Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS).

Transkript

1 Teori til elevforløb på Institut for Biokemi og Molekylærbiologi på Syddansk Universitet: Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS). Peter Windfeldt 1, Christian Gothard Rix 2, Søren Andersen 3 og Ann Zahle Andersen 4 Stor tak til Peter Højrup og Karin Hjernø, hvis kapitler i bogen Proteiner oprensning og karakterisering 5 har dannet grundlag for denne tekst. 1 Nordfyns Gymnasium, Højagervej 25, 5471 Søndersø, Danmark, pwb@sport.dk 2 Rødkilde Gymnasium, Rødkildevej Vejle, Danmark, cr@roedkilde-gym.dk 3 Protein Research Group, Syddansk Universitet, Campusvej 55, 5230 Odense M, Danmark, sa@bmb.sdu.dk 4 Outreach Koordinator på Institut for Biokemi og Molekylærbiologi, Syddansk Universitet, zahle@bmb.sdu.dk 5 Redaktion Vivi Kielberg og Leif Rasmussen, udgivet af Gyldendal, 4. udgave, 1. oplag, ISBN

2 Indhold Kernestof som behandles i øvelsen på SDU... 3 Biologi A... 3 Bioteknologi A... 3 Supplerende stof... 3 Kort introduktion til det samlede forløb... 4 Generel indledning omkring proteiner fra bakterier... 4 Kort om proteiner og deres opbygning Baggrund og teori til:... 6 Forberedelse af proteinblanding, SDS-gel... 6 Coomassie farvning af Proteiner i SDS gel... 6 Udvælgelse af protein og fordøjelse med trypsin... 6 Oprensning og opkoncentrering af peptider... 8 Massespektrometri (MS)... 9 Principperne og apparaturet... 9 Videre analyse af proteinet: Øvelsesopgave 1: Identifikation af insulintype ved MALDI MS Spørgsmål a Spørgsmål b Andre massespektrometriske metoder Isotoper: Øvelsesopgave 2: Molekylebestemmelse ud fra massespektrometri Litteraturliste

3 Kernestof som behandles i øvelsen på SDU Biologi A Opbygning og biologisk betydning af proteiner og nukleinsyrer. Eksempler på anvendt bioteknologi, herunder bioinformatik. Eksempler på undersøgelses- og analysemetoder samt statistisk resultatbehandling inden for biokemi. Supplerende stof Biologien som videnskabsfag, herunder molekylærbiologi og bioteknologi Bioteknologi A Udvalgte uorganiske forbindelser og de organiske stofklasser (aminosyrer) Biokemiske forbindelser med særlig vægt på deres struktur og egenskaber (proteiner) Eksperimentelle arbejdsmetoder der anvendes inden for bioteknologi, herunder, elektroforese, separations- og Oprensningsmetoder. Supplerende stof Forsknings- og anvendelsesaspekter 3

4 Kort introduktion til det samlede forløb Den metode, som i skal benytte kaldes Peptide mass fingerprinting, løst oversat; Peptid masse fingeraftryk (PMF). Metoden danner grundlag for moderne proteomics, idet den tillader identifikation og karakterisering af store som små proteiner, samt deres foldning og modifikationer. Vi vil anvende PMF, i dens simpleste form, til at identificere et protein fra en kompleks proteinblanding. Identifikation af et protein i en kompleks blanding af tusinder af proteiner og andre cellekomponenter er ikke nogen triviel opgave. Heldigvis består et protein af lineære kæder af aminosyrer, som kan skæres op i et antal mindre dele (peptider), som er lettere at karakterisere. Den viden man således opnår om peptiderne, er proteinets peptid masse mønster eller proteinfingeraftryk. Proteinets fingeraftryk er som regel unikt og man kan så ved hjælp af databaser over hundredtusindvis af proteinfingeraftryk identificere det protein, man oprindeligt skar i stykker. PMF oversigt. Proteinet oprenses fra en 1D gel, skæres i peptider, som massebestemmes ved MALDI-MS. Derefter sammenlignes peptid masse mønsteret med forudsagte skæringsmønstre in en database. Resultatet fra databasen er en liste med proteiner, rangeret efter hvor godt peptid masse mønsteret passer med proteinets forudsagte mønster. I vores tilfælde vil vi skære vores oprensede protein med enzymet trypsin. Derefter måles masserne af vores peptider ultra nøjagtigt ved hjælp af MALDI-MS. Den store styrke ved MALDI- MS er, at man kan analysere meget, meget små mængder protein (få nanogram), som ikke ville kunne spores på andre måder. Derfor kan vi nøjes med at oprense meget små mængder protein fra en gel. Efter at vores peptidstørrelser er bestemte, kan vi sammenligne masserne med forudsagte protein fingeraftryk i en database over kendte proteiner og derved finde ud af specifikt hvilket protein, vi har i vores prøve. Generel indledning omkring proteiner fra bakterier I øvelsen på SDU arbejdes der med at identificere forskellige proteiner fra forskellige bakteriestammer. Der findes et utal af forskellige proteiner i bakterierne, hvor nogle af 4

5 proteinerne er generelle proteiner, som langt de fleste bakterier danner, f.eks. generelle nedbrydningsenzymer og membranproteiner som Na + /K + pumper og Ca 2+ pumper. Andre proteiner vil være specifikke for den enkelte bakterie og vil derfor være et slags fingeraftryk for den enkelte bakteriestamme. Bakterier kan også anvendes til at producere store mængder af et protein der stammer fra en anden organisme, og i så fald vil der være store mængder af netop det protein i prøven. Kort om proteiner og deres opbygning. Proteiner består af kæder af aminosyrer og betegnes også som et peptid. De forskellige aminosyrer er opbygget omkring et centralt C-atom hvortil der er bundet en aminogruppe (-NH 2 ), et hydrogenatom (H) og en carboxylsyregruppe (-COOH). På den sidste af det centrale C-atoms fire bindinger sidder den gruppe, som varierer fra aminosyre til aminosyre og betegnes molekylets radikal (R). Det er det varierende radikal, som giver de enkelte aminosyrer deres specielle egenskaber (ikke polære hydrofobe, polære hydrofile, positivt ladede og negativt ladede radikaler). Sammensætningen af proteinets primærstruktur (rækkefølgen af aminosyrer i proteinet) har stor betydning, for hvordan proteinet danner forskellige bindinger, dels i proteinmolekylets egen struktur og herigennem foldning og dels i bindinger til andre molekyler, som f.eks. enzymers specifikke binding til substratet. Forskellige proteiner har igennem sin specifikke primærstruktur særlige bindinger mellem molekylets forskellige områder, hvilket betegnes som sekundærstruktur. To almindelige sekundærstrukturer er alpha-helix (α-helix) og beta-foldeblade (β-sheet). Den sekundære struktur er sammen med proteinets andre bindinger med til at danne proteinets overordnede form, den tertiære struktur, som er forskellige bindinger mellem de forskellige radikaler (disulfidbinding, ionbinding, hydrogenbindinger og hydrofobe lommer). Samlet set vil det enkelte protein danne en specifik foldning og dermed rummelig struktur, som er specielt for det enkelte protein. (se Figur 1) Figur 1 Proteinet trypsin. Enzym som benyttes til at klippe denaturerede proteiner i mindre peptidkæder. Trypsin indeholder både α-helix (spiraler i figuren) og β-foldeblade (brede pile i figuren) Kilde 5

6 Baggrund og teori til: Forberedelse af proteinblanding, SDS-gel En af de udfordringer, der er ved at undersøge og isolere forskellige proteiner, er netop de forskellige proteiners foldning og rummelige struktur. Den første forberedelse af proteinblandingen i den praktiske laboratorieøvelse er derfor at opbryde den rummelige struktur (denaturere), sådan at proteinerne kun adskiller sig ved forskellige længder af deres aminosyrekæder. Et protein denatureres, når det koges i en opløsning af SDS (natrium dodecylsylfat, har samme funktion som alm. sæbe) og β-merkaptoethanol (som er et kemisk stof der bryder disulfid broer). Her bliver både den sekundære og den tertiære struktur af proteinet ødelagt, fordi hydrogen- og svovlbindingerne brydes og molekylet udfoldes (se Figur 2). Proteinerne vil samtidig, fordi SDS bindes til det, få maskeret og udjævnet de ladningsforskelle, der skyldes de forskellige aminosyrers radikaler. Resultatet bliver, at proteinerne nu er jævnt negativt ladede over hele deres aminosyrekæde og derfor kan adskilles efter længde vha. elektroforese. Det vil sige at proteinblandingen separeres på en gel ved at sætte en spænding hen over gelen som trækker de negativt ladede proteiner hen imod karrets anode (+) og dermed separerer dem efter størrelse (på samme måde som DNA separeres). Figur 2 Protein denatureres ved kogning med SDS. Herved foldes proteinet ud og de naturlige ladninger maskeres, sådan at proteinet får en jævn ladning i hele sin udstrækning. Baseret på figur i L. Rasmussen mfl. (2010) Proteiner oprensning og karakterisering. Gyldendal 4. udgave, 1. oplag. Coomassie farvning af Proteiner i SDS gel Efter at have adskilt de forskellige bakterieproteiner efter størrelse, skal proteinerne gøres synlige, dette gøres ved at farve gelen med et farvestof der hedder Coomassie Brilliant Blue. Gelen der nu indeholder de separerede proteiner placeres i et kar med Coomassie, der trænger ind i gelen og binder stærkt til proteinerne. Efterfølgende affarves selve gelen, men farven der er bundet til proteinerne bliver, således at proteinerne nu træder frem på gelen som tydelige blå bånd. Den samlede mængde af bånd og hvordan de fordeler sig i gelen vil, som tidligere nævnt være specifikt for den enkelte bakteriestamme og herigennem afspejle bakteriens individuelle egenskaber (se Figur 3) Udvælgelse af protein og fordøjelse med trypsin Når proteinerne på gelen er farvede, kan der nu udvælges et eller flere bånd på gelen, som hver udelukkende indeholder proteiner af præcis samme længde. Efter udvælgelse af det bånd (og 6

7 dermed protein) man ønsker at undersøge, skæres båndet fysisk ud af gelen med en skalpel og proteinet, der er fanget i gelen, viderebehandles. Proteinet skal klippes i mindre stykker (peptider), for at peptid masse fordelingen kan give det fingeraftryk som vi bruger til at identificere proteinet. Dette gøres ved hjælp af enzymet trypsin, der specifikt klipper efter aminosyrerne lysin (forkortes Lys eller K) og arginin (forkortes Arg eller R). Der er dog en undtagelse i forhold til skæring. Hvis aminosyren ved siden af R eller K er Prolin (forkortes Pro eller P) så skærer trypsin ikke aminosyrekæden. Proteinet klippes/fordøjes efter samme princip som ved klipning af DNA med restriktionsenzymer (f.eks. EcoRI). Klipningen af proteinet med trypsin medfører en masse mindre peptider i størrelsesordnen Da (ca aminosyrer pr peptid). I denne protokol oprenses proteinet ikke inden det skæres, vi skærer det simpelthen inde i gelen og de mindre peptider diffunderer så ud i den omkringliggende væske (se Figur 3). Figur 3 Trypsin fordøjelse af udvalgt protein: 1) Et bånd udvælges fra SDS gelen og skæres ud med en skalpel. 2) Båndet skæres i mindre stykker for at få en større overflade på gelstykkerne. 3) Gelstykkerne vaskes flere gange i en acetonitril/vand blanding. Lige inden enzymet trypsin tilsættes, skrumpes gelen ekstra meget med 100% acetonitril, således at gelen kan opsuge så meget enzymblanding som muligt når det tilsættes. 4) Trypsin diffunderer ind i gelen og skærer proteinet i mindre peptider, som diffunderer ud af gelen og nu befinder sig i den vandige fase (i væsken). I det følgende forklares protokollen kort: 1) Man udvælger et bånd som principielt kun indeholder en slags protein. Dette bånd skæres ud af gelen. 7

8 2) Gelklumpen der nu indeholder det ønskede protein skæres i mindre stykker, så man får en større overflade. Dette er vigtigt, idet det skal være let at diffundere ind og ud af gelklumperne. 3) Gelklumperne vaskes i acetonitril, som er et organisk opløsningsmiddel, der skrumper gelen og dermed presser buffer, salte og coomassie farve ud af gelstykkerne (som når man vrider en svamp). Buffer og salte erstattes så af rent vand og acetonitril. Når gelklumperne er vasket 2 gange skrumpes de til sidst med 100% acetonitril, således at de er klar til at opsuge enzymet trypsin. 4) Trypsin tilsættes i en vandig buffer, som så opsuges af gelstykkerne, der svulmer op igen. Trypsin fordøjer vores protein, og de resulterende peptider diffunderer ud af gelstykkerne. Oprensning og opkoncentrering af peptider Når trypsin har skåret proteinet til peptider, findes peptiderne nu i den skæringsbuffer, der er omkring gelstykkerne, men denne væske indeholder også salte og andre stoffer, som vil forurene vores massespektrum. Derudover ønsker vi at have vores petider i et noget mindre væskevolumen, som vi så kan analysere. Derfor skal peptiderne nu oprenses og opkoncentreres. Dette gør vi på en μ-søjle (mikro-søjle, se Figur 4, venstre). Figur 4 Venstre: Hjemmelavet μ-søjle. Højre: Target plade hvorpå peptiderne sættes i en dråbe, efter oprensning og opkoncentrering. En μ-søjle er et meget tyndt rør, hvori der er en lille bitte smule materiale, der binder proteiner og holder dem tilbage, så man kan sortere peptiderne fra den væske de findes i. Protokollen beskrives kort i det følgende. Oprensning af peptider (illustreres i figur 5): 1) Peptiderne tilsættes til søjlen og fordi de hellere vil binde søjlematerialet end den vandige fase de er i, tilbageholdes de i søjlematerialet. 2) søjlen vaskes i en vandig opløsning af myresyre, der sikrer at peptiderne bliver siddende imens urenheder og salte vaskes væk. 3) peptiderne elueres, det betyder, at vi nu skyller peptiderne ud af søjlen ved at tilsætte noget, de hellere vil være i end søjlematerialet. I dette tilfælde er det opløsningsmidlet acetonitril (som vi 8

9 også brugte før til at skrumpe vores gel) iblandet vores matrix (beskrives under afsnittet Massespektrometri). Figur 5 Udsnit af den del af søjlen som indeholder søjlematerialet. Se forklaringerne på punkts 1-3 i teksten herover. Det 3. trin i protokollen, elueringen forgår direkte ud på MALDI target pladen, se figur 4 (højre). Der afsættes små dråber af peptidet, der nu er opløst i acetonitril og matrix i cirklerne på pladen, og efter at disse er tørret ind, kan prøverne behandles i massespektrometeret. Massespektrometri (MS) Principperne og apparaturet Når vi v.h.a. SDS har fået isoleret det ønskede protein og skåret det i peptider v.h.a. trypsin, er opgaven nu at få identificeret, hvilket protein vi har med at gøre. Hertil benytter vi massespektrometri, som er en meget følsom metode, hvor der kan arbejdes med prøvestørrelser på ned til picomol (10-12 mol). Derfor kan den ud over identifikation af proteiner også bruges til fx påvisning af pesticider i drikkevand og dopinganalyser. 9

10 Figur 6 Princippet i MALDI. Figur kopieret fra Rasmussen mfl. (2010) Proteiner oprensning og karakterisering. Gyldendal 4. udgave, 1. oplag Metoden bygger på, at molekylet under meget lavt tryk og ved høj temperatur bringes på gasform og dernæst ioniseres. I dette tilfælde bringes peptiderne på gasform ved at de indlejres i nogle krystaller, som absorberer laserens energi og omdanner den til varme når man skyder på peptiderne med en laser (se Figur 6 og 7). Idet matrixmolekylerne optager energien fra laseren eksploderer matrix krystallerne og slynger peptiderne ud i ioniseringskammerets vakuum. Her fordamper resten af matrix fra peptiderne og efterlader peptidet med en eller flere positive ladninger. Figur 7 Matrix (gul) med peptider (rød) indlejrede. Matrix eksploderes af laserens energi, således at peptiderne kommer op at svæve (kommer på gasfase) og får en positiv ladning. Figur venligst stillet til rådighed af Peter Højrup (professor ved Institut for Biokemi og Molekylærbiologi, SDU) Den kemiske ændring der sker med peptiderne, kan beskrives som følger: X (matrix) + M (prøve) + laser XH + + X + MH + 10

11 Herefter accelereres de ladede peptider ved at de udsættes for en spænding i flyverøret (se Figur 6), som trækker i deres positive ladning. Princippet er, at jo større et molekyle er, des lavere bliver dets hastighed, hvis det bliver trukket i med samme spænding. Det vil sige, at analysatoren (flyverøret) separerer de dannede ioner efter deres masse/ladningsforhold (m/z). Når de rammer detektoren, registreres deres flyvetid, og deres masse over ladning (m/z) beregnes. Resultatet vises i et spektrum hvor ioner (MH + ) med en bestemt m/z værdi vises som toppe med forskellig højde/intensitet (alt efter hyppigheden af ionen). MH + ionerne kaldes molekylærionerne. Peptidernes molekylær ioners (MH + ) vægt er præcis den, som kan beregnes ud fra deres aminosyresammensætning + 1 Dalton, (1 Dalton er vægten af en proton) som stammer fra den positive ladning peptidet modtog fra matrix. Ud over MH + ionen kan der også være række andre ioner som stammer fra at peptidet (eller hvad der nu analyseres) brydes op under ioniseringen (altså i ionkilden, se Figur 7). Disse ioner kan anvendes til at bestemme stoffets sammensætning, på samme måde som vi kan bestemme et protein ud fra dettes peptidsammensætning (se spektrum i Figur 8). Metoden kan ses live på nedenstående link, så du kan danne dig et overblik over metoden. Link 1 viser MS mere generelt, hvor ionerne afbøjes i deres bane og ud fra denne afbøjning identificeres, mens link 2 viser ideen i time-of-flight (TOF) som MALDI benytter sig af: 1. MS mere generelt (7,59 min) 2. TOF metoden (0,43 min) Videre analyse af proteinet: Når man ved hjælp af MALDI MS har fundet den eksakte molekylevægt på peptiderne sin peptidblanding, så kan denne data overføres til en række internetbaserede databaser, hvor der ligger information om utroligt mange molekyler, heriblandt proteiner. Så samholder man sin peptidsammensætning med databasen over teoretiske peptidstørrelser, som er beregnet ud fra kendskabet til proteinernes aminosyresekvens. På denne måde sammenligner man informationerne om sit eget protein (dettes peptid masse mønster), med databasen over alle kendte peptider på samme måde som man vil bruge et fingeraftryk i en forbryderdatabase. og her fra stammer så navnet på metoden: Peptid masse fingeraftryk (PMF) Hvis det er et helt ukendt protein man analyserer, altså et der ikke er sekventeret eller annoteret 6 endnu, er det stadigt muligt at få oplysninger om primær-, sekundær- og tertiær struktur, hydrofobe- samt hydrofile områder i molekylet og en masse mere, hvilket kan bringe en på sporet af nøjagtigt hvilket protein, man har isoleret og analyseret. Eller, informationerne kan give fingerpeg om, hvad det ukendte protein evt. kan have for funktion i en celle eller et organ. Dette kan være interessant f.eks. i forbindelse med giftstoffer eller udvikling af lægemidler. 6 Annoteret betyder at man ud fra Proteinets DNA sekvens har kategoriseret det som værende et bestemt protein, baseret på at dets sekvens ligner allerede kendte sekvenser fra undersøgte proteiner. 11

12 Øvelsesopgave 1: Identifikation af insulintype ved MALDI MS Følgende er et MALDI MS massespektrum fra et ukendt insulin. Ud fra vores teoretiske viden om insulins protein sekvens i forskellige organismer, kan vi identificere hvilket insulin der er tale om. Spørgsmål a Herunder er listet 4 rå aminosyre sekvenser på 4 insuliner. Skær insulinerne med trypsin (efter R og K, men ikke efter KP eller RP) og identificer dem i forhold til tabellerne med peptid sekvenser herunder. 1) MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGG GPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN Insulinsekvens stammer fra 2) MAPPQHLCGSHLVDALYLVCGDRGFFYNPKGIVDQCCHRPCDIFDLQNYCN Insulinsekvens stammer fra 3) MALWMQCLPLVLVLLFSTPNTEALANQHLCGSHLVEALYLVCGDRGFFYYPKIKRDIEQAMG Insulinsekvens stammer fra 4) MAALWLQSVSLLVLLIVSWPGSQAFTPPQHLCGSHLVDALYLVCGDRGFFYNPKRDVDPLMG FLPPKADGAAGAGGENEVAEFAFKDQMEMMVKRGIVEQCCHKPCNIPVLQNYCN Insulinsekvens stammer fra Sekvenser af peptider skåret med Trypsin: > insulin - cod (TORSK) Område i sekvens MH+ Sekvens GFFYNPK GIVDQCCHRPCDIFDLQNYCN MAPPQHLCGSHLVDALYLVCGDR > insulin - Xenopus (FRØ) Område i sekvens MH+ Sekvens R IK DIEQAMG GFFYYPK MALWMQCLPLVLVLLFSTPNTEALANQHLCGSHLVEALYLVCGDR 12

13 > insulin - Micropterus salmoides (KARPE) Område i sekvens MH+ Sekvens R R GFFYNPK DQMEMMVK DVDPLMGFLPPK ADGAAGAGGENEVAEFAFK GIVEQCCHKPCNIPVLQNYCN MAALWLQSVSLLVLLIVSWPGSQAFTPPQHLCGSHLVDALYLVCGDR > insulin - Homo sapiens (MENNESKE) Område i sekvens MH+ Sekvens R R TR MALWMR GFFYTPK GIVEQCCTSICSLYQLENYCN EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQK LLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGER Spørgsmål b Hvilket dyr stammer nedenstående insulinspektrum fra: 13

14 Figur 8 Masse spektrum optaget med MALDI MS Spektret stammer fra: Andre massespektrometriske metoder Ved anvendelse af det MALDI-MS apparatur der bruges i vores forsøg, kan man ikke måle molekyler der er meget mindre end 500 Da. Men der findes andre typer massespektrometri, som typisk bruges i kemien til at identificere strukturen af ukendte eller nysyntetiserede kemiske stoffer (f.eks. aktive stoffer til nye lægemidler). Denne type massespektrometri frembringer en anden type spektre hvor toppene typisk ligger indenfor 150 Da. Som eksempel på et spektrum kan vi se på methanol (CH 3 OH), som er vist på Figur 9, og vi vil koncentrere os om de vigtigste toppe i spektret: 14

15 1. Den mest intense top har en m/z på 31, og de andre toppe er afbilledet relativt til denne. 2. Toppen på m/z 32 er vores molekylar-ion (M + ): CH 3 OH Denne ion er ustabil og vil fragmenteres på to måder og bliver til: m/z 15 CH 3 + og m/z 31 CH 2 OH + 4. Sidstnævnte ion kan igen fragmenteres og blive til: m/z 29 CHO + Dvs at et massespektrum giver informationer om, hvilke atomer eller atomgrupper, der indgår i molekylet samt stoffets molare masse. Figur 9 Methanols massespektrum, fra NIST Chemistry WebBook ( Isotoper: Et massespektrum kan også give information om et molekyle består af atomer, der findes som forskellige isotoper, og vi vil her kigge på et simpelt molekyle som HCL (se Figur 10) Man ser her 4 toppe på trods af, at det er et ret simpelt molekyle, der er analyseret, hvilket skyldes, at massespektrometeret kan skelne mellem ioner, der består af forskellige isotoper af samme grundstof. I dette tilfælde er det klor, der er tale om, da det i naturen findes som en blanding af isotoperne 35 Cl og 37 Cl i forholdet 3:1. Når man kigger på spektret, ser man derfor den mest intense top som m/z 36 (M + ), der skyldes H 35 Cl, som er ca. 3 gange så stor som m/z 38, der skyldes H 37 Cl. Den hyppigst forekommende isotop benyttes altid til beregning af M +. Hvis man slår den molare masse op for HCL så angives den til 36,461 g/mol, altså ikke som hverken 15

16 36 eller 38 g/mol. Det skyldes, at den molare masse angives som en middelværdi af de to isotopers masser i forhold til deres forekomst i naturen. Figur 10 Hydrogenchlorids (HCl) massesketrum ( Øvelsesopgave 2: Molekylebestemmelse ud fra massespektrometri Ud fra nedenstående spektrum, Figur 11, samt Figur 12 (hvor man ser typiske ionserier for en række funktionelle grupper), skal du forsøge at tyde spektret og angive hvilket molekyle, som er blevet analyseret vha. MS: Figur 11 Ukendt stof?? ( 16

17 Figur 12 Tabellen viser ionserier for en række funktionelle grupper, som består af en basision samt andre typiske toppe. Tabel kopieret fra S.U. Pedersen mfl. (2003) Spektroskopi molekylernes fingeraftryk. Kemiforlaget. 1. udgave, 1. oplag Litteraturliste L. Rasmussen mfl. (2010) Proteiner oprensning og karakterisering. Gyldendal 4. udgave, 1. oplag. K.C. Torp (2007) Biokemibogen liv, funktion, molekyle. Nucleus 1.udgave, 1. oplag. S.U. Pedersen mfl. (2003) Spektroskopi molekylernes fingeraftryk. Kemiforlaget. 1. udgave, 1. oplag. Billeder Animationer SDS-page 17