PLATELIA Candida Ab Plus 96 TEST TESTENS FORMÅL 2- BRUGSANVISNING 3- KLINISK VÆRDI 4- PROCEDUREPRINCIP 5- REAGENSER

Transkript

1 PLATELIA Candida Ab Plus 96 TEST KONSTATERING AF CANDIDA ANTI-MANNAN-ANTISTOFFER I SERUM ELLER HUMANT PLASMA VED HJÆLP AF IMMUNENZYMATISK ANALYSE 1- TESTENS FORMÅL Platelia Candida Ab Plus er en indirekte immunenzymatisk mikropladeanalyse for kvantitativ konstatering af mannan-igantistoffer i serum eller humant plasma. 2- BRUGSANVISNING Diagnosen invasiv candidiasis skal baseres på en kombination af screening for antistof og cirkulerende antigener. 13 Platelia Candida Ab Plus (kode 62785) er en test, der anvendt sammen med Platelia Candida Ag Plus (kode 62784) bidrager til forbedret mulighed for tidlig diagnose og øger diagnosens sensibilitet som en del af en komplet diagnostisk metode, hvori der indgår kliniske og mykologiske data samt indefrakommende og iatrogene risikofaktorer. 10, 13, 14 Denne kombination er ligeledes en integreret del af et bioklinisk patientovervågningssystem som hjælp til fastlæggelse af behandlingen KLINISK VÆRDI Candida-infektioner er den hyppigste form for nosokomielle svampeinfektioner, idet candidæmier tegner sig for den fjerdestørste 12, 15, 16 årsag til septikæmier af nosokomiel oprindelse. På det kliniske plan er invasiv candidiasis den mest alvorlige form med en dødelighed, der svinger mellem 30 og 70 % hos de immundeprimerede patienter. Diagnosen er fortsat svær at stille på grund af de kliniske symptomers ringe specificitet og hæmokulturens lave sensibilitet. Det er oftest en kombination af argumenter, der muliggør diagnosen invasiv candidiasis og iværksættelse af en adækvat behandling. 2 I denne sammenhæng skal diagnosen systemisk candidiasis altid bestå af serologiske teknikker og direkte mykologiske metoder. Den serologiske overvågning af anti-candida-antistoffer muliggør orientering eller styrkelse af diagnosen sammen med de mykologiske resultater. 10, 13, 14 Platelia Candida Ab Plus konstaterer antistoffer rettet mod mannan-antigenet af Candida, der er den primære bestanddel af gærcellevæggen for Candida-arten. Mannan, der er biomarkør for candidiasis, er et meget immunogent polysaccharid. En regelmæssig overvågning af patienter med risiko for invasiv candidiasis, hvor konstatering af mannan-antigenet og antimannan-antistoffer kombineres, udgør en hjælp til diagnosticering af disse infektioner PROCEDUREPRINCIP Platelia Candida Ab Plus er en to-trins indirekte immunenzymatisk mikropladeanalyse, som muliggør konstatering af antimannan-antistoffer i serum eller humant plasma. De fortyndede serum- eller plasmaprøver fordeles i mikropladebrønde, der er sensibiliserede med mannan oprenset fra Candida albicans. Efter inkubation ved 37 C vaskes teststrimlerne for fjernelse af alt ikke-fikseret materiale. Konjugatet (peroxidase-mærkede gede antihumane IgG/IgA/IgM polyklonale antistoffer) tilsættes hver brønd på mikropladen og inkuberes ved 37 C. Ved forekomst af anti-mannan-antistoffer i den humane prøve dannes et kompleks: mannan human anti-mannan Ig - gede anti-human IgG/IgA/IgM-antistof/peroxidase. Teststrimlerne vaskes for fjernelse af alt ikke-fikseret materiale. Tilsætningen af chromogen, der indeholder peroxidasesubstratet og er inkuberet ved stuetemperatur, muliggør påvisning af eventuelt dannede komplekser. Enzymreaktionen standses ved tilsætning af 1N svovlsyre. Den optiske densitet bestemmes med et spektrometer, der er indstillet til en bølgelængde på 450/620 nm. 5- REAGENSER Reagenserne leveres i en mængde, der er tilstrækkelig til gennemførelse af 96 bestemmelser i maksimalt 9 serier. Opbevar sættet ved +2-8 C. Bring samtlige reagenser op på stuetemperatur ( C) før brug. Nedkøl straks samtlige reagenser til +2-8 C efter brug. Læg ubrugte teststrimler tilbage i posen og luk den omhyggeligt. Fjern ikke tørremidlet. 1

2 Bestanddel Indhold Mængde R1 Microplate Mikroplade: - 96 brønde (12 teststrimler med 8 brønde hver), der er 1 sensibiliserede med mannan oprenset fra Candida albicans. Koncentreret vaskeopløsning (20 x): R2 Concentrated Washing - TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4) Solution (20x) - 2 % Tween 20 1 x 70 ml - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 Kalibrator 0 UA/ml (klar til brug): R3 Calibrator 0 - Tris-NaCl-buffer - Konserveringsmiddel: methylisothiozolon 0,02 %, 1 x 2,5 ml bromnitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 R4a Calibrator 5 Kalibrator 5 UA/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-buffer - Humant serum, der indeholder Ig anti-mannan 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: methylisothiozolon 0,02 %, bromnitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 R4b Calibrator 10 Kalibrator 10 UA/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-buffer - Humant serum, der indeholder Ig anti-mannan 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: methylisothiozolon 0,02 %, bromnitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 R4c Calibrator 20 Kalibrator 20 UA/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-buffer - Humant serum, der indeholder Ig anti-mannan 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: methylisothiozolon 0,02 %, bromnitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 R4d Calibrator 80 Kalibrator 80 UA/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-buffer - Humant serum, der indeholder Ig anti-mannan 1 x 2,5 ml - Konserveringsmiddel: methylisothiozolon 0,02 %, bromnitrodioxan 0,02 %, < 1,5 % ProClin 300 R6 Conjugate Konjugat (klart til brug): - Peroxidase-mærkede gede anti-humane totale Ig polyklonale antistoffer - Malakitgrøn 1 x 26 ml R7a R7b R9 R10 Sample Diluent 1 Sample Diluent 2 Chromogen TMB Stopping Solution - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 Fortyndingsprøve 1 (klar til brug): - Tris-NaCl-buffer, - 0,1 % Tween 20 - Phenolrød, - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 Fortyndingsprøve 2 (klar til brug): - Tris-NaCl-buffer, - 0,1 % Tween 20, - Bromthymolblå, - Konserveringsmiddel: < 1,5 % ProClin 300 Prøve af TMB-chromogen (klar til brug): - Opløsning af 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2 O 2 (<1,0 %) 1 x 28 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml Stopopløsning (klar til brug): - 1N-svovlsyre 1 x 28 ml Selvklæbende film 4 6- HYGIEJNE- OG SIKKERHEDSFORSKRIFTER 1. Alene til in vitro-diagnosticering. 2. Kun til professionel brug. 3. Det anbefales ikke at bruge dette testsæt med andre prøver end humant serum eller plasma. 4. Kalibratorerne R4a, R4b, R4c og R4d er fremstillet af humant serum, der er testet og fundet negativt for anti-hiv-1-, anti- HIV-2-, anti-hcv-antistoffer samt HBs-antigen med CE-mærkede test. Samtlige reagenser skal imidlertid håndteres som potentielt smittefarlige. Samtlige test skal udføres i henhold til OSHA-standarden for blodbårne patogener, biosikkerhedsniveau 2, eller i henhold til anden adækvat biosikkerhedspraksis. 2

3 5. Bær beskyttelsestøj, herunder laboratoriekittel, beskyttelsesbriller og ansigtsværn samt engangshandsker (syntetiske, latexfrie handsker anbefales), og håndtér sættets reagenser samt patientprøverne i henhold til kravene for god laboratoriepraksis. Vask hænderne grundigt efter udførelse af testen. 6. Undgå at pipettere med munden. 7. Undgå at ryge, drikke eller spise i de områder, hvor prøverne eller reagenserne i sættet håndteres. 8. Undgå sprøjt fra prøvemateriale eller opløsninger. 9. Overflader, hvorpå der er spildt en smittefarlig væske, der ikke indeholder syre, skal tørres grundigt af med et effektivt desinfektionsmiddel. De desinfektionsmidler, der kan anvendes, omfatter (men er ikke begrænset til) en 10 % blegemiddelopløsning (0,5 % natriumhypochloritopløsning), 70 % ethanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Materialer, der anvendes til rengøring, skal bortskaffes som biologisk farligt affald. ADVARSEL: Anbring aldrig opløsninger, der indeholder blegemiddel, i autoklaven. 10. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal de tilsmudsede overflader tørres af eller neutraliseres med natriumbikarbonat og derefter skylles og tørres; såfremt den kontaminerende væske indeholder et biologisk farligt materiale, skal området rengøres med et kemisk desinfektionsmiddel. 11. Bortskaf alle prøver og materiale, der har været anvendt i udførelsen af testen, som om de indeholder potentielt smitsomme stoffer. Bortskaffelsen skal overholde alle gældende krav til farligt, kemisk og biologisk affald. 12. ADVARSEL: Følgende er en liste over potentielt kemiske risici, der er forbundet med nogle af sættets bestanddele (se kapitel 5 - REAGENSER) Nogle reagenser indeholder ProClin 300 < 1,5 %: R43: Kan forårsage overfølsomhed ved berøring med huden S : Undgå indånding af dampe/aerosol-tågen. Undgå kontakt med huden. Brug egnede beskyttelseshandsker. Dette materiale og dets beholder skal bortskaffes som farligt affald. Xi - Irriterende 13. Materialesikkerhedsdataarket (MSDS) udleveres efter anmodning. 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUGERNE 1. NEDFROSNE SERUM- ELLER PLASMAPRØVER, DER HAR VÆRET OPBEVARET UNDER UKENDTE FORHOLD, KAN GIVE FALSKE POSITIVE RESULTATER SOM FØLGE AF KONTAMINATION MED SVAMP OG/ELLER BAKTERIER. 2. Undgå at bruge sættet eller reagenser i sættet efter udløbsdatoen. 3. Undgå at blande reagenser fra andre sæt med andre batchnumre. BEMÆRK: Det er muligt at anvende andre vaskeopløsninger (R2, identifikation*: 20x grønfarvet), Chromogen (R9, identifikation*: TMB turkisfarvet) og stopopløsning (R10, identifikation*: 1N rødfarvet) end dem, der medfølger i sættet, forudsat at der anvendes strengt ækvivalente reagenser med samme partinummer i en given serie. BEMÆRK: Vaskeopløsningen (R2, identifikation*: 20X grønfarvet) må ikke blandes med vaskeopløsningen (R2, identifikation*: 10X blåfarvet), der medfølger i Bio-Rads reagenssæt. * på flaskens etiket 4. Vent inden brug 30 minutter, således at reagenserne kan stabiliseres ved stuetemperatur (+18 til +30 C). 5. Brug fortrinsvis engangsmateriale. Er det ikke muligt, skal der bruges perfekt afvasket udstyr af glas, der er skyllet med destilleret vand. 6. Kontrollér, at pipetterne er præcise, og at de anvendte apparater fungerer korrekt. 7. Genfortynd omhyggeligt reagens R2 og undgå enhver kontamination. 8. Enzymreaktionen er meget følsom over for metal eller metalioner. Som følge heraf må intet metalelement komme i berøring med de forskellige opløsninger, der indeholder konjuagatet eller substratopløsningen. 9. Ved manuel pipettering af kalibratorer og prøver skal der anvendes en ny pipettespids til hvert serum for at forebygge kontamination. 10. For at sikre tilstrækkelig rengøring af brøndene skal det anbefalede antal vaskecyklusser overholdes, og du skal sørge for, at brøndene er helt fyldte og efterfølgende helt tømte. Vask må ikke udføres med en mikropladevasker. 11. Undgå at mikropladen tørrer mellem slutningen af vaskecyklussen og tilsætningen af reagenser. 12. Brug ikke den samme beholder til konjugat og substratopløsning. 13. Undgå at udsætte chromogen- eller substratopløsningen for stærkt lys under opbevaring eller inkubation. Undgå, at chromogenopløsningerne kommer i kontakt med et iltningsmiddel. 14. Chromogenet (R9) skal være farveløst. Forekomst af en blåfarvning indikerer, at reagenset er ubrugeligt og skal kasseres. 15. Undgå, at stopopløsningen kommer i berøring med et iltningsmiddel, metal eller metalioner. 16. Undgå at hælde overskydende konjugat tilbage i den oprindelige beholder. 8- FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENSER Mikroplade (R1) Hver plade med 12 teststrimler er emballeret i en pose. Klip posen op lige under svejsningen. Åbn posen og tag pladen ud. Læg pladen med ubrugte teststrimler tilbage i originalposen. Luk omhyggeligt posen og opbevar den ved C. Efter åbning af posen under vakuum er teststrimlerne stabile i 8 uger, når de opbevares ved +2-8 C i deres omhyggeligt lukkede originalpose. Kontrollér, at posen indeholder tørremiddel. 3

4 Vaskeopløsning (R2) Forbered vaskeopløsning ved at fortynde den koncentrerede vaskeopløsning 20 gange i destilleret vand: 50 ml R2 i 950 ml destilleret vand (anvend 650 ml fortyndet vaskeopløsning til en fuld plade med 12 teststrimler eksklusive dødvolumen på grund af det anvendte apparatur). Efter fortynding kan vaskeopløsningen opbevares i 14 dage ved C. Efter åbning er den koncentrerede vaskeopløsning stabil indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis den opbevares ved C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. Kalibrator 0 (R3), Kalibrator 5 (R4a), Kalibrator 10 (R4b), Kalibrator 20 (R4c), Kalibrator 80 (R4d): Kalibratorerne er klare til brug. Efter åbning er disse reagenser stabile i 8 uger, hvis de opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. Konjugat (R6), Fortyndingsprøve 1 (R7a), Fortyndingsprøve 2 (R7b), TMB-chromogenopløsning (R9): Disse reagenser er klare til brug. Efter åbning er disse reagenser stabile i 8 uger, hvis de opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. Stopopløsning (R10): Dette reagens er klart til brug. Efter åbning er dette reagens stabilt indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis det opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ingen kontamination forekommer. 9- PRØVER 1. Test udføres på serum- eller plasmaprøver indsamlet på EDTA-, heparin- eller citrat-antikogualanter. 2. Overhold følgende forskrifter ved prøvetagning, behandling og opbevaring af blodprøver: - Tag blodprøver i henhold til sædvanlige procedurer. - For serum skal prøverne have lov til at clotte totalt inden centrifugering. - Opbevarer de lukkede rør. - Efter centrifugering udvindes serum eller plasma, der opbevares i lukkede rør. - Prøverne opbevares ved +2-8 C, hvis testen udføres inden 4 dage. - Hvis testen ikke udføres inden 4 dage, nedfryses prøverne til -20 C (eller -80 C). - Det kan ikke anbefales at foretage mere end tre nedfrysninger/optøninger. Prøverne skal omhyggeligt homogeniseres (Vortex) efter optøning og inden udførelse af testen. 3. Resultaterne påvirkes ikke af prøver, der indeholder 60 g/l humant albumin eller 120 g/l totalprotein eller 200 mg/l ikkekonjugeret bilirubin eller 200 mg/l konjugeret bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder ækvivalenten til 30 g/l triolein (triglycerid) eller 5 g/l kolesterol eller hæmolyserede prøver, der indeholder 2 g/l hæmoglobin. 4. Undgå at opvarme prøverne. 10- PROCEDURE Medfølgende materialer Se kapitel 5- REAGENSER Krævede materialer, der ikke medfølger 1. Sterilt, destilleret eller deioniseret vand til fortynding af koncentreret vaskeopløsning. 2. Sugende papir. 3. Engangshandsker. 4. Beskyttelsesbriller. 5. Natriumhypochlorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, der kan være automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller faste, til måling og fordeling af 10 μl til 1000 μl, 1 ml, 2 ml og 10 ml. 7. Prøverør med 25 ml, 50 ml, 100 ml og 1000 ml gradueringer. 8. Engangsrør. 9. Beholder til kontamineret affald. 10. Vortex-mixer. 11. Mikropladeinkubator, der kan indstilles til 37 C ± 1 C (*). 12. Halvautomatisk eller automatisk mikropladevasker (*). 13. Mikropladelæser med filtre på 450 og 620 nm (*). (*) Kontakt os venligst for mere præcise informationer om apparater, der er godkendt af vores tekniske afdelinger. EIA-procedure Overhold den foreslåede protokol nøje. Overhold god laboratoriepraksis. Reagenserne skal have stuetemperatur (18-30 C) i mindst 30 minutter før brug. Anvend samtlige kalibratorer ved hver kørsel til validering af testens kvalitet. 4

5 Fremgangsmåde: 1. Fastlæg omhyggeligt planen for fordeling og identifikation af kalibratorerne og prøverne. 2. Forfortynd de prøver, der skal testes, til øjeblikkeligt brug: i forholdet 1:20, eller 10 μl serum eller plasma μl prøvefortynding 1 (R7a). Forfortyndingen af prøven fremstår med en dybrød farve. 3. Tag pladeholderen og teststrimlerne (R1) ud af den beskyttede emballage. Læg ubrugte teststrimler tilbage i emballagen og luk den. 4. Tilsæt 190 μl prøvefortynding 2 (R7b) til de brønde, der er beregnet til testprøver, og tilsæt 10 μl fortyndede prøver i forholdet 1:20. Bland forsigtigt ved gentagne aspirationer 2 eller 3 gange. NB! Prøvernes tilsætning kan kontrolleres på dette håndteringstrin. Efter tilsætning af 10 μl forfortyndet prøve farves de brønde, der indeholder prøverne, brune. En brønd uden prøve fremstår med en grøn farve. 5. Tilsæt de kalibratorer, der er klare til brug, med 200 μl pr. brønd efter nedenstående plan: - A1: Kalibrator 0 UA/ml (R3) - B1: Kalibrator 5 UA/ml (R4a) - C1: Kalibrator 10 UA/ml (R4b) - D1: Kalibrator 20 UA/ml (R4c) - E1: Kalibrator 80 UA/ml (R4d) A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Dæk mikropladen med en klæbende film og tryk den omhyggeligt fast på hele overfladen for at sikre tæthed. 7. Inkubér straks mikropladen i en tør mikropladeinkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Forbered den fortyndede vaskeopløsning (se kapitel 8). 9. Fjern den klæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en affaldsbeholder til kontamineret affald (en beholder med natriumhypochlorit). 10. Vask mikropladen 4 gange ved hjælp af en mikropladevasker med 800 μl fortyndet vaskeopløsning. Efter den sidste vask vendes mikropladen og duppes forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 11. Bland indholdet af flasken R6 ved at vende den før brug. For anvendelse af en multikanalspipette skal der kun udtages det nødvendige volumen for gennemførelse af serien: anvend 3,5 ml til to teststrimler og 8 brønde. 12. Tilsæt 200 μl R6-konjugat til hver brønd. 13. Dæk mikropladen med en klæbende film og tryk den omhyggeligt fast på hele overfladen for at sikre tæthed. 14. Inkubér straks mikropladen i en tør mikropladeinkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 15. Fjern den klæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en affaldsbeholder til kontamineret affald (en beholder med natriumhypochlorit). 16. Vask mikropladen 4 gange ved hjælp af en mikropladevasker med 800 μl fortyndet vaskeopløsning. Efter den sidste vask vendes mikropladen og duppes forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 17. Tilsæt hurtigt 200 μl TMB-chromogenopløsning (R9) til hver brønd og undgå at udsætte dem for skarpt lys. 18. Inkubér mikropladen i mørke ved stuetemperatur ( C) i 30 ± 5 minutter. Anvend ikke klæbende film på dette inkubationstrin. 19. Tilsæt 100 μl stopopløsning (R10) til hver brønd i samme rækkefølge og med samme rytme som for substratopløsningen. Bland grundigt. 20. Tør bunden af hver plade grundigt. 21. Aflæs den optiske densitet for hver brønd ved 450 nm (referencefilter på 620 nm) senest 30 minutter efter tilsætning af stopopløsningen (teststrimlerne skal konstant opbevares beskyttet mod lys inden aflæsningen). 22. Tjek inden transskription af resultaterne, at der er konkordans mellem aflæsning og pladernes fordelingsplan. 11- KVALITETSKONTROL (VALIDERINGSKRITERIER) Brug kalibratorerne på hver mikroplade til hver test. Følgende kriterier skal opfyldes, for at testen kan valideres: Værdi for optisk densitet: OD R4a > 0,160 Forhold: OD R4a/OD R3 > 6,00 OD R4b/OD R4a > 1,20 OD R4c/OD R4b > 1,20 OD R4d/OD R4c > 1,20 5

6 12- FORTOLKNING AF RESULTATERNE Oprettelse af kalibreringskurven Kalibreringskurven er oprettet ud fra 5 intervalpunkter (kalibratorer) 0, 5, 10, 20 og 80 AU/ml. Opret kalibreringskurven [OD = funktion (AU/ml)] ved plotting på den vertikale akse (Y-aksen) af OD for kalibratorerne R3, R4a, R4b, R4c og R4d og deres respektive koncentration på den horisontale akse (X-aksen) i AU/ml. Vælg en punkt-til-punkt-kurve, der forbinder de forskellige intervalpunkter. Bestemmelse af anti-mannan-antistofkoncentrationen (AU/ml) i de testede prøver Den tidligere oprettede kalibreringskurve kan anvendes til at bestemme anti-mannan-antistofkoncentrationen, udtrykt i AU/ml, for hver testprøve. Fortolkning af resultaterne Prøver med koncentrationer under 5 AU/ml (C < 5) betragtes som "negative" for forekomst af anti-mamnan-antistof. Prøver med koncentrationer mellem 5 og 10 AU/ml (5 C < 10) betragtes som "mellemsensitive" for forekomst af anti-mamman-antistof. Prøver med koncentrationer på eller over 10 AU/ml (C 10) betragtes som "positive" for forekomst af anti-mannanantistof. De anvendte kalibratorer til oprettelse af kalibreringskurven muliggør ikke en præcis bestemmelse af koncentrationer over 80 AU/ml. Testen skal gentages efter en yderligere forfortynding af serum eller plasma i fortyndingsmidlet 1 (R7a) i forholdet 1:10. Efter den første forfortynding følges fremgangsmåden, der er anført i kapitel 10 (forfortynding i forholdet 1:20 i R7a, derefter fortynding i forholdet 1:20 i R7b). Den stærkt positive prøves koncentration beregnes ved at multiplicere den således opnåede koncentration med en faktor 10. Et "mellemsensitivt" resultat vil kunne bekræftes på en ny patientprøve i ugerne efter den prøvetagning, der viste en mellemsensitiv koncentration. 13- PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. En negativ test udelukker ikke diagnosen invasiv candidiasis. Fortolkningen af fravær af antistoffer er vanskelig hos patienter med ændret immunsystem.der kan først stilles en diagnose på invasiv candidiasis efter sammenligning af de kliniske, terapeutiske, radiologiske, cytologiske, direkte mykologiske og serologiske argumenter, idet hver bestanddel isoleret set skal fortolkes med forsigtighed. 2. En negativ test for forekomst af anti-mannan-antistof skal ligeledes sammenholdes med resultatet af screening for mannan-antigen: selv i tilfælde af invasiv candidiasis er antigenet vanskeligere at finde hos patienter, der er positive for anti-mannan-antistof (se kapitel 15- Ydeevne) 3. Ydeevnen for konstatering af anti-mannan-antistof i sera eller plasmaer er forbundet med hyppigheden af test udført for patienterne. Regelmæssig overvågning af patienter i risikogruppen og screening for mannan-antigen anbefales for at øge sensitiviteten og opnå en tidlig konstatering ved positiv test. 4. Proceduren for og fortolkningen af resultaterne, der er beskrevet for testen for Platelia Candida Ab Plus, skal følges, når prøverne testes for forekomst af anti-mannan-antistof. Det anbefales brugeren af sættet at læse pakkens indlægsinformation grundigt, før testen udføres. Testproceduren skal især følges omhyggeligt ved prøve- og reagenspipettering, vask af mikroplade og tidsbestemmelse af inkubationstrinnene. 5. Der kan opnås et falsk negativt resultat, hvis prøverne eller reagenserne ikke tilsættes som anført i indlægsinformationen. Der skal testes en ny prøve fra samme patient i tilfælde af klinisk mistanke om invasiv candidiasis eller i tilfælde af procedurefejl. 6. Kontamination af negative patientprøvebrønde med positive kontrol- eller patientprøvebrønde er mulig, hvis indholdet af den ene brønd flyder over i en anden brønd på grund af uforsigtig håndtering af mikropladen eller forkert pipetteringsteknik under tilsætning af reagenserne. 7. Ydeevnen for Platelia Candida Ab Plus er ikke blevet evalueret med serum- eller plasmaprøver fra nyfødte eller pædiatriske patienter. 8. Ydeevnen for Platelia Candida Ab Plus er ikke fastsat for en manuel aflæsning og/eller en visuel bestemmelse af resultaterne. 9. Der er observeret falsk positive resultater, når prøverne indeholder mere end 60 g/l humane hæmoglobuliner og ligeledes for nogle prøver testet positive for rheumatoid faktor for forekomst af anti-ds-dna-antistoffer eller for forekomst af anti- Aspergillus IgG. 14- FORVENTEDE VÆRDIER Prævalensen for antistoffer rettet mod det specifikke mannan-antigen for Candida målt ved hjælp af Platelia Candida Ab Plustesten er blevet evalueret ved anvendelse af et panel af 613 prøver fra 51 nederlandske patienter (Sted 1 Nederlandene), der var indlagt for cancerbehandling (49 patienter med malign hæmopati og 2 med ikke-hæmotologisk cancer) ved intensiv kemoterapi. 6

7 Ud af 613 prøver blev 114 konstateret positive og 136 mellemsensitive, dvs. en prævalens på 114/613 = 18,6 % [KI 95 %: 15,6-21,9 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 250/613 = 40,8 % [KI 95 %: 36,9-44,8 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. Udtrykt i forhold til patienter havde 14 ud af 51 testede mindst én positiv prøve og 20 mindst én mellemsensitiv prøve uden nogen positiv, dvs. en prævalens på 14/51 = 27,5 % [KI 95 %: 15,9-41,7 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 34/51 = 66,7 % [KI 95 %: 52,1-79,2 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. Ud af disse 51 patienter havde 30 (388 prøver) ikke dokumenteret invasiv candidiasis. Blandt disse blev 20 koloniserede ved hjælp af gær (12 ved hjælp af Candida albicans, 7 ved hjælp af Candida albicans sammen med en anden art af Candida og 1 koloniseret ved hjælp af mindst én ikke-albicans Candida-art). Fire andre patienter havde kliniske symptomer og en superficiel, mikrobiologisk konstateret Candida-infektion. 24 af disse patienter havde svære skader på slimhindebarriererne. Ud af 388 tilsvarende prøver blev 53 konstateret positive og 95 mellemsensitive, dvs. en prævalens på 53/388 = 13,7 % [KI 95 %: 10,4-17,5 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 148/388 = 38,1 % [KI 95 %: 33,3-43,2 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. Udtrykt i forhold til patienter havde 7 ud af 30 testede mindst én positiv prøve og 12 mindst én mellemsensitiv prøve uden nogen positiv, dvs. en prævalens på 7/30 = 23,3 % [KI 95 %: 9,9-42,3 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 19/30 = 63,3 % [KI 95 %: 43,9-80,1 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. 15- YDEEVNE A. Undersøgelse af reproducerbarhed Præcision for den interne analyse (repeterbarhed): Til evaluering af repeterbarheden for den interne analyse blev en negativ prøve og fem positive prøver testet i 32 gentagelser i samme test. Koncentrationen i AU/ml blev bestemt for hver prøve. Middelkoncentrationen, standardafvigelsen (Standard Deviation, SD) og variationskoefficienten (VK %) for hver prøve er angivet i nedenstående tabel: Præcision for den interne analyse (repeterbarhed) N=32 Prøve Negativ Svagt positiv prøve nr. 1 Svagt positiv prøve nr. 2 Svagt positiv prøve nr. 3 Middel positiv prøve Stærkt positiv prøve Middelkoncentrationer (AU/ml) 3,14 7,91 10,17 10,06 38,42 67,62 SD 0,123 0,547 0,424 0,464 3,836 4,070 VK % 3,9 % 6,9 % 4,2 % 4,6 % 10,0 % 6,0 % Præcision for den interne analyse (reproducerbarhed): Til evaluering af reproducerbarheden for den interne analyse blev seks prøver (én negativ og fem positive) hver især testet i to eksemplarer i to serier pr. dag over en tyve dages periode. Koncentrationen i AU/ml blev bestemt for hver prøve. Middelkoncentrationen, standardafvigelsen (Standard Deviation, SD) og variationskoefficienten (VK %) for hver prøve er angivet i nedenstående tabel: Præcision for den interne analyse (reproducerbarhed) Prøve Svagt positiv N=80 Negativ prøve nr. 1 Middelkoncentrationer Svagt positiv prøve nr. 2 Svagt positiv prøve nr. 3 Middel positiv prøve Stærkt positiv prøve 3,54 8,16 11,51 11,42 31,54 62,58 (AU/ml) SD 0,332 0,814 1,481 1,452 6,55 7,162 VK % 9,4 % 10,0 % 12,9 % 12,7 % 20,8 % 11,4 % B. Krydsreaktioner Patologi Antal testede prøver Antal positive Antal mellemsensitive Antal bekræftede positive med kommerciel test Antal bekræftede mellempositive med kommerciel test Anti-Aspergillus-antistoffer /12 12/30 Anti-ds-dna-antistoffer /2 0/2 Positive ANA Ikke relevant 0/1 Myelom-IgG/IgM Ikke relevant Ikke relevant Anti-toxoplasma IgG /1 1/1 Humane anti-museantistoffer /1 0/1 Rhumatoid faktor /5 1/4 7

8 De prøver, der blev testet positive eller mellemsensitive med Platelia Candida Ab Plus-testen, blev efterfølgende testet med en kommerciel, konkurrerende test til konstatering af anti-candida-antistoffer (bestående af en test til konstatering af anti- Candida IgG og en test til konstatering af anti-candida-igm). C. Linearitet Linearitetsområdet for Platelia Candida Ab Plus-testen blev bestemt til mellem 2 og 78 AU/ml ud fra undersøgelser af fortyndinger af 5 positive prøver. D. Kliniske test Ydeevnen for Platelia Candida Ab Plus-sættet blev evalueret på 3 steder med i alt 836 prøver fra 489 patienter. SENSITIVITET Platelia Candida Ab Plus-sættets sensibilitet blev bestemt ud fra et panel med 436 prøver fra 89 indlagte patienter på 2 hospitaler i Nederlandene og i Frankrig. Der var følgende fordeling for prøverne: Sted 1 (Nederlandene): 225 prøver fra 21 nederlandske patienter indlagt på en onkohæmatologisk afdeling for behandling mod malign hæmopati (19 tilfælde) eller ikke-hæmotologisk cancer (2 tilfælde) ved hjælp af intensiv kemoterapi, der alt efter tilfældet blev efterfulgt af en hæmatopoietisk stamcelletransplantation. Alle disse patienter havde invasiv candidiasis, der var mikrobiologisk dokumenteret på grundlag af mindst én kultur, der var positiv for Candida (hæmokultur eller kultur af normalt steril vævsprøve). 17 Sted 2 (Frankrig): 211 prøver fra 68 franske patienter indlagt på forskellige hospitalsafdelinger, intensiv eller onkohæmatologisk afdeling, og med invasiv candidiasis, der var mikrobiologisk dokumenteret på grundlag af mindst én positiv hæmokultur for Candida spp. NB! De anvendte prøvepaneler under disse to undersøgelser stammede fra patienter, der fik taget blodprøver mellem 1999 og Mannan-antigenets og anti-mannan-antistoffernes relative stabilitet i disse prøver i nedfrysningsperioden samt efter hver nedfrysnings- og optøningscyklus gav resultater afhængigt af testpanelets opbevaringstilstand. Testens sensitivitetsværdier, der blev bestemt som led i retrospektive kliniske studier, kan således være mindre end de, der blev opnået ved prospektive, kliniske studier foretaget på grundlag af nyligt indsamlede prøver. Resultater fra Sted 1 De 21 nederlandske patienter, der indgik i dette studie, blev indlagt for behandling af en malign hæmopati (akut myeloid leukæmi, akut lymfatisk leukæmi, kronisk lymfatisk leukæmi, myelom, myelodysplastisk syndrom, aplastisk anæmi eller ikke- Hodgkin-syndrom) eller en ikke-hæmatologisk cancer ved hjælp af intensiv kemoterapi eventuelt efterfulgt af en hæmatopoietisk stamcelletransplantation. 17 Disse 21 patienter havde udviklet invasiv candidiasis, der var mikrobiologisk dokumenteret på grundlag af mindst én kultur, der var positiv for Candida spp (hæmokultur eller kultur af normalt steril vævsprøve). Status for disse patienter for forekomst af antistoffer rettet mod det specifikke mannan-antigen for Candida, konstateret med Platelia Candida Ab Plus-testen, betragtes som positiv, hvis mindst én af patientens prøver er positive. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af patientens prøver er mellemsensitiv, og som negativ, hvis samtlige patientens prøver er negative. 17 Patientkategorier 21 patienter (225 prøver) med mindst én kultur, der er positiv for Candida spp. Parallelt med Platelia Candida Ab Plus-testen blev disse samme prøver testet for forekomst af det specifikke mannan-antigen for Candida med Platelia Candida Ag Plus-sættet. 9 Patientens status for forekomst af det specifikke mannan-antigen eller anti-mannan-antistof for Candida betragtes som positiv, hvis mindst én af de to test er positiv. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af de to test er mellemsensitiv, og som negativ, hvis begge test er negative. Patientkategorier 21 patienter (225 prøver) med mindst én kultur, der er positiv for Candida spp. Resultater for Platelia Candida Ab Plus Antal patienter (antal Sensitivitet Sensitivitet prøver) (mellemsensitive (mellemsensitive Positiv Mellemsensitiv betragtet som betragtet som negative) positive) 33,3 % 71,4 % 7 (61) 8 (41) 6 (123) [14,6-57,0 %] [47,8-88,7 %] Kombination af resultaterne for Platelia Candida Ab Plus og Platelia TM Candida Ag Plus Antal patienter (antal Sensitivitet Sensitivitet prøver) (mellemsensitive (mellemsensitive Positiv Mellemsensitiv betragtet som betragtet som negative) positive) 71,4 % 90,5 % 15 (98) 4 (34) 2 (93) [47,8-90,5 %] [69,9-98,8 %] 8

9 Resultater fra Sted 2 De 68 franske patienter, der indgik i dette studie, blev indlagt på forskellige hospitalsafdelinger for intensiv behandling (kirurgi, transplantation, forbrændinger, traumatologi, pneumologi osv.) eller for onko-hæmatologi (malign hæmopati). Alle udviklede invasiv candidiasis, der blev konstateret mikrobiologisk på grundlag af mindst én hæmokultur positiv for Candida (albicans, 6, 7, 14 parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei eller tropicalis) i dagene forud for eller efter den testede blodprøve. Blodprøverne blev i gennemsnit taget 6 dage efter den første hæmokultur, der har positiv for Candida (mindst 61 dage før, maksimalt 67 dage efter). Disse patienters status for forekomst af antistoffer rettet mod det specifikke mannan-antigen for Candida, konstateret med Platelia Candida Ab Plus-testen, betragtes som positiv, hvis mindst én af patientens prøver er positiv. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af patientens prøver er mellemsensitiv, og som negativ, hvis samtlige patientens prøver er negative. Patientkategorier 68 patienter (211 prøver) med mindst én hæmokultur, der er positiv for Candida spp. Resultater for Platelia Candida Ab Plus Antal patienter (antal Sensitivitet prøver) (mellemsensitive Mellemsensitiv betragtet som Negativ negative) Positiv 30 (71) 13 (51) 25 (89) - heraf 34 for C. albicans (113 prøver) 17 (45) 6 (31) 11 (37) - heraf 15 for C. parapsilosis (37 prøver) 4 (5) 6 (15) 5 (17) - heraf 12 for C. glabrata (32 prøver) 7 (15) 1 (4) 4 (13) 44,1 % [32,1-56,7 %] 50,0 % [32,4-67,6 %] 26,7 % [7,8-55,1 %] 58,3 % [27,7-84,8 %] Sensitivitet (mellemsensitive betragtet som positive) 63,2 % [50,7-74,6 %] 67,6 % [49,5-82,6 %] 66,7 % [38,4-88,2 %] 66,7 % [34,9-90,1 %] - heraf 4 for C. tropicalis (19 prøver) 2 (6) 0 (1) 2 (12) 50,0 % * 50,0 % * - heraf 2 for C. krusei (8 prøver) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % * - heraf 1 for C. norvegensis (2 prøver) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % * * : Det var ikke muligt at beregne konfidensintervallet på 95 % på grund af utilstrækkelig prøvestørrelse. Parallelt med Platelia Candida Ab Plus-testen blev disse samme prøver testet for forekomst af det specifikke mannan-antigen for Candida med Platelia Candida Ag Plus-sættet. Patientens status for forekomst af det specifikke mannan-antigen eller antimannan-antistof for Candida betragtes som positiv, hvis mindst én af de to test er positiv. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af de to test er mellemsensitiv, og som negativ, hvis begge test er negative. 17 Patientkategorier 68 patienter (211 prøver) med mindst én hæmokultur, der er positiv for Candida spp. Kombination af resultaterne for Platelia Candida Ab Plus og Platelia TM Candida Ag Plus Antal patienter (antal prøver) Sensitivitet (mellemsensitive Sensitivitet (mellemsensitive Positiv Mellemsensitiv negative) betragtet som betragtet som Negativ positive) 48 (122) 8 (40) 12 (49) - heraf 34 for C. albicans (113 prøver) 28 (74) 2 (22) 4 (17) - heraf 15 for C. parapsilosis (37 prøver) 5 (7) 6 (15) 4 (15) - heraf 12 for C. glabrata (32 prøver) 11 (24) 0 (3) 1 (5) 70,6 % [58,3-81,0 %] 82,4 % [65,5-93,2 %] 33,3 % [11,8-61,6 %] 91,7 % [61,5-99,8 %] 82,4 % [71,2-90,5 %] 88,2 % [72,6-96,7 %] 73,3 % [44,9-92,2 %] 91,7 % [61,5-99,8 %] - heraf 4 for C. tropicalis (19 prøver) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0 % * 100,0 % * - heraf 2 for C. krusei (8 prøver) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % * - heraf 1 for C. norvegensis (2 prøver) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % * * : Det var ikke muligt at beregne konfidensintervallet på 95 % på grund af utilstrækkelig prøvestørrelse. 9

10 SPECIFICITET Specificiteten blev bestemt ud fra et panel på 400 prøver, der stammede fra 2 steder i Frankrig, med følgende fordeling: Sted 1: 200 prøver fra 200 franske patienter, der blev overvåget for toxoplasmose-serologi under svangerskab, og som ikke havde kliniske symptomer på Candida-infektion. Sted 2: 200 prøver fra 200 franske bloddonorpatienter. Patientkategorier 200 gravide kvinder (200 prøver) overvåget for toxoplasmose-serologi 200 bloddonorer (200 prøver) Resultater for Platelia Candida Ab Plus Antal patienter (antal Specificitet Specificitet prøver) (mellemsensitive (mellemsensitive Positiv Mellemsensitiv positive) negative) betragtet som betragtet som Negativ 78,0 % 95,5 % [71,6-83,5 %] [91,6-97,9 %] 82,0 % [76,0-87,1 %] 96,0 % [92,3-98,3 %] 16- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle produkter, der fremstilles og markedsføres af selskabet Bio-Rad, kvalitetssikres fra modtagelse af råmaterialerne til markedsføring af slutprodukterne. Hvert parti af slutprodukter kvalitetskontrolleres og markedsføres kun, hvis det opfylder acceptkriterierne. Producenten opbevarer dokumentation for fremstilling og kontrol af hvert parti. 17- BIBLIOGRAFISKE REFERENCER 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U Comparative evaluation of (1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candidaspecies-specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103):p Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag,D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candidainfections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M.,Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p Nucci, M.,, Colombo, A.L Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F.,Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p

11 14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /