Det sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen. Onsdag den 12. januar 2005, kl. 09:00-15:00 Atletion, Stadion Allé 70, Aarhus C.

Transkript

1 MEDICINSK BIOKEMI Aarhus Universitet Januar 2005 Det sundhedsvidenskabelige Fakultet Medicinsk Kandidateksamen BIOKEMI MED KEMI Onsdag den 12. januar 2005, kl. 09:00-15:00 Atletion, Stadion Allé 70, Aarhus C. Dette opgavesæt indeholder 1 essayopgave og 5 kortsvarsopgaver. Som bilag er tilføjet en Tabel med navne på - og strukturer af de 20 aminosyrer. Tilladte hjælpemidler: Almindelige skriveredskaber og lommeregner. På eksamensbordet er fremlagt et gult omslag påtrykt DET SUNDHEDSVIDENSKABELIGE FAKULTET samt gult kladdepapir og tre-farvede formsæt til indskrivning. Opgavebesvarelser skal afleveres indskrevet på det tre-farvede formsæt. Benyt kuglepen ved indskrivningen - af hensyn til gennemtryk. Ved besvarelsen af beregningsopgaver skal relevante mellemregninger anføres. Reaktionsligninger (men ikke reaktionsskemaer) skal være støkiometrisk afstemte. Hvor andet ikke er anført i opgaveteksten, kan navne og autoriserede forkortelser anvendes i besvarelsens reaktionsligninger og -skemaer.

2 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 2 Essayopgave. Fordøjelse, absorption og metabolisme af triglycerider (triacylglyceroler) Besvarelsen skal indeholde redegørelser for: 1. Fordøjelse, absorption og afgivelse af triglycerider (TG) til blodbanen, samt for de hormoner, der er vigtige for fordøjelsen af oralt indtaget TG. 2. Forekomst og metabolisme af TG i blodet i den postprandiale fase efter et større måltid med ca. 35% af energien i fedt herunder for hormonal regulering af metabolismen. 3. Metabolisme af TG i organismens fedtdepoter i den postabsoptive fase (6-12 timer efter måltidet) herunder for hormonal regulering.

3 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 3 Opgave 1. Nedenstående forbindelser anvendes som sødemidler i madvarer. a. Markér de bindinger, der kan brydes ved hydrolyse. b. Skriv strukturformler for produkterne efter sur hydrolyse (ph 1). c. Hvilket sødemiddel bør ikke indtages af personer, der lider af Phenylketonuri (også kaldet PKU eller Føllings sygdom)? Begrund svaret. d. Angiv mulige nedbrydningsprodukter, der kan forekomme i urinen hos de under (c.) nævnte personer, hvis de alligevel indtager det pågældende sødemiddel.

4 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 4 Opgave 2. Aktiviteten af lactatdehydrogenase (LDH) i en serumprøve kan bestemmes ved at måle de initiale reaktionshastigheder ved to forskellige koncentrationer af pyruvat, idet den LDHkatalyserede reaktion kan antages at følge Michaelis-Menten kinetik: Michaelis-Menten ligningen: V 0 = V max [S] 0 K M + [S] 0 Til 2 kuvetter (med 1,00 cm lysvej) hver indeholdende 2,90 ml fosfatbuffer, hvori er opløst pyruvat og NADH 2, sættes 0,100 ml af serumprøven. Umiddelbart efter blanding måles ved 340 nm de initiale ændringer i reaktionsblandingernes absorption som funktion af tid ( A 340 min 1 ). Det oplyses, at en NADH 2 -opløsning med koncentrationen 1,00 mol L 1 har en absorption ved 340 nm på 6300, når lysvejen er 1 cm. Samhørende værdier af pyruvatkoncentrationer og A 340 min 1 er: pyruvatkoncentration A 340 min 1 0,20 mmol L 1 0,036 0,30 mmol L 1 0,042 a. Skriv ligning for den LDH-katalyserede reaktion. b. Beregn K M og V max for LDH i prøveopløsningen (kuvetten). c. Beregn LDH-aktiviteten i serum som µmol L 1 min 1.

5 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 5 Opgave 3. a. Beskriv kortfattet opbygningen af et ekstracellulært glycoprotein (N-bundet kulhydrat), og hvordan kulhydratdelen af et sådant glycoprotein dannes. b. Forklar - med henvisning til kulhydratdelens specifikke funktioner - hvorfor lysosomale enzymer er glycoproteiner.

6 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 6 Opgave 4. Hæmoglobin er en tetramer, der normalt består af to ens α-kæder og to ens β-kæder. β-globin genet koder for β-kæden i det normale hæmoglobin. Nedenfor er vist et stykke af genet omkring promoterregion og startkodon. DNA sekvensen i dette stykke er analyseret for tilstedeværelsen af fire restriktionsendonukleasesites, MstII, EcoRI, EcoRV og BamHI. Genkendelsessekvenserne for disse enzymer er: MstII: CCTNAGG (hvor N angiver, at det kan være hvilken som helst af de fire nukleotider, A, G, C eller T); EcoRI: GAATTC; EcoRV: GATATC og endelig BamHI: GGATCC. Det nedenfor viste fragment af det normale β-globin gen indeholder således kun seks sites, hvor en af disse fire restriktionsendonukleaser kan kløve DNA'et som angivet på skitsen af den kodende streng. Tallene angiver hvor mange nukleotider, der er mellem hvert restriktionssite. Seglcelleanæmi skyldes en enkelt mutation i den transkriptive del af genet, hvor en A er muteret til T i den 6. codon. Det tilsvarende DNA stykke (kodende streng) hos en patient med seglcelleanæmi er således identisk med DNA stykket hos normale bortset fra denne A til T mutation som angivet nedenfor. a. Giv forslag til en RFLP-analyse ("restriction fragment length polymorphism"), hvormed man kan diagnostisere seglcelleanæmi. Besvarelsen skal indeholde hvilke(t) restriktionsendonuklease(r), der skal anvendes, forslag til probens omtrentlige placering på DNA-stykket samt størrelse(n) af de(t) fragment(er), der ses ved analysen hos en normal person, hos en heterozygot samt hos en homozygot. b. Til hæmoglobinets normale funktioner hører reversibel binding af O 2 og CO 2. Hvordan bindes disse to forbindelser til hæmoglobinmolekylet?

7 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 7 Opgave 5. Hurtigt voksende celler har brug for rigelig forsyning af TTP (deoxyribothymidintrifosfat) til syntese af DNA. Disse cellers følsomhed over for inhibition af TTP syntese kan derfor udnyttes ved behandling af cancer. a. Gør rede for omdannelsen af dump til TMP. b. Beskriv hvorledes syntesen af TTP specifikt kan inhiberes ved anvendelse af substrat analoger. c. Hvilke bivirkninger medfører inhibition af TTP syntese ved cancerbehandlıng?

8 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 8 Bilag. DE 20 AMINOSYRER - VED PH 7,4

9 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 9 Svar til Essayopgave. 1. Hydrolyse af TG starter i beskedent omfang i mundhulen, katalyseret af lipase i spyt. I ventriklen fortsætter hydrolysen (stadig beskeden) katalyseret af gastrisk lipase. Ventriklens peristaltik og det forhold, at de frigivne fedtsyrer fungerer som "surfactanter", fører til dannelse af en fedtemulsion. Fosfolipider og fedtsyrer indtaget i kosten sammen med TG understøtter denne proces. Lipid emulsionen injiceres som sur chymus til duodenum, hvor hovedparten af fordøjelsen fınder sted på grund af sekretion af såvel galdesalte som pancreatisk lipase. Galdesalte er flade molekyler med en hydrofob og en hydrofil side og lægger sig derfor på overfladen af de emulgerede lipiddråber, hvor de forankrer pancreatisk lipase samt en co-lipase, der er nødvendig for katalytisk aktivitet. I duodenum og videre i jejunum hydrolyseres TG fortrinsvist til fedtsyrer og monoacylglycerol (2-MAG). Galdesalte på overfladen af lipiddråber er i ligevægt med frie galdesalte, der danner miceller med hydrolyseprodukter og fosfolipider (blandingsmiceller). Micellerne (ca. 50 nm) med galdesaltene og fedtstoffernes hydrofıle grupper vendende udad er vandopløselige og kan diffundere igennem den vandhinde ("unstirred layer"), der omgiver enterocytter. Fra micellerne afgives fedtsyrer og monoacylglycerol, der diffunderer ind i enterocytterne. Kort- og mellemkædede fedtsyrer (mindre end C12) afgives til v. porta, mens langkædede fedtsyrer og monoacylglycerol genopbygges til TG i enterocytter. Sekretionen af galde stimuleres af cholecystokinin, der også stimulerer sekretion af pancreas lipase. Cholecystokinin sekretionen stimuleres af fedtsyrer i chymus. Sekretion af vand og hydrogencarbonat, der er nødvendig for etablering af det alkaliske ph i tarmen, stimuleres af sekretin, hvis væsentligste sekretionsstimulus er den sure chymus. Den vigtigste "pathway" for resyntese af TG i enterocytter involverer 2-MAG og de langkædede fedtsyrer, idet en mindre del syntetiseres de novo fra glycerol (fosfatidsyre-pathway). Acyl-CoA syntetiseres i enterocytter, katalyseret af acyl-coa synthase. Resyntese af TG sker i forbindelse med det ru endoplasmatiske reticulum, hvor der desuden sker syntese af apolipoprotein B48 (apob48). Den secernerede partikel, chylomicronen, består overvejende af TG og cholesterolestere i den centrale del, fosfolipider og cholesterol på overfladen, samt apob48, der er vundet omkring partiklen. Andre lipofile stoffer følger med, herunder lipofile vitaminer. Chylomicroner secerneres til Iymfen og når blodbanen via ductus thoracicus. 2. I blodet passerer de TG-rige chylomicroner endothelceller, eksempelvis i fedtvæv, med lipoprotein lipase (LpL) bundet til proteoglycaner på celleoverfladen. LpL (med hjælpeproteiner) hydrolyserer en del af TG, og partiklen kaldes nu en chylomicron-rest (remnant). Samtidig forsynes partiklens overflade med apolipoproteiner, herunder apoe, via udveksling med andre lipoproteiner. Chylomicron-resten kan nu binde sig til endocytiske receptorer som LDL-receptor (apob100 / E receptor), og hovedparten optages i leveren ved receptor-medieret endocytose. Chylomicronrester "cleares" på denne måde ret hurtigt, og leveren tilføres TG, der sammen med nysyntetiseret TG indgår i VLDL secerneret fra leveren.

10 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 10 De til blodet afgivne langkædede fedtsyrer bindes til og transporteres af serum albumin. En del bliver oxideret f.eks. i skeletmuskulatur og hjerte. I den postprandiale fase bliver en betydelig del optaget i fedtvæv og forestret til TG via glycerol-3-fosfat dannet fra glukose. De TG-rige VLDL partikler secerneret fra leveren leverer fedtsyrer til forskellige væv. Det sker, som for chylomicronrester, efter hydrolyse af TG medieret af LpL (evt. hepatisk lipase), under dannelse af VLDL-rester (evt. betegnet IDL). VLDL og VLDL-rester indeholder en række apolipoproteiner, hvoraf de vigtigste er apob100 og apoe. Efterhånden som VLDL rester formindskes, får apob 100 og apoe den rette konformation for binding til LDL-receptoren, og en del optages i leveren. Andre partikler når at blive næsten tømt for TG (og mister apoe), og de betegnes nu som LDL partikler, hvis hovedfunktion er at levere cholesterol/cholesterolestre til perifere væv. En stor del optages imidlertid i leveren via apob100 og LDL receptoren, hvilket sammen med optagelsen af VLDL-rester kan betragtes som et "overflow" system, der yder en vis beskyttelse mod høje LDL koncentrationer i blodet. Sideløbende hermed optages noget TG i væv, specielt leveren, ad anden vej. Det sker ved, at HDL (rige på cholesterolestre - såkaldt HDL3; disse er dannet fra "tomme" HDL skiver (præbeta HDL)), der optager cholesterol fra perifere væv, hvorefter dette esterifıceres af LCAT) udveksler cholesterolestre med TG i VLDL og VLDL-rester (samt chylomikroner og deres rester). Denne proces er faciliteret af CETP*. Det nu TG-holdige HDL (HDL2) optages under indvirken af specifikke receptorer fortrinsvist i leveren. Insulin er det afgørende hormon i den postprandiale fase, mens koncentrationerne af glucagon og andre anti-insulinære hormoner er lave. Insulinsekretionen stimuleres af stigning i blodglukose efter måltidet og af visse tarmhormoner. De centrale insulinvirkninger af betydning i TG metabolisme er øget udtryk af LpL, øget produktion af VLDL samt øget optagelse af glukose eksempelvis i fedtceller, hvilket faciliterer dannelse af depot TG. På denne måde kommer sammensætningen af fedtsyrer i fedtcellernes TG til i væsentlig omfang at reflektere de med kosten indtagne fedtsyrer. 3. Den postabsorptive fase er karakteriseret ved en høj glucagon / insulin ratio, hvilket medfører stimulering af den hormonsensitive lipase i fedtceller. Samtidig nedsættes fedtcellernes glukose permeabilitet (nedsættelse af Glut4 i plasmamembranen), og dermed dannelse af glycerolfosfat til forestring. Hydrolysen af TG fører til afgift af fedtsyrer der, med albumin som transportvehikel, optages og oxideres eksempelvis i skeletmuskulatur og hjerte. Det fra fedtvævet frigivne glycerol yder - sammen med laktat og alanin / glutamin fra muskler - et væsentligt bidrag til gluconeogenese i leveren, der er ansvarlig for ca. 30% af leverens afgift af glukose og dermed for opretholdelse af blodsukkeret. Ketogenese i leveren, der forårsages af relativt lave koncentrationer af oxaloacetat i mitochondrierne og dæmpning af TCA cyclus samtidig med et stort tilbud af acetyl-coa, er endnu minimal, og det samme gælder gluconeogenese i nyrerne. *) Note: CETP ikke nævnt i målfortegnelsen.

11 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 11 Svar til Opgave 1. a. b. c. Aspartam må ikke indtages af personer med Phenylketonuri (Føllings sygdom). Aspartam spaltes i organismen til asparaginsyre (Asp) og phenylalanin (Phe). Ved nedsat aktivitet af enzymet phenylalaninhydroxylase kan Phe ikke metaboliseres som normalt via tyrosin, hvorfor der ophobes Phe og unormale katabolitter (se d.), og der kan eventuelt opstå mangel på tyrosin. d. Navnet Phenylketonuri refererer til unormale katabolitter af phenylalanin: phenylpyruvat (fenylpyrodruesyre) og phenyllactat (fenylmælkesyre).

12 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 12 Svar til Opgave 2. a. LDH katalyserer den reversible reaktion: Pyruvat + NADH 2 Lactat + NAD b. pyruvatkoncentration A 340 min 1 [NADH 2 ] mol L 1 min 1 V 0 mol L 1 min 1 0,20 mmol L 1 0,036 5, , ,30 mmol L 1 0,042 6, , Michaelis-Menten ligningen: V 0 = V max [S] 0 K M + [S] 0 omformes til: V max = V 0 [S] 0 (K M + [S] 0 ) V max = 5, , (K M + 2, ) = 6, , (K M + 3, ) Løsninger: K M = 1, mol L 1 & V max = 9, mol L 1 min 1 c. I kuvetten er enzymaktivitets-koncentrationen af LDH altså: 9, mol L 1 min 1 og LDH aktiviteten derfor: 9, mol L 1 min 1 0,003 L = 2, mol min 1 LDH stammer udelukkende fra 0,100 ml serum LDH aktivitets-koncentration i serum: 299 µmol L 1 min 1

13 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 13 Svar til Opgave 3. a. Denne type glycoproteiner har kulhydratgrupper koblet til N i amid(side)gruppen af asparaginylrester, hvor sidstnævnte indgår i en bestemt kort aminosyresekvens ("konsensussekvens" N-X-S/T). Kulhydratgruppen er knyttet til asparaginylgruppen via et specifikt saccharid (N-acetylglucosamin). Herudover består kulhydratet af en kæde af forskellige saccharider som f.eks. mannose, galactose, sialsyre og N-acetylgalactosamin. Forgrening af kæden ses hyppigt ved mannoserester. Syntese af N-glycosidbundne oligosaccharider starter med sammenkoblingen af saccharider og sacchariderivater, katalyseret af enzymer knyttet til endoplasmatisk reticulum, hvorefter heterosaccharidet "en bloc" bindes til asparaginylgruppen af det relevante protein. Efter partielle specifikke enzymkatalyserede hydrolyser af saccharidgrupperne overføres glycoproteinet til Golgi apparatet, hvor den endelige modifikation / maturation finder sted. b. Lysosomale enzymer har en speciel kulhydratstruktur, hvor en terminal mannoserest er fosforyleret. Dette genkendes af en specifik receptor (mannose-6-fosfatreceptor), som transporteres i vesikler mellem Golgi-apparat og endosomer/lysosomer. I Golgi-apparatet genkender receptoren enzymer med mannose-6-fosfat, hvorved enzymerne transporteres til lysosomer. Pga. det lave ph i endosomer/lysosomer afkobles enzymerne og forbliver i lysosomerne, hvorimod receptoren vender tilbage til Golgi-apparatet.

14 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 14 Svar til Opgave 4. a. A til T mutationen er lokaliseret i et MstlI site (site E) således, at det normale β-globin gen har tre MstII sites (site A, E og F - se skitse), mens seglcelle β-globin genet kun har to MstII sites (site A og F). Der vælges en DNA probe, der ligger upstream i forhold til mutationen (dvs imellem site A og site E). DNA'et fra personerne kløves med MstII og separeres på en agarosegel, der anvendes til Southern blotting. Proben mærkes med radioaktivitet (evt. en syntetisk DNA probe mærket i 5' enden med polynukleotidkinase). Proben vil hybridisere til et fragment på 1,2 kb hos en normal og til et 1,4 kb fragment hos en homozygot. En heterozygot vil have begge fragmenter. For at udføre analysen skal der således benyttes MstII, men analysen kan suppleres med EcoRI eller EcoRV hvorved fragmenterne bliver 0,8 kb (normal) og 1 kb (homozygot) henholdsvis 0,5 kb (normal) og 0,7 kb (homozygot). Endelig kan proben placeres mellem site E og F og give fragmenter på 0,2 kb (normal) og 1,4 kb (homozygot). Sidstnævnte kan evt være kortere ved at supplere med EcoRI (1 kb) eller EcoRV (0,7 kb). Besvarelser, der inkluderer PCR amplifikation i stedet for Southern blotting, vil også kunne accepteres. b. Hver globinenhed indeholder en hæmgruppe bestående af en porphyrinring med en komplekst bundet Fe 2+ ion, hvortil O 2 reversibelt kan bindes. En mindre del af den i vævene dannede CO 2 kan reversibelt bindes til en aminogruppe (globinets N-terminal) under dannelse af en carbaminogruppe.

15 Eksamen i Biokemi med Kemi januar 2005 side 15 Svar til Opgave 5. a. Enzymet thymidylatsyntase katalyserer, under dannelse af en kovalent binding til substratet (dump), overførslen af en methylgruppe til dump fra methyl-donoren N 5, N 10 -methylentetrahydrofolat. Ved afgivelsen af methylgruppen fra N 5, N 10 -methylentetrahydrofolat dannes dihydrofolat. b. Thymidylat-syntase inhiberes af fluorodeoxyuridin, efter fosforylering bindes dette substrat kovalent til enzymet i det aktive sæde. Enzymet inaktiveres herved irreversibelt ("selvmordsinhibition"), idet fluor-atomet forhindrer overførslen af methylgruppen fra N 5, N 10 -methylentetrahydrofolat. Folat-analoger (methotrexat, aminopterin) bindes meget stærkt til dihydrofolatreduktase, hvorved dannelse af tetrahydrofolat ved reduktion af dihydrofolat forhindres, hvilket standser gendannelse af N 5, N 10 -methylentetrahydrofolat fra tetrahydrofolat. c. Hæmning af TTP-syntese rammer alle hurtigt voksende celler i organismen, hvilket bl.a. medfører hårtab og nedsat produktion af blod- og epithelceller.