Pen Strep 19, som også indeholder penicillin G. Udfordringen ved at anvende penicillin er dog, at bakterier på et tidspunkt kan blive resistente (Chemnitz et al, 1990). 19 Penicillin-Streptomycin 21

22 Cellekultur I dette afsnit er dagene i laboratoriet kort beskrevet; for yderligere oplysninger se bilag 3-9. De dendritiske celler (DC) udvikles fra CD14 + monocytter. Ved tilsætning af GM-CSF og IL-4 udvikler de sig i løbet 6-7 dage til CD14-umodne DC, som har dendritter og lamellipodier og udviser en høj ekspression af HLA-DR og til dels CD80 og CD86. Hvis de herefter får tilsat LPS, udvikler de sig til modne DC med lange lamellipodier samt meget høj ekspression af HLA-DR, CD80, CD86 (og også CD83). Skift af medium (25/04 og 29/04) Følgende udføres for både stamceller og kontrolceller. Cellerne hentes i CO 2 -inkubator (37 C), da denne temperatur er optimal for cellerne. Medium suges fra cellerne, og der skylles med s-pbs (sterile-phosphat buffered saline), som er en neutral væske, og det påvirker derfor ikke cellerne (se bilag 2 for mængder). Der blandes stamcelle-vækstmedium og DC-vækstmedium i forholdet 1:1, og blandingen tilsættes cellerne. Det er vigtigt, at der tilsættes vækstmedium, da cellerne ellers vil dø, og vækstmedium skal have stuetemperatur. Herefter stilles cellerne tilbage i CO 2 -inkubator. Trypsinering af celler (dag -1, 30/04) Medium suges fra cellerne og overføres til et 50 ml centrifugerør. Dette medium er det konditionerede medium, som skal bruges til forsøget, og det skal derfor gemmes. Det konditionerede medium centrifugeres, hvorefter det hældes fra og sterilfiltreres for at være sikker på, at der ingen celler er til stede, og det nedfryses herefter, indtil det skal bruges. Cellerne skylles med s-pbs, og der tilsættes 1,5 ml trypsin/edta for at få cellerne til at løsne sig. Trypsin er en serin-protease, som tilsættes cellekulturer for at løsne cellerne fra den overflade, hvorpå de dyrkes. Kontakten mellem celler hhv. celler/matrix afhænger af adhæsionsmolekylerne, som videre afhænger af calciums tilstedeværelse. Calcium- og magnesiumioner inhiberer desuden trypsin. Medium til celledyrkning (her α-mem) indeholder calcium- og magnesiumioner, hvorfor der også tilsættes EDTA, da dette binder bl.a. calcium- og magnesiumioner 20. Herefter tilsættes nyt medium kulturflasken; dette blandes og overføres til et 15 ml centrifugerør, som centrifugeres, og supernatanten hældes fra. Der resuspenderes i 1 ml medium. 10 µl cellesuspension blandes med 10 µl trypanblåt, og 10 µl af denne suspension overføres til tællekammer. Cellerne tælles, og der udregnes, hvor mange celler, der skal være pr. brønd set 07/

23 Oprensning af PBMC 21 fra fuldblod (dag 0, 01/05) Lymfoprep tages ud af køleskabet, så det kan få den rette densitet. Lymfoprep er et densitetsgradient-medium, som kan adskille cellerne ud fra densitet. Det indeholder bl.a. natrium diatrizoat og polysakkarider. Man kan ved brug af Lymfoprep isolere mononukleære celler (monocytter og lymfocytter) fra blod, da disse har en lavere densitet end andre celler i blodet, fx granulocytter. Lymfoprep har en densitet på 1,077 ± 0,001 g/ml. Siden størstedelen af mononukleære celler har en lavere densitet, kan man adskille dem ved at centrifugere med Lymfoprep, eftersom dette medium tillader celler med større densitet end 1,077 g/ml at sive gennem mediet, således at cellerne med en densitet på under 1,077 g/ml bliver liggende ovenpå 22. Fuldblodet suges fra blodprøveflaskerne og fordeles på 6 x 50 ml TPP-rør med 8-9 ml i hvert rør. Der tilsættes yderligere 8 ml RPMI 1640 til hvert rør. Herefter lejres Lymfoprep forsigtigt under fuldblodet i hvert rør med en kanyle. Rørene centrifugeres i 20 min ved 180 x g, C og bremse 0. Der skal bruges bremse 0, så de dannede lag ikke ødelægges. Supernatanten suges fra, og der centrifugeres igen, denne gang ved 380 x g. Herefter høstes interfasen (= PBMC, det tågede lag) fra alle rør, og de samles to og to i TPP-rør med 10 ml kold PBS + 1 mm EDTA. PBS skal være koldt, da cellerne ellers vil sætte sig fast, og EDTA hindrer, at cellerne klumper sammen. Polypropylenrør anvendes, da cellerne har svært ved at adhærere til disse. Der fyldes op med PBS + 1 mm EDTA til 35 ml. Der centrifugeres i 10 min ved 300 x g, nu ved 4 C, da cellerne endnu ikke må adhærere. Supernatanten hældes fra, og centrifugerørene med celler køres over et rack, så cellerne slipper bunden. Der tilsættes 10 ml kold PBS + 1 mm EDTA, og der centrifugeres igen, hvorefter supernatanten hældes fra. Centrifugerørene køres igen over et rack, og der tilføres 5 ml PBS + 1 mm EDTA til det ene rør; det blandes og tilføres et andet rør. Der tilføres yderligere 5 ml PBS + 1 mm EDTA til det nu tomme rør; der blandes, og det tilføres igen det andet rør. Dette gøres igen med det tredje rør, så der til sidst er 20 ml PBS + 1 mm EDTA + celler i det andet rør. Dette rør centrifugeres, og supernatanten hældes fra. Cellerne resuspenderes i 6 ml koldt RP10 medium 23. Nu blandes 90 μl methylviolet med 10 μl cellesuspension, og 10 μl af denne blanding overføres til et tællekammer, hvorefter cellerne tælles, indtil der er talt mindst 100 celler. Der udregnes, hvordan der skal fortyndes, så der er 8 mio. celler i hver brønd. Billede 1: Her ses de fire faser før interfasen høstes. 21 Perifer blod mononukleær celle 22 set 28/ Standardmedium indeholdende RPMI 1640 med 1 % P/S, glutamin samt 10 % FCS 23

24 Oprensning af monocytter ved adhærens (dag 0, 01/05) Der udsås 8 x 10 6 celler i hver brønd i en 6-brøndsbakke, dvs. 1 ml cellesuspension, og der tilsættes yderligere 2 ml RP10 til hver brønd; dette gøres, fordi cellerne skal have ekstra næring. Bakken sættes i CO 2 - inkubator i 1,5 time, hvorved monocytterne vil adhærere til bunden. PBMC indeholder ca. 15 % monocytter, og resten adhærerer ikke, hvorfor de skylles fra. Herefter suges supernatanten fra (denne indeholder nonadhærente celler), og hver brønd skylles forsigtigt 2 gange med ca. 1 ml varmt RPMI % P/S, idet bakken vippes forsigtigt et par gange, så medium løber ned over brøndene. Tilsætning af medium + cytokiner (dag 0, 01/05) Cytokinerne GM-CSF og IL-4 optøs og slynges. De antages for værende friske i op til 5 dage ved 4 C. Der tilsættes 3 ml RP10 medium, 1,8 μl GM-CSF og 3 μl IL-4 til hver brønd, hvorefter cellerne stilles tilbage i CO 2 -inkubator. Tilsætning af medium + cytokiner (dag 2, 03/05) Først tages billeder af cellerne (med AxioCam ERc 5s). Herefter blandes medium + cytokiner, som tilsættes brøndene. Til hver brønd skal tilsættes 0,5 ml RP10, 1,8 µl GM-CSF og 3 µl IL-4 (for beregninger, se bilag 6). RP10 skal være ca. 37 C, da dette er den optimale temperatur for cellerne. GM-CSF er en forkortelse for granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor, en hæmopoietisk vækstfaktor, som produceres af bl.a. T- celler og endothelceller 24. GM-CSF øger produktion af makrofager, granulocytter og DC (Agger, 2011, s. 195). IL-4 er et interleukin, som produceres naturligt af Th2-celler og i øvrigt bruges til dyrkning af DC in vitro, da det forhindrer monocytterne i at differentiere sig til makrofager. Der er 6 brønde, så det, der skal tilsættes til én brønd, ganges op til 7 brønde, så der er lidt ekstra, da man ikke kan få det hele op. Dvs. der blandes 3,5 ml RP10, 12,6 µl GM-CSF og 21 µl IL-4. Cellerne tages ud af CO 2 -inkubator, og der tilsættes 0,5 ml af det blandede medium + cytokiner til hver brønd, hvorefter de stilles tilbage i inkubator. Tilsætning af medium + cytokiner + konditioneret medium (dag 6, 07/05) Initialt tages billeder af cellerne (med AxioCam ERc 5s). Til brønd tilsættes 1 ml ASC-medium blandet med 1,8 µl GM-CSF og 3 µl IL-4. Til brønd tilsættes 1 ml HEK-medium, der blandes med 1,8 µl GM-CSF og 3 µl IL-4. Til brønd tilsættes 1 ml konditioneret medium bestående af 1 ml RP10 medium blandet med 1,8 µl GM-CSF og 3 µl IL-4. Til hver brønd tilsættes også 4,5 ml LPS (lipopolysakkarid) med henblik på at fremme modningsprocessen; det tager et døgn for en dendritiske celle at modne, når den er blevet udsat for LPS (Agger, 2011) CSF/300-03, set 28/

25 Høst af celler + flowcytometri (dag 7, 08/05) Som tidligere tages billeder af cellerne (med AxioCam ERc 5s). Cellerne høstes ved at suge medium fra indeholdende celler. Medium fra brønd samles i et 50 ml TPP-rør, medium fra brønd samles i et andet rør, og medium fra brønd samles i et tredje rør. Eftersom der er en del celler, som er semiadhærente, skal hver brønd spules flere gange med koldt RPMI 1640, som også overføres til matchende rør. Der tages billeder af cellerne efter høst for at se, hvor meget der er høstet. Cellerne centrifugeres, og supernatanten hældes fra. Der resuspenderes i 200 μl PBS + 0,5 % BSA + 0,01 % natrium azid. Der måles nu, hvor meget der er i hvert rør. BSA (Bovine Serum Albumine) er et standardprotein, som benyttes for at reducere baggrunden af non-specifik binding af antistoffer. BSA dækker alle proteinbindende overflader, så antistoffer ikke kan binde til disse uspecifikt, fx på glas, rør og celleoverflader. Natrium azid er en form for konserveringsmiddel, der også hjælper med at holde bakterier ude. Natrium azid lammer også cellerne (og forhindrer dem derved i at fjerne overfladebundne antistoffer ved endo- eller exocytose). 10 μl trypanblåt overføres til 3 Eppendorfrør, og der tilsættes 10 μl cellesuspension til hvert rør; 1 med ASC, 1 med HEK og 1 med RP μl af blandingerne overføres til tællekammer, og cellerne tælles. 3 x 4 FACS-rør gøres klar med følgende: Rør med antistoffer Rør med isotyper CD14 FITC FITC Isotype CD80-PE-Cy5 20 μl PE-Cy5 isotype 20 μl 10 μl 10 μl HLA-DR-APC-H7 5 μl APC-H7 isotype 5 μl CD86-PE 20 μl PE isotype 20 μl CD83-APC 20 μl APC isotype 20 μl Herefter overføres størst mulig mængde fra hvert TPP-rør til ét FACS-rør indeholdende antistoffer, ét rør indeholdende isotyper, ét rør indeholdende CD14 FITC samt ét rør indeholdende FITC isotype. Rørene i n- kuberes i 30 minutter ved 4 C under sølvpapir, da antistoffer/isotyper er lysfølsomme. Herefter tilsættes 1,5 ml PBS + 0,05 % BSA + 0,01 % natriumazid til hvert rør, og der centrifugeres, og supernatanten hældes fra. Herefter tilsættes igen 1,5 ml PBS + 0,05 % BSA + 0,01 % natriumazid til hvert rør, og der centrifugeres, hvorefter supernatanten hældes fra. Pellet resuspenderes i 500 μl PBS før vortex, og cellerne er da klar til videre analysere på flowcytometer. qpcr (dag 16, 16/05) 1 μl udleveret celleprøve suspenderes i 99 μl H 2 O for at fortynde 1:100, hvilket letter cellefordelingen. Herefter forberedes mastermix for både HEK-celler og ASC. Denne skal kun laves én gang og ganges derfor med to; dette kan lade sig gøre, da det er samme mastermix, som bruges. Mastermix består af 25 μl super- 25

26 mix 25, bl.a. indeholdende SYBR Green, som binder til dobbeltstrenget DNA og vil fluorescere ved analyse. Der anvendes også to primere i form af en forward og reverse, som er en forudsætning for replikation af DNA-sekvenserne. Til sidst tilsættes miliq vand, som er renset for kalium og andre stoffer. Herefter blandes 28 µl mastermix og 25 μl cdna, og der tages herefter 25 μl af blandingen og tilsættes to brønde på PCRpladen. PCR-pladen er en 96-brøndsplade af polypropylen (for at cellerne får svært ved at adhærere). PCRpladen dækkes med tape for at sikre, at laseren kan læse resultaterne, hvorefter den centrifugeres i 2 min på rpm ved 4 C. Slutteligt sættes pladen i PCR-maskinen, hvor første trin i processen er ved 95 C i 5 min. Det næste trin sv.t. anden cyklus er 95 C i 10 sekunder, hvorefter temperaturen sænkes til 60 C i 30 sekunder. Dette gentages 45 gange, efter hver cyklus måles mængden PCR-produktet for til sidst at få en amplifikationskurve. Ved den tredje og sidste cyklus laves smeltekurver. 25 Supermixen indeholder: itaq DNA-polymerase, dntps, MgCl 2, SYBR Green I dye, enhancers, stabilizers og fluorescein 26

27 Farvning af celler Methylviolet anvendes i processen til cellekvantificering, hvor der ved samtidig tilsætning af eddikesyre (ethansyre) ses lysis af erythrocytterne, mens leukocytterne består. Methylviolet farver deres kerne, og de kan således tælles. Ved lysering af erythrocytterne opløses disse, idet membranen nedbrydes. Trypanblåt er en hyppigt anvendt metode til cellekvantificering in vitro. Trypanblåt farver udelukkende de døde celler, idet levende celler vil forblive ufarvede som følge af den sufficiente membran. Ved brug af denne farvemetode kan der ikke skelnes mellem nekrotiske og apoptotiske celler, idet farven blot trænger gennem den utætte cellemembran, hvor proteinerne i cytoplasmaet farves blåt (Kielberg, 2001). Flowcytometri Et flowcytometer bruges til fluorescensbaserede målinger på celler i en væskestrøm, som føres til et optisk måleområde, hvor overflademolekylerne mærkes med fluorescerende antistoffer rammes af laserstråler. Fluorescenscen måles vha. lysfølsomme sensorer, og de detekterede signaler bruges som i disse undersøgelser til at kvantificere ekspressionen af forskellige overflademolekyler på cellerne i form af datasæt. Under processen med flowcytometri fremkommer flere events i form af celler, og da ønskes en specifik cellepopulation (subpopulation) afgrænset i en såkaldt gate på et scatter plot. Akserne er defineret på baggrund af det reflekterede laserlys; forward scatter er afhængig af cellens yderstruktur, herunder størrelse og form, og side scatter er afhængig af intern cellestruktur, bl.a. granulering. Gaten kan fx defineres ved at trække simple punkter og linjer omkring den mængde, der selektivt ønskes adskilt til videre undersøgelse. Når cellerne skal analyseres tages aktuelt en cellesuspension, der har været behandlet med et eller flere antistoffer, så der således kan være bundet antistoffer til cellerne. Der er koblet fluorokrom (fluorescerende molekyler) til antistoffer med kovalente bindinger, og cellerne suges således op i flowcytometret, hvor cellerne enkeltvis passerer måleområdet. Fluorokromer absorberer (laser-)lys med en given bølgelængde og udsender lys med en anden bølgelængde. Ved at anvende flere forskellige antistoffer, som har tilkoblet hvert sit fluorokrom, kan forskellige antigener/cellemarkører påvises. Hastigheden er mellem og celler i sekundet, men den er samtidig afhængig af antallet af celler i cellesuspensionen, og derfor kan dataopsamlingen indeholde et varierende antal celler. Resultaterne bliver sendt til en computer, hvor de behandles i et computersystem. Nogle flowcytometre er også i stand til at isolere forskellige celletyper på baggrund af målingerne, og dette benævnes fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). 27

28 Antistoffer og isotypekontrol Antistoffer kaldes også immunglobuliner, forkortet Ig, og der findes fem forskellige klasser af immunglobuliner: IgA, IgG, IgD, IgM og IgE. De har alle den samme Y-formede grundstruktur bestående af to lightkæder og to heavy-kæder, som er bundet til hinanden med disulfidbindinger. Der findes 5 forskellige slags heavy-kæder: α-, δ-, ε-, γ- og μ-kæden. Således findes der også forskellige light-kæder, dog kun to typer: κ og λ. Et immunglobulinmolekyle indeholder altid heavy- og light-kæder af samme type, fx forekommer aldrig én α- og én γ-kæde i samme molekyle. Både heavy- og light-kæderne kan opdeles i domæneregioner. Heavy-kæderne α, δ og γ har 4 domæneregioner, som består af en variabel del, hvor antigenet binder, samt 3 konstante domæneregioner. Disse konstante regioner i γ-kæden findes i 4 forskellige sekvenser, hvilket giver IgG (som har γ-kæder som tunge kæder) 4 subklasser. Tilsvarende kan IgA også have 2 forskellige sekvenser i α-kædernes konstante domæneregioner og findes derfor i 2 subklasser. De to heavy-kæder ε og μ har hele 4 konstante domæneregioner, dog har disse ingen hængselregion. Light-kæderne har én variabel og én konstant domæneregion. Der er altså hos mennesket i alt 9 forskellige heavy-kæder og 2 forskellige light-kæder. Dette giver 18 mulige kombinationer af heavy- og light-kæder. Hver af disse kaldes en immunglobulinisotype (Agger 2011). Figur 4: Immunglobulinmolekyle med forskellige domæneregioner (Agger, 2011) Når der tales om isotypekontrol i forbindelse med flowcytometri, anvendes foruden det egentlige primære antistof et kontrolantistof, der grundlæggende har samme molekylære struktur. Forskellen findes i den region, hvortil der kan bindes antigen, og der vil da være variationer i specifik hhv. uspecifik binding. Primære antistof og isotypekontrol skal tilsættes i samme koncentrationer, og begge skal være konjugeret med samme type og mængde fluorokrom for at kontrollere resultater. Isotypekontrol er således en form for negativ kon- 28

29 trol, der kan bruges til at undersøge og vurdere bindingspotentiale, altså hvorvidt bindingen mellem antigen (overflademarkør) og antistof er specifik. Med andre ord bruges en isotypekontrol til at vurdere størrelsen af et ikke-specifikt baggrundssignal forårsaget af primære antistoffer, idet isotypen kan være mod en ikkehuman struktur 26. Markører i forsøget I forhold til det aktuelle forsøg ønskes påvist en eventuel forekomst af kendte markører for dendritiske celler (DC) samt monocytter, hvor antistoffer og tilsvarende isotypekontrol til følgende er taget i betragtning: - CD14 27 : Blandt de celler, der bærer denne receptortype, kan nævnes makrofager og monocytter. Hvis denne receptor påvises, er der sandsynlig forekomst af monocytter, som ikke er udviklet til DC. - CD80: Denne receptor kommer til udtryk på aktiverede B-celler samt DC. Positivt resultat for denne vil muligvis tyde på DC i prøven. - CD83: Findes på modne DC (samt aktiverede T- og B-celler); det er dermed et udtryk for, hvorvidt de dendritiske celler er modne. - CD86: Denne kommer til udtryk på DC, monocytter og aktiverede B-celler. Derfor vil et positivt resultat for denne kunne indikere forekomst af DC. - HLA-DR: HLA står for Human Leukocyttype system A. HLA-DR er en type af MHC-klasse II, og det er involveret i antigenpræsentation. MHC II findes på alle antigenpræsenterende celler, dvs. DC, makrofager og B-celler. Ved påvist HLA-DR er der således antigenpræsenterende celler tilstede. PCR og qpcr PCR (Polymerase Chain Reaction) er én af de mest anvendte diagnostiske metoder og en grundsten i basal biologisk DNA-forskning. Kort fortalt kan man med denne metode finde et ønsket DNA-segment ud fra en forholdsvis lille mængde DNA, som da fordobles i hver cyklus, hvor det amplificerede stykke betegnes a m- plicon. Typisk forudsætter teknikken, at de flankerede DNA-sekvenser kendes, og der skal biokemisk være fremstillet to primere, der ca. indeholder 20 basepar og der hybridiserer 28 til hver DNA-streng. PCR udføres i en termocykler ved at gentage cykliske processer bestående af varmesmeltning af det dobbeltstrengede DNA. Dette ved ca. 95 C, hvor der sker en denaturering 29 med dannelse af to enkeltstrenge. Herefter bindes de to primere til hver sin DNA-streng (hybridisering) ved en hurtig sænkning af temperaturen til C. Slutteligt syntetiseres ny dobbeltstrenget DNA ved primerforlængelse (70-75 C), hvor en varmeresistent DNA-polymerase er baggrund for syntesen, der foregår i templatens 3 til 5 -ende (primerne er bindingssteder for DNA-polymerasen). Den anvendte polymerase er Taq polymerase (navnet af bakterien 26 set 28/ set 28/05 28 Alsbjørn et al, Sprængning af hydrogenbinding 29

30 Thermus aquaticus), som grundet stabilitet og funktionalitet ved højere temperaturer er anvendeligt i den komplementære forlængelse 30 og DNA-opformering ved PCR. Denne kræver tilstedeværelse af magnesium som co-faktor. Syntesen foregår da ud fra enkeltstrenget DNA som template ved samtidig tilstedeværelse af primer (Agger, 2011). I dette projekt udføres aktuelt qpcr, der også kaldes for RT-PCR (Real Time PCR). qpcr kombinerer almindelig PCR amplifikation med påvisning, så det ikke er nødvendigt at detektere PCR-produkter efterfølgende. Derved bliver de kvantitative resultater mere præcise. Man bruger fluorescerende farve til at markere PCR-produkterne under de termiske cyklusser, og der kan således måles på mængden af fluorescerende signal under den eksponentielle fase af reaktionen (hvor der sker en fordobling af produkt); man måler herved på produktet, mens reaktionen foregår, heraf også navnet Real Time PCR. Ved almindelig PCR kan man først måle data efterfølgende i plateau-fasen. I denne fase er reaktionen stoppet, og der dannes ikke mere produkt 33. Til at markere PCR-produkterne er anvendt SYBR Green. SYBR Green binder sig til the minor groove af dobbeltstrenget DNA, og det udsender kun fluorescens, når det er bundet hertil. SYBR Green bindes dog til al dobbeltstrenget DNA, og fluorescens er således proportional med mængden af dobbeltstrenget DNA. Figur 5:Billedet illustrerer DNA dobbelt helix med angivelse af minor groove (Vivi et al, 2001) 30 set 27/ set 27/

31 Der tages udgangspunkt i cdna (complementary DNA; copy DNA), som er DNA syntetiseret forud for selve PCR-processen og specifikt på baggrund af genetisk mrna oprenset fra de oprindeligt udleverede celler. Der er således ikke forekomst af intron-sekvenser, idet der med enzymet revers transkriptase syntetiseres enkeltstrenget DNA ud fra RNA-skabelonen. I forløbet med qpcr testes der for, hvorvidt cellerne udtrykker Transforming Growth Factor i form af TGF-β, som er et protein med funktion i de fleste celler, herunder kontrol af bl.a. proliferation og cellulær differentiering. Flere væv udtrykker således en betydelig ekspression af det kodende gen for TGF-β, der som cytokin også har en effekt i forhold til immunitet og cancersygdomme, og kan i forhold til sidstnævnte opfattes som en antiproliferativ faktor i normale epithelceller og i tidlige onkogenetiske stadier (cancerceller kan ses at have øget produktion af TGF-β og virke autokrint samt parakrint; signaleringsmekanismen er da muteret, og TGF-β kontrollerer ikke længere cellen). Studier har vist, at TGF-β har en nedregulerende virkning på en række forskellige immunreaktioner, bl.a. aktivering og proliferation af T-celler (Tran, 2011). Det kan derfor være relevant at undersøge, hvorvidt ASC udtrykker TGF-β, idet dette cytokin måske også kan have betydning ift. ASCs immunmodulerende effekt på DC set 28/

32 Laboratoriesikkerhed Ved laboratoriearbejde skal sikkerheden og de gældende regler til enhver tid overholdes. I laboratoriet skal der altid bæres indendørssko, helst lukkede sko med hælkappe for at mindske uheld. Desuden skal der altid bæres kittel i laboratoriet, og denne skal tages af udendørs; efter endt brug autoklaveres kitlen. Der skal også bruges handsker til størstedelen af laboratoriearbejdet. Øvrige regler for arbejde i laboratoriet er at finde i den udleverede laboratoriehåndbog. Når der arbejdes i laboratoriet er det vigtigt at de forskellige kemikalier samt redskaber bliver håndteret korrekt, både under og efter brug (affaldssortering). Der er forud for laboratoriearbejdet lavet en analysebrugsanvisning (bilag 15) indeholdende både H/R sætninger og en guide til, hvilke affaldsgrupper disse er tilhørende (for at kunne behandle alle kemikalier på den rette måde). Der er udarbejdet en kemisk APV til håndtering af farlige stoffer (bilag 14). Ved uheld er det vigtigt at vide, hvor der forefindes førstehjælpskasser, øjenskyl m.m., som skal være tilgængelige. Skader behandles i overensstemmelsen med anerkendte retningslinjer for førstehjælp. 32

33 Resultater og resultatbehandling I dette afsnit behandles resultaterne fra forsøget med inddragelse af mikroskoperede billeder af cellerne fra de forskellige dage. Det anvendte mikroskop er af mærket Olympus CKX41, hvor der er påsat et kamera AxioCam ERc 5s. Billederne er hentet i programmet AxioVision Rel Billede 2: Viser monocytter på dag 2 inden tilsætning af medium og cytokiner. 10 x zoom Billede 3: Viser celler på dag 6, hvor der er blevet tilsat cytokiner; cellerne er ved at differentiere til DC. 40 x zoom Billede 4: Dag 6 hvor celler er blevet løsnet 10 x zoom 33

34 Billede 5: Billedet er fra dag 7, hvor celler er dyrket i RP10 medium; inden vask. 20 x zoom Billede 6: Her ses celler på dag 7, dyrket i HEKkonditioneret medium; inden vask. 20 x zoom Billede 7: Viser celler på dag 7, der er dyrket i ASCkonditioneret medium; inden vask. 20 x zoom 34

35 Billede 8: Viser celler dyrket i RP10 medium; efter vask. 40 x zoom Billede 9: Viser celler på dag 7, dyrket i HEK konditioneret medium; efter vask. Her ses DC med udløbere. 40 x zoom Billede 10: Viser celler dyrket i ASC-konditioneret medium dag 7; efter vask. Cellerne frembyder en mere afrundet form. 40 x zoom 35

36 De følgende resultater er fra flowcytometri og udelukkende fra eget forsøg (for andre gruppers resultater, se bilag 10-12). På graferne ses en blå kurve, som repræsenterer det udtrykte antistof og en rød kurve, som repræsenterer isotypen til denne. På figur 24 ses desuden en orange kurve, som repræsenterer monocytpopulation. På y-aksen ses celleantal, og på x-aksen ses mængden af den udtrykte cellemarkør. Figur 6: Illustrerer gaten for dendritiske celler dyrket i RP10 medium. Figur 7: Illustrerer HLA-DR (MHC II), ved celler dyrket i RP10 medium Figur 8: Illustrerer CD80, ved celler dyrket i RP10 medium Figur 9: Illustrerer CD83, ved celler dyrket i RP10 medium 36

37 Figur 10: Illustrerer CD86, for celler dyrket i RP10 medium Figur 11: Illustrerer CD14, ved celler dyrket i RP10 medium Histogrammer for cellerne dyrket i RP10 medium viser, at hele HLA-DR kurven er forskudt mod højre i forhold til isotypekontrol-prøven. Deraf kan vi konkludere, at stort set alle de tilstedeværende celler udtrykker HLA-DR, i hvilket er i overensstemmelse med det forventede, nemlig at cellerne har udviklet sig til dendritiske celler, som jo er HLA-DR positive. For at vise, om det er dendritiske celler, er der også undersøgt for CD80, som er en co-stimulerende faktor relateret til dendritiske celler (samt modne T- og B-celler). I forbindelse med analysen er der også undersøgt for CD83 og CD86, som begge fremstår positive og dermed bekræfter, at der er tale om dendritiske celler. Ved CD83 ses dog to populationer i form af en positiv og en negativ. I tillæg er undersøgt for CD14, som ligeledes indikerer dendritiske celler grundet negativitet (CD14 er positiv for monocytpopulation). 37

38 Figur 12: Illustrerer gaten for DC, dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler Figur 13: Illustrerer histogrammet HLA-DR (MHC II), dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler Figur 14: Illustrerer histogrammet for CD80, dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler Figur 15: Illustrerer histogrammet for CD83, dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler 38

39 Figur 16: Illustrerer histogrammet for CD86, dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler Figur17: Illustrerer histogrammet for CD14, dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler For celler dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler undersøges der for samme parametre som ved RP10 medium for optimal sammenligning. Igen er HLA-DR positiv, da hele kurven er forskudt mod højre i forhold til isotypekontrol-prøven, det tyder på at der er antigenpræsenterende celler tilstede. CD80 er positiv, hvilket kan tyde på, at der er DC tilstede. CD83 er både positiv og negativ, og det kan give indtrykket, at nogle af cellerne er modnet tilstrækkeligt til at udtrykke CD83, mens andre er umodne (eller ikke modne i samme grad). CD86 viser sig ved to populationer, hvilket igen kan tyde på modningsforskelle. Derudover viser CD14 sig igen at være negativ, og det kan dermed tyde på, at der er dendritiske celler. 39

40 Figur 18: Illustrerer gaten for celler dyrket i konditioneret medium fra ASC-celler Figur 19: Illustrerer gaten for celler dyrket i konditioneret medium fra ASC-celler. Her er der kontrolleret for CD14, og det ses, at der er opstået en population af monocytter Figur20: Illustrerer histogrammet for HLA-DR (MHC II), hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium fra ASC Figur 21: Illustrerer histogrammet for CD80, hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium fra ASC 40

41 Billede 22: Illustrerer histogrammet for CD83, hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium fra ASC Billede 23: Illustrerer histogrammet for CD86, hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium fra ASC Billede 24: Illustrerer histogrammet for CD14, hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium fra ASC 41

42 Ovenfor ses resultater for dendritiske celler dyrket i konditioneret medium fra ASC og med måling af samme parametre. Ved HLA-DR ses to populationer, en negativ og en positiv, så der er formentlig antigenpræsenterende celler i prøven. CD80 viser også to populationer, og det kan indikere, at der både forefindes monocytter og et antal celler, der ikke er fuldt udviklede dendritiske celler. Ligeledes er der ved CD83 også to populationer i form af en stor negativ og en lille negativ, hvilket kan være udtryk for, at der ikke er mange modne dendritiske celler. For CD86 ses en stor positiv population, og det kan omvendt tyde på, at der er dendritiske celler men da CD86 også udtrykkes af monocytter, kan dette også forklare resultatet. Det tages i betragtning, at CD14 udviser en positiv monocytpopulation, hvilket til dels forklarer resultaterne; gaten for CD14 er medtaget, se figur 19. qpcr Der er som basis udført PCR med undersøgelse af to referencegener, YWHAS og PPIA, se figur Disse to gener forventes at være positive og konstant udtrykt i alle forsøgets celler, og det vil da være muligt at korrigere for varierende antal celler (og dermed mrna) i de enkelte prøver. Herunder er angivet amplifikationskurver, figur 25-26, hvor der ad x-aksen ses antal cyklusser, og ad y-aksen (logaritmisk skala) ses antal relativt fluorescerende units (RFU). For begge gener ses en tydelig ekspression og gennemgående plateaufase efter cyklus 30. I forhold til baseline, defineret som de første 3-15 cyklusser, ses små udsving i signaler, der kan tolkes som baggrundsstøj i reaktionen, muligvis genereret af PCR-maskinen. Kurverne for begge gener er til dels forskudte, hvilket skyldes den forskellige startkoncentration. På figur 25 ses muligvis en defekt prøve, idet der er et udsving i baseline efter de resterende prøver er overgået til den ekspotentielle fase. Figur 25: Amplifikationskurver for YWHAZ Figur 16: Amplifikationskurver PPIA Ligeledes er der for ovennævnte referencegener angivet smeltekurver samt kurver for smelte-peak, figur PCR-produkterne ses at have samme længde, idet de smelter ved samme temperatur, og det indikerer også, at der måles på et specifikt genprodukt. Smelte-peaks er ensartede og udtryk for den temperatur, hvor halvdelen af DNA et er denatureret. Det bemærkes, at der på disse figurer for referencegen YWHAZ findes linjer følgende x-aksen som udtryk for manglende produkt. 42

43 Figur 27: Smeltekurver for YWHAZ Figur 28: Smeltekurver for PPIA Figur 29: Smelte-peaks for YWHAZ Figur 30: Smelte-peaks for PPIA Med udgangspunkt i ovenstående referencegener kan det med rimelighed vurderes, at systemet fungerer tilfredsstillende. Som tidligere anført er det relevant at undersøge, hvorvidt cellerne udtrykker TGF-β, og figuren herunder viser amplifikationskurver for dette cytokin. I forhold til baseline er der mere udtalte udsving, og et større antal cyklusser er nødvendige for at opnå et målbart fluorescerende signal. Det betyder, at der er meget lidt TGF-β i prøverne. Der ses en forskydning af de grønne kurver som udtryk for, at de enkelte prøver udviser variation i startkoncentration. Figur 31: Amplifikationskurver for TGF-β Som for de to referencegener er der ligeledes lavet smeltekurver og smelte-peaks for TGF-β, og de grønne kurver indikerer, at PCR-produkterne er af forskellig længde grundet spredning i smeltetemperatur. Alle 43

44 DNA-molekyler er smeltet ved ca. 90 ºC, men smelte-peaks er meget varierende, hvilken kan være udtryk for en noget uspecifik reaktion som følge af en eventuel manglende forekomst af TGF-β. Figur 32: Smeltekurver for TGF-β Figur 9: Smelte-peaks for TGF-β 44

45 Diskussion Diskussionsafsnittet tager udgangspunkt i resultaterne fra flowcytometri og PCR. Egne resultaterne sammenlignes med andre gruppers og sættes i relief til eksisterende litteratur og forskning samt tidligere studier. Figurerne 7, 13 og 20 illustrerer, hvorvidt HLA-DR kommer til udtryk på cellerne, hvor de er dyrket i RP10 hhv. konditioneret medium fra HEK-celler samt ASC. Det vises, at HLA-DR kommer til udtryk på samtlige grafer/histogrammer, og det kan derfor tyde på, at cellerne er antigenpræsenterende. Hvorvidt det er dendritiske celler (DC) kan ud fra denne ene betragtning være vanskeligt at afgøre, idet HLA-DR findes på alle antigenpræsenterende celler (bl.a. på aktiverede B-celler). På figur 20 ses en negativ population af HLA-DR; dog er der i denne prøve påvist monocytter jf. gaten. For at afgøre, om der reelt set er tale om DC, analyseres for den co-stimulerende faktor CD80. Ved sammenligning med CD80 på figurer 8, 14 og 21, kommer denne også til udtryk på alle grafer. På figur 21 ses en lille negativ population, der muligvis kan sættes i sammenhæng med den pludseligt opståede population af monocytter. Eftersom både HLA-DR og CD80 er positive, kan det tyde på, at der er modnede DC; dette kan kontrolleres ved at tjekke ekspression af CD83, CD86 samt CD14. CD83 kommer til udtryk på modne DC, og dette vurderes på figurerne 9, 15 og 22, hvor der gennemgående er udtrykt i CD83 i én eller anden grad. Overvejende ses en stor negativ population af CD83 samt en mindre positiv population af CD83. Ved celler dyrket i konditioneret medium fra ASC ses dog en lidt mere positiv population (figur 22). Tilstedeværelsen af dendritiske celler kan betragtes ud fra en eventuel detektion af CD86. Figurer 10, 16 og 23 illustrerer to populationer; en mindre, som udtrykker CD86 i svag grad, mens en større er markant positiv for CD86. På figur 23, hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium fra ASC, ses kun én population, hvor CD86 udtrykkes kraftigt (og da CD86 ydermere kommer til udtryk på monocytter, kan det være den reelle situation). Billede 9 og 10 viser desuden, at der er dendritiske celler tilstede efter dag 7, hvilket kan ses på deres lange udløbere samt lamellipodier. Supplerende kan der undersøges for, hvorvidt cellerne udtrykker CD14, hvilket er en indikator for monocytter. På figurerne 11, 17 og 24 er denne negativ, cellerne må da være differentierede til DC. På figur 24, hvor cellerne er dyrket i konditioneret medium, ses dog en tydelig positiv population sv.t. monocytter. 45

46 At der er monocytter i ASC stemmer godt overens med de resultater fra HLA-DR, CD80, CD83, CD86 samt CD14. På gaten er der vist en population af monocytter, og på graferne ses der populationer, der kan tyde på, at der er nogle monocytter, der ikke er blevet modne. Den pludselige opståen af monocytpopulationen kan muligvis forklares med henvisning til et tidligere studie (Jiang, 2005), der behandler denne problemstilling og argumenterer for, at DC med oprindelse fra CD14 + monocytter og makrofager frit kan omdannes til hinanden, såfremt de pågældende DC ikke er modnede. Da dette kun ses ved ASC dyrkede monocytter, tyder det på, at den har en nedregulerende virkning på modningen af de dendritiske celler. Litteratur og en række studier har tidligere behandlet problemstillingen, som er helt central i dette projekt, aktuelt om der kendes en nedregulerende effekt på modningen af DC. I litteraturen (Zhang, 2004) er bl.a. påvist, at supernatanten (sv.t. det konditionerede medium) ved tilsætning 48 timer før modning af DC har en inhiberende effekt på molekylerne CD40, CD80, CD86 og HLA-DR. Dette har dog ikke umiddelbart været muligt at genskabe i eget projekt, hvilket skal korreleres med mulige fejlkilder. Bl.a. kom der under høstni n- gen af cellerne (dag 7) et ukendt antal HEK-celler i centrifugerøret med ASC i forsøget på at få de sidste celler op fra brønden, og der var i øvrigt mange celler, der sad så godt fast i brønden, at det ikke var muligt at skylle dem løse (bekræftet ved mikroskopi). Det er dog svært at vurdere, hvorvidt det har haft en reel betydning for vores resultater. En anden fejlkilde kan være, at forsøgsdeltagerne ikke har været øvede i pipettering, og det kan derfor betyde forskelle i tilsatte mængder, og celler kan muligvis være gået tabt. Da projektet er en del af et større projekt sammenlignes egne resultater med udfald af andre opstillinger. Først og fremmest sammenlignes vores resultater med resultaterne fra den gruppe, hvis forsøg mindede mest om vores; opsætningen var den samme, bortset fra at konditioneret medium blev tilsat ved forsøgets start (dag 0) (for resultater, se bilag 10). For DC dyrket i RP10 medium er resultaterne tilnærmelsesvis ens, omend denne gruppe har populationer, hvor isotypen ved HLA-DR binder uspecifikt, hvilket rejser spørgsmålet, om den anvendte isotype er den bedste til formålet; men af ressourcemæssige årsager var det den tilgængelige mulighed. Hvor DC er dyrket i konditioneret medium fra HEK-celler ses tre populationer i isotypen, og det kan da tyde på, at den binder uspecifikt. Der er et fåtal af celler positive for HLA-DR, og for CD80 samt CD86 observeres positive populationer, mens der ved CD83 findes en stor, negativ population samt en lille, positiv population. Ved måling på CD14 kan den tolkes som værende lidt positiv, og det er en plausibel forklaring, at der er tilbageværende monocytter. Slutteligt er der lavet undersøgelser, hvor DC er dyrket i konditioneret medium fra ASC. Her viser resultaterne igen flere populationer i isotypen for HLA-DR, og det tyder ydermere på, at de fleste celler er positive for HLA-DR, da der ses en stor population til højre for isotypen. Ved CD80, CD83 og CD86 er der overvejende positive populationer, mens CD14 FITC fra ASC konditioneret medium er positiv og en anelse kraftigere end den tilsvarende DC population efter tilsætning af HEK-konditioneret medium. Den lille population af monocytter er kraftigt positiv for CD14. 46

47 Der er således ikke entydig overensstemmelse mellem resultater og litteratur, idet resultaterne for både vores forsøg samt forsøget med konditioneret medium tilsat dag 0 viser, at der ikke sker en nedregulering af modningen af DC. Det ses endda, at der ved gruppen med konditioneret medium tilsat dag 0 tilnærmelsesvis er sket en opregulering af CD83. Med henvisning til en tidligere publikation (Puissant et al, 2004) havde en mere udtalt nedregulering af DC været forventeligt, hvor konditioneret medium er tilsat dag 0; men resultater viser det modsatte. I en anden opstilling er monocytter med ASC hhv. HEK-celler blevet dyrket i co-kultur 35 (se bilag 11). Her viser resultater for cellerne dyrket i RP10 medium positivt udslag for HLA-DR, CD80, CD83 og CD86, selvom der ved CD83 også ses en stor negativ population. Derudover er CD14 at betragte som negativ, hvi l- ket tyder på modning af DC. Hvor DC er dyrket med HEK-celler observeres positive populationer af HLA- DR, CD80 og CD86, mens CD83 er negativ. Ved dyrkning af DC sammen med ASC ses der på resultaterne udelukkende negative populationer. Her er dog ingen udført CD14 FITC kontrol, og derfor kan der potentielt have været andre celler end DC. Derudover blev der lavet et forsøg, hvor der undersøgtes for indirekte cellekontakt ved hjælp af transwell inserts (se bilag 12). HLA-DR er positiv, dog med en lille population, der binder uspecifikt. CD80, CD83 og CD86 er ligeledes positive, mens CD14 FITC (kontrol) viser en lille population af monocytter, hvilket også kan forklare den uspecifikke population i HLA-DR. DC dyrket med HEK-celler i inserts viser delvist en positiv population af HLA-DR, men med 3 populationer i isotypen. CD80, CD83 og CD86 er positive, og CD14 FITC er overvejende negativ, men der viser sig en ekstra population af monocytter. DC dyrket sammen med ASC i inserts viser positivitet for HLA-DR med to isotype-populationer. CD80 og CD83 er negative, mens der ved CD86 ses en mindre negativ population samt en større positiv population. Dette kan forklares ved, at DC med lav densitet isoleret efter dyrkning in vitro udtrykker CD86, men ikke CD80 (McLellan, 1995). CD14 FITC viser igen en ekstra population af monocytter, og dette kan ligeledes forklares ud fra tidligere studier (Jiang, 2005). Som beskrevet menes DC med oprindelse fra CD14 + monocytter og makrofager frit at kunne omdannes til hinanden, såfremt de pågældende DC ikke er modnede og her kan det tyde på, at det er sket med en større effekt, end hvor det konditionerede medium er tilsat dag 6. Den for ASC inhibitoriske effekt er med rimelighed påvist i forsøget med co-kultur, hvilket stemmer overens med fund i tidligere studier, der observerer suppression i både co-kultur og inserts, hvor co-kulturforsøget vistes mest inhiberende (Jiang, 2005). Da det ikke var muligt at sammenligne resultaterne med CD14 FITC kontrol, kan det dog i princippet have været en anden type celler, der blev inhiberet. 35 Celle-celle kontakt 47

48 Ved transwell inserts samt co-kultur spiller antallet af ASC en rolle i den inhibitoriske effekt. I forhold til førnævnte artikler er der uenighed om forholdet mellem monocytter og ASC. I forsøg, hvor rationen har været 1:10, var differentieringen helt blokeret (Jiang, 2005). Dette skete dog også ved referencerne 1:20 og 1:40. De forsøg som blev udført i forbindelse med denne rapport, var forholdet mellem monocytter og ASC 1:20 for co-kultur og transwell inserts. Til flowcytometri er der anvendt på forhånd definerede anti-cd-antistoffer til målingerne. Som angivet under teoriafsnittet om DC er CD40 involveret i opreguleringen af CD80 og CD86, og hvis CD40 således ikke bliver udtrykt, vil CD80/86 derfor heller ikke komme til udtryk på cellerne. Det er ikke usandsynligt, at CD40 endvidere må være nedreguleret, hvorfor der ved flowcytometri kunne være målt på dette sammen med de andre parametre. For optimering og større validitet af resultater kunne forsøgene have været gentaget, men af tidsmæssige årsager var dette ikke muligt. Såfremt det ønskes at genskabe resultaterne, vil der formentlig ses udsving og variation i de enkelte værdier. Det skal også anføres, at der grupperne imellem ikke blev anvendt blod fra samme individ, hvilket kan have let indvirkning på forekomst og fordeling af blodceller. qpcr I forhold til resultater kan det ikke udelukkes, at TGF-β udtrykkes af cellerne (ASC hhv. HEK), men i så fald er det i meget lille mængde. Der er således ikke tale om tendens til massiv ekspression, og det er derfor næppe TGF-β, der spiller en rolle i det opstillede forsøg. Med henvisning til tidligere teoriafsnit om DC er det anført, at cytokinet IL-10 har en blokerende effekt på modningen af disse. Det kunne derfor have været mere relevant at undersøge ekspressionen af dette gennem PCR. I forsøget er anvendt SYBR Green som fluorescerende markør, og dette kan være forbundet med visse problemstillinger. Én betydelig ulempe er, at primerne binder relativt uspecifikt til DNA, så signalet kommer ikke nødvendigvis kun fra det ønskede produkt. Alternativt kunne denne begrænsning have været elimineret ved yderligere brug af en helt specifik hybridiseret probe, der er en DNA- eller RNA-sekvens af varierende længde. Denne kan komplementært bindes til et enkeltstrenget "target", som er den nukleotidsekvens i prøven, hvis tilstedeværelse ønskes undersøgt. Hvorvidt proben er hybridiseret til målsekvensen kan efterfølgende klarlægges med udgangspunkt i probens markør, der kan være radioaktiv eller fluorescerende. Hvis det fx tilstræbes at teste, hvorvidt en primer er dårligt designet, kan en såkaldt positiv kontrol udføres. Hermed henvises til en celleprøve, hvor der med sikkerhed udtrykkes TGF-β. Dermed kan det i forhold til dette projekt ikke endeligt konkluderes, om der reelt set ikke var tilstedeværelse af TGF-β, eller hvorvidt primeren var insufficient. Det skal da nævnes, at der forekommer støj (dvs. mere end ét peak på kurven for smelte-peaks) i forsøgets prøver med TGF-β, og det tyder på flere produkter. Disse produkter kan bl.a. 48

49 være i form af primer dimer, hvor to primere binder uspecifikt til hinanden, hvilket oftest forekommer i prøver uden template eller blot kan primerne have bundet til andet produkt (som ikke burde være til stede). Andre forhold, der kan føre til misvisende resultater, omfatter kontaminering i selv lille grad. 49

50 Konklusion I dette forsøg om adipøse stamcellers påvirkning på immunsystemet var formålet at undersøge effekten af tilsat konditioneret medium til monocytkultur på dag 6. Der kunne overordnet ikke observeres nogen forskel mellem ekspressionen af de undersøgte overflademarkører på dendritiske celler fra kontrolkulturerne og dendritiske celler fra kulturerne tilsat HEK-konditioneret medium. For de kulturer, hvor der blev tilsat ASCkonditioneret medium, udtryktes de fleste overflademarkører på samme niveau som RP10-behandlede celler og de HEK-behandlede celler. Dog var der én iøjnefaldende forskel i relation til markøren CD14. Tilsætning af konditioneret medium fra ASC øger tilsyneladende ekspressionen af CD14 på DC (se figur 24, 11, 17), samtidig med at der i disse kulturer forekommer en tydelig population (se figur 19), af CD14 + som kendetegnet ved monocytter eller monocytlignende celler. Denne population forekommer ikke i kontrolkulturerne eller de kulturer, som har fået tilsat HEK-konditioneret medium. Det tyder dermed på, at konditioneret medium fra ASC udskiller nogle faktorer, som får dendritiske celler til at antage en mere monocytlignende fænotype og måske endda får en lille population til at revertere til monocytter. Der kan desværre ikke konkluderes noget på baggrund af resultaterne fra qpcr. 50

51 Perspektivering Stamcellebaseret terapi har i fremtiden potentiale til at forandre succesraten for behandlingen af en række sygdomme, idet stamceller specifikt kan modulere immunforsvaret og det inflammatoriske respons, hvilket bidrager til stamcellers reparerende og regenerative virkninger (Mizuno H, 2012). Idet embryonale stamcellers anvendelse er begrænset af en række tekniske og etiske forhold, har voksne stamceller, særligt de mesenkymale stromale celler, fået større opmærksomhed i de seneste år (Mizuno H, 2012). Blandt mesenkymale stamceller findes de adipøse stamceller, der på mange måder minder om knoglemarvs-deriverede stromaceller, dog med den forskel, at de adipøse stamceller frembyder nogle tekniske fordele, idet de lader sig høste på en langt nemmere og mindre invasiv måde end knoglemarvens celler. Desuden kan de adipøse stamceller høstes i større mængder end øvrige stamceller. På trods af deres mesenkymale natur, kan adipøse stamceller differentiere til mange andre former for celletyper såsom vaskulære, endotheliale, chondrogene, hepatiske, epitheliale, myogene, osteogene, neuronale, pankreatiske, endokrine, kardiogene, periodontale, tendinære og hæmatopoietiske celler (Mizuno H, 2012; Yarak S, 2010; Gimble JM, 2012). Således kan man potentielt set benytte adipøse stamceller til at erstatte ødelagte, syge eller døde celler, næsten uanset hvilket organ, der har behov for regeneration. Mange forbinder stamceller med deres multipotente evne til at skabe nye, differentierede erstatningsceller, der kan regenerere ødelagte væv. Men nyere forskning peger på, at de adipøse stamcellers parakrine virkninger formentligt udgør de vigtigste terapeutiske mekanismer, fordi de regulerer immunforsvarets celler og især de specifikke og antigenpræsenterende dele af immunapparatet, hvortil de dendritiske celler henregnes (McIntosh KR, 2013; Mizuno H, 2012; Tobita M, 2011; Yarak S, 2010). Hvilke opløselige faktorer, der secerneres, hvornår eller hvor længe, og i hvilke koncentrationer, vil afhænge af det mikromiljø, som de adipøse stamceller omgives af eller transplanteres til, idet stamcellerne tilpasser sig de lokale molekylære omgivelser og eventuelt tilstedeværende inflammation, hvilket afspejler stamcellernes store adaptation og plasticitet (McIntosh KR, 2013; Mizuno H, 2012; Tobita M, 2011; Yarak S, 2010; Gimble JM, 2012). Det betyder, at adipøse stamceller reagerer anderledes, såfremt de anbringes i et proinflammatorisk versus et anti-inflammatorisk eller non-patologisk mikromiljø (Yarak S, 2010; Gimble JM, 2013; Ryu HH, 2009; Ikegame Y, 2011; Kim JM, 2007; Gir P, 2012). Via sine parakrine mekanismer inhiberer adipøse stamceller de monocytderiverede dendritiske celler, der er blandt kroppens mest potente antigenpræsentatorer og dermed regulator af T-lymfocytters inflammatoriske aktivitet. Dette er påvist in vitro ved at co-kultivere stamcellerne med dendritiske celler (Ivanova-Todorova E, 2009; Peng W, 2012), og de samme virkninger er genfundet i in vivo forsøg ved forskellige inflammatori- 51

52 ske sygdomsmodeller på dyr, hvor en terapeutisk applicering af adipøse stamceller har haft gavnlige immunmodulerende effekter samtidigt med at det kliniske respons blev forbedret (Gimble JM, 2012; Gimble JM, 2013). Studier viser, at adipøse stamceller hæmmer dendritiske celler mere effektivt og potent end andre mesenkymale stamceller (Ivanova-Todorova E, 2009), og derfor kan man på sigt forestille sig, at adipøse stamceller vil kunne anvendes i kliniske behandlingsstrategier til at inaktivere immunapparatets specifikke dele, heru n- der primært de dendritiske celler og desuden T-cellerne (McIntosh KR, 2013; Mizuno H, 2012; Tobita M, 2011; Yarak S, 2010; Gimble JM, 2012; Gimble JM, 2013). Dette forventes at kunne optimere behandlingen af autoimmune og pro-inflammatoriske tilstande samt problematikken ved organafstødning i forbindelse med allogen transplantation (Ivanova-Todorova E, 2009; Peng W, 2012). De adipøse stamcellers immunsupprimerende effekt har således et meget stort klinisk og immunologisk anvendelsespotentiale (Gimble JM, 2012; Gimble JM, 2013; Ryu HH, 2009; Ikegame Y, 2011; Kim JM, 2007; Gir P, 2012; Ivanova-Todorova E, 2009; Peng W, 2012). Samlet set er der således en stigende mængde data, der peger på adipøse stamceller som et nyt værktøj indenfor cellebaseret immunterapi af en lang række forskellige patologiske tilstande, selvom disse endnu har til gode at blive valideret i kliniske forsøg med patienter. Der eksisterer således relativt få kliniske faseforsøg med patienter, der modtager stamcelletransplantation, hvilket bl.a. skyldes at der endnu mangler væsentlig viden om de adipøse stamcellers inflammatoriske og patologisk-biologiske respons. Dertil kommer, at ingen endnu har fastslået, hvorvidt de adipøse stamceller er tilbøjelige til at danne tumorceller, hvilket desværre er en potentiel risiko ved anvendelsen af stamcelleterapi (Tobita M, 2011; Yarak S, 2010; Gir P, 2012). Således er der p.t. ingen enighed eller afklaring i forhold til cancerrisikoen ved at anvende adipøse stamceller i mennesker, men idet der foreligger studier, som har vist at adipøse stamceller bidrager uhensigtsmæssigt til tumorvækst, tumorinvasion og metastaser, er der således en del undersøgelser, som skal gennemføres inden man kan applicere og implementere de eksperimentelle resultater i klinikken (Tobita M, 2011; Yarak S, 2010; Gir P, 2012). Dette kan muligvis have noget at gøre med den immunsupprimerende effekt, idet der er evidens for interaktioner mellem cancerceller og immunsystemet. Skulle det vise sig at være sikkert at anvende adipøse stamceller indenfor den kliniske regenerative og a n- vendelig medicin, er der ingen tvivl om, at disse stamceller besidder et meget lovende terapeutisk potentiale. 52

53 Litteraturliste Agger R et al. Immunologi, Munksgaard Danmark, 1. udgave, 1. oplag, 2011 Alsbjørn B et al. Klinisk Ordbog, Munksgaard Danmark, 16. udgave, 1. oplag, 2004 Banchereau J et al. Dendritic cells and the control of immunity. Nature ;392(6673): Banchereau J et al. Immunobiology of Dendritic cells; Annu. Rev. Immunol : Chemnitz J, Rasmussen L. Basisbog i celledyrkning. Gads Forlag, 1. udgave, 1. oplag, 1990 Cignarelli A, Perrini S, Ficarella R, Peschechera A, Nigro P, Giorgino F. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 2012;14:e19. Ehlers C, Schirmer S, Kehlenbach RH, Hauber J, Chemnitz J. Post-transcriptional regulation of CD83 expression by AUF1 proteins. Nucleic Acids Res. 2013;41: Geneser, F. Histologi På molekylærbiologisk grundlag. 1. udgave, 10. oplag, 2011 Gimble JM, Bunnell BA, Frazier T, Rowan B, Shah F, Thomas-Porch C, Wu X. Adipose-derived stromal/stem cells: A primer. Organogenesis. 2013;9: Gimble JM, Bunnell BA, Guilak F. Human adipose-derived cells: an update on the transition to clinical translation. Regen Med Mar;7(2): Gir P, Oni G, Brown SA, Mojallal A, Rohrich RJ. Human adipose stem cells: current clinical applications. Plast Reconstr Surg Jun;129(6): Gupta M, Lo MK, Spiropoulou CF. Activation and cell death in human dendritic cells infected with Nipah virus. Virology Apr 12, In Press Ikegame Y, Yamashita K, Hayashi S, Mizuno H, Tawada M, You F, Yamada K, Tanaka Y, Egashira Y, Nakashima S, Yoshimura S, Iwama T. Comparison of mesenchymal stem cells from adipose tissue and bone marrow for ischemic stroke therapy. Cytotherapy Jul;13(6): Ivanova-Todorova E, Bochev I, Mourdjeva M, Dimitrov R, Bukarev D, Kyurkchiev S, Tivchev P, Altunk o- va I, Kyurkchiev DS. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are more potent suppressors of dendritic cells differentiation compared to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Immunol Lett. 2009;126: Jiang X. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells; Blood (print ISSN , online ISSN ), 2005 Kielberg, Vivi et.al.: Celledyrkning. En praktisk håndbog i dyrkning af mammale celler. Gads Forlag, 2. Udg, 1. Opl,

54 Kim JM, Lee ST, Chu K, Jung KH, Song EC, Kim SJ, Sinn DI, Kim JH, Park DK, Kang KM, Hyung Hong N, Park HK, Won CH, Kim KH, Kim M, Kun Lee S, Roh JK. Systemic transplantation of human adipose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke model. Brain Res Dec 5;1183: Lindskog B. Medicinsk ordbog. Nordisk Forlag A/S, 1. udgave 1. opslag, 2004 McIntosh KR, Frazier T, Rowan BG, Gimble JM. Evolution and future prospects of adipose-derived immunomodulatory cell therapeutics. Expert Rev Clin Immunol Feb;9(2): McLellan AD et. Al: Activation of human peripheral blood dendritic cells induces the CD86 co-stimulatory molecule. Eur J Immunol 1995 Dec;25(12):3525 Mizuno H, Tobita M, Uysal AC. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells May;30(5): Peng W, Gao T, Yang ZL, Zhang SC, Ren ML, Wang ZG, Zhang B. Adipose-derived stem cells induced dendritic cells undergo tolerance and inhibit Th1 polarization. Cell Immunol. 2012;278: Puissant B et al; Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Blackwell Publishing Ltd, British Journal of Haematology, 2005 Ramasamy R et al. Mesenchymal Stem Cells Inhibit Dendritic Cell Differentiation and Function by Preventing Entry Into the Cell Cycle. Transplantation 2007;83: Ryu HH, Lim JH, Byeon YE, Park JR, Seo MS, Lee YW, Kim WH, Kang KS, Kweon OK. Functional recovery and neural differentiation after transplantation of allogenic adipose-derived stem cells in a canine model of acute spinal cord injury. J Vet Sci Dec;10(4): Sand O, Sjaastand Ø V., Haug E. Fysiologi en grundbog. 1. udgave, 2. oplag, 2007 Tobita M, Orbay H, Mizuno H. Adipose-derived stem cells: current findings and future perspectives. Discov Med Feb;11(57): Vermehren K. Stamceller og celleterapi. Gyldendal, 1. udgave, 1 oplag, 2006 Yarak S, Okamoto OK. Human adipose-derived stem cells: current challenges and clinical perspectives. An Bras Dermatol Sep-Oct;85(5): Zhang W et al. Effects of Mesenchymal Stem Cells on Differentiation, Maturation, and Function of Human Monocyte-Derived Dendritic Cells; STEM CELLS AND DEVELOPMENT 13: (2004) 54

55 Bilag Bilag 1. Stamcellers differentiering De voksne stamceller i den menneskelige organisme kan som anført herunder differentiere til forskellige celler, afhængig af forekomst. Stamceller Forekomst Differentiering Hæmatopoietiske stamceller Mesenchymale stamceller Knoglemarven Knoglemarven Røde blodlegemer B-lymfocytter T-lymfocytter NK-celler Granulocytter Monocytter Blodplader Osteocytter Chondrocytter Adipocytter Bindevævsceller Neurale stamceller Hjernen Neuroner Astrocytter Oligodendrocytter Tarmens epithelstamceller Hudens stamceller Leverens ovale celler Liberkühnske krypter Villi Basalcellelag Basis af hårfolliklerne Celler i leveren som har stamcelle egenskaber Alle celletyper i tyndtarmens epithel Hornceller Hårfolliklerne Overhudsceller Ovale celler (kan danne modne hepatocytter og galdegangsepithelceller) 55

56 Bilag 2. Areal og mængder 56