Screening og optimering af hydrolyse- og fast fase ekstraktionsmetoder til aminosyreanalyse.

Transkript

1 Screening og optimering af hydrolyse- og fast fase ekstraktionsmetoder til aminosyreanalyse. Screening and optimization of hydrolysis and solid phase extraction methods for amino acid analysis. Ovenstående illustration viser reaktionen ved hydrolyse af protein. Af: Brian G. Hansen 4. juli 1986 Vejledere: Kristian Fog Nielsen, Center for Mikrobiel Bioteknologi, DTU Peter Boldsen Knudsen, Center for Mikrobiel Bioteknologi Merete Norsker Bergsøe, Professionshøjskolen Metropol Professionsbachelorprojekt Uge uge

2 Resume. The purpose of this study is to find the best hydrolysis method for the analytical step in metabolic flux analasis. Another purpose is to implement the automation of solid phase extraction step. Five different hydrolysis methods were first screened with the hydrolysis of Bovin serum albumin, and then the best were tested against the current hydrolysis method, with hydrolysis of Aspergillus nidulans. The hydrolysis was performed at 110 C at five different time intervals (12, 16, 20, 24 and 28 h). The five hydrolysis methods were. 6M HCL (current), 6M HCl + 0,2% mercaptoethanol, 6M HCl + 3 % phenol, 6M HCl + 0,2% mercaptoethanol + 3 % phenol and 99 % Trifluoric acetic acid. The samples was then extracted on a Strata SCX 100 mg/ml column, then derivatiseized with ethyl chloroformate and finally measured with GC-MS. The screening showed that 16 hours was the best hydrolysis time, and 6M HCl + 0,2 % mercaptoethanol was the best method. But the test on Aspergillus nidulans showed no difference between the current hydrolysis method and 6M HCl + 0,2 % mercaptoethanol. It wasn t possible to implement the automation of the solid phase extraction step, due to bad results caused by the robot. 2

3 Forord Denne rapport er skrevet som det afsluttende kapitel af uddannelsen til Professionsbachelor i laboratorieteknologi, en uddannelse der udbydes på Professionshøjskolen Metropol. Projektet er udført på Center for Mikrobiel Bioteknologi (CMB), en afdeling på Danmark Teknologiske Institut (DTU). Tidsforbruget til hele projektet er angivet til ti uger. I denne angivelse er medtaget tid til planlægning, udførelse af forsøg samt udarbejdning af denne rapport. Til projektet har underviser Merete Norsker Bergsøe været tilknyttet som skolevejleder, hun skal have stor tak for kyndig vejledning. En anden stor tak skal gå til hovedvejleder Kristian Fog Nielsen og dag- til dag vejleder Peter Boldsen Knudsen begge fra DTU. De har været en stor hjælp tilblivelsen af projektet og planlægningen af forsøgene. Sidst men ikke mindst skal CMB, og dets ansatte, have en tak for udlån af faciliteter så denne rapport kunne få sin tilblivelse.. Brian Glenn Hansen 3

4 Indhold Forord... 1 Problembaggrund Formål Mål Problemformulering Hypotese Teori Hydrolyse... 7 Solid phase extraction Stærk kationbytning med aminosyre:... 8 Derivatisering Massespektrometri Electron inpact Quadropol massefilter Isotopfortynding Statistik Variansanalyse: Lineærregressionsanalyse: Metodevalg og afgrænsning Metode Automatisk SPE Hydrolyse Manuel SPE ECF derivatisering GC-MS Kvantitativ bestemmelse Sammenligning af funden bedste- og nuværende metode Sikkerhed Kvalitetssikring Databehandling Chemstation: Regressionsanalyse: Ensidet variansanalyse: Resultater Diskussion Konklusion Perspektivering Bilagsoversigt

5 Problembaggrund. Traditionelt har stammeforbedring foregået ved optimeringer baseret på screening og isolering. Disse metoder tager udgangspunkt i selektion af relevante karakteristika og forbedring af disse ved hjælp af random mutagenese. Siden hen har udviklingen af teknikker kendt som metabolic engineering åbnet op for mere direkte stammeforbedringsteknikker, så som genetiske deletioner, introduktion af både heterologe og homologe gener m.m. Problemet med disse nye teknikker er, at genetisk manipulation af organismen sommetider leder til uforudsete modifikationer af metabolismen, hvilket kan identificeres ved hjælp af metabolisk flux analyse(mfa). Denne teknik blander metoder såsom stabil isotopmærkningsforsøg og metabolitbalancer, der tillader effektiv analyse af de metaboliske effekter en genetisk modifikation bibringer. Kombineret med andre teknikker inden for genteknologi og proteinkemi kan MFA også anvendeligt i designfasen til forudsigelsen af effekterne ved genetisk modifikation, og er derfor også et vigtigt værktøj til optimering ved udviklingen af industrielle stammer. Den nuværende metode der anvendes ved Center for Mikrobiel Bioteknologi (CMB), tager udgangspunkt i 13 C-mærkningsforsøg og efterfølgende analyse af mikroorganismen på GC-MS. 13 C-mærkningsforsøgsdelen er gennem det seneste stykke tid blevet opgradet ved indkøb af en robot. Men GC-MS delen har haltet, og derfor ønsker man gennem en række forsøg en opgradering af denne, hvilket ligger til grund for dette projekt. Formål. Dette projekt er en del af et større projekt, hvor formålet er at få optimeret GC-MS delen. GC- MS delen består af en række metoder: hydrolyse, Solid phase extraction (SPE, solid fase ekstraktion), derivatisering (omdannelse af et stof til noget der ligner) og kørsel på selve GC- MS en Optimering af disse punkter vil gøre det muligt at måle aminosyrer, der ved de tidligere metoder var umulige at bestemme. Optimeringen af GC-MS bestemmelsen vil give flux modellen en øget robusthed og en bedre bestemmelse af fluxene igennem de forskellige pathways. Derfor vil det være givtigt for CMB og alle dets medarbejdere, som beskæftiger sig med flux-arbejde, at optimeringen finder sted. 5

6 Mål. Der er to mål med dette projekt. Det ene er at få afklaret, hvilken hydrolysemetode der vil være den bedste, her tænkes på hydrolysevæske og på hvor lang tid hydrolysen skal foregå. Tidligere har hydrolysetiden været over natten, hvilket er et diffust tidsinterval. Derfor ønskes dette tidsinterval specificeret. Det andet mål ved projektet er at få tidseffektiviseret SPE oprensningen. CMB har indkøbt en robot, som skulle være behjælpelig med dette, derfor ønskes der en optimering af denne metode. De to punkter lægger op til følgende problemformulering. Problemformulering. Hvilken hydrolysemetode er bedst mht. tidsinterval og beskyttelse af labile aminosyrer? Hvor tidseffektiv kan den automatiserede SPE oprensning gøres? Hypotese. En hydrolysemetode med et additiv er bedre end en hydrolysemetode uden additiv når det kommer til labile aminosyrer. Det der ligger til grund for denne hypotese, er at et additiv i teorien vil gå ind at beskytte aminosyrerne imod syrepåvirkning og andre faktorer under hydrolysen. 6

7 Teori. Hydrolyse: Hydrolyse er en kemisk proces, hvor et molekyle reagerer med vand (syre opløst i vand) og bliver opdelt i mindre molekyler. I proteinkemien vil det betyde at proteinet bliver spaltet til aminosyrer, ved at peptidbindingerne hydrolyseres. Denne proces kan være hård for aminosyrerne, da de ikke alle er lige labile. Derfor kan der adderes forskellige organiske stoffer, hvis opgave er at beskytte fra påvirkninger i hydrolyseprocessen. Mercaptoethanol: Mercaptoethanol er et organisk molekyle, som har en evne til at bryde de disulfidbinder, som findes i proteiner. Derved kan mercaptoethanol bidrage til, at hydrolysen af proteiner bliver mere effektiv. Mercaptoethanol har yderligere egenskab af biologisk antioxidant. Denne evne gør det muligt at opsnappe hydroxyl, der er med til at nedbryde nogle aminosyrer. Artiklen Improved recovery of methionine after hydrolysis using mercaptoethanol af H.T. Keutmann og J.T. Potts, Jr, ligger til grund for forsøg, hvor man har ønsket at optimere på udbyttet af metheonin fra proteiner. Her sammenlignes forsøg, hvor proteiner hydrolyseres med henholdsvis 6M HCl og 6M HCl adderet med 0,2 V/V % mercaptoethanol. Undersøgelsen resulterede i at udbyttet af metheonin steg fra 0,0055 µmol til 0,0060 µmol, altså en stigning på ca. 9 %. Udover dette blev udbyttet af andre aminosyrer ikke ændret i en negativ retning. Tværtimod forøger metoden med mercaptoethanol udbyttet af tyrosin og andre labile amninosyrer. Phenol: Phenol er et organisk molekyle der har en evne til at opsnappe frie chloridioner (Cl - ). Chloridionerne fremkommer ved hydrolyse med saltsyre, og kan være med til at nedbryde aminosyrer. Ved at tilsætte phenol til hydrolysevæsken vil det mindste antallet af chloridioner og hydrolysen vil derfor være mindre hård for aminosyrerne. Artiklen Recovery of tryptophan in peptides and proteins by high-temperature and short-term acid hydrolysis in the present of phenol af Koji Muramoto og Hisao Kamiya, ligger til grund for en undersøgelse, hvor udbyttet af tryptophan ønskedes forbedret ved at tilsætte 3 % (v/v) phenol til 6M HCl som hydrolysevæske. Som reference blev 6M HCl brugt. 7

8 Undersøgelsen resulterede i at udbyttet af tryptophan steg med 80 % ved phenoltilsætning. Ydermere konkluderes det at udbyttet af methionin forøges, samt at tabet af andre aminosyrer var begrænset. Solid phase extraction. Solid phase extraction (SPE) er en ekstraktionsmetode, hvis princip bygger på at en mobilfase indeholdende prøvekomponenter sendes igennem en kolonne, hvor den tilbageholdes i en stationær fase, kaldet resin. Stærk kationbytning med aminosyre: Kolonner med stærk kationbytter baseres på silica eller styrene-divinylbenzene resiner. Silica foretrækkes da, det er muligt at binde mange forskellige funktionelle grupper hertil. De mest anvendte resiner til stærk kationbytter har enten aromatiske sulfonsyrer eller propansulfonsyre bundet til silica et 1. Nedenstående figurer illustrerer, hvordan kationbytning fungerer når der er tale om aminosyrer. Ved step 1 er vist en konditionering af kolonnen, her vaskes resinen først med en organisk solvent, for det meste methanol og derefter med vand, her bindes der ikke noget til resinen så denne beholder sin originale form. Ved step 2 påsættes prøven påsat kolonnen og resinen tilbageholder amiosyrerne. Ved step 3 vaskes resinen med de tilbageholdte aminosyrer først 1 Solid Phase Extraction, Principle and Practice 8

9 med en organisk væske der fjerner organiske urenheder, og siden med en uorganisk væske der fjerner uorganiske urenheder. Ved step 4 elueres med natriumhydroxid, her bytter natriumionerne plads med aminosyrerne, som nu ligger som frie molekyler i eluatet. Derivatisering. Derivatisering er en kemisk proces, der muliggør en modificering af en kemisk forbindelse til en ny, som har egenskaber velegnet til GC-analyse. Artiklen Enantiomer separation of amino acids after derivatization with alkyl chloroformates by chiral phase capillary gas chromatography af Iweo Abe et. al, ligger til grund for en undersøgelse, hvor bestemmelsen af den bedste derivatiseringsmetode til bestemmelsen af aminosyrer skulle findes. To forskellige derivatiseringsmetoder blev i denne testet, en hvor methylchloroformat (MCF) blev benyttet, og en hvor ethylchloroformat (ECF) blev benyttet. Undersøgelsen resulterede i at ECF blev vurderet til at være den bedste, da separationsfaktorerne af aminosyrerne var bedre ved ECF end ved MCF. Nedenstående billede viser reaktionerne, der forekommer ved derivatisering med ECF. Her reagerer aminosyren og ECF i tilstedeværelsen af pyridin, ved at ECF og pyridin danner en carbokation, hvorefter der sker en nukleofil substitutionsreaktion mellem ECF-forbindelsen og aminosyren. Step 1 H 3 C O O N + R O NH 2 OH + 2 H 3 C O O Cl N Step 2 R O NH 2 OH H 3 C + O O N + C H 3 O O O O NH O R midlertidig O CH 3 Ved tilsætning af en stærk syre vil der spaltes kuldioxid fra det midlertidige produkt resulterende i dannelsen af et derivat af aminosyren. C H 3 O O NH R O O O O CH 3 HCl O O NH O O CH 3 R H 3 C + CO 2 9

10 Massespektrometri. Et massespektrometer er op bygget af 4 dele: inlet, ioniseringskilde, massefilter og detektor: Inletet er overgangen fra GC en massespektrometret, her går prøvemolekylerne fra at være under atmosfærisk tryk til at være i vakuum. Ioniseringskilden bombarderer prøve molekylerne hvorved de fragmenteres. Massefilteret sorterer dem efter masse. Detektoren detekterer intensiteten af masse- og fragmentstrålerne fra prøvens molekyler. Electron inpact Electron Inpact (EI) er en metode, hvor en elektronstråle benyttes til at ionisere molekylerne. Det sker ved, at der lægges en spænding mellem en katode og en anode. Denne spænding frembringer en elektronstrøm med en tilpasset energi på 70 ev, der forårsager at ioniseringen af molekylerne er optimal. Trykket i EI er meget lavt, dette bevirker at ionerne har en bevægelsesmulighed, der er større end selve ionkilden. Det betyder at der ringe sandsynlighed for, at ioner kolliderer indbyrdes. 2 Når et molekyle passerer fra inletet ind i EI, vil der opstå en kollision mellem molekylet og elektronstrømmen. Denne forårsager at en elektron løsrives fra molekylet og en positiv ion dannes, samt at de positive ioner fragmenteres. Den nyligt opståede positive ion, bliver herefter frastødt af en reflektorelektrode, som også er positivt ladet. Ved denne frastødning bliver den positive ion accelereret hen mod en port bestående af negativt ladet elektroder, der er placeret overfor hinanden med stigende negativ spænding. Denne opsætning bevirker, at den positive ion fortsætter sin acceleration igennem porten og videre mod massefilteret. Quadropol massefilter: Et quadropolt massefilter består af fire poler der er arrangeret symmetrisk, sådan at to modstående poler danner et par, som er forbundet elektrisk og med en radiofrekvens de to par imellem. En jævnstrøm er derudover lagt oven på radiofrekvensen. Dette bevirker at kun ioner med en bestemt m/z-værdi vil kunne trænge gennem massefiltret, da ioner med enten for stor eller for lille m/z-værdi vil støde sammen med polerne, og derved gå tabt inden de når til detektoren, som er placeret bag quadropolen. 2 Analyseteknik, Instrumentering og metoder. 10

11 På denne måde kan der ved variering af vekselstrømmen og radiofrekvensen være i stand til at skanne med quadropolen, således at ionmasserne når frem til detektoren efter tur 3. Isotopfortynding. Isotopfortynding er en form for standardadditionsmetode. Her bruges en 13 C-mærket version af det stof der ønskes kvantificeret. Isotopen har de samme kemiske egenskaber som det normale stof, men den stabile isotop vejer 1 masseenhed mere end det normale carbon-12. Denne vægtforskel kan aflæses på massespektrometret, og derved kan forholdet mellemanalytten der ønskes kvantificeret, og den tilsatte isotop regnes ud. I praksis fungerer det sådan, at en kendt mængde af isotopen tilsættes til hvert prøve i en fortyndingsrække, af det stof der ønskes kvantificeret. Ved at udregne arealerne under kurvene kan der derved dannes en lineær kurve, med arealet som y-værdi og koncentrationen som x- værdi. På denne måde kan der tilsættes samme mængde af isotopen til sine prøver, og ved at tage forholdet mellem stoffet og isotopen, kan koncentrationen af det ønskede stof aflæses på kurven. Isotopfortynding er ideel, da det forøger præcisionen, samtidig med det reducerer problemer med kalibrering og interferenser forårsaget af prøvens matrix. Statistik. Variansanalyse: Variansanalyse er en del af statistikken, hvor man undersøger to eller flere datasæts middelværdier. Variansanalyse er en totrinsraket, hvor første del går ud på at fastlægge variansen for middelværdierne, og efterfølgende sammenligne middelværdierne med en hypotesetest. Ud fra disse to test kan det konkluderes, om der er statistisk belæg for at sige om middelværdierne er forskellige, og derved bestemme hvilken af datasættenes middelværdiger der er bedst. Variansanalyse kan laves på data som er normalfordelte, statistiske uafhængige og har varianhomogenitet. Lineærregressionsanalyse: Lineærregressionsanalyse er en del af statistikken, hvor sammenhængen mellem en afhængig variabel og en uafhængigvariabel, undersøges. Ved lineærregressionsanalyse opstiller man en matematisk sammenhæng mellem observerede størrelser, som antages at være lineært, og 3 Quantitative Chemical Analysis. 11

12 hvor der tages højde for statistisk usikkerhed. For at sikre reggressionsliniens validitet laves der F-test på denne, samt en t-test på de parametre der har dannet regressionslinien. Hvis disse to test viser statistisk signifikans kan regressionslinien validitet bekræftes. En lineær regressionanalyse kan laves på data som er normalfordelte, statistisk uafhængige og har varianshomogenitet. 12

13 Metodevalg og afgrænsning. Den automatiske SPE del udføres i starten af projektet, dette gøres da det kan tænkes at det vil spare tid når hydrolysedelen undersøges. Derimod kan det vise sig at den automatiske SPE del ikke er tidseffektiv nok i forhold til at køre SPE-oprensningen manuelt, hvis dette er tilfælde vil der køres manuelt SPE i hydrolysedelen. Som SPE-kolonne er valgt en Strata 4 SCX 100 mg/ml kolonne. Denne vælges, da den ved tidligere forsøg på CMB, har vist sig at være den bedste. Da den automatiserede SPE-del udføres med positivt tryk, er metoden der ønskes optimeret indstillet med det lavest mulige flow på de vitale dele af metoden. Dette vælges, da det tænkes at lavest muligt flow er mindst skadeligt for resinen, og derfor er der størst mulighed for at få et brugbart resultat. Da den automatiske SPE-del foregår før hydrolyseundersøgelsen, hydrolyseres der efter den nuværende metode, hvor 6M HCl anvendes som hydrolysevæske, og hydrolysetiden er ca. 16 timer. Som prøve hydrolyseres Bovin Serum Albumin (BSA), dette vælges da BSA er proteinrigt og derfor indeholder store mængder aminosyrer. Til hydrolysedelen af projektet hydrolyseres der ligesom tidligere også BSA som prøve, her bruges samme argumentation som før. Der udføres 4-dobbeltbestemmelse, dette vælges, da det gør forsøgene repræsentative, samtidig med at der er en 3-dobbeltbestemmelse at falde tilbage på, hvis en prøve skulle gå tabt. Endvidere, vil en større prøvemængde end en 4- dobbeltbestemmelse besværliggøre arbejdet apparatmæssigt og dermed også tidsmæssigt. Der vælges fem forskellige hydrolysevæsker: 1. 6M HCl (nuværende) 2. 6M HCl + 0,2 % 2-mercaptoethanol 3. 6M HCl + 3 % phenol 4. 6M HCl + 0,2 % 2-mercaptoethanol + 3 % phenol % triflouroacetic acid (TFA, triflouroeddikesyre) De fem forskellige hydrolysemetoder vælges, da det giver repræsentativt billede af de eksisterende hydrolysemetoder til hydrolyse af protein, som ud fra et litteraturstudie vurderedes mest relevante. At der ikke vælges flere hydrolysemetoder, skyldes at den samlede prøvemængde vil blive uoverskuelig. 4 Fra phenomenex 13

14 Hydrolysemetoden med 6M HCl vælges, da det er den metode, der normalt bruges på CMB til hydrolyse af proteiner, derfor er det også denne metode de andre hydrolysemetoder skal testes op imod. Hydrolysevæsken hvor 0,2 % 2-mercaptoethanol adderes, er valgt da man i Improved recovery of methionine after hydrolysis using mercaptoethanol 5, har konkluderet en gavnlig effekt på udbyttet af methionin og andre aminosyrer. Hydrolysevæsken hvor 3 % phenol adderes, vælges da Recovery of tryptophan in peptides and proteins by high-temperature and short-term acid hydrolysis in the present of phenol 6, konkluderer at ved tilsætning af 3 % phenol til hydrolysevæsken forøges udbyttet af tryptophan og methionin. Hydrolysevæsken med 0,2 % mercaptoethanol og 3 % phenol tilsat, vælges da begge additiver beskytter aminosyrerne under hydrolysen. De beskytter dog på to forskellige måder, og det kan derfor tænkes, at have en større effekt, hvis begge additiver er til stede samtidig. Hydrolysemetoden hvor der hydrolyseres med TFA vælges, da det er et alternativ til saltsyre, samtidig er det en svagere syre, og det kan derfor tænkes, at den er blidere i hydrolysen af proteinerne, og samtidig ikke skader aminosyrerne grundet den svagere syrestyrke. Ydermere bruges TFA til andre hydrolyser på CMB. Der hydrolyseres over fem forskellige tidsintervaller; 12, 16, 20, 24 og 28 timer. 12 timer vælges, da hydrolysen ønskes undersøgt i en kortere periode end den nuværende metode på 16 timer. 20 vælges da det ligger mellem de nuværende 16 timer og de 24 timers hydrolyse som undersøgelserne Improved recovery of methionine after hydrolysis using mercaptoethanol og Recovery of tryptophan in peptides and proteins by high-temperature and short-term acid hydrolysis in the present of phenol er udført ved. 28 timer er valgt da det ønskes undersøgt en hydrolyse længere end de 24 timer. Der hydrolyseres ved 110 C, dette vælges da det er denne temperatur som nuværende hydrolysemetode køres efter. Andre temperaturer fravælges, da prøvemængden dermed vil blive for stor i forhold til tiden af dette projekts varighed. Til hydrolyserne adderes der intern standard, dette gøres så der i sidste ende kan korrigeres for variationer. Dette gøres, da det bedste største areal af den interne vil være en bench mark for, hvad de andre resultater burde have været hvis alt gik lige godt. 5 Keutamann, H.T og Pott, J.T Jr, Muramoto, K og Kamiya, H.,

15 Til derivatisering bruges ECF, dette vælges, da det er den metode som Enantiomer separation of amino acids after derivatization with alkyl chloroformates by chiral phase capillary gas chromatography 7 anbefaler. Samtidig er det denne metode som bruges på CMB. Andre derivatiseringsmetoder fravælges grundet tiden angivet til dette projekt. Det vælges at udføre analysearbejdet med den nuværende GC-MS metode. Dette vælges da der ikke er tid til at udvikle en ny metode, samtidig med at den er designet til analysen med den nuværende derivatiseringsmetode. For at versificere om den hydrolysemetode der vurderes som den bedste, også er det. Sættes den op mod den nuværende hydrolysemetode med 6M HCl i ca. 16 timer. Til forskel fra screeningen med BSA sættes de op mod hinanden med Aspergillus nidulans som biomasse. Dette vælges da denne svamp bruges i flux-forsøg ved CMB. Til versificeringen af den bedste metode (nuværende vs. Screeningsresultatet) udføres der ensidet variansanalyse på arealerne under kurverne fra alle aminosyrerne. Dette gøres da det giver et statistisk belæg for at konkludere på dataene. Den ensidede variansanalyse kan udføres, da det vurderes at dataene er normalfordelte, da dette er normen i et kemisk analyselaboratorium, derudover er alle prøverne målt hver for sig, hvilket gør at de er statistisk uafhængige. Varianshomogeniteten testes ved den ensidede variansanalyse, og derefter kan det konkluderes om der er forskel på metoderne. For at kunne underbygge argumentet om, hvilken metode der er bedst; kvantificeres der på aminosyren serin. Denne vælges da den er et vigtigt pejlepunkt i flux-analyse. Andre aminosyrer er fravalgt grundet mangel på tid. Til kvantificering bruges metoden isotopfortynding. Dette gøres da det vurderes at 13 C-mærket serin vil være den bedste interne standard, da denne har de samme kemiske egenskaber som almindeligt serin. Samtidig er isotopfortynding en standard additionsmetode, hvilket tager højde for matrixeffekter i prøven. Ligesom ved screeningen af den bedste metode kan de resterende aminosyrer korrigeres ud fra den interne standard. Til kvantificeringen af serin vælges at lave tre standardkurver i stedet for en. Dette vælges da der derved kan laves en lineær regressionsanalyse, hvilket giver en mere repræsentativ standardkurve. Den lineære regressionsanalyse kan udføres, da det forudsættes at dataene er normalfordelte. Samtidig er de tre standardkurver målt adskilt fra hinanden, hvilket betyder at de er statistisk uafhængige. Varianshomogeniteten testes ved beregning af den lineære regressionsanalyse, og er dermed den eneste faktor, der er ubekendt på forhånd. Til standardkurven vælges der 7 Abe, I et al,

16 syv punkter, dette vælges da det giver en god nøjagtighed, og samtidig er normen ved metodevalidering. 16

17 Metode. Automatisk SPE. 1 ml af hydrolysat tilsættes prøverøret, og en Strata SCX 100mg/mL kolonne sættes i robottens kolonnesampler. Det ønskede program vælges i robottens softwareprogram og der startes. Der køres på en Biotage rapid trace SPE robot med følgende metode: Step Source Output Vol flow (ml/min) Condition MeOH Waste Condition H2O Waste Load Sample Waste 1 1 0,37 Add to mixer EtOH - 0,5 2 Add to mixer H2O - 0,5 2 Mix Mixer Condition Mixer Waste Condition NaOH Waste 1 0,2 0,5 Add to mixer 4% NaOH i salin - 0,6 1 Add to mixer EtOH - 0,3 1 Add to mixer Pyridin - 0,1 0,5 Mix Mixer Collect Mixer Fraction 1 1 0,37 Purge cannula H2O Waste Tid: 22 min og 45 sekunder Hydrolyse. Ved hydrolysedelen afvejes 100 prøver af ca. 2 mg BSA 8. Til hvert tidsinterval bruges 20 afvejninger, disse fordeles på de 5 forskellige hydrolysemetoder således at 4 prøver tilsættes 600µL 6M HCl, 4 prøver tilsættes 600µL 6M HCl 0,2 % 2-mercaptoethanol, 4 prøver tilsættes 600µl HCl 3 % phenol, 4 prøver tilsættes 600µL HCl 0,2 % 2-mercaptoethanol 3 % phenol, og de sidste 4 prøver tilsættes 600µL 99 % TFA. Alle prøver tilsættes 50µL 0,5 mg / ml chlorphenylanalin som intern standard. Prøverne forsegles, og stilles i en ovn ved 110 C i 5 forskellige tidsintervaller 12,16, 20, 24 og 28 timer. Efter endt hydrolyse fjernes forseglingen, og prøverne stilles til tørring i den samme ovn ved 110 C i 3 timer, eller til hydrolysevæsken er forsvundet. Efter tørring tilsættes der 1mL milli-q vand til prøven, der nu er klar til SPE. 8 Se bilag 1 17

18 Manuel SPE. En Strata SCX 100mg/mL kolonne sættes på et manifoldkar. Kolonnen gennemgår følgende: 1. Konditionering med 1 ml methanol, gennemløb går til affald. 2. Konditionering med 1 ml milli-q vand, gennemløb går til affald. 3. Påførsel af prøve, gennemløb går til affald. 4. Vaskning med 1 ml H 2 O:EtOH (50:50), gennemløb går til affald. 5. Vaskning med 200µL 1 M NaOH, gennemløb går til affald. 6. Eluering med 1 ml blanding af 4 % NaOH i salin, ethanol og pyridin (9:5:1), gennemløb opsamles, og prøven er klar til derivatisering ECF derivatisering. 500 µl af SPE eluatet tilsættes 50 µl ECF, der mikses forsigtigt med pipettespidsen, og mikses forsigtigt på en vortexer, mens låget holdes fast, da der vil dannes overtryk i Eppendorfrøret, grundet dannelsen af CO 2. Trykket lettes ved at åbne låget, og der mikses på ny, indtil dannelsen af CO 2 ophører. Herefter tilsættes 5µL ECF, der mikses indtil dannelsen af CO 2 ophører. Herefter tilsættes 200 µl propylacetat, og der mikses igen indtil dannelsen af CO 2 ophører. Herefter tilsættes 50µL 1M HCl, der mikses kraftigt i ca. 10 sekunder, og indtil dannelsen af CO 2 ophører. 150 µl af det øverste organiske lag i Eppendorfrøret overføres til et nyt Eppendorfrøret indeholdende en spatelspids vandfrit natriumsulfat, der mikses i 10 sekunder. Herefter overføres så meget af supernatanten til et HPLC rør med indsats. Prøven er nu klar til analyse på GC-MS. 18

19 GC-MS. Gaschromatografen der bruges til analyse er en HP 6896 series, massespektrofotometeret er en HP 5973 series. Der køres splitless injektion og med en 1701 kolonne med helium som carrier gas. MS en er med EI som ionkilde og med quadropol massefilter. Programmet der køres efter ser således ud: Intlet Temp 200 C Pressure Flow Columnn Pressure Flow 0,64 bar 13,7 ml/min 0,64 bar 1,3 ml/min 75 C hold, 1 min 75 C -140 C,40 C / min Oven Temp 140 C- 175 C, 4 C / min 175 C -205 C, 40 C / min 205 C -240 C, 4 C / min, hold 4min 240 C -260, C 40 C / min, hold 4 min Kvantitativ bestemmelse. En stamopløsning på 1mg/mL Serin laves. Ud fra denne laves en fortyndingsrække med syv koncentrationer gående fra 0,1 0,9 mg/ml serin, sådan så mængden af væske er 300 µl i et Eppendorfrør. Til hver prøve tilsættes 33 µl 3 mg/ml 13 C-mærket serin som intern standard. Der udføres en tredobbeltbestemmelse på fortyndingsrækken. Hvert Eppendorfrør tilsættes 200 µl pyridin : ethanol (1:4), og derivatiseres derefter som beskrevet ovenfor. Derefter køres prøverne på GC-MS som beskrevet. Sammenligning af funden bedste- og nuværende metode. Ca. 1 mg 9 Aspergillus nidulans tilsættes til et HPLC rør. 600 µl af den bedste hydrolysevæske tilsættes til svampen og der hydrolyseres ved 110 C i den tid som vurderes som den bedste. For at sammenligne metoden med den nuværende, tilsættes der 600 µl 6M HCl til et andet HPLC rør, og der hydrolyseres ved 110 C i 16 timer. Der køres 4-dobbeltbestemmelser. De i alt otte prøver gennemgår manuel SPE, derivatisering og GC-MS analyse som beskrevet ovenfor. 9 Se bilag 2 19

20 Sikkerhed. Alt arbejde undtaget GC-MS delen udføres i stinkskab, samtidig skal kittel, nitrilhandsker og sikkerhedsbriller være påklædt under hele forsøgsgangen. Ud over generel sund fornuft, skal der udvises ekstra påpasselighed ved arbejde med phenol, mercaptoethanol, methanol og ECF, da disse er meget giftige. Ydermere skal der også vises påpasselighed i derivatiseringsdelen, da der arbejdes med carcinogene opløsninger. Ved spild skal der straks tørres op, og vaskes med ethanol. Da gennemtrægningstiden på nitrilhandsker er meget kort, skal der ved spild på disse, straks skiftes til et par nye for at undgå direkte kontakt på huden. Brugte handsker og optørringsartikler smides i en pose til biologisk affald. Pipettespidser og brugte HPLC rør smides i en plastikbeholder for sig. Alt flydende affald opsamles i en plastikdunk med den rigtige affaldsgruppe påført. Alt affald hentes, og destrueres andetsteds. Kvalitetssikring. Al forsøgsgang er udført efter SOP er, som er skrevet og revideret af kemikere på CMB. Under hele projektet er der udført laboratoriejournal i henhold til de regler, som er vedtaget på CMB. Hver unik prøve har fået et unikt prøvenummer, dette nummer har prøven fra start til slut, dette gør at chancen for forbytning af prøver formindskes. For at undgå forbytning af prøver yderligere skal hvert HPLC rør, Eppendorfrør og lignende være påført et mærkat med prøvenummer og dato angivet. Dette skal ske i henhold til CMB s egne kvalitetssikringsregler. Databehandling. Chemstation: Det ønskede kromatogram åbnes i Chemstation. Under menuen Chromatogram vælges Auto integrate og derefter Integration results. Ved at trykke på copy kan integralerne kopieres ind i Excel. Regressionsanalyse: Koncentrationerne sættes ind i den første kolonne 1 og arealet under toppen i kromatogramet sættes ind i kolonne 2 i Statgraphics. Herefter vælges relate, i denne undermenu one factor og single regression, herefter sættes kolonne 1 som X og kolonne 2 som Y. Der trykkes ok. Der vælges linear. Der sættes flueben i Analasis of variance og Lack of test under tables, og Plot fitted model under graphs. 20

21 Ensidet variansanalyse: Det der beskriver data sættes ind som kolonne 1 og data sættes i kolonne 2 i Statgraphics. Herefter vælges compare i denne undermenu vælges analysis of varians og derfefter one way anova. Kolonne 2 sættes som depentent variable og kolonne 1 sættes ind som factor. Der sættes flueben i Anova table og Varians Check under Tables, og der sættes flueben ved Means plot under Graphs. 21

22 Resultater. Nedenstående er et kromatogram fra GC-MS analysen, hvor SPE er foretaget automatisk, ved laveste flow. kromatogram 1: A b und a nc e 1.2e +07 T IC: H 23.D 1.1e +07 1e T im e -->

23 Nedenstående kromatogram viser en optimal kørsel på GC-MS hvor SPE er foretaget manuelt. kromatogram 2. 3,18 alanin. 3,33 glycin. 3,8 valin. 4,56 leucin. 4,61 isoleucin, 5,17 prolin. 5,72 threonin. 5,83 serin. 7,46 asperagin/aspertat. 9,74 Glutamin/glutamat. 10,65 phenylalain. 15,60 lysin. 17,47 tyrosin. 20,1 tryptophan. 23

24 Area Ala Gly Val Leu Ile Pro Thr Ser Asx Met Glx Phe Lys Tyr Trp IS Area Nedenstående figur viser det grafiske resultat af de 5 hydrolysevæsker samt den relative standardafvigelse efter 12 timer. Rådata kan ses i bilag 3. Figur 1: 1,4E+09 1,2E timer 1E HCl HCl + MerOH HCl + PhOH HCl +MerOH + PhOH TFA 0-2E+08 Aminosyre Nedenstående figur viser det grafiske resultat af 4 af de 5 hydrolysevæsker samt den relative standardafvigelse efter 16 timer. Rådata kan ses i bilag 4. Figur 2: 1,2E+09 1E timer HCl HCl + MerOH HCl + PhOH HCl + MerOH + PhOH Ala Gly Val Leu Ile Pro Thr Ser Asx Met Glx Phe Lys Tyr Trp IS Aminosyre 24

25 Ala Gly Val Leu Ile Pro Thr Ser Asx Met Glx Phe Lys Tyr Trp IS Area Ala Gly Val Leu Ile Pro Thr Ser Asx Met Glx Phe Lys Tyr Trp IS Area Nedenstående figur viser det grafiske resultat af 4 af de 5 hydrolysevæsker samt den relative standardafvigelse efter 20 timer. Rådata kan ses i bilag 5. Firgur 3: 1,2E+09 1E timer HCl HCl + MerOH HCl + PhOH HCl + MerOH + PhOH Aminosyre Nedenstående figur viser det grafiske resultat af 4 af de 5 hydrolysevæsker samt den relative standardafvigelse efter 24 timer. Rådata kan ses i bilag 6. Figur 4: 1E Timer HCl HCl + MerOH HCl + PhOH HCl + MerOH + PhOH 0-2E+08 Aminosyre 25

26 Ala Gly Val Leu Ile Pro Thr Ser Asx Met Glx Phe Lys Tyr Trp IS Area Nedenstående figur viser det grafiske resultat af 4 af de 5 hydrolysevæsker samt den relative standardafvigelse efter 28 timer. Rådata kan ses i bilag 7. Figur 5: timer HCl HCl + MerOH HCl + PhOH HCl + MerOH + PhOH E+08 Aminosyre 26

27 Col_2 Nedenstående skema viser udregningen fra Statgraphics af varianshomogeniteten på den lineære regressionsanalyse på de tre standardkurver. Rådata kan ses i bilag 8 Skema 1: Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Model 31,2 1 31, ,00 Residual 0, ,029 Lack-of-Fit 0,18 5 0,037 1,41 0,28 Pure Error 0, ,026 Total (Corr.) 31,7 20 Nedenstående figur viser den kurve der fås ved den lineære regressionsanalyse på datasættet fra de tre standardkurver. Kurven har ligningen y = 4,333 x 0,109 Figur 6 5 Plot of Fitted Model Col_2 = -0, ,33253*Col_ ,2 0,4 0,6 0,8 1 Col_1 27

28 Ala Gly Val Leu Ile Pro Thr Ser Asx Met Glx Phe Lys Tyr Trp Is Area Nedenstående figur viser det grafiske resultat af sammenligningen af den bedste metode fundet ved screeningen af de fem hydrolysemetoder og den nuværende. Rådata kan ses i bilag 9. Figur 6: HCl HCl + MerOH Aminosyre 28

29 Col_2 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren alanin. Skema 2: Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 2,44E13 1 2,44E13 0,21 0,66 groups Within groups 5,83E14 5 1,16E14 Total (Corr.) 6,07E14 6 Variance Check Test P-Value Levene's 1,68 0,251 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren alanin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 7: (X 1,E6) 69 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl ALA Col_1 MerOH ALA 29

30 Col_4 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren glycin. Skema 3. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1,81E14 1 1,81E14 6,01 0,058 groups Within groups 1,51E14 5 3,02E13 Total (Corr.) 3,32E14 6 Variance Check Test P-Value Levene's 4,80 0,080 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren glycin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 8 (X 1,E7) 3 Means and 95,0 Percent LSD Interv als 2,5 2 1,5 1 0,5 0 HCl Gly Col_3 MerOH GLy 30

31 Col_6 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren valin. Skema 4. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 6,78E13 1 6,78E13 0,22 0,66 groups Within groups 1,52E15 5 3,04E14 Total (Corr.) 1,59E15 6 Variance Check Test P-Value Levene's 0,099 0,76 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren valin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 8. (X 1,E6) 98 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Val Col_5 MerOH Val 31

32 Col_8 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren leucin. Skema 5. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 4,77E13 1 4,77E13 0,17 0,69 groups Within groups 1,40E15 5 2,80E14 Total (Corr.) 1,45E15 6 Variance Check Test P-Value Levene's 1,24 0,31 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren leucin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 9. (X 1,E6) 105 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Leu Col_7 MerOH Leu 32

33 Col_10 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren isoleucin. Skema 6. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 4,63E13 1 4,63E13 0,13 0,72 groups Within groups 1,72E15 5 3,45E14 Total (Corr.) 1,77E15 6 Variance Check Test P-Value Levene's 0,67 0,44 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren isoleucin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 10. (X 1,E6) 85 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Ile Col_9 MerOH Ile 33

34 Col_12 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren prolin. Skema 7. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 8,57E13 1 8,57E13 0,65 0,45 groups Within groups 6,62E14 5 1,32E14 Total (Corr.) 7,47E14 6 Variance Check Test P-Value Levene's 1,05 0,35 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren prolin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 11. (X 1,E6) 69 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Pro Col_11 MerOH Pro 34

35 Col_14 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren threonin. Skema 8. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 3,88E12 1 3,88E12 0,39 0,55 groups Within groups 4,96E13 5 9,93E12 Total (Corr.) 5,35E13 6 Variance Check Test P-Value Levene's 4,09 0,098 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren threonin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 12. (X 1,E6) 19 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Thr Col_13 MerOH Thr 35

36 Col_16 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyrerne aspertat/asparagin. Skema 9. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1,58E14 1 1,58E14 0,22 0,65 groups Within groups 3,55E15 5 7,11E14 Total (Corr.) 3,71E15 6 Variance Check Test P-Value Levene's 1,64 0,25 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyrerne aspertat/asparagin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 13. (X 1,E7) 8 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Asx Col_15 MerOH Asx 36

37 Col_18 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren methionin. Skema 10. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 4,70E14 1 4,70E14 0,86 0,39 groups Within groups 2,73E15 5 5,47E14 Total (Corr.) 3,20E15 6 Variance Check Test P-Value Levene's 2,04 0,21 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren methionin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 14. (X 1,E7) 10 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Met Col_17 MerOH Met 37

38 Col_20 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyrerne glutamin/glutamat. Skema 11. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 1,28E14 1 1,28E14 1,61 0,26 groups Within groups 3,99E14 5 7,98E13 Total (Corr.) 5,27E14 6 Variance Check Test P-Value Levene's 3,16 0,13 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyrerne glutamin/glutamat. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 15. (X 1,E6) 25 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Glx Col_19 MerOH Glx 38

39 Col_22 Nedenstående skema viser det fra Statgraphics beregnede resultat af den ensidede variansanalyse, mellem den nuværende metode og den metode der blev vurderet som den bedste i screeningen. Variansanalysen er på aminosyren phenylanalin. Skema 12. Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 2,06E14 1 2,06E14 2,68 0,16 groups Within groups 3,86E14 5 7,72E13 Total (Corr.) 5,92E14 6 Variance Check Test P-Value Levene's 0,24 0,63 Nedenstående figur viser 95 % konfidensintervaller for de to metoder bestemt ved ensidet varians analyse på aminosyren phenylanalin. Til venstre 95 % konfidensintervallet for den nuværende metode, og til højre 95 % konfidensintervallet for den bedst vurderet metode fra screeningen. Figur 15. (X 1,E7) 4 Means and 95,0 Percent LSD Interv als HCl Phe Col_21 MerOH Phe 39

40 Diskussion. Det kan diskuteres om den automatiske SPE del, er berettiget til at være en del af dette projekt. Men da det kunne tænkes gøre SPE-delen mere tidseffektiv, og da der laves en del SPE i dette projekt, vurderes det til at være yderst relevant. Hvis der sammenlignes på kromatogram 1 og 2, kan det ses, at den automatiserede SPE del ikke lever op til samme standard, som den manuelle, derfor er der foretaget manuelt SPE på hydrolyseprojektet. Hvad der skyldes at den automatiske SPE del ikke fungere, vides ikke helt præcist, men det er plausibelt at tro at det positive tryk spiller ind, også selvom det er på det laveste niveau, som robotten er gearet til, da det kan tænkes at kolonnen løber tør. Hvis det havde vist sig at robotten ville være lige så god som det manuelle arbejde, er det et godt spørgsmål om, hvorvidt det ville være hurtigere at lade robotten klare arbejdet, hvis prøvemængden som i dette projekt er 20 pr. hydrolyse. Dette er et spørgsmål, der må stå hen i det uvisse. Men det der taler for den automatiserede SPE, er at tiden kan bruges andet steds, end ved den manuelle, hvor personlig tilstedeværelse er påkrævet. Desuden er det plausibelt at standardafvigelsen vil reduceres, ved at fjerne det menneskelige element fra oprensningen. Berettigelsen af brugen af BSA som prøve i screeningen kan diskuteres, da der på CMB normalt bruges biomasse fra gær- eller svampetyper. Der kunne sagtens være brugt et andet proteinrigt stof, men argumentet for brugen af noget andet end gær eller svamp til screeningen, ligger i, at BSA er mere proteinrigt end biomasse, og dermed giver et resultat, der er nemmere at analysere, da udbyttet af aminosyrer vil blive større. Udover 6M HCl kan valget af hydrolysevæsker til screeningen diskuteres. 6M HCl er givet da denne blev brugt før projektets start. Der kan diskuteres om metoden med 0,2 % mercaptoethanol additiv er relevant. Dette vurderes den til at være, da de i artiklen Improved recovery of methionine after hydrolysis using mercaptoethanol rapporterer om bedre udbytte af aminosyrer ved addition af mercaptoethanol til 6M HCl. Det samme argument kan bruges til at forsvare brugen af 3 % phenol som additiv, da der i artiklen Recovery of tryptophan in peptides and proteins by high-temperature and short-term acid hydrolysis in the present of phenol rapporteres om forøget udbytte af aminosyrer ved addition af 3 % phenol til 6M HCl. Relevansen i at bruge 0,2 % mercaptoethanol + 3 % phenol, ligger i at det kunne være spændende at se, om der ville være en dobbelteffekt, så udbyttet af aminosyrerne blev endnu større end ved addition af kun det ene stof. Der er ingen videnskabelig artikel, der konkluderer 40

41 dette, men der er heller ingen der beskriver det, derved er argumentet for at bruge denne metode, at en ny hydrolysemetode ville være fundet. Argumentet der ligger til grund for at bruge TFA som hydrolysevæske er udelukkende, at det kunne være interessant at have en alternativ syre, der var svagere i syrestyrke end saltsyre, da det kunne tænkes at beskytte aminosyrerne. Der er ingen videnskabelig artikel der ligger til grund for denne beslutning. Relevansen i at bruge ECF som derivatiseringsmetode underbygges af artiklen Enantiomer separation of aminoacids after derivatiozation with alkyl chloroformates by chiral phase capillary gas chromatography. Denne er relevant da den beskriver ECF som den bedste derivatiseringsmetode når alkyl chloroformater bruges som derivat. Da ECF yderligere er den derivatiseringsmetode, der bruges på CMB underbygges relevansen yderligere. Hvis der sammenlignes på figur 1 til figur 5 er det bemærkelsesværdigt at 6M HCl viser sig at være at være en lige så god eller bedre hydrolysevæske som hydrolysevæskerne, hvor mercaptoethanol, phenol eller begge dele er brugt som additiv. Dette kan ses da udbyttet for HCl i figurerne er højere eller på højde med de andres kolonner. Den eneste hydrolysevæske der skiller sig virkelig ud, er TFA, som må siges, ikke at kunne hydrolysere BSA ved andet end 12 timer. Dette er dog i en begrænset mængde i forhold til de andre hydrolysevæsker. Selvom hydrolysemetoden kun med HCl ikke adskilte sig synderligt fra de resterende, valgtes der er gå videre med mercaptoethanol som additiv i tiden 16 timer. Dette begrundes ved, at der måltes det største areal under kurven, når det kom til den labile aminosyre tryptophan 10, der desuden blev målt i alle 4-dobbeltbestemmelsens prøver med mercaptoethanol, og samtidig ikke var til stede ved HCl, og ikke konsekvent ved de andre hydrolysemetoder. Hvis der skal argumenteres for at 16 timer også er det bedste tidsinterval for HCl alene, kan dette gøres ved at se på den relative standardafvigelse. Hvis der ses på figurerne 1-5 er det tydeligt at se, at den er mindst ved 16 timer på nær for aminosyren lysin. Derfor vurderes det at 16 timer er den bedste hydrolyseinterval. Det kan diskuteres om det er relevant at lave regressionsanalyse på standardkurven. Hvis der ses på skema 1, kan der argumenteres for dette. Da p-værdien i lack of fit -testen er over 0,05, viser det, at regressionsanalysen har varianshomogenitet, og derfor er alle krav for at lave regressionsanalyse opfyldt. Dermed er det relevant da en kurve lavet af regressionsanalysen er mere repræsentativ end en normal standardkurve. 10 Dette kan være svært at se på grafen, se evt. bilag 4. 41

42 Det kan diskuteres om det er relevant, at anvende Aspergillus nidulans til bestemmelsen om hydrolysemetoden med mercaptoethanol adderet er bedre end hydrolysemetoden med 6M HCl. Dette vurderes den at være da denne svamp bruges til flux analyse på CMB, og derfor vil der i fremtiden skulle analyseres på denne. Hvis der ses på figur 6 ses det, at der ved hydrolysemetoden indeholdende 6M HCl gives et større areal under kurverne for alle aminosyrerne end ved hydrolysemetoden, hvor mercaptoethanol er adderet. Dog er den relative standardafvigelse også større for HCl. Det kan så diskuteres, hvilken hydrolysemetode der er bedst. Til dette bruges ensidet variansanalyse, hvis legitimitet kan diskuteres. Legitimiteten er på sin rette plads da værdien af varianstjekket, som ses under skema 2 til skema 12, alle er over 0,05. Dermed er der varianshomogenitet, hvilket er det sidste krav, der skal opfyldes, for at en ensidet variansanalyse kan foretages. Når det kommer til diskussionen om, hvilken hydrolyse metode der er bedst, er det ikke lige til at fastslå. Godt nok er alle kolonnerne for 6M HCl større end for adderingen med mercaptoethanol, men da det ses at p-værdien for den ensidede variansanalyse, i skema 2 til skema 12 er over 0,05, kan der ikke bevises statistisk forskel på de to metoder. Dette ses yderligere i figur 7-15, hvor de to metoders 95 % konfidensintervaller overlapper hinanden. Dermed er der ikke noget endegyldigt og klart svar på, hvilken hydrolysemetode der er bedst. Der kan dog skæres ned til to kandidater som er statistisk ens, den nuværende metode med 6M HCl som giver de største arealer, men også har en større standardafvigelse, og 6M HCl adderet med 0,2 % mercaptoethanol som giver lidt mindre arealer, men også lavere standardafvigelse. Når alt kommer til alt, passer hypotesen om at en hydrolysemetode med additiv er bedre end en hydrolysemetode uden additiv ikke. Samtidig er resultatet fra artiklen Improved recovery of methionine after hydrolysis using mercaptoethanol af H.T. Keutmann og J.T. Potts, Jr, hvor udbyttet af methionin steg efter addition med mercaptoethaniol ikke er blevet eftervist. Det var heller ikke muligt at kvantificerer mængden af serin da denne ikke var til stede i de to hydrolysemetoder. 42