NF-light (Neurofilament light) ELISA

Transkript

1 Brugsanvisning NF-light (Neurofilament light) ELISA Kvantitativt immunassay til bestemmelse af humant neurofilament light (NF-L) protein i cerebrospinalvæske. Antistofferne krydsreagerer med neurofilament light fra rotte, ko og makakabe, og kan anvendes til forskning af disse dyrearter x8 2-8 C EU: U.S.: For research use only Not for use in diagnostic procedures UmanDiagnostics AB Box 7996 Phone: +46(0) info@umandiagnostics.com Umea, Sweden Brugsanvisninger på andre sprog kan downloades på virksomhedens website.

2 Tilsigtet anvendelse Dette immunassay kan anvendes til kvantitativ bestemmelse af humant neurofilament light (NF-L) protein i cerebrospinalvæske. Antistofferne krydsreagerer med neurofilament light fra rotte, ko og makakabe og kan anvendes til forskning af disse dyrearter. Introduktion UmanDiagnostics NF-light (neurofilament light) assay er et enzymatisk immunassay beregnet til kvantitative bestemmelser af NF-light i human cerebrospinalvæske. Testen gør brug af to meget specifikke ikkekompetitive monoklonale antistoffer (Norgren et al, 2002). Neurofilamenter udgør den største del af cytoskelettet i neuronale celler. De er vigtige for at bibeholde aksonernes volumen og morfologiske integritet, som påvirker hastigheden og nøjagtigheden af neuronale transmissioner. Der findes tre forskellige slags neurofilamentkæder, som har fået navn efter deres størrelse., Det er henholdsvis neurofilament light, medium og heavy. Neurofilament light udgør rygraden, som de øvrige kædetyper binder til og danner neurofilamentfibre (Lee et al, 1993). Som følge af skader på nerveceller, afhængig af om det er direkte trauma eller langsomme degenerative processer, kan nervecellernes indhold frigøres til det omgivende væv. Dette gør det muligt kvantitativt at bestemme mængderne af de aksonale proteiner. Forhøjede niveauer af neurofilament light er blevet vist hos forskellige degenerative sygdomme, såsom amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers sygdom, multipel sklerose, og i visse typer dyremodeller, såsom kronisk eksperimentel autoimmun encefalomyelit (Rosengren et al., 1996; Norgren et al., 2003, 2004, 2005). Dette assay er et 2-site solid phase sandwich ELISA. Et af de specifikke monoklonale antistoffer er coatet på en fast overflade og binder neurofilament light. Detektionen gennemføres ved anvendelse af et andet specifikt monoklonalt antistof, som er konjugeret. De kvantitative bestemmelser udføres enzymatisk, hvor et farveløst substrat omdannes til et farveprodukt, som svarer til mængden af neurofilament light i prøven. Måleområde: 100 pg/ml pg/ml Detektionsgrænse: 32 pg/ml Præcision: Intra-assay CV% < 5 Inter-assay CV% < 9 Inkubationstid: 2,5 timer Prøvevolumen: 50 L/replikation Opbevaringstemperatur: 2-8 C. Holdes væk fra varme eller direkte sollys. Opbevaringstid: 18 måneder fra produktionsdato. NF-light strip-pladen skal bruges indenfor fire uger efter åbning af forpakningen. Det skal sikres, at den åbnede strip-plade pakke er forsvarligt lukket for at undgå fugtighed under opbevaring. Advarsler og forholdsregler 1. Udelukkende til in vitro-diagnostisk brug. Det er kun beregnet til professionel anvendelse. 2. Læs anvisningerne grundigt og fuldstændigt, inden assayet udføres. Benyt den medfølgende korrekte version af indlægssedlen fra kittet. Vær sikker på, at du forstår det hele. 3. Hvis kittets emballage er svært beskadiget, kontaktes forhandler skriftligt inden for en uge efter modtagelsen af kittet. Brug ikke beskadigede komponenter. Opbevar beskadigede komponenter med henblik på reklamationsrelaterede spørgsmål. 4. Bland ikke reagenser fra forskellige lots. Benyt ikke reagenser, som har overskredet udløbsdatoen. 5. Anvend det vedlagte 15 ml Sarstedt-rør ( ), når konjugatopløsningen klargøres. 6. Det tilrådes at køre prøver, kontroller og standarder som dobbeltanalyser. Hvis der forekommer signifikante afvigelser mellem prøverne, skal analysen tages om. 7. Følg god laboratoriepraksis og sikkerhedsanvisninger. Benyt laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når det er påkrævet. 8. Undgå kontakt med stopreagenset. Det kan forårsage hudirritationer og forbrændinger. Sikkerhedsdatabladet for produktet er tilgængeligt og sendes på begæring direkte fra UmanDiagnostics. Version Dansk 1 (7)

3 9. Kemikalier og klargjorte eller anvendte reagenser skal behandles som farligt affald ifølge nationale sikkerhedsregler og bestemmelser for håndtering af biologisk smitsomt materiale. 10. Benyt en roterende ELISA pladeryster (bordmodel) ved 800 o/m. Kit indhold: Indhold Kit-komponent Mængde Pladelåg 2 stk. 15 ml rør til konjugatfortynding 2 stk. PLATE Precoatet, vacuumpakket anti-nf-light Strip-plade 12 x 8 brønde STOP Stopreagens 1 x 6 ml TMB Færdigblandet TMB-substrat 1 x 12 ml SAMDIL Prøvefortyndingsbuffer 1 x 40 ml CONDIL Konjugatfortyndingsbuffer 1 x 12 ml CONJ Streptavidin-HRP-konjugatkoncentrat 1 x 260 L 50xTRAC Biotin-mærket anti-nf-l mab-koncentrat (50x) 1 x 260 L STAND Bovint NF-L-koncentrat, frysetørret 2 hætteglas 10xWASH Vaskebufferkoncentrat (10x) 2 x 40 ml Kromogen og stopreagens: Enzym: Peberrodsperoxidase (horse radish peroxidase) Substrat: Tetramethylbenzidin, TMB Stopreagens: H2SO4 8 % v/v (OBS! Ætsende) Nødvendigt udstyr, der ikke er inkluderet: Mikrotiterpladelæser 450 nm (reference bølgelængde nm) Mikropipetter L Vortex-blander Roterende ELISA pladeryster (bordmodel) (800 o/m) Afioniseret vand Vaskeflaske, automatiseret eller halvautomatiseret mikrotiter plade-vaskesystem Absorberende papir, pipettespidser og timer Polystyren- eller polypropylenrør til standard- og prøvefortyndinger Vigtig information: Anvend kun det vedlagte 15 ml rør, når der klargøres konjugatopløsning. Testens egenskaber Prøvetyper NF-light ELISA-testen er udviklet til analyse af cerebrospinalvæskeprøver og kan i den nu aktuelle udformning ikke benyttes til analyse af blodprøver. Temperaturafhængighed Assayet er udviklet til stuetemperatur (20 25 C). Måleområde Standardkurven omfatter intervallet pg/ml NF-L (se kurve på side 7). Ekstrapolering uden for kurven er ikke tilladt og prøver med værdier uden for kurven skal fortyndes yderligere og måles igen. Klargøring af reagenser Vaskebuffer Fortynd hele indholdet af flasken med 10x vaskebufferkoncentrat med afioniseret vand til en slutvolumen på 400 ml. Ubrugt ufortyndet vaskebuffer kan opbevares ved stuetemperatur og skal bruges inden for 2 måneder.10x vaskekoncentratet kan synes opaliserende pga. den høje saltkoncentration (ingen indvirkning på assayresultatet). Version Dansk 2 (7)

4 Standarder Rekonstituering og klargøring af standardfortyndingsserien skal gøres umiddelbart før anvendelse. Det højeste standardpunkt ( pg/ml) fås ved, at et hætteglas med frysetørret standard rekonstitueres med den volumen af prøvefortynder, der er indikeret på flaskens mærkat. Vortex-bland kortvarigt og opbevar ved stuetemperatur. Mærk 6 mikrorør, et for hvert standardpunkt (dvs pg/ml, pg/ml, pg/ml, 500 pg/ml, 100 pg/ml and 0 pg/ml). Fortynd standarden ifølge nedenstående fortyndingsskema: Standardfortynding: Rør nr. Prøvefortynder Standard fra rør nr. Koncentration pg/ml hætteglas Rekonstituér med prøvefortynder (SAMDIL) ifølge mærkningen på standardhætteglasset L 300 L (hætteglas) L 300 L (1) L 240 L (2) L 300 L (3) L 60 L (4) L 0 L 0 Rekonstitueret standard skal anvendes umiddelbart og kan derefter ikke genanvendes. Tracer Umiddelbart inden anvendelse fortyndes den koncentrerede tracer (50x TRAC; biotin anti NF-L mab)) 1:50 med prøvefortynder. Bland grundigt ved at vende røret eller ved at vortex-blande det. Konjugat Umiddelbart inden anvendelse fortyndes det koncentrerede konjugat (CONJ; Streptavdin-HRP konjugatkoncentrat) i det vedlagte Sarstedts 15 ml rør ifølge mærkningen på hætteglasset med konjugatfortynder. Bland grundigt ved at vende røret eller vortex-bland det. Version Dansk 3 (7)

5 Assay-anvisninger Alle assay-reagenser skal være stuetempererede inden anvendelse. Efter hver vaskecyklus skal pladen slås tør mod absorberende papir. Det er MEGET VIGTIGT, at pladen rystes ved 800 o/m. 1. Fortynd cerebrospinalvæskeprøverne med samme mængde (1+1) prøvefortynder til en samlet minimumsvolumen på 210 L. De rekonstituerede og fortyndede standarder ifølge standardfortyndingstabellen er klar til anvendelse (dvs. ingen yderligere fortynding nødvendig). 2. Vask brøndene, der skal benyttes, med vaskebuffer (3x300 L). Den tilsatte vaskebuffer kan enten aspireres eller fjernes ved at slå pladen mod absorberende materiale umiddelbart før næste vaskecyklus. 3. Tilsæt 100 L af hver standard og prøve i duplikat. Inkubér på pladeryster (800 o/m) ved stuetemperatur (20-25 C) i 1 time. 4. Vask brøndene med vaskebuffer (3x300 L), se punkt Tilsæt 100 L nyfortyndet tracer (biotin anti-nf-l) antistof til hver brønd. Inkubér på pladeryster (800 o/m) ved stuetemperatur (20-25 C) i 45 minutter. 6. Vask brøndene med vaskebuffer (3x300 L), se punkt Tilsæt 100 L nyfortyndet konjugat (streptavidin-hrp) til hver brønd. Inkubér på pladeryster (800 o/m) ved stuetemperatur (20-25 C) i 30 minutter. 8. Vask brøndene med vaskebuffer (3x300 L), se punkt Tilsæt 100 L TMB til hver brønd. Inkubér på pladeryster (800 o/m) ved stuetemperatur (20-25 C) i 15 minutter. 10. Tilsæt 50 L stopreagens til hver brønd og aflæs absorbansen ved 450 nm (referencebølgelængde nm). Stopreagenset indeholder ufortyndet svovlsyre og er ætsende. Ændringer i assayets udførelse eller egenskaber Eventuelle formodede ændringer i assayets udførelse og egenskaber er beskrevet i den medfølgende kitspecifikke brugsanvisning. Prøver Cerebrospinalvæskeprøverne må ikke være kontaminerede med blod. Alle patientprøver skal også betragtes som potentielt smitsomme. Efter lumbalpunktur skal prøverne opbevares ved -80 C i polypropylenrør. Undgå at fryse/tø prøverne flere gange. Prøvestabilitet Prøvestabiliten er vurderet i 5 forskellige kliniske prøver. Prøvernes reaktivitet efter forskellige behandlinger blev sammenlignet med den oprindelige prøve som var opbevaret ved -80 C. Middelværdi i % Middelværdi i % range af -80 C kontrol Frys-tø 4 cyklusser Opbevaring 5-8 C 1 uge 99, timer ved RT (22 C) C ved 1 måned 95, Version Dansk 4 (7)

6 Resultater Resultaterne kan beregnes automatisk ved at benytte en immunassay-software. En 4-parameter Marquardt transformation giver den bedste kurvetilpasning (se en typisk standardkurve nedenfor). Hvis denne type immunassay-software ikke er tilgængelig, kan koncentrationen af NF-L beregnes ved at plotte middelabsorbans (OD) ved ( 450 minus 620) mod de kendte standardkoncentrationer. Alle testniveauer fås direkte fra immunassay-softwaren, eller fra den manuelt plottede kurve. De prøver, der giver koncentrationer over det højeste standardpunkt, skal fortyndes og analyseres igen. Når en prøve med forventede niveauer over standardkurven analyseres igen, skal prøven først fortyndes med en lige mængde prøvefortynder i henhold til punkt 1 i analyseanvisningerne. Dette skal efterfølges af endnu en behørig fortynding, der gør det muligt for koncentrationen at nå de niveauer, der er dækket af standardkurven. Koncentrationen, der aflæses fra kurven, skal ganges med fortyndingsfaktoren, der blev anvendt i andet trin. De bedste resultater nås sædvanligvis, når målinger i de laveste og højeste standardværdiområder udelades. De opnåede værdier fra standardkurven svarer direkte til NF-L-niveauet. Standardkurva 3 Medel OD NF-L [pg/ml] 4-parameter Marquardt transformation Forventede værdier Cerebrospinalvæske værdier fra 50 raske forsøgspersoner uden tegn på neurologisk sygdom blev undersøgt. Normalværdierne blev målt til at være mellem 112 og 821 pg/ml. De raske forsøgspersoner blev inddelt i tre aldersgrupper og referenceniveauerne blev defineret som middelværdien NF-L-niveau + 2 SD. Alder Referenceværdi < 30 år < 290 pg/ml (n=17) år < 380 pg/ml (n=15) 40 - <60 år < 830 pg/ml (n=18) Resultaterne er kun gyldige, hvis analysen udføres i henhold til de medfølgende anvisninger, og skal korreleres til andre kliniske observationer og diagnostiske tests. Brugeren skal følge GLP (god laboratoriepraksis) eller andre gældende standarder/love meget nøje. Det anbefales, at hvert laboratorium etablerer egne normalværdier samt benytter egne prøver med kendte neurofilament light-niveauer som interne kontroller. Version Dansk 5 (7)

7 Udførelse Analytisk følsomhed (Detektionsgrænse) Præcision Intra-assay Inter-assay Genindvinding efter spiking Liniaritet 32 pg/ml LOB+1,645x SD (100 pg/ml standard) Lav (250 pg/ml) Høj (5.000 pg/ml) 4,8 % CV 3 % CV 9,1 % CV 3 % CV 250 pg/ml 500 pg/ml pg/ml 88,4 % Område pg/ml 91,0 % Seriefortynding 1:128 98,7 % Område 93,4 109 % Middelværdi Præcision 4 % CV 6 % CV Middel genindvinding 93 % Middel genindvinding 99,8 % Garanti De resultater, der er præsenteret her, er blevet opnået ved at benytte den angivne procedure. Ændringer eller modificeringer af proceduren, der ikke anbefales af UmanDiagnostics AB, kan påvirke resultatet. Hvis det er tilfældet, frasiger UmanDiagnostics AB sig alle garantier som er udtrykt, underforståede eller lovpligtige, herunder den underforståede garanti for salgbarhed og egnethed til brug. UmanDiagnostics AB og dets autoriserede forhandler kan ved sådanne omstændigheder ikke gøres ansvarlige for skader, det være sig direkte eller indirekte eller som en konsekvens af assayets gennemførelse. Referencer: Lee MK, Xu Z, Wong PC, Cleveland DW. Neurofilaments are obligate heteropolymers in vivo. J Cell Biol Sep;122(6): Norgren N, Karlsson JE, Rosengren L, Stigbrand T. Monoclonal antibodies selective for low molecular weight neurofilaments. Hybrid Hybridomics Feb; 21(1): 53-9 Norgren N, Rosengren L, Stigbrand T. Elevated neurofilament levels in neurological diseases. Brain Res Oct 10;987(1): Norgren N, Sundstrom P, Svenningsson A, Rosengren L, Stigbrand T, Gunnarsson M. Neurofilament and glial fibrillary acidic protein in multiple sclerosis. Neurology Nov 9;63(9): Norgren N, Edelstam A, Stigbrand T. Cerebrospinal fluid levels of neurofilament light in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res Bull Oct 30;67(4): Rosengren LE, Karlsson JE, Karlsson JO, Persson LI, Wikkelso C. Patients with amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases have increased levels of neurofilament protein in CSF. J Neurochem Nov;67(5): Version Dansk 6 (7)

8 Symboler Katalognr. Sidste anvendelsesdato: Lotnummer Antal tests In vitro-diagnostisk medicinsk udstyr Læs brugsanvisningen før anvendelse Holdes væk fra varme eller direkte sollys Opbevares ved: Producent Forsigtig! Version Dansk 7 (7)