PROFESSIONSBACHELORPROJEKT Bioanalytikeruddannelsen UCL i Odense. Maria Erlinda Haugaard Gozun Studienummer: Hold: SB

Transkript

1 PROFESSIONSBACHELORPROJEKT Bioanalytikeruddannelsen UCL i Odense Optimering af FNA-materiale til forbedret subklassificering af lungecancer Optimization of FNA material for improvement of subclassification of lung cancer Maria Erlinda Haugaard Gozun Hold: SB Klinisk vejleder: Bioanalytikerunderviser Kirsten Hartmann, Afdeling for Klinisk Patologi, Odense Universitetshospital. Teoretisk vejleder: Adjunkt/molekylær- og cellebiolog Tone Elisabeth Bernchou, University College Lillebælt, Odense. Anslag:

2 Resumé Baggrund Finnålsaspiration anvendes til at aspirere tumorceller fra lungetumorer, hvorefter materialet udstryges og vurderes af patologen med henblik på en subklassificering af ikke-småcellet lungekarcinom. Problematikken med metoden er at det udtagne materiale er sparsomt og indholdet af tumorceller er varierende. Udstrygninger kan laves til et skrabekoagel og derved kan der produceres snit til supplerende histokemiske- og immunhistokemiske farvninger. Formål I dette projekt undersøges hvilken betydning brugen af skrabekoagel har, i optimeringen af May- Grünwald-Giemsa-farvet materiale fra finnålsaspiration, for at kunne subklassificere ikke-småcellet lungekarcinom i hhv. adeno- og planocellulært karcinom. Materialer og metoder FNA materiale fra lungetumorer fra 22 patienter. Udstrygningerne farves med May-Grünwald- Giemsa. Skrabekoaglet laves ved at skrabe udstrygningscellerne af objektglasset og der laves et plasma-trombinkoagel, som paraffinindstøbes. Der skæres snit, som farves med Hæmatoxylin- Eosin, Alcian van Gieson, samt to immunhistokemiskefarvninger: anti-ttf-1 og anti-p63. Disse vurderes af projektets observatører og der stilles en diagnose pr. patient. Diagnoserne sammenlignes derefter med patientens afgivne diagnose. Resultater Skrabekoagler lavet af May-Grünwald-Giemsa-farvede udstrygninger fik et karakteristisk udseende, hvor cellerne ligger sammenrullet i tråde. Med SK var det muligt at diagnosticere 20 ud 22 patienter med diagnoserne adeno- eller planocellulært karcinom. Enigheden mellem projektets observatører og patologens afgivne diagnose var 100 %. Konklusion Skrabekoaglet kan optimere det sparsomme materiale fra finnålsaspiration, således at ikkesmåcellet lungekarcinom kan subklassificeres i hhv. adeno- og planocellulært karcinom. Metoden er simpel og billig. Dog bør årsagen til det trådede udseende undersøges, før metoden kan implementeres på Afdeling for Klinisk Patologi, Odense Universitetshospital. Side 2 af 63

3 Forord Den praktiske del af dette projekt er udført på Afdeling for Klinisk Patologi, Odense Universitetshospital og i den anledning vil jeg gerne sige tak til afdelingen for at give mine medstuderende og mig muligheden for at udføre projektet, samt lov til at bruge afdelingen faciliteter. Derudover en tak til medarbejderne for hjælp når det har været nødvendigt. Jeg vil også gerne sige tak til: Overlæge Karen Ege Olsen, for støtte og vejledning, især med hjælp til mikroskopering og til at lære mig at udtage materiale ved finnålsaspiration. Bioanalytikerunderviser Kirsten Hartmann og Adjunkt/molekylær- og cellebiolog Tone Elisabeth Bernchou, for god støtte og vejledning gennem hele projektforløbet. Til sidst vil jeg gerne takke mine medstuderende og projektpartnere Ann Sofie Lindebjerg Larsen (observatør 1) og Maiken Rosager Hansen (observatør 2) for godt samarbejde, samt støtte og sparring gennem hele forløbet. Side 3 af 63

4 Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Baggrund... 2 Formål... 2 Materialer og metoder... 2 Resultater... 2 Konklusion... 2 Forord... 3 Forkortelser... 6 Introduktion... 7 Problembaggrund... 7 Lungerne... 8 Lungecancer... 8 Subklassificering af NSCLC... 8 Afgrænsning... 9 Histokemiske farvninger... 9 MGG... 9 HE AvG IHC Problemformulering Metodiske overvejelser Etiske overvejelser Materialer Patientmateriale Reagenser Apparatur Metoder FNA MGG SK HE AvG IHC Side 4 af 63

5 Resultater Udstrygningernes kvalitet Kvaliteten af SK HE AvG TTF p IHC på MGG-farvede udstrygninger Kontrol af IHC Vurderinger og diagnoser Individuel aflæsning, observatør Sammenligning af diagnoser Diskussion Prøvematerialet i projektet Udstrygningernes kvalitet Kvalitet af SK i projektet SK lavet af MGG-farvede udstrygninger IHC-farvning af SK AvG-farvning af SK SK metoden Vurdering af SK og diagnoser Konklusion Perspektivering SK som metode Fremtidige fordele Bioanalytiker som diagnostiker Litteratur Bilag 1: HE-forskrift Bilag 2: IHC-protokoller Protokol nr. 70: IE TTF Protokol nr. 153: IP P Bilag 3: MGG-forskrift Bilag 4: SK-forskrift Bilag 5: Afparaffinering Side 5 af 63

6 Bilag 6: AvG-forskrift Bilag 7: Multiblokke Multiblok K Multiblok K Bilag 8: Rådata Bilag 9: Tro og love erklæring skriftlige opgaver Forkortelser NSCLC Ikke-småcellet lungekarcinom MGG May-Grünwald-Giemsa AK Adenokarcinom HE Hæmatoxylin-Eosin PK Planocellulært karcinom TTF-1 Thyroid transkriptionsfaktor-1 FNA Finnålsaspiration AvG Alcian van Gieson EBUS Endobronkial ultralydsscanning HIER Heat-Induced Epitop Retrieval EUS Endoskopisk ultralydsscanning HRP Peroxidase SK Skrabekoagel DAB 3,3'-Diaminobenzidin IHC Immunhistokemiskfarvning Tc Tumorceller AKP Afdeling for Klinisk Patologi Side 6 af 63

7 Introduktion Problembaggrund I Danmark bliver ca mennesker om året ramt af lungecancer (1). Lungecancer inddeles overordnet i småcellet lungekarcinom (20-25 %) og ikke-småcellet lungekarcinom (NSCLC) (75-80 %) (2). NSCLC kan yderligere inddeles adenokarcinom (AK) (ca. 24 % af alle lungecancer tilfælde), planocellulært karcinom (PK) (ca. 20 % af alle lungecancer tilfælde) og storcellet karcinom (10 %) (3). Finnålsaspiration (FNA) er en teknik, hvorved man kan aspirere cytologisk materiale fra en tumor og efterfølgende udstryge det på et objektglas. Udstrygningen kan herefter farves, så man kan mikroskopere og vurdere cellerne. Derved kan udstrygningerne anvendes diagnostisk (4). FNAmaterialet kan udtages i forbindelse med Endobronkial ultralydsscanning (EBUS) og Endoskopisk ultralydsscanning (EUS), som er ultralyds- eller CT-vejledt (1). Problematikken med denne metode er at FNA-materialet er sparsomt og udtages oftest kun materiale nok til en eller to udstrygninger. Om udstrygningerne indeholder maligne celler kan først ses ved mikroskopi, efter at udstrygningen er blevet farvet. Hvis udstrygningerne ikke indeholder maligne celler kan de ikke bruges diagnostisk. Formålet med dette projekt er at undersøge en metode til at optimerer anvendelsen af den sparsomme mængde FNA-materiale, således at det er muligt at anvende det samme materiale til flere supplerende undersøgelser, efter vurderingen af udstrygningen. Metoden som undersøges er skrabekoaglet (SK), hvor de udstrygende celler skrabes af objektglasset og der tilføjes plasma og trombin, så der dannes et plasma-trombinkoagel. Af dette koagel kan der skæres snit med en tykkelse på 3 µm, som kan farves med histokemiske- og immunhistokemiskefarvninger (IHC). Dette projekt kan bidrage med ny viden, som kan klargøre hvorvidt SK-metoden kan medvirke til en subklassificering af lungecancer, så patienten kan modtage en målrettet behandling. Fordelen ved SK er at det er muligt at optimere materialemængden, da man kan få flere snit ud af samme koagel og derved udføre flere farvninger, der kan præcisere patientens diagnose. Dette projekt udføres med henblik på en fremtidig implementering af SK-metoden på Afdeling for Klinisk Patologi (AKP), Odense Universitetshospital (OUH). Side 7 af 63

8 Lungerne Lungerne består af en højre og en venstre lunge, som er opdelt i hhv. tre og to lapper. Lungerne omgives af en serøs hinde, pleura visceralis (5). Trachea splittes til to hovedbronkier, som går ind i hver lunge ved hilus, hvorefter de splittes til sekundære bronkier, som yderligere splittes til tertiære bronkier og til sidst fordeles disse til bronkioler. Dette kaldes for bronkietræet (5,6) Lungecancer Der findes flere typer for lungecancer og størstedelen af primære maligne tumorer i lungerne er karcinomer, som udgår fra bronkierne, disse kaldes derfor bronkogene karcinomer. Det største karcinogen i forbindelse med lungecancer er cigaretrygning, herefter er det faktorer som eksponering for stråling, asbest, samt nogle mineraler, såsom nikkel og krom. Derudover kan luftforurening og genetisk eksponering ligeledes være en faktor (2). Subklassificering af NSCLC Diagnosticering af lungecancer sker ofte ved analyse af en celle- og/eller vævsprøve. Først laves en oversigtsfarvning, såsom May-Grünwald-Giemsa (MGG) ved cytologisk materiale og Hæmatoxylin-Eosin (HE) ved histologisk materiale, for at kunne vurdere cellernes morfologi og evt. malignitet. Det er oftest ud fra disse farvninger, at patologen beslutter sig for hvilke supplerende farvninger, som skal bruges for at kunne stille en præcise diagnose. For lungecancer er subklassificeringen vigtig, især adskillelsen af AK og PK, bl.a. i forbindelse med valg af behandling. Der findes forskellige behandlingsmetoder for lungecancer og nogle behandlingspræparaters effekt er forskellig alt efter tumortypen. For eksempel ses der bedre resultater med præparatet Pemetrexed hos AK-patienter i forhold til patienter med PK (7). AK er oftest lokaliseret perifert i lungen og den mest hyppige forekommende lungecancertype hos ikke rygere. Ved lavt differentieret AK kan der ses forekomst af mucin (2,8,9), derudover kan thyroid transkriptionsfaktor-1 (TTF-1) ofte påvises (2,10,11). Dette er et kerneprotein, der findes i glandula thyroidea og som er vigtig ved udvikling af lungen (2,11). PK er den hyppigste forekommende lungecancertype hos kvinder og rygere. PK er oftest lokaliseret centralt i hovedbronchus. Udviklingen sker gradvist pga. en pladeepitelmetaplastisk forandring i epitelet i respirationsvejen (8,9). Ved PK kan p63 påvises, som findes i pladeepitelceller (10,11). p63 er et kerneprotein fra p53-familien (10). Side 8 af 63

9 Afgrænsning I dette projekt fokuseres på at forbedre anvendelsen af FNA-materiale fra lungetumorer med henblik på en mulig implementering af metoderne på AKP. Projektets opbygning tager derfor udgangspunkt i AKP's fremgangsmåder. Projektet tager udgangspunkt i problemstillingen omkring FNA-materialet med inspiration fra artiklen: Skov BG, et Al.: "A Technique to Improve Diagnostic Information From Fine-Needle Aspirations: Immunohistochemistry on Cytoscrape", som anvender SK-metoden. Denne metode er valgt til projektet for at undersøge, hvorvidt den kan optimere anvendelse af FNA-materialet (7). Farvningerne til projektet er valgt ud fra de farvninger, som i forvejen anvendes på afdelingen, derudover skal det være farvninger, som anses for at gøre det muligt at subklassificere lungecancer i hhv. AK og PK. MGG-farvning af udstrygningerne er valgt, fordi denne farvning i forvejen anvendes, som oversigtfarvning på FNA udstrygninger til vurdering af cellernes morfologi og malignitet. Derfor anvendes denne farvning frem for andre cytologiske oversigtsfarvninger. HE-farvningen er en oversigtsfarvning, der anvendes på AKP, som den første farvning på alle histologiske fikserede og paraffinindstøbte præparater. Derfor anvendes HE-farvningen, i stedet for andre oversigtsfarvninger. Til diagnosticeringen af AK udvælges to farvninger: antistof rettet mod TTF-1 og Alcian van Gieson (AvG). Disse er valgt med udgangspunkt i artiklen af Skov BG, et Al. (7), da TTF-1 er en kendt markør for AK og AvG anvendes til påvisning af mucin. Antistof rettet mod p63 anvendes til diagnosticering af PK. Denne er udvalgt, da den egner sig som markør for PK (10), samt anvendes p63 rutinemæssigt på AKP ved projektets udarbejdelse. Der findes også andre markører for PK, som fx p40, men disse anvendes ikke rutinemæssigt ved projektets udarbejdelse og derfor er de ikke medtaget i projektet. Histokemiske farvninger MGG Her anvendes en farveblanding af kationfarvestoffer, samt anionfarvestoffet Eosin Y. Det er Eosin Y og kationfarvestoffet Azur B, som er årsag til MGG-farvningens farveegenskaber. Azur B bindes til de negativt ladede grupper i proteinerne og Eosin Y bindes til de positivt ladede grupper (12). Side 9 af 63

10 Kernefarvningen opnås ved Romanowsky-Giemsa effekten. I farveopløsningen danner Azur B en dimér, som holdes sammen af hydrofobe interaktioner. Denne divalente kation bindes til de negative fosfatgrupper i nukleinsyrerne og derefter bindes Eosin Y til de bundne Azur B-dimérer. Derved opnås en purpur kernefarvning (12). Strukturer med negativt ladede carbohydrater farves af blå kationfarvestoffer, men fremstår violette. Dette kaldes metakromasi og opstår under nogle omstændigheder hvor farvestoffet, bundet til vævet/cellerne, absorberer lys af en anden bølgelængde og derved får en anden farve. I dette tilfælde skyldes det hydrofob stabilisering mellem farvemolekylerne når mange farvemolekyler bindes til samme makromolekyle. Dette giver en forskydning i lysabsorbtionen og farven ændres fra blå til violet (12). HE Til kernefarvningen anvendes Carazzi's hæmatoxylin, som er et metalkompleksfarvestof med aluminium, der bindes til de negativt ladede fosfatradikaler i nukleinsyrer. Aluminium bindes til vævet, hvorefter hydrofob stabilisering forstærker bindingerne. Efter farvning med hæmatoxylin er det vigtigt at der sker en ph forskydning fra sur til neutral, for at fremkalde en blåning af farvestoffet. Dette medfører at kernefarvningen skifter fra rød til blå. Eosin Y anvendes til cytoplasmafarvningen og farver de positivt ladede grupper, heriblandt proteiner i cytoplasma, muskulatur og bindevæv, samt de positive histoner i kernerne. Eosin Y farver disse røde. Kernerne bliver blå-violette, som resultat af en kombinationsfarvning af Eosin Y i histonerne og Carazzi i nukleinsyrerne (12,13). AvG Farvningen er en kombination af to farvninger: Alcian Blue, der anvendes til påvisning af sure carbohydrater og van Gieson, der er en bindevævsfarvning. Der anvendes flere farvestoffer til denne farvning: Alcian Blue er et stort kationfarvestof, som farver sure mucosubstanser; sure proteoglycaner og sure glycoproteiner. Farvestoffet bindes til negativt ladede grupper, såsom sulfat og carboxylgrupper, som er ioniseret ved en lav ph-værdi og giver disse en blå farve (14). Weigerts jernhæmatoxylin er et metalkompleksfarvestof med jern og bindes til de negativt ladede fosfatradikaler i nukleinsyrer i kernerne, som farves brune (14). Pikrofuksin er en blanding af pikrinsyre, syrefuksin og konc. eddikesyre, som farver kollagen rødt, erytrocytter bliver gule og muskulatur farves gul-brunt (14). Side 10 af 63

11 IHC Inden farvningen laves først en epitop demaskering, hvor bindingsstederne til antigenerne bliver blotlagte, således at antistofferne får lettere ved at binde sig. Demaskeringen kan ske ved varmebehandling, også kaldet Heat-Induced Epitop Retrieval (HIER), hvor paraffinsnittet opvarmes i en buffer eller saltopløsning efter afparaffinering og rehydrering. Mekanismen ved varmebehandlingen er ikke præcist kendt, men det tyder på at varmen påvirker paraffinsnittene på en måde så formalin tværbindingerne brydes, samt Ca + -ionerne fjernes og en vis proteindenatureing sker, som kan blotlægge skjulte epitoper (11). De fleste immunenzymatiske detektionssystemer anvender enzymer, som forekommer naturligt i en række celler i humant væv, fx peroxidase. Derfor blokeres mod endogen aktivitet, for kun at påvise det enzym, som er tilsat i forbindelse med detektionssystemet (11). Efter forbehandlingen tilsættes det primære antistof, som bindes til det antigen man ønsker at påvise. Ud fra hvad man ønsker at påvise, samt det antistof man anvender, findes der forskellige inkubationstider og temperaturer, som giver et optimalt resultat (11). Til sidst skal antistof-antigen interaktionen påvises ved hjælp af et detektionssystem. Der findes 1-, 2- og 3-lags teknikker, alt efter antallet af antistoffer der anvendes (11). Ventana BenchMark Ultra's OptiView detection er en 3-lags teknik, hvor der anvendes en HQ Universal Linker, der er et sekundært antistof, som bindes til det primære antistof. HRP Multimer bindes herefter til HQ Universal Linker og til denne er bundet enzymet peroxidase (HRP). HRP visualiseres ved at anvende H 2 O 2, som substrat, og kromogenet 3,3'-Diaminobenzidin (DAB). Derved opnås en detektion, i form af en brunlig farve (15). Ventana anvender kobbersulfat (16,17), som forstærker DAB reaktionen, således at det giver en mørkere og mere intens farve (18). IHC afsluttes med en kernefarvning med hæmatoxylin, for at kunne se lokaliseringen af DAB reaktionen, i forhold til hvor antigenet befinder sig i cellerne (11). Problemformulering Hvilken betydning har brugen af skrabekoagel i optimeringen af den begrænsede mængde FNA-materiale på MGG-farvede udstrygninger fra tumorer i lungerne, til subklassifikation af NSCLC i hhv. adeno- og planocellulære karcinomer? Side 11 af 63

12 Metodiske overvejelser For at kunne besvare problemformuleringen udarbejdes et projekt, hvor FNA-materiale anvendes til at lave et SK for at få mulighed for at producere flere snit til at udføre forskellige farvninger på det samme materiale. I samarbejde med Overlæge Karen Ege Olsen og AKP valgte vi at sætte et mål for at indsamle prøvemateriale fra minimum 25 patienter. Årsagen til dette antal er at det er nok data til at opnå reproducerbare konklusioner, derudover er det et realistisk antal ud fra den mængde tid vi har, samt det antal lungepræparater der modtages på AKP. Projektet kræver en vis størrelse population, da der er risiko for at udtage materiale med nekrose og bindevæv, samt manglende tumorceller (Tc). Vi valgte samtidig at udtage materiale til 20 udstrygninger pr. patient for at sikre at vi havde nok prøvemateriale for hver patient i projektet. Patienterne registreres med et BA nr., fx 01 og patientens udstrygninger bliver registreret med BA nr. og udstrygningsnr., fx 0117 for patient nr. 01's udstrygning nr. 17. SK får samme nummer som den udstrygning cellerne er skrabet af fra. De ufarvede udstrygninger opbevares i -80 ºC fryser, da cellerne bevares bedst ved denne temperatur, frem til de skal anvendes (19). Problemformuleringen tager udgangspunkt i MGG-farvede udstrygninger, da denne farvning anvendes obligatorisk ved FNA udstrygninger. Vi valgte at medtage ufarvede udstrygninger i dette projekt, for at undersøge hvorvidt MGG-farvningen har en betydning for resultatet af SKs efterfølgende farvninger. Der skæres snit på 4 SK pr. patient, 2 MGG-farvede og 2 ufarvede, som derefter farves. Vi valgte at få medarbejderne på AKP til at skære koaglerne, da vi ikke selv vurderede at have rutine og øvelse nok til at skære snit af så sparsomt materiale. Vi bad om at få skåret 8 snit af hvert koagel, som vi selv monterede på objektglas. Vi monterede snit på 4 objektglas (2 alm. og 2 coatede) til farvningerne, derudover blev der monteret snit på 4 ekstra glas (2 alm. og 2 coatede). De 4 udvalgte farvninger farves på snit fra hvert koagel. HE anvendes, som en oversigtsfarvning, til at identificerer Tc. AvG anvendes til at påvise celler med mucinfyldte vakuoler, som er karakteristisk ved lavt differentieret AK. Derudover anvendes antistoffer rettet mod TTF-1, til diagnosticering af AK. Antistoffer rettet mod p63, anvendes som markør for PK (7). Ved mikroskoperingen startes med HE-farvningen, hvor cellernes morfologi vurderes og derved identificeres evt. Tc. Derefter vurderes AvG-farvningen, hvor der kigges efter Tc med mucinfyldte vakuoler. AvG-farvningen blev testet inden projektets start, ved at farve snit fra normalt væv fra Side 12 af 63

13 tyktarm, da dette indeholder mucin (6), for at sikre farvningens egnethed til påvisning af mucin. Testen viste at det er muligt at påvise mucin ved AvG-farvningen. Til sidst vurderes de to IHCfarvninger, rettet mod hhv. TTF-1 og p63, hvor Tc i HE-farvningen genfindes og intensitet, samt mængden af celler med IHC reaktion vurderes. Hver IHC-farvning får en score (0, +, ++, +++). Ud fra dette afgives en samlet diagnose (AK eller PK) pr. patient. Ved IHC-farvningerne monteres et kontrolsnit med positiv og negativ kontrol ved hver farvning. De positive kontroller anvendtes ligeledes som kontrol for den specifikke kørsel. Reaktionerne i de positive kontroller er +++ og derfor kan farvningen i kontrollerne sammenlignes med farvningen i præparatet, da farveintensiteten i de positive kontroller angiver intensiteten for en score på +++ ved den pågældende kørsel. Ved dette projekt anvendtes kontrollerne for IHC farvningerne på samme måde som i den daglige rutine på AKP. De SK, hvor der ikke kan identificeres Tc i HE-farvningen, vil udgå fra projektet, for at få projektets fremgangsmåde til at ligne fremgangsmåden på AKP, hvor man først vurderer HE-farvningen og derefter bestiller supplerende farvninger, såsom IHC. Dog mikroskoperes AvG og IHC, uanset tilstedeværelsen af Tc i HE-farvningen, for at undersøge om disse farvninger bidrage med diagnostisk information på trods af manglende Tc i HE-farvningen. Alle farvningerne mikroskoperes individuelt af projektets observatører 1-3, der ikke har erfaring som diagnostiker, og derefter konfereres og opstilles en fælles diagnose pr. patient. Dette gøres uden kendskab til diagnoserne som patologen har afgivet. Denne procedure følges for at undersøge hvorvidt det muligt for observatørerne at stille en diagnose baseret udelukkende på baggrund af projektets undersøgelser. Derfor sammenligner vi diagnoserne med patologens for at kunne vurdere undersøgelsernes brugbarhed. Etiske overvejelser Dette projekt er en afprøvning af en ny metode, som ikke får betydning for patienternes videre forløb. Der udtages materiale fra ufikserede lungepræparater med teknikker som ikke medfører nogle skader på det resterende materiale. Patienterne har fået en diagnose på det tidspunkt hvor vi laver projektet og der behøves derfor ingen samtykke fra patienterne. Da der arbejdes med sparsomt materiale skal håndteringen være korrekt for at undgå at materialet går til spilde. Derfor er det vigtigt, at vi er grundigt forberedte og behersker FNA teknikken inden projektets start. For at sikre patientens anonymitet, tildeles hver patient et BA nr. Hverken patienternes navne, CRP-nummer eller patologisystemets numre anvendes i dette projekt. Side 13 af 63

14 Materialer Patientmateriale Prøvematerialet er FNA-materiale fra ufikserede lungepræparater, som er modtaget på AKP i perioden fra den til den Reagenser - Xylen. - Plasma (humant, fra Klinisk Immunologisk Afdeling). - Trombin (kemisk fremstillet, fra Biofac). - Ethanol (70 %, 96 %, 99 %). - Buffer-opløsning (170 ml fosfat buffer 0,067 M ph 6,5, tilsat ionbyttet vand op til 1700 ml). - May-Grünwald-opløsning (85 ml May-Grünwald, 170 ml bufferopløsning). - Giemsa-opløsning (69 ml Giemsa, 690 ml buffer). - Konc. Eddikesyre. - Pertex. - Histo-Clear. - Neutral bufferet formaldehyd (4 %). - Isopropanol. - Paraffin. - Carazzi hæmatoxylin. - NH 3 -vand arbejdsopløsning (680 ml postevand, 1.25 ml konc. ammoniakopløsning). - Eosin arbejdsopløsning (340 ml dest. vand, 340 ml Eosinopløsning blandet 2,1 %, 200 μl konc. eddikesyre 100 % t.a.). - 0,8 % Alcianblue pyridin ph 2,7 (25 g Alcianblue pyridin variant, 3112 ml renset vand, 13 ml konc. eddikesyre). - Weigerts jernhæmatoxylin: Opløsning I (50 g Hæmatoxylin, 5000 ml 99 % ethanol) og Opløsning II NY (2000 ml 4,5 % Ferrosulfat 7H 2 O vandig, 50 ml konc. HCl, 2000 ml 2,5 % Ferrichlorid 6H 2 O vandig, 980 ml dest. vand). - Picrofuchsin-opløsning (1 g Syrefuksin, 1000 ml mættet vandig Picrinsyre, 3 tsk. Picrinsyrepulver pr. farvekar). - EZ Prep (Ventana). - Cell Conditioner 1 (Ventana). - Reaktions buffer (Ventana). - OV PEROX IHBTR (Ventana). - Prep kit 46 (Ventana) med anti-ttf-1 (antistofklon SPT24) fra NovoCastra. - Prep kit 53 (Ventana) med anti-p63 (antistofklon 4A4) fra Zeta. - OV HQ UNIV LINKR (Ventana). - HRPMultimer (Ventana). - OV H 2 O 2 (Ventana). - OV DAB (Ventana). - OV COPPER (Ventana). - Hæmatoxylin II (Ventana). - Bluing reagent (Ventana). Apparatur - MGG farves på Leica St HE farves på Tissue-Tek Prisma. - AvG farves manuelt. - TTF-1 og p63 farves på Ventana BenchMark Ultra. Side 14 af 63

15 Metoder Projektets praktiske forløb illustreres på nedenstående flowdiagram, figur 1: Figur 1: Flowdiagram, som kort illustrerer fremgangsmåden af det praktiske arbejde i forbindelse med dette projekt. Side 15 af 63

16 FNA Sprøjten monteres i håndtaget og derefter sættes kanylen på sprøjten. Med stemplet i bund stikkes kanylen ind i tumor, der hvor der ønskes at udtage celler. Herefter trækkes stemplet op for at danne et undertryk. Kanylen bevæges op, ned og roteres i samme indstik for at løsne cellerne. Stemplet slippes langsomt inden nålen trækkes ud og tumormaterialet vil befinde sig i kanylen. Kanylen tages af sprøjten, som fyldes med luft, hvorefter kanylen igen påsættes. Lufttrykket anvendes til at presse cellerne ud af kanylen i en dråbe på objektglasset. Herefter anvendes et andet objektglas til at udstryge dråben og derved danne et smear, hvor cellerne ligger i et lag (4). MGG Udstrygningerne lufttørres og derefter farves med MGG efter afdelingens forskrift. Udstrygningerne føres igennem 3 kar med 96 % ethanol, hvorefter de farves med May-Grünwald. Dernæst skal udstrygningerne igennem 3 kar med Giemsa, samt 2 kar med fosfatbuffer. Udstrygningerne er 4,5 min. i hvert kar. Til sidst skal udstrygningerne tørre i minutter i sugeskab og derefter monteres dækglas med Pertex. En detaljeret gennemgang af fremgangsmåden forefindes i bilag 1 (20). SK Dækglasset afmonteres ved at sætte objektglasset i xylen indtil dækglasset falder af, hvorefter objektglasset hydreres i 2 bade med 99 % ethanol á 2 min. og derefter føres til postevand. I et glaslåg afpipeteres 3 dråber plasma, hvorefter der anvendes et barberblad til at skrabe cellerne forsigtigt af objektglasset og ned i glaslåget, som holdes på skrå. Der tilsættes 2 dråber trombin og det hele blandes sammen med en metalspatel, så der dannes et koagel. Metalspatlen der steriliseres mellem hver patient. Ved de ufarvede udstrygninger tilsættes en dråbe Eosin arbejdsopløsning til plasmaet for at synliggøre koaglet. Koaglet ligges i linsepapir, der bliver foldet og ligges i kapslen. Herefter indgår kapslen i vævsfremføringen fra formalin til paraffin natten over og indstøbes manuelt i paraffin dagen efter. Der skæres efterfølgende paraffinsnit på 3 µm. En detaljeret gennemgang af fremgangsmåden forefindes i bilag 2 (21). HE HE farves efter afdelingens forskrift. Først kommes paraffinsnittene i varmeskab ved 72 ºC, for at smelte paraffinen, hvorefter de sættes på farvemaskinen. Først skal snittene igennem 2 kar med Histo-Clear á 5 min. varighed. Herefter foretages en hydrering med 2 kar 99 % ethanol og et kar med 96 % ethanol, alle i 3 min., hvorefter de gennemgår en vask i rindende vand på 2 min. Snittene kernefarves med Carazzis sure hæmalun (á 2 gange 4 min.), efterfulgt af 4 min. vask i rindende Side 16 af 63

17 vand, 2 min. i NH 3 og yderligere 4 min. vask i rindende vand. Snittene føres til Eosin Y i 3 min. og skylles i rindende vand i 1 min. Tilslut dehydreres snittene i 96 % ethanol og 2 kar med 99 % ethanol a 3 min. varighed og der monteres en dækfilm. En detaljeret gennemgang af fremgangsmåden forefindes i bilag 3 (13). AvG Først afparaffineres snittene med Histo-Clear efter forskrift, hvor de føres gennem 2 kar med Histo- Clear á 5 min pr. kar, efterfulgt af 2 kar med 99 % ethanol, 2 kar med 96 % ethanol og et kar med 77 % ethanol á 2 min. pr. kar og til sidst kommet snittene i rindende vand i 5 min. Fremgangsmåden forefindes i bilag 4 (22). Derefter skal snittene Alcian Blue i 5 min. og rindende vand i 2 min., efterfulgt af en kernefarvning med Weigert jernhæmatoxylin i 7,5 min. Snittene skylles i rindende vand i 5 min. og herefter kommes de i Picrofuksin i 10 sek. Til sidst dehydreres snittene: 4 dyp i 77 % ethanol, 5 dyp i 96 % ethanol og derefter i 2 kar med 99 % ethanol á 2 min., herefter de tørrer i stinkskab og der monteres dækglas med Pertex. En detaljeret gennemgang af fremgangsmåden forefindes i bilag 5 (23). IHC Anti-TTF-1 og anti-p63 farves efter afdelingens indkodede protokoller. Fremgangsmåden er ens for anti-ttf-1 og anti-p63. Den eneste forskel er at der anvendes forskellige primære antistoffer, hhv. prepkit 46 med klon SPT24 ved TTF-1 og prepkit 53 med klon 4A4 ved p63. Protokollerne kan ses i deres fulde længde i bilag 6 (16,17). Først bages objektglasset ved 75 ºC i 4 min og derefter afparaffineres ved 72 ºC i 4 min. Demaskeringen udføres herefter, som en kombination af varmebehandling og reagenset Cell Conditioning 1 (CC1). CC1 påføres og objektglasset opvarmes til 100 ºC og inkuberingen foregår i først 2 gange 4 min, efterfulgt af 4 gange 8 min. ved TTF-1 og 2 gange 8 min. ved p63. Objektglasset skylles med reaktions buffer og opvarmes til 36 ºC. Endogen aktivitet blokeres med OV PEROX IHBTR og inkuberes i 4 min. Objektglasset skylles med reaktions buffer. En dråbe primært antistof fra prepkit 46/53 og objektglasset inkuberes i 32 min, hvorefter der skylles med reaktions buffer (16,17). Påvisning af antistofreaktionen sker ved Ventana BenchMark Ultra's OptiView detection. Først påføres OV HQ UNIV LINKR og inkuberes i 8 min og objektglasset skylles med reaktions buffer, hvorefter HRP Multimer påføres og inkuberes i 8 min, efterfulgt af endnu en omgang skylning med reaktions buffer. En dråbe OV H2O2 og en dråbe OV DAB påføres og inkuberes i 8 min, derefter Side 17 af 63

18 skylles med reaktions buffer. Til sidst påføres en dråbe OV COPPER og inkuberes i 4 min, efterfulgt af skylning med reaktions buffer (16,17). Sidste trin i protokollerne er en kernefarvning med HEMATOXYLIN II, hvor en dråbe påføres objektglasset og inkuberes i 8 min, hvorefter der skylles med reaktions buffer. Der påføres en dråbe BLUING REAGENT, som inkuberes i 4 min. Til sidst skylles med reaktions buffer. IHC reaktionerne scores med 0, +, ++ eller +++, ved at sammenligne reaktionerne med de positive kontroller i multiblokkene (24,25). Derudover vurderes også mængden af Tc med IHC reaktion ud fra de identificerede Tc i HE-farvningen, se tabel 1: Reaktion Betydning Konklusion 0 Ingen farvning i <10 % af Tc identificeret i forhold til HE Negativ + Svag farvning i >10 % af Tc identificeret i forhold til HE Negativ ++ Svag til moderat farvning i >10 % af Tc identificeret i forhold til HE Positiv +++ Stærk farvning i >30 % af Tc identificeret i forhold til HE Positiv Tabel 1. Vurdering af IHC, hvor reaktionerne i Tc scores (0, +, ++, +++) ud fra intensitet og antallet af reagerede Tc. Derudover angives hvornår reaktionen er positiv/negativ. Side 18 af 63

19 Resultater Udstrygningernes kvalitet FNA-udstrygningerne har meget forskelligt udseende. I de gode udstrygninger ligger cellerne i et enkelt cellelag og det er derved muligt at vurdere den enkelte celle. I de dårlige udstrygninger kan cellerne ligge sammenklumpet og det er ikke muligt at skelne cellerne fra hinanden eller udstrygningen kan være koaguleret og fyldt med erytrocytter. I figur 2 ses eksempler på gode og dårlige MGG-farvede udstrygningerne: Figur 2. Eksempler på MGG-farvede FNA-udstrygninger. a) God udstrygning, hvor cellerne ligger i et cellelag. Der ses en del erytrocytter og to større klaser af Tc (røde pile). b) Dårlig udstrygning. Celler ligger sammenklumpet (orange pile). c) God udstrygning. Cellerne ligger i et enkelt lag. Der ses flere klaser af Tc (røde pile). d) Dårlig udstrygning, med koagulerede erytrocytter (gule pile) dominerer billedet. Side 19 af 63

20 Kvaliteten af SK Farvningerne på SK gav varierende resultater. SK lavet af MGG-farvede udstrygninger havde et meget karakteristisk udseende, hvor cellerne "rullede" sammen i tråde. Dette medførte at det ikke altid var muligt at vurdere den enkelte celle. Ved SK lavet af ufarvede udstrygninger observeres et meget pænere cellebillede, hvor det var lettere at vurdere cellernes strukturer. Figur 3-6 viser et udpluk af de 4 farvninger, HE, AvG, anti-ttf-1 og anti-p63, som blev udført på snit fra SK, samt illustrering af gradering af IHC-farvningerne for TTF-1 og p63 med score fra 0 til +++: HE Figur 3. Eksempel på HE-farvning af SK. a) SK lavet af en MGG-farvet udstrygning. Cellerne ligger rullet sammen i tråde (grønne pile). b) SK er lavet af en ufarvet udstrygning. Her ses et pænere cellebillede. Der observeres Tc med forstørrede cellekerner (røde pile). Side 20 af 63

21 AvG Figur 4. Eksempel på AvG-farvning af SK. a) AvG negativ på SK lavet af en MGG-farvet udstrygning. Der ses diffus blåfarvning omkring de sammenrullede celler (mørkeblå pile), men ikke i vakuoler i cellernes cytoplasma. b+d) AvG positiv. Der ses celler med blåfarvet mucin i vakuoler i cytoplasma (gule pile). c) AvG negativ på SK lavet af en ufarvet udstrygning. Her ses blåfarvning i strøg imellem og omkring cellerne (lyseblå pile). Side 21 af 63

22 TTF-1 Figur 5. Her ses repræsentative eksempler for gradering af TTF-1 fra 0 til +++. a) Her ses en klase af Tc, der er TTF-1 positive med en score på +++ (røde pile). b) En mindre gruppe Tc, som har en reaktion for TTF-1 med scoren ++ (grønne pile). c) Der ses en TTF-1 score på + i en gruppe Tc (blå pile). d) TTF-1 negative Tc, med en IHC score på 0 (gule pile). Side 22 af 63

23 p63 Figur 6. Her ses repræsentative eksempler på IHC reaktioner for p63. a) Flere grupper p63 positive Tc med en IHC score på +++ (røde pile). b) Her ses en mindre gruppe Tc, som er p63 positive med en score på ++ (grønne pile). c) En gruppe Tc med en score på + for p63 (blå pile). d) p63 negative Tc med en score på 0 (gule pile). Side 23 af 63

24 IHC på MGG-farvede udstrygninger Ved SK lavet af MGG-farvede koagler kunne Tc ikke altid identificeres i HE-farvningen og derfor udgik disse koagler fra videre diagnostik. Nogle gange kunne Tc identificeres ved IHCfarvningerne på trods af manglende identifikation i HE-farvningen. Eksempler på dette ses i figur 7: Figur 7. Eksempler på SK lavet af MGG-farvede udstrygninger, hvor Tc har været vanskelige at identificere i HE-farvningen, men lettere at se i IHC-farvningerne. a) Her er cellerne ikke mulige at vurdere morfologisk, da de er sammenkrøllede (blå pil). b) Cellekernerne mere tydelige i forhold til HE. Cellerne er p63 negative med en score på 0 (grøn pil). c) Cellerne er her TTF-1 positive med en score på +++ (rød pil). d) Cellerne er ødelagte og ligger sammenklumpet i flager (gule pile). e) Her ses p63 positive Tc med en score på ++ (rød pil). f) Cellekernerne er lettere at vurdere i forhold til HE-farvningen, men der identificeres ingen Tc (sorte pile). Alle cellerne er TTF-1 negative med en score på 0. Side 24 af 63

25 Kontrol af IHC Som kontrol på IHC anvendes to multiblokke, se figur 8-9. Multiblok K3 anvendes som kontrol til TTF-1 og multiblok K2 anvendes som kontrol til p63. Oversigt over multiblokkene forefindes i bilag 7 (24,25). Figur 8. Visuel oversigt over multiblok K3. Ved thyreoidea og medullært thyreoidea karcinom ses en score på +++. Disse fungerer som projektet positive kontrol for TTF-1 (26). Figur 9. Visuel oversigt over multiblok K2. Ved hud, tonsil og prostata ses score på +++. Disse fungerer som projektet positive kontrol for p63 (27). Vurderinger og diagnoser Individuel aflæsning, observatør 3 Ud af i alt 89 SK fra 22 patientprøver var det muligt at identificere Tc i HE- farvningen i 63 koagler. Et SK indeholdte ingen celler og ved de sidste 25 SK var det ikke mulig at identificere Tc i HE-farvningen. SK uden Tc i HE-farvningen udgår fra diagnosticeringen. Kun et koagel ud af 89 var positiv for mucin. Rådata forefindes i bilag 8 (28). Side 25 af 63

26 Der laves en samlet diagnose pr. patient i henhold til de to NSCLC subtyper: AK eller PK. Ved IHC laves et gennemsnit af scoren, hvor scoren af hvert koagel med Tc pr. patient sammenlægges og deles med antallet af koagler, for hhv. TTF-1 og p63. En oversigt over diagnoserne ses i tabel 2: BA nr. Farvning Resultat Diagnose BA nr. Farvning Resultat Diagnose HE 3 blokke Tc HE 2 blokke Tc 01 AvG - N AvG - N AK 12 TTF P TTF P AK p63 0 N p63 0 N HE 2 blokke Tc HE 4 blokke Tc 02 AvG - N AvG - N AK 13 TTF P TTF-1 ++(+) P AK p63 0 N p63 (+) N HE 4 blokke Tc HE 3blokke Tc 03 AvG - N AvG - N AK 14 TTF P TTF P AK p63 0 N p63 0 N HE 3 blokke Tc HE 2 blokke Tc 04 AvG - N AvG - N AK 15 TTF-1 ++(+) P TTF P AK p63 0 N p63 0 N HE 4 blokke Tc HE 3 blokke Tc 05 AvG - N AvG - N AK 16 TTF P TTF P AK p63 0 N p63 (+) N HE 2 blokke Tc HE 1 blok Tc 06 AvG - N AvG - N AK 17 TTF P TTF-1 0 N - p63 0 N p63 0 N HE 1 blok Tc HE 3 blokke Tc 07 AvG - N AvG - N AK 18 TTF P TTF-1 0 N PK p63 0 N p63 ++ P HE 2 blokke Tc HE 2 blokke Tc 08 AvG - N AvG - N AK 19 TTF-1 ++ P TTF-1 0 N - p63 (+) N p63 0 N HE 4 blokke Tc HE 4 blokke Tc 09 AvG - N AvG - N PK 20 TTF-1 (+) N TTF-1 (+) N PK p63 ++ P p63 ++(+) P HE 4 blokke Tc HE 2 blokke Tc 10 AvG 1 blok P AvG - N AK 21 TTF-1 ++(+) P TTF-1 (+) N PK p63 (+) N p P HE 4 blokke Tc HE 4 blokke Tc 11 AvG - N AvG - N AK 22 TTF P TTF P AK p63 0 N p63 0 N Tabel 2. Farvningsresultater og diagnose pr. patient. For HE angives hvor mange blokke pr. patient, hvor Tc kunne identificeres. AvG vurderes positiv (P) eller negativ (N). For TTF-1 og p63 laves en gennemsnitlig score (0, +, (+), ++, ++(+), +++), baseret på IHC-reaktionerne i de blokke hvor TC blev identificeret i HEfarvningen. BA nr. 17 og 19 var ikke mulige at diagnosticere på baggrund af dette projekt. Side 26 af 63

27 2 ud af 22 patienter (9,09 %) var ikke mulige at diagnosticere ud fra de anvendte farvninger, da der hverken fandtes IHC reaktioner for TTF-1/p63 eller mucinpåvisning. På baggrund af dette projekt er diagnoserne ukendte, se tabel 2. Fordelingen af observatør 3's diagnoser viser at 72,73 % (16 ud af 22) har NSCLC subtypen AK og 18,18 % (4 ud af 22) har subtypen PK. Ved nogle af patienterne observeres coekspression af TTF-1 og p63. Reaktionerne for TTF-1 og p63 inden for diagnoserne AK og PK fordelte sig som illustreret i tabel 3: Diagnose AK PK Diagnose (+) (+) ++ TTF Antal PK-patienter med TTF coekspression Antal AK-patienter med p p coekspression Tabel 3. Fordeling af IHC reaktionerne for AK og PK. Fordeling af patienternes TTF-1 score for AK, samt antal af patienter med p63 coekspression. Fordeling af patienternes p63 score for PK, samt antal af patienter med TTF-1 coekspression. Side 27 af 63

28 Sammenligning af diagnoser Observatørernes individuelle diagnoser sammenlignes med hinanden, hvorefter der i fællesskab afgives en fælles diagnose pr. patient. Herefter hentes patologens afgivne diagnose via afdelingens patologisystem. Her ses det at to af patienternes diagnoser, BA nr. 17 og 19, hverken var AK eller PK, men i stedet neuroendokrint karcinom og karcinoid tumor. Enigheden mellem projektets 3 observatører er på 95,45 % (21 ud af 22) og enigheden mellem observatørernes fælles diganose og patologens diagnose var på 100 %. Alle diagnoserne ses i tabel 4: BA nr. Diagnose Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Fælles Diagnose fra patologen 01 AK AK AK AK AK 02 AK AK AK AK AK 03 AK AK AK AK AK 04 AK AK AK AK AK 05 AK AK AK AK AK 06 AK AK AK AK AK 07 AK AK AK AK AK 08 AK AK AK AK AK 09 AK PK PK PK PK 10 AK AK AK AK AK 11 AK AK AK AK AK 12 AK AK AK AK AK 13 AK AK AK AK AK 14 AK AK AK AK AK 15 AK AK AK AK AK 16 AK AK AK AK AK Neuroendokrint karcinom 18 PK PK PK PK PK Karcinoid tumor 20 PK PK PK PK PK 21 PK PK PK PK PK 22 AK AK AK AK AK Tabel 4. Oversigt over projektgruppens individuelle og fælles diagnoser for AK og PK. Patologens diagnoser for projektets 22 patienter er hentet fra AKP's patologisystem efter de individuelle og fælles diagnoser af lavet. Ved BA nr. 09 ses ikke enighed blandt observatørernes individuelle diagnoser (markeret med rød). Side 28 af 63

29 Diskussion Prøvematerialet i projektet Til dette projekt blev der udtaget materiale til 20 udstrygninger pr. patient og til diagnosticering anvendtes 4 koagler pr. patient. Denne mængde prøvemateriale er ikke realistisk under et patientforløb, da der normalt modtages op til 2-3 FNA udstrygninger pr. patient. Materialet til projektet er indsamlet fra lungepræparater modtaget på AKP og derfor var det muligt for os at palpere præparatet for at lokalisere tumor inden udførsel af FNA. Derudover skulle der ikke tages hensyn til ubehag for patienten ved materialeindsamling til dette projekt. Når der på normalvis udtages FNA-materiale fra en patient gøres dette ultralyds- eller CT-vejledt ved fx EBUS eller EUS, imens tumoren er i patienten og afhængig af tumors placering er det ikke altid muligt at udtage mere materiale. Gentagelse af FNA kan også medføre gene for patienten. Derfor er det vigtigt, at det modtagende FNAmateriale udnyttes bedst muligt. Prøvemængden i dette projekt var på 22 patienter, hvilket ikke antages for optimalt til at sikre metodens reproducerbarhed. Hvis projektet havde foregået over en længere periode, ville det være muligt at opnå en større population og derved være sikker på at projektets resultater og konklusioner er repræsentative. Derfor bør der udarbejdes et større og mere omfattende projekt, som kan be- eller afkræfte konklusionerne i dette projekt. Da prøvematerialet normalt er sparsomt, er det yderst vigtigt at det udstrygningsmateriale man vælger at lave til SK indeholder Tc. Derfor skal patologen have mulighed for at vurdere udstrygningsmaterialet for at kunne udvælge den rette udstrygning. Udstrygningernes kvalitet De MGG-farvede FNA-udstrygninger havde meget forskelligt udseende, se figur 2. En god udstrygning kendetegner sig ved at cellerne ligger i et enkelt cellelag, således at det er muligt at vurdere den enkelte celle. Den store variation i udstrygningernes udseende er medvirkende til at supplerende undersøgelser kan være nødvendige. Hvis der modtages udstrygninger med sammenklumpede celler eller mange erytrocytter, kan det være umuligt at konkludere noget udelukkende på baggrund af disse. En alternativ anvendelse af udstrygningsmaterialet til supplerende undersøgelser kunne være SK, som undersøges i dette projekt. Det kan tænkes at dårlige udstrygninger kan føre til dårlige SK snit, da stort indhold af erytrocytter eller nekrose kan være forstyrrende ved vurdering af SK, men dette bør undersøges ved et nyt pro- Side 29 af 63

30 jekt. Hvis udstrygningens kvalitet ikke betyder noget for kvaliteten af SK kan det være en fordel, da det kunne gavne de tilfælde hvor der modtages dårlige udstrygninger, som ikke kan anvendes diagnostisk. Derfor er det også vigtigt at der laves en oversigtsfarvning af SK, fx HE-farvningen, som kan anvendes til morfologisk vurdering af cellerne, i tilfælde af, at denne vurdering ikke kunne laves på MGG-udstrygningen. Dette kunne gøre det muligt at anvende dårligt udstrygningsmateriale til SK, som ellers ville være mislykket. Derved undgår patienterne at få foretaget yderligere undersøgelser for at få udtaget FNA-materiale. Kvalitet af SK i projektet SK lavet af MGG-farvede udstrygninger Alle koagler lavet af MGG-farvede udstrygninger havde et meget karakteristisk udseende i de efterfølgende farvninger. Celler lå "rullet" sammen i tråde, se bl.a. figur 3a, 4a og 7. Det gjorde det vanskeligt at vurdere cellernes morfologi og ofte umuligt at identificere Tc i HE-farvningen. 26 koagler udgik fra diagnosticeringen, hvor 25 koagler udgik pga. manglende identifikation af Tc i HEfarvningen og det sidste koagel indeholdte ingen celler. 20 af 25 koagler, som udgik pga. manglende identifikation af Tc, var lavet af MGG-farvede udstrygninger. I artiklen Skov BG, et Al. (7) viser billederne det samme trådede udseende som de MGG-farvede i dette projekt, dog bliver denne tendens ikke påtalt. Det eneste artiklen omtaler er at der fandtes færre Tc i SK i forhold til udstrygningen. I studiet vurderede de udstrygningen inden de lavede SK og derfor ved de på forhånd hvorvidt udstrygningen indeholder Tc. Det undres at artiklen ikke vurderer SK's udseende som problematisk, men anses som acceptabelt. Artiklen konkluderer at SK-metoden er gavnlig til supplerende undersøgelser til i forbindelse med diagnosticering af lungecancer. I dette projekt anses det trådede udseende ikke for acceptabelt og årsagen til det sammenrullede udseende bør undersøges nærmere, men det blev ikke afklaret i dette projekt. En tænkelig årsag kan være fikseringen, da cellerne kommer igennem flere former for fiksering i løbet af denne proces. Først luftfiksering efter udstrygning, derefter alkoholfiksering før MGG-farvningen og til sidst formalinfiksering efter dannelsen af plasma-trombinkoaglet. Luft- og alkoholfiksering er koagulerende fiksering, som sker ved irreversibel denaturering, hvor der sker en udfældning af proteinerne. Formalin er et gelerende fiksativ som anvendes til histologiske præparater, hvor der dannes tværbroer mellem proteiner og derved fastholde proteinernes strukturer. I dette projekt bliver cellerne først Side 30 af 63

31 denatureret, hvor den tertiære struktur nedbrydes og aggregater dannes. Dernæst skrabes cellerne af objektglasset, hvor de ruller sammen til en klump og tilføjelsen af plasma og trombin samlede cellerne mere sammen. Til sidst formalinfikseres cellerne, som ligger sammenrullet i et koagel. Ved formalinfikseringen kan det tænkes at disse tværbroer dannes og derved fastholder denne sammenrulning (12). Ved afskrabning af celler fra ufarvede udstrygninger blev cellerne ikke skrabet af i en rulle, men materialet var mere smuldrende, inden plasma og trombin tilføres. Ved koagulerende fiksering ødelægges cellernes naturlige tilstand og tertiære struktur (12). Etablering af disse bindinger medfører at cellerne bliver stive og fastholdte. Der formodes at farvestoffernes komplekser påvirker cellerne således at denne stivhed fastholder cellerne i den sammenrullede tilstand, som opnås ved afskrabning af cellerne. Hvorvidt denne påvirkning er specifik for farvestofferne i MGG-farvningen bør undersøges ved at projekt, hvor der laves SK af udstrygninger som er farvet med andre farvninger, fx HE-farvningen. Artiklen Wu M, et Al.: "Cytology Applications of p63 and TTF-1 Immunostaining in Differential Diagnosis of Lung Cancers" (10) anvender både alkohol- og formalinfiksering på cytologisk materiale og påtaler at alkoholfiksering efterfulgt af formalinfiksering er anvendeligt til diagnostisk analyse af cytologisk materiale.. Ud fra denne artikel tyder det ikke på at det er fikseringen, som er årsag til det trådede udseende, der ses i dette projekt. Cellerne fra SK lavet af de ufarvede udstrygninger havde et helt andet udseende, se figur 3b. Her ligger cellerne i et pænt cellelag, hvor det er muligt at se cellerne kernestruktur, samt cytoplasma. I disse koagler var det lettere at genfinde de samme celler i de forskellige farvninger og derved kunne konstatere reaktionerne for de specifikke celler. Ud af de 25 udgåede koagler var 5 af disse lavet af ufarvede udstrygninger. Alle koagler er lavet ved samme fremgangsmåde, derfor er alkoholfikseringen, MGG-farvning, samt dækning med dækglas og Pertex, den eneste forskel. Det tænkes at årsagen til det karakteristiske udseende er et eller flere af disse punkter. For at bestemme den præcise proceduremæssige årsag må der udarbejdes et projekt. Dette kan gøres ved at lave SK på forskellige måder, hvor de enkelte trin udelades på forskellig vis, fx ved at udelade alkoholfikseringen ved nogle og udelade dækning med Pertex ved andre osv. På den måde kan det være muligt at finde frem til den præcise årsag til cellernes udseende i SK lavet af MGG-farvede udstrygninger. Side 31 af 63

32 IHC-farvning af SK Ved SK lavet af MGG-farvede udstrygninger observeres ofte ved IHC-farvningerne at cellerne havde forstørrede cellekerner og kunne identificeres som Tc, på trods af manglende identifikation af Tc i HE-farvningen, se figur 7. Det kunne tænkes at demaskeringen ved IHC kunne have påvirket cellernes struktur, da det virker som om cellerne er åbnet mere op og derved bliver visuelt tydeligere. På nuværende tidspunkt anvendes IHC-farvningerne supplerende i forhold til oversigtsfarvningerne. Dog bør man overveje, hvorvidt IHC-farvningerne kunne have en større indflydelse på diagnosticeringen, da der i nogle tilfælde i dette projekt blev tilføjet diagnostisk viden fra IHC-farvningerne, som ikke kunne ses ved HE- eller AvG-farvningen. Wu M, et Al. (10) omtaler anvendelsen af TTF-1og p63, som markører ved diagnosticering af lungecancer. I artiklen undersøges TTF-1og p63 ekspression i en række FNA prøver fra bl.a. lunge og lever. Ved sammenligning af artiklens resultater og patienternes tidligere diagnoser, verificeres TTF-1 og p63's egnethed som markør for subklassificering af lungecancer. Artiklen bekræfter at TTF-1 og p63 er egnet, som markører for hhv. AK og PK i lungetumorer. Samtidig konkluderes at disse markører bør indgå i et større panel af tumormarkører for at være mere sikre på diagnosen (10). Dog anvendte Wu M, et Al. (10) ikke SK, men i stedet celleblokke, hvor FNA-materialet alkoholfikseret direkte fra kanylen og derefter formalinfikseres og indgår i den histologiske fremgangsmåde. Denne metode kan ikke anvendes til dette projekt, da det er vigtigt at patologen kan vurdere cellernes morfologi før de indstøbes i paraffin. IHC-farvningerne graderes med en score fra 0 til +++, se tabel 1, ud fra farvningens intensitet, samt mængden af Tc med antistof ekspression for hhv. TTF-1 og p63, se figur 5-6. IHC-farvningen for TTF-1 havde generelt gode resultater, se tabel 3, hvor 12 ud af 16 patienter med AK havde en IHC score på +++ for TTF-1. Der observeres p63 coekspression med en score på (+) ved 4 af disse patienter. p63 scoren for PK var mere jævnt fordelt og årsagen til dette kan være at der kun var 4 PK patienter i dette projekt. Ligeledes observeres TTF-1 coekspression ved PK i 3 ud af 4 tilfælde. Det kan være et tilfælde at projektet indeholdte så få PK, da PK bør udgøre 20 % af alle lungecancer tilfælde (3). Dette er endnu en grund til at der bør udarbejdes et mere omfattende projekt med en større patientpopulation, for at sikre at resultaterne for PK er repræsentative. Artiklen Bishop JA, et Al.: "p40 (DeltaNp63) is superior for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma" (29) diskutere anvendelsen af p63 som markør for PK. Det er tidligere påvist at p63 Side 32 af 63

33 har en sensitivitet på ca. 100 % for PK, men problemet opstår ved markørens ringe specificitet, da der observeres p63 ekspression i % AK. p63 påvises ligeledes også i andre tumortyper, såsom lymfomer. Dette giver anledning til mulige fejlvurderinger, hvor AK og lymfomer kan fejldiagnosticeres som PK. Markøren p40 anses som et bedre alternativ til p63, da denne er mere specifik for PK. I artiklen observeres en signifikant forskel i p63 og p40 ekspression ved AK. Der observeres en minimal p40 ekspression i AK (7 ud af 205) med en ekspression i < 5 % Tc. P63 blev observeres i 74 ud 237 AK med en ekspression i op til > 50 % Tc. Denne artikel bekræfter tidligere studier i at p40 er mere specifik end p63, da artiklens resultater viste en specificitet for NSCLC på 66 % ved p63 og 97 % ved p40. Artiklen Bishop JA, et Al. (29) bekræfter at der kan observeres coekspression af p63 og TTF-1 ved AK, hvilket også blev observeret ved nogle AK-patienter i dette projekt. Derfor bør det overvejes at erstatte p63 med p40 for at mindske dette ved en evt. implementering på AKP. Kontrollerne for begge IHC-farvninger (multiblok K3 og K2) blev mikroskoperet for at sikre farvningen korrekthed ud fra IHC reaktionerne i de positive og negative kontroller. For TTF-1 forventes en +++ reaktion ved thyreoidea og medullært thyreoidea karcinom, som er positive kontroller for TTF-1 (26), og ingen reaktion forventes i resten af multiblokken, se figur 8 for multiblok K3. Ved p63 agerede hud, tonsil og prostata som positive kontroller med +++ reaktion (27) og ingen reaktion i resten af multiblokken, se figur 9 for multiblok K2. Kontrollerne i dette projekt stemte overens med det forventede, se figur 8-9, og derfor antages at IHC-reaktionerne for både TTF-1 og p63 er korrekte i dette projekt. AvG-farvning af SK AvG-farvningen var kun positiv ved en patient, BA nr. 10, og kun i ét af koaglerne, 1005, se figur 4. Denne farvning var meget upræcis og vanskelig at vurdere i de fleste koagler. Der observeres en del diffus og uspecifik blåfarvning, men det var ikke muligt at se mucinfyldte vakuoler i cellerne. Dette voldte problemer ved mikroskopering, da farvningen var ekstra tidskrævende at vurdere. Det kan ikke udelukkedes at andre patienter havde mucinøse AK, men det var ikke muligt at påvise i dette projekt. Ud fra dette projekt bidrog denne farvning ikke med yderligere diagnostisk information. Det ene AvG-positive koagel var ligeledes positiv for TTF-1. Artiklen Skov BG, et Al. (7) vurderer AvG, som positiv anderledes end der gøres i dette projekts. Ud fra artiklens billede af en positiv AvG-farvning ses diffus blåfarvning og ingen tydelige vakuoler i cellernes cytoplasma. Dette kan være årsagen til at de har påvist flere mucinøse AK i forhold til Side 33 af 63

34 nuværende projekt, samt havde de et større antal patienter (47 patienter, hvoraf der laves SK på 43 af disse). Denne diffuse farvning blev også observeret i dette projekt i flere koagler, men blev fortolket som uspecifik farvning. Det er antaget i dette projekt at farveresultatet for AvG er korrekt, da farvemetoden er blevet testet, på normalt væv fra tyktarm, før projektets start og derved bekræftedes at metoden er egnet til påvisning af mucin. Det kan diskuteres hvilken vurdering der er korrekt og derfor vurderes det at der bør laves en mere omfattende undersøgelse af AvG-farvningen, for at afgøre om metoden er god nok til påvisning af mucin ved AK. En anden årsag til at mucin påvises i få AK, kan være at AK-tumorer ikke længere er en lavtdifferentiet tumor med mucin ved diagnosetidspunktet. Da AK ligger oftest perifert i lungen og opdages senere end PK (9). Derfor er AK ofte mere udviklet ved diagnosetidspunktet. SK metoden Ved at anvende FNA-udstrygninger til at lave SK, blev et muligt at skære 8 snit af den sparsomme mængde celler. Artiklen Bhatia P, et Al.: "Cell Blocks from Scraping of Cytology Smear: Comparison with Conventional Cell Block" (30) sammenligner FNA udstrygning, SK og den konventionelle celleblok med materiale fra 17 patienter. En HE-farvet udstrygning anvendes til at lave SK. Den konventionelle celleblok laves ved at tilføre FNA-materiale direkte i et rør med sodium-citrat, som derefter centrifugeres, laves til et plasma-trombin koagel og efterfølgende indstøbes i paraffin efter formalinfiksering. Der observeres ingen signifikant forskel ved sammenligning af SK og den konventionelle celleblok. Artiklen vurderer at både SK-metoden og den konventionelle celleblok er god til morfologisk vurdering af cellerne. Dog er prøvemængden i dette studie lille, 17 patienter og derfor er der risiko for at resultaterne ikke er repræsentative. Der udover er artiklen mangelfuld mht. metoderne og farvningerne. Det er ikke klart, hvordan studiet er udført, samt hvornår de forskellige farvninger anvendes og hvordan de aflæses. Dette studie kan ikke udføres ud fra oplysningerne i artiklen, hvilket gør artiklen utroværdig. Et nyt og mere udførligt projekt bør udarbejdes for at undersøge om artiklens resultater er repræsentative. Artiklen Bhatia P, et Al. (30) har lavet SK af HE-farvede udstrygninger og disse har ikke samme trådede udseende, som de MGG-farvede i dette projekt. Artiklen viser at det er muligt at opnå et renere cellebillede ved anvendelse af farvede udstrygninger til SK. Derfor kunne det tænkes at HEfarvningen kunne være et alternativ til MGG-farvningen, for at kunne forbedre cellernes udseende i SK. Dog angiver artiklen ikke om SK farves med HE igen eller om snittet aflæses ud fra den oprindelige HE-farvning på udstrygningen. Dette bør ligeledes undersøges nærmere i et nyt projekt. Side 34 af 63

35 Vurdering af SK og diagnoser De udstrygninger, som blev lavet til koagler, blev ikke vurderet ved mikroskopi som udstrygninger. Mængden af Tc i den oprindelige udstrygningen kendes ikke og derfor er det ikke muligt at vurdere hvorvidt antallet af Tc i SK er lig med antallet som oprindeligt var i udstrygningen. Cellernes morfologi kunne ikke altid vurderes i HE-farvningen af SK ved både ufarvede og MGG-farvede udstrygninger. Derfor er en vurdering af cellerne i udstrygningen vigtig, da cellernes morfologiske udseende er grundlæggende for diagnosticeringen, samt grundlag for udvælgelsen af supplerende undersøgelser. Derudover er det muligt at udvælge de rette udstrygninger til SK, hvis de er MGG-farvet, således at der ikke laves ubrugelige koagler. Det er derfor vigtigt at metoden til de supplerende undersøgelser er anvendelige på farvet udstrygningsmateriale. Det kunne evt. også være en mulighed at danne et koagel med materiale fra flere udstrygninger i stedet for kun én, for at optimere materialet yderligere. Hvis der modtages 3 udstrygninger på et patient og der i disse kun er få Tc, kunne det være en fordel at samle materialet i ét koagel. Det kunne give et større udbytte af det sparsomme materiale. Dette er ikke blevet undersøgt i projektet. Artiklen Haukali S, et Al.: "Subtyping of Nonsmall Cell Lung Cancer on Cytology Specimens: Repoducibility of Cytopathologic Diagnoses on Sparse Material" (31) undersøger SK-metodens reproducerbarhed, hvor 4 patologer med forskellige erfaringsniveauer vurderer og diagnosticerer MGG-farvede udstrygninger, samt IHC-farvninger fra SK, på 79 patienter. Der var ingen signifikant forskel mellem patologerne, ud fra deres erfaringsniveau. Haukali S, et Al. (31) konkluderer reproducerbarheden var god ved at kombinerer en MGG-farvet udstrygning med IHC på SK. Metoden vurderes især egnet i de tilfælde hvor FNA-materialet er utilstrækkeligt til dannelsen af et koagel direkte fra aspiratet. Enigheden mellem observatørerne i dette projekt var på 95,45 %, se tabel 4. Dette viser at SKmetoden er reproducerbar og derved kan være egnet som en diagnostisk undersøgelse, dog kræves der en løsning på problemet omkring cellernes sammenrulning i SK lavet af MGG-farvede udstrygninger, før metoden kan implementeres på AKP. Enigheden mellem observatørernes fælles diagnose og patologens afgivne diagnose var på 100 %, se tabel 4, hvilket viser at det har været muligt at opnå de samme diagnoser som patologen med de metoder og farvninger, der blev anvendt i projektet. Side 35 af 63

36 Ved BA nr. 09 var projektgruppens observatører ikke enige, da to observatører vurdere patientens diagnose til at være PK og den sidste observatør mente AK. Årsagen til uenighed var at der blev observeret IHC reaktion for både TTF-1 og p63. Den ene observatør vurderede TTF-1 reaktionen, som mere afgørende end resten de to andre. Ved konferencemikroskopering var det muligt for observatørerne at afgive en fælles diagnose for patienten. Fælles diagnosen for BA nr. 09 blev PK, da p63 ekspressionen på ++ var betydelig mere positiv end TTF-1 ekspressionen på (+), se tabel 2. Vurdering af intensiteten af IHC-farvninger, samt mængden af reagerede celler, er en vurdering efter nogle specifikke retningslinjer, men det er også en meget individuel vurdering, især for uerfarne diagnostikere. Derfor er det forventeligt at observatørerne vurderer Tc forskelligt i nogle tilfælde. Dette kan undgås ved at sikre at patologerne, som diagnostikere har den rigtige viden, uddannelse og erfaring til at gøre dette. På trods af manglende viden, uddannelse og erfaring, er projektets observatørers succesrate i forhold til korrekt diagnosticering i forhold til den erfarne patolog på 100 %. Dette viser at med de rette farvninger og midler, har det været muligt for bioanalytikere, uden diagnostisk erfaring, at subklassificere NSCLC i AK eller PK, ud fra celler fra lungetumorer. Diagnostisk arbejde kræver stort kendskab til cancertyper, samt evt. differentialdiagnoser. For at en bioanalytiker kan arbejde som diagnostiker, kræves der faglig viden omkring de anvendte farvninger og deres påvisningers betydning, derudover kræves der en grundig oplæring. Det var ikke muligt at diagnosticere 2 ud af 22 patienter ud fra projektet og årsagen til dette er at de to patienters tumorer hverken var AK eller PK, men i stedet var det hhv. neuroendokrint karcinom for BA nr. 17 og karcinoid tumor for BA nr. 19, se tabel 4. Disse oplysninger blev hentet fra AKP's patologisystem. Side 36 af 63

37 Konklusion På baggrund af projektets resultater har brugen af SK optimeret FNA-materialet, således at det er blevet muligt at subklassificere lungetumorerne i hhv. AK og PK. Dog vurderes det, at der bør laves et mere udførligt projekt, som kan klargøre nogle af problematikkerne fra dette projekt. Disse problematikker skal løses inden metoden kan implementeres på AKP. Fordelen ved SK er at det er en simpel og billig metode, som giver en bedre udnyttelse af et sparsomt materiale. Metoden kræver heller ikke større ændringer på afdelingen i forbindelse med implementering af metoden, da farvningerne anvendt i projektet i forvejen er indkørt på AKP. MGG-farvning af udstrygningerne medførte den bedste morfologiske vurdering af cellerne. Den samme morfologi var ikke altid muligt at genfinde i HE-farvningen af SK. AvG-farvningen bidrog ikke med yderligere diagnostisk viden i dette projekt. AvG-farvningens anvendelse bør undersøges nærmere i et mere omfattende projekt, for at klargøre hvorvidt farvningen egner sig til subklassificering af AK. Ud fra resultaterne i dette projekt kan det udledes at markørerne TTF-1 og p63 kan anvendes til differentiering af NSCLC subtyperne AK og PK. Dog har andre studier påvist at p40 kunne være mere egnet som markør for PK og dette bør undersøges med henblik på at undersøge mulighederne for at erstatte p63 med p40. Den bedste optimering af FNA-materialet opnås ved at kombinere udstrygninger og SK. Dette gøres bl.a. ved at anvende MGG-farvede udstrygninger til morfologisk vurdering af cellerne og derefter supplerende farvninger på SK, såsom IHC- eller specialfarvninger. Det største problem, der blev observeret ved dette projekt var det trådede udseende ved SK lavet af MGG-farvede udstrygninger. Et nyt projekt kræves for at undersøge præcist hvor i processen denne forandring sker, samt hvad der er årsagen, for at kunne finde en løsning på problemet. Dette er nødvendigt før SK-metoden egner sig til MGG-farvede udstrygninger. Side 37 af 63

38 Perspektivering SK som metode SK-metoden kan bidrage med en række fordele, dog er der enkelte uklarheder som endnu skal opklares og derfor kræves der et nyt og mere omfattende undersøgelser af metoden. En yderligere optimering af SK-metoden kunne ske ved at udføre en IHC-farvning med en antistof-pool, som indeholder flere forskellige antistoffer og derved kunne opnå en bredere diagnostisk viden ud fra en enkelt farvning. Dette vil mindske arbejdsbyrden for bioanalytikerne i laboratoriet og ligeledes mindske mikroskoperingsmængden for patologen. Derudover kunne det forkorte svartiderne for patienten, så patienten hurtigere kan få en diagnose og påbegynde en behandling. FNA-teknikken kan anvendes til at udtage materiale fra andre organer end lungerne, bl.a. lymfeknuder og lever. Derved kan det tænkes at SK-metoden også kan anvendes til at forbedre den diagnostiske viden ved andre cancerformer end lungecancer. Dette bør undersøges nærmere. Fremtidige fordele Optimering af det sparsomme FNA-materiale, ved brug af SK, vil gøre det lettere at subklassificere NSCLC i AK eller PK. Det medfører at patienten hurtigere kan få en behandling, som er målrettet til tumortypen. Dette kan forbedre patientens prognose, bl.a. forlænge patientens levetid. Derudover vil optimeringen betyder færre mislykkede FNA-prøver pga. manglende materiale med Tc og derved undgår patienten at skulle igennem undersøgelserne igen, hvilket ikke altid er muligt. Brugen af SK kan være medvirkende til at patienten kan få et bedre patientforløb med mindst mulige gener. Optimering af FNA-materialet kan ligeledes medfører at denne teknik anvendes oftere. Teknikken er skånsom for patienten og mindre invasiv end fx vævbiopiser. Derfor er FNA-teknikken at foretrække fra patientens synspunkt og det ville gavne patienten, hvis FNA-materialets anvendelse kunne forbedres diagnostisk. Bioanalytiker som diagnostiker Ud fra dette projekt var det muligt, som bioanalytiker, at stille de samme diagnoser på lungecancer patienter som patologen, på trods af uvidenhed omkring cancerdiagnostik og manglende erfaring som diagnostiker. Dette understøtter vigtigheden af gode og pålidelige metoder til cancerdiagnostik. Bioanalytikerens faglige viden om IHC og histokemiske farvninger medvirker til at bioanalytikeren kan være egnet som diagnostiker. Dog kræver det at bioanalytikeren modtager den rette oplæring, før denne kan fungere som diagnostiker. Det kunne tænkes at udvide bioanalytikerens faglige kompetencer med den relevante efteruddannelse i form af et kursus eller modul. På den måde uddannes Side 38 af 63

39 bioanalytikere med speciale indenfor mikroskopi og diagnostik. Dette kunne blive et nyt fagområde for bioanalytikere, i samarbejde med patologer. Dette kan ligeledes afhjælpe patologens arbejdsbyrde, i og med, at bioanalytikeren kan mikroskopere en del af præparaterne. Det kan bl.a. være en mulighed at bioanalytikeren mikroskoperede rutinepræparaterne, således at patologen havde mulighed for at koncentrere sig om cancerdiagnostikken og de mere problematiske cases, som kræver patologen ekspertise. Side 39 af 63

40 Litteratur (1) Sundhedsstyrelsen. Pakkeforløb for lungekræft. 2012; Available at: Accessed 09/09, (2) Young B, Stewart W, O'Dowd G, Wheater PR. Wheater's Basic pathology: a text, atlas and review of histopathology.. 5. ed. ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; p. 133, 136. (3) Lægehåndbogen: Lungekræft. 2012; Available at: Accessed 12/07, (4) Orell SR. Manual and atlas of fine needle aspiration cytology.. 3. ed ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; p (5) Geneser F. Histologi - på molekylærbiologisk grundlag.. 1. udgave ed. [Kbh.]: Munksgaard; p (6) Junqueira LCU, Mescher AL, Junqueira LCU. Junqueira's basic histology: text and atlas ed. ed. New York: McGraw-Hill Medical; p. 279, (7) Skov BG, Kiss K, Ramsted J, Linnemann D. A technique to improve diagnostic information from fineneedle aspirations: immunohistochemistry on cytoscrape. Cancer 2009 Apr 25;117(2): (8) Baandrup U. Klinisk patologi. Kbh.: FADL; p (9) Sidawy MK, Ali SZ. Fine needle aspiration cytology. Foundations in diagnostic pathology Edinburgh: Elsevier Churchill Livingstone; p , 185. (10) Wu M, Szporn AH, Zhang D, Wasserman P, Gan L, Miller L, et al. Cytology applications of p63 and TTF-1 immunostaining in differential diagnosis of lung cancers. Diagn Cytopathol 2005 Oct;33(4): (11) Vyberg M. Anvendt immunhistokemi: Mogens Vyberg.. 6 udg. ed. Kbh.: Bioanalytikeruddannelsen; p. 157, 173. (12) Hallager K, Jelsbak V, Meyer T. Farvning af Celler og Væv; Modul 1 og th ed.: VIA University College Bioanalytikeruddannelsen; p. 3, 6, 35-40, (13) Afdeling for Klinisk Patologi. Forskrift: HE farvning. 2013;Hentet fra Infonet(Vedlagt som bilag 1). (14) Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice.. 3. edition ed. Oxford: Butterworth-Heinemann; p. 109, 146, (15) Ventana. OptiView Detection Chemistry. 2011; Available at: Accessed 11/22, (16) Afdeling for Klinisk Patologi. Protokol nr. 70: IE TTF (Vedlagt som bilag 2). (17) Afdeling for Klinisk Patologi. Protokol nr. 153: IP P (Vedlagt som bilag 2). Side 40 af 63

41 (18) Scopsi L, Larsson LI. Increased sensitivity in peroxidase immunocytochemistry. A comparative study of a number of peroxidase visualization methods employing a model system. Histochemistry 1986;84(3): (19) Hans Lyon PP. Celle- og vævspræparation til lysmikroskopi: Kompendium i kemiske og biokeiske analyseprincipper. Bioanalytikeruddannelsen København. ; p. 9. (20) Afdeling for Klinisk Patologi. Forskrift: MGG farvning. 2013;Hentet fra Infonet(Vedlagt som bilag 3). (21) Kirsten Hartmann. Forskrift: Skrabekoagel. 2013;Udleveret af Bioanalytikerunderviser Kirsten Hartmann(Vedlagt som bilag 4). (22) Afdeling for Klinisk Patologi, Kirsten Hartmann. Afparaffinering med Histo-Clear. ;Udleveret af Bioanalytikerunderviser Kirsten Hartmann(Vedlagt som bilag 5). (23) Afdeling for Klinisk Patologi, Anette Lykke. Forskrift: AvG farvning. 2007;Udleveret af Bioanalytikerunderviser Kirsten Hartmann(Vedlagt som bilag 6). (24) Afdeling for Klinisk Patologi. Multiblok K (Vedlagt som bilag 7). (25) Afdeling for Klinisk Patologi. Multiblok K (Vedlagt som bilag 7). (26) Leica Biosystems: NovoCastra. Datasheet: TTF-1 (Clon SPT24). Available at: Accessed 12/04, (27) Zeta Corporation. Datasheet: p63 (Clon 4A4). Available at: Accessed 12/04, (28) Rådata. (Vedlagt som bilag 8). (29) Bishop JA, Teruya-Feldstein J, Westra WH, Pelosi G, Travis WD, Rekhtman N. p40 (DeltaNp63) is superior to p63 for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma. Mod Pathol 2012 Mar;25(3): (30) Bhatia P, Dey P, Uppal R, Shifa R, Srinivasan R, Nijhawan R. Cell blocks from scraping of cytology smear: comparison with conventional cell block. Acta Cytol 2008 May-Jun;52(3): (31) Silje Haukali O, Henrik H, Olsen EK, Birthe T, Guldhammer SB. Subtyping of nonsmall cell lung cancer on cytology specimens: Reproducibility of cytopathologic diagnoses on sparse material. Diagn Cytopathol 2013 May 17. Side 41 af 63

42 Bilag 1: HE-forskrift (13) Side 42 af 63

43 Bilag 2: IHC-protokoller Protokol nr. 70: IE TTF1 Side 43 af 63

44 Side 44 af 63

45 (16) Side 45 af 63

46 Protokol nr. 153: IP P63 Side 46 af 63

47 Side 47 af 63

48 (17) Side 48 af 63