Lipid Interference ved IgG analyser på ImmunoCAP 250

Transkript

1 KLINISK BIOKEMISK AFDELING SLAGELSE SYGEHUS Lipid Interference ved IgG analyser på ImmunoCAP 250 Bachelorprojekt Rikke Uth Rasmussen Antal tegn uden mellemrum (Eksklusiv forside, forord, indholdsfortegnelse, litteraturliste og bilag)

2 Forord Tak til Klinisk Biokemisk Afdeling Slagelse og dennes personale, hvor forsøget foregik. Tak til Klinisk Biokemisk Afdeling Nykøbing Falster for hjælp i forbindelse med indsamling af prøvemateriale. Tak til Phadia 250 for sponsorat af ImmunoCAP 250 kopper/brønde til forsøget. Tak til mine vejledere i forbindelse med forsøget og rapportskrivningen Ida Enø Jensen og Charlotte Topsøe Voigt. Tak til min medstuderende Armend Salihu, som forsøget blev udarbejdet i samarbejde med. Billedet fra forsiden er fra Phadia

3 Indholdsfortegnelse Abstract... 5 Introduktion... 6 Problembaggrund... 6 Problemformulering... 7 Systemisk lupus erythematosus detekteres af ANA... 8 Sklerodermi detekteres af ANA... 8 Polymyositis/dermatomyositis detekteres af ANA... 8 Mixed Connective Tissue Disease(MCTD) detekteres af ANA... 8 Rheumatoid arthritis (RA) detekteres af CCP... 9 Mikroskopisk polyangitis detekteres af MPOs og Granulomatosis med Polyangiitis detekteres af PR3s Antigen antistof analyseprincippet kemi og bindinger... 9 Kunstig lipid versus naturlig lipid Metodevalg Valg af prøvemateriale og antal prøver Lipid type og HIL indeks Valg af databehandling Materialer og Metode Apparater Analyse Wells Fælles reagenser for ANA, CCP, MPOs og PR3s Fælles Kalibratorer: Fælles Kurvekontroller: Fælles Interne kontrol Fælles Eksterne kontrol Metode Pilotforsøg CV% Forsøg Holdbarhedsforsøg Resultater ANOVA for ANA, CCP, MPOs og PR3s Bonferroni korrigeret T-test ANA Differensplot

4 ANA Kappa CCP Differensplot CCP Kappa MPOs Differensplot MPOs Kappa PR3s Differensplot PR3s Kappa Pilotforsøg Intra serial CV% Holdbarhedsforsøg Diskussion Diskussion ANA ANOVA Diskussion ANA Kappa Diskussion ANA Differensplot Diskussion CCP ANOVA Diskussion CCP Kappa Diskussion CCP Differensplot Diskussion MPOs Diskussion PR3s Diskussion Impræcision Diskussion Interferens Diskussion Holdbarhedsforsøg KONKLUSION Litteraturliste Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag

5 Abstract Introduktion I dette forsøg er foremålet at undersøge lipids indflydelse på analyserne ANA, CCP, MPOs og PR3s, da Producenten Phadia 250 i deres indlægssedler skriver at lipæmiske patient serum prøver ikke må analyseres på grund af interferens fra lipid, der kan give ukorrekte analyseresultater. Metode Den eneste mulighed der var for at undersøge om lipid havde en indflydelse på de immunkemisk metoder, var at bruge intralipid, en fedt emulsion som bruges til paraentheral ernæring. Ved at sammenligne analyseresultater for ANA, CCP, MPOs og PR3s serumprøver med 0µL kunstig lipid tilsat, med 6µL kunstig lipid tilsat og med 30µLkunstig lipid tilsat. Kunne det undersøges om kunstig lipid har en indflydelse på ImmunoCAP 250's analyser. Analyseresultaterne blev behandlet med Differensplot, Kappa og ANOVA, da analyseresultaterne både var kategoriske data og kvalitative data. Resultater Der var ved 3 af analyserne CCP, MPOs og PR3s ingen signifikant forskel i ANOVA analyseresultaterne. Ved ANA var der derimod en P-værdi på 0,01 og dermed måtte hypotesen, om at der ikke var en forskel på analyseresultater uden og med de 2 koncentrationer lipid, forkastes. Ved Kappa var der for alle resultater en god eller næsten perfekt overensstemmelse imellem resultaterne. Ved differensplottet sås ved ANA L0/L30 en tendens til at serum patient prøverne med Lipid 30µL konsekvent havde et højere analyseresultat en d lipid 0µL. Konklusion Der er ifølge ANOVA signifikant forskel på analyseresultaterne ved ANA lipid 0µL og lipid 30µL. Kappa siger dog der er god overensstemmelse imellem analyseresultaterne, da der kun er få prøver der skifter kategori. Der kan på grund at et meget lille prøveantal ved MPOs og PR3s ikke drages nogen konklusioner, da der skal flere serum patient prøve resultater til at kunne drage en valid konklusion. Ved CCP databearbejdningen sås ingen signifikant forskel på analyseresultaterne med og uden lipid. 5

6 Introduktion På Klinisk Biokemisk Afdeling på Slagelse Sygehus blev der i 2014 lavet Anti-Nukleære Antistof analyser, Anti cyclic citrunatede peptide analyser, Anti-Neutrofilocyt-Cytoplasma-Antistof myeloperoxidase analyser og Anti-Neutrofilocyt-Cytoplasma-Antistof Anti proteinase 3 analyser. (Petersen, 2015) Da analyserne der indgår i forsøget kan gå under forskellige navne beskrives navnene de kort herunder, og hvilken betegnelse der er valgt i denne opgave. Anti-Nukleære Antistof analysen kaldes både Anti-CTD og ANA, her er valgt igennem hele opgaven at kalde den ANA. Anti cyclic citrunatede peptide analysen kaldes både Anti-CCP og CCP, her er valgt CCP. Anti-Neutrofilocyt-Cytoplasma-Antistof myeloperoxidase analysen kaldes både ANCA MPOs, MPS og MPO, her er valgt betegnelsen MPOs. Anti-Neutrofilocyt-Cytoplasma- Antistof Anti proteinase 3 analysen kaldes bland andet ANCA PR3, PR3s og PRS, her er valgt betegnelsen PR3s. Der bliver i opgaven skrevet om den samme serum patient-prøve uden tilsat lipid og med 2 koncentrationer af lipid tilsat. I opgaven vil serum patientprøven uden tilsat lipid enten blive refereret til som Lipid 0µL eller som L0. Serumpatientprøven med den laveste tilsatte koncentration lipid, som er på 6µL, vil enten blive refereret til som Lipid 6µL eller som L6. Serum patient prøven med den højeste tilsatte koncentration lipid vil blive refereret til som Lipid 30µL eller L30. Problembaggrund På Indlægssedlerne fra Phadia 250, til Elia modul reagenssystem for ANCA, ANA og CCP analyserne, er der i den nyeste indlægsseddel lavet ændringer, hvor der under "Prøvetagning, -håndtering og klargøring" står følgende: ((Phadia 250a, 2014) (Phadia 250b, 2014) (Phadia 250c, 2014) (Phadia 250, 2011)) "Proceduren kan udføres med serum eller plasmaprøver. Lipæmiske, hæmolyserede eller mikrobielt forurenede prøver kan give dårlige resultater og må ikke bruges." Der er i dette forsøg og i den efterfølgende rapport kun fokuseret på lipæmiske serum patient prøver. På Klinisk Biokemisk Afdeling Slagelse analyseres fortsat lipæmiske prøver. Det er derfor ikke muligt på baggrund af indlægssedlernes ordlyd at være sikker på, at analyseresultater for lipæmiske patient prøver er 6

7 validt i forhold til diagnostisk brug, desværre er der på indlægssedlerne ingen dokumentation for hvorfor det er problematisk. I artiklen af N. Nikolac et. al. "Heterogeneity of manufacturers' declarations for lipemia interference - An urgent call for standardization" står der blandt andet at producenterne er forpligtet af Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) til at oplyse resultaterne af deres interferens studier. (Nikolac, 2013) Ikke at skulle kassere lipæmiske serum patient prøver, vil være til gavn for patienter under udredning, da de ikke skal have taget blodprøven om og de hurtigere kan få svar på deres analyser. For lægerne er det en fordel hvis lipæmiske prøver kan analyseres, og at den diagnostiske validitet ikke er et problem, da andre undersøgelser og eventuel behandling dermed ikke forsinkes. For Klinisk Biokemisk Afdeling Slagelse er der besparelser på materialer i forbindelse med prøvetagning, samt personaleforbrug, både til prøvetagning, men også i laboratoriet, da prøven håndteres helt frem til ImmunoCAP 250, hvor der bruges tid på at vurdere om prøven kan analyseres eller skal kasseres. Dette videnskabelige forsøg vil hjælpe til at kunne bekræfte eller afkræfte ovenstående citat fra Phadia 250. ((Phadia 250a, 2014) (Phadia 250b, 2014) (Phadia 250c, 2014) (Phadia 250, 2011)) Problemformulering Hvilke signifikante forskelle ses ved analyseringen af serum patient prøver ved ANA, CCP, MPOs og PR3s, på ImmunoCAP 250, ved tilsætning af kunstig lipid emulsion? Vil eventuelle kategoriskift fra negativ til tvivlsom, tvivlsom til positiv eller omvendt være klinisk relevante? 7

8 Systemisk lupus erythematosus detekteres af ANA Systemisk lupus erythematosus (SLE)har en prevalence på imellem pr Det er primært yngre og midaldrende kvinder der får sygdommen og deres chance for at få den er 9 gange større end for mænd. Årsagen til sygdommen er ukendt og det er vanskeligt at stille diagnosen. Den stilles ud fra symptomer, tegn og ANA anlysen. Der er en kronisk betændelsessygdom i bindevævet. Symptomer kan være fra hud, led, blodårer og nyrer. Det er vigtigt at patienten diagnosticeres tidligt da behandling kan reducere sygelighed og risiko for tidlig død. Målet med behandlingen er at mindske risikoen for gentagen betændelse i vævet og blodpropper i forskellige organer. (Baslund, 2015) Sklerodermi detekteres af ANA Ved sygdommen sklerodermi producerer kroppen for meget bindevæv. Der findes 2 former, en der primært rammer huden og en der også rammer led, muskler, blodkar, mavetarmkanal, hjerte, lunger og nyrer. Sygdommen starter ofte i års alderen og der er hvert år nye tilfælde pr. 1 million indbyggere, det er en sjælden sygdom. (Søndergaard, 2012) Polymyositis/dermatomyositis detekteres af ANA Det er en sjælden sygdom, det vides ikke præcis hvor mange der rammes af den hvert år, men det vurderes at det er cirka personer om året. Sygdommen rammer oftest kvinder og er en kronisk betændelse i skeletmuskulaturen. Den kan optræde som en primær sygdom eller som symptom på andre bindevævssygdomme eller kræft. Symptomerne er nedsat kraft i overarme, lårmuskler på grund af kronisk betændelse i muskulaturen. Der kan være andre symptomer, som udslet i ansigtet/hænder, kortåndethed og feber. (Gigtforeningen, 2013a) Mixed Connective Tissue Disease(MCTD) detekteres af ANA Symptomerne overlapper med ovenstående sygdommes, men for at have MCTD skal der være antistof markøren U1RNP i blodet, som detekteres af ANA. Symptomerne er kolde og hvide hænder, fingre og tæer. Ledbetændelse og hævede fingre. Derudover muskelbetændelse og gigtbetændelse i lungerne som rammer cirka 20-30% af MCTD patienterne. (Gigtforeningen, 2013b) 8

9 Rheumatoid arthritis (RA) detekteres af CCP Der diagnosticeres cirka 1700 nye tilfælde hvert år og sygdommen opstår som regel i alderen 30 til 60 år og kvinder rammes 3 gange så hyppigt som mænd. Årsagen til sygdommen kan være mange forskellige faktorer for genetisk disponerede personer. Det er en kronisk inflamatorisk sygdom som fører til knogle erosion, ødelæggelse af brusk. Dette fører til destruktion af led, nedsat livskvalitet og øget mortalitet. Tidlig behandling er en vigtig forudsætning for en god prognose, men diagnosen er en udfordring. (Baslund et al. 2014) Mikroskopisk polyangitis detekteres af MPOs og Granulomatosis med Polyangiitis detekteres af PR3s. Mikroskopisk polyangitis og Granulomatosis med Polyangiitis er inflamation som primært rammer de små og mellemstore kar i lungerne og nyrerne. Patienterne udviser upecifikke symptomer, som feber, udslet, muskel og ledsmerter, vægttab og slaphed. Hos mange patienter kan detekteres autoantistoffer som er rettet imod enzymerne proteinase 3 og myeloperoxidase i de neutrofile celler. Hvis sygdommen er begrænset til huden vil den være relativt godartet, imens patienter med en aggressiv vaskulit skal i hurtig behandling for at bedre prognosen.(baslund og Hansen-Nord, 2014) Antigen antistof analyseprincippet kemi og bindinger Sygdommene i de forrige afsnit bliver diagnosticeret dels ved hjælp af symptomer, tegn og derudover ved hjælp af analysering for de autoantistoffer kroppen selv har dannet, hvordan analyseringen af disse autoantistoffer foregår beskrives i dette afsnit. Analyserne på ImmunoCAP 250 er alle immunkemiske analyser. Nedenfor kommer en beskrivelse af analyseprincippet for ANA, CCP, MPO s og PR3s, der alle er Enzym linkede immun analyser (Elia). Alle 4 Elia analysers formål er at detektere human IgG. I denne immunkemiske metode er der tale om en solid fase immunanalyse, da brøndene er coatede med antigener. (Denniston, 2007) (Andersen, 2008 ) (Buckingham, 2012) Bindingen imellem antigen og antistof afhænger af om deres fysiske form passer sammen. Derudover handler det også om, hvorvidt de er kemisk kompatible. Antigen-antistof bindingerne er non-kovalente bindinger; altså hydrogenbindinger, Ion-bindinger, hydrofobe interaktioner og London bindinger. Der er flere variabler der påvirker antigen-antistof reaktionen, blandt andet ph, temperatur, ionstyrke, 9

10 inkubationstid, mængden af antigen og antistof. Derudover har lipid ifølge N. Nikolac og J. Schiettecatte et. al. også indvirkning på antistoffernes binding in vitro i immun analyser, da de kan interferere med bindingsstederne. (Nikolac, 2014) (Schiettecatte, 2012) Brøndene der bruges i analysen er coatede med antigener. ANA kopperne er coatede med 14 forskellige antigener. CCP kopperne er coatede med citrullinerede syntetiske peptider. MPOs kopperne er coatede med proteinet myeloperoxidase og PR3s. kopperne med anti proteinase 3 protein. På figur 1 ses brønden/koppen der er coated med antigener(røde) og de specifikke IgG antistofferne (turkise) fra patient serum prøven bindes til antigenerne i brønden. Efter inkubation er det første vasketrin hvor resten af materialet fjernes fra koppen. (Andersen, 2008) Figur 1: Modificeret fra Phadia 250 Til venstre på figur 2 ses, brøndene med de bundne antigen-antistoffer, hvor der tilsættes antistoffet anti-igg (muse monoklonale antistoffer),rettet mod humant IgG, mærket med enzymet ß- Galactosidase. Disse danner et kompleks med autoantistofferne der har bundet sig til antigenerne i koppen. Herefter vaskes ubundne mærkede antistoffer væk ved andet vasketrin. (Andersen, 2008) Figur 2: Phadia 250 På figur 3 ses det bundne kompleks. Efter at development solution tilsættes, inkuberes materialet, hvorved der dannes et fluorescerende stof i koppen. Efter en fastlagt reaktionstid tilsættes stopsolution, hvilket giver en kontrolleret reaktion. Fluorescensen detekteres fotometrisk ved 455 nm, fluorescensen er direkte proportional med IgG koncentrationen i patient serum prøven og altså et mål for hvor meget antistof der er i vores serum patient prøve. Det ovenstående forløb foregår over ca. 2½ time. Der blev i forsøget tilsat lipid inden analyseringen startede. (Andersen, 2008) Figur 3: Phadia

11 Kunstig lipid versus naturlig lipid Det kunstige lipid som er en del af en infusionsvæske/emulsion kaldet Smof kabiven på 1970 ml indeholdende 2200kcal, hvoraf fedtemulsionen består af 375 ml. Præparatet er separeret før infusion og det er heraf fedtemulsionen er tappet. Fedtemulsionen består af i alt 75 g fedt. så for hver 5 ml er der 1 g. fedt. (Smof Kabiven) (Bilag 2) Tabel 1: Indhold i Smof Kabiven fedt emulsjon. Oversigt over indholdet i lipid emulsionen fra Smof Kabiven. Soya Olie Triglycerider Oliven Olie Piscis Olie omega 3 addis abundans Lecithin. purif. e vitello ovi Natr. oleas Aqua ad iniect Int-rac-alfa-tocopherol Natr. hydroxid (Bilag 2) 22,5 g 22,5 g 18,8 g 11,3 g 11

12 Metodevalg Dette projekt omhandler et eksperimentelt forsøg, hvor det undersøges om der er en påvirkning af prøvemateriale der analyseres for ANA, CCP, MPOs og PR3s, ved tilsætning af henholdsvis 6 og 30 µl lipid til 300 µl serum, analyseret på ImmunoCAP 250. Valg af prøvemateriale og antal prøver Da disse analyser er forholdsvis dyre og da der ikke var meget prøvemateriale til rådighed, blev det besluttet at analysere hver patientprøve 3 gange, 1 gang uden lipid og 2 gange med forskellige koncentrationer lipid. Det i samarbejde med Klinisk Biokemisk Afdeling Slagelse besluttet at analysere 35 ANA positiv samt 5 ANA negative og 35 CCP positiv samt 5 CCP negative patient serum prøver. Der blev besluttet at udvælge serum patient prøver med resultater der lå omkring definitionsgrænserne for negativ/tvivlsom og tvivlsom/positiv, så vidt det var muligt, idet dette ville tydeliggøre en eventuel forskel i analyseresultaterne for de inddelte kategorier. Der er 37 ANA prøver, hvoraf 40 CCP prøver, 12 MPOs prøver og 6 PR3s prøver. Da MPOs positive og PR3s positive prøver er forholdsvis sjældne blev det besluttet at analysere på alle positive prøver vi kunne få. Derudover at analysere minimum samme antal eller op til 5 negative prøver indenfor hver analyse. Ifølge udregning på baggrund af Altmans formel for mængden af prøvemateriale i forhold til forsøgets styrke, skulle der have været 90 patientserumprøver pr. analyse. (Altman, 1991)(Se Bilag 1) Det er dog i forhold til hvad der er af tilgængelige positive patient serum prøver og på baggrund af økonomi på afdelingen ikke en mulighed. Efter samtaler med personale på Klinisk Biokemisk Afdeling Slagelse vurderes det, at det stadig med vores prøveantal for ANA og CCP er muligt at drage valide og repræsentative konklusioner. Ved analyserne MPOs og PR3s er prøveantallet så lavt, at det er meget begrænset hvad der kan konkluderes derudaf, men da det er samme analysemetode som ved ANA og CCP dog med andre antigener i brøndene, kan der drages paralleller imellem analyserne. Lipid type og HIL indeks I forsøget er formålet at undersøge lipids indflydelse på analysemetoden ELia, det var ikke muligt at indsamle lipæmiske prøver til undersøgelsen, da der ikke var særlig mange af den type. Derfor valgte vi at bruge en fedtemulsion, der normalt bruges til parenteral ernæring, da det er det tætteste vi kunne komme på naturlig lipæmi. (Se Bilag 2) På baggrund af erfaring og samtale med personale på afdelingen valgte vi at analysere på et lipid indhold, der svarer til 4 på HIL indekset og på et lipid indhold der svarer til 8 som er det højeste på HIL indekset. (Se 12

13 Bilag 3)Ved lipæmiske, prøver der undersøges på Dimension Vista for HIL ligger prøverne erfaringsmæssigt på ca. 4 på HIL indekset, derfor valgte vi netop dette. For at være sikre på at detektere en mulig forskel, valgt vi også det højeste på HIL indekset, nemlig 8.(Bkn, 2015) Lipiden blev tappet fra Smof Kabiven infusionsposen via et lukket system over i Liquid Draw glas, som ikke er coatede med noget der kan influere på analyse resultaterne. Valg af databehandling Ved både Differensplot og ANOVA er alle resultater med værdier der er målt som "over" en talværdi, ikke inddraget i den statistiske behandling, da disse målte værdier ligger udenfor måleområdet for analysen og der ikke er en præcis talværdi. Til at vurdere de kvalitative data bruges differensplot der viser om der er overensstemmelsen imellem serum patient prøverne uden tilsat lipid og med tilsat lipid. Bias er med for at synliggøre forskydningen fra nul linjen og vise om en af serumprøverne L0, L6 eller L30 gennemsnitligt har en større differens.(sindt, 2013) Kappa bruges til at vurdere overensstemmelse imellem de kategoriske analyseresultater, som udgives samtidig med de kvalitative analyseresultater af IDM(ImmunoCAP information Data Manager). Dette betyder at Cohens Kappa kan synliggøre om nogle prøver skifter kategori og om der eventuelt er prøver der skifter 2 kategorier fra negativ til positiv eller omvendt. Der er ikke valgt at bruge en vægtet Kappa, da ingen analyseresultater skifter fra negativ til positiv og dermed skifter over 2 kategorier, hvis vi havde brugt en vægtet Kappa ville vores Kappa værdi have været større. (Sindt, 2013) Derudover bruges ANOVA også til de kvalitative analyseresultater, da det er en robust metode der tåler store afvigelser fra normalfordelingen, det er en forudsætning at data er tilnærmelsesvist normalfordelte. Vores hypotese her er, at der ikke er signifikant forskel på analyseresultaterne, uden lipid og med henholdsvis lipid 6µL og lipid 30µL. (Sindt, 2013) 13

14 Materialer og Metode Apparater ImmunoCAP 250-4, serie nr. N Dimension Vista 1500 Thermo Rack Ljungberg og Kögel AB Analyse Wells Elia CCP Well ( Art. No ) (Der blev brugt 120 CCP brønde i alt til forsøget) Produkt ID: Indhold: Brønde coatede med citrullinerede syntetiske peptider. Klar til brug. Symbol: cp Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Åbnet på ImmunoCAP 250: 28 dage. Åbnet i foliepose: 9 måneder. Uåbnet: Til udløbsdato. LOT 0180 Elia Symphony Well(ANA) ( Art. No )(Der blev brugt 120 Symphony brønde i alt til forsøget) Produkt ID: Indhold: Antigen brønde coatede med rekombinante humane autoantigener: RNP-(70 kda,a,c), SS-A/Ro(60 kda, 52 kda), SS-B/la, Centromere B-, Scl-70, Jo-1, Fibrillarin, RNA Pol 3, Rib-P, PM-Scl, PCNA,Mi-2 proteiner, Sm proteiner og naturligt oprenset DNA samt native oprensede Sm-proteiner. Klar til brug. Symbol: ctd. Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Åbnet på ImmunoCAP 250: 28 dage. Åbnet i foliepose: 9 måneder. Uåbnet: Til udløbsdato. LOT 0050 MPOs Well ( Art. No ; 4 x 16 brønde) (Der blev brugt 30 MPOs brønde i alt til forsøget) Produkt ID: Indhold: Antigen brønde coatede med humant MPO protein. Klar til brug. Symbol: mps Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Uåbnet til udløbsdato. LOT

15 PR3s Well ( Art. No ; 4 x12 brønde) (Der blev brugt 30 PR3s brønde i alt til forsøget) Produkt ID: Indhold: Antigen brønde coatede med humant pr3 protein. Klar til brug. Symbol: prs Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Uåbnet til udløbsdato. LOT 0040 Fælles reagenser for ANA, CCP, MPOs og PR3s Elia Sample Diluent ( Art. No ; 6 flasker à 48 ml, 1flaske er nok til 188 fortyndinger) (Der blev brugt 2 flasker á 48 ml til forsøgets 360 analyser) Produkt ID: Indhold: PBS indeholdende Bouvint serum albumin, detergent og natrium-azid (0,095%). Klar til brug. Symbol: Dil Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Uåbnet til udløbsdato. LOT H1BN Dilution Plates (Mikrotiterplader) 96 brønde pr. styk LOT E13Ø1Ø3H Elia IgG Conjugat ( Art No ; 6 hætteglas à 5,0 ml, 1 hætteglas er tilstrækkeligt til 50 bestemmelser) (Der blev brugt 8 hætteglas til forsøget) Produkt ID: Indhold: ß-galactosidase-anti-IgG (Monoklonale muse-antistoffer). I PBS indeholdende BSA, rensemiddel og natrium-azid (0,06%). Klar til Brug. Symbol: EL-G Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Uåbnet til udløbsdato 15

16 LOT H7Y1 LOT BVCGK Development Solution ( Art. No ; 6 flasker á 17 ml til 170 bestemmelser) (Der blev brugt 3 flasker) Produkt ID: Indhold: 4-methylumbelliferyl-ß-D-galactosid 0,01 %, Kathon CG 0,05 %. 10,8 ml4 Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Uåbnet til udløbsdato. LOT BW1MJ LOT H470 Stop Solution (Art. No ; til 6 x 194 bestemmelser) (Der blev brugt 2 flasker) Produkt ID: Indhold: 120 ml Natriumkarbonat 4% Klar til brug. Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Uåbnet til udløbsdato. LOT GLHA Washing Solution ( Art. No ; 2 flasker à 86 ml + 2 flasker à 400 ml) (Der blev brugt 1 flaske á 86 ml og 1 flaske á 400 ml) Produkt ID: Indhold: Washing solution additive Surfactant; kathon CG 5,8 % (86ml). Washing solution Contentrate Phosphate buffer; Kathon CG 0,05 % (400 ml) Rekonstruktion: Indholdet af én flaske nr. 1 og nr. 2 tilsættes 5 l H 2 O (grøn vandhane) i en plastikdunk. Indhold rystes kraftigt, til det skummer. Holdbarhed og opbevaring: Uåbnet til udløbsdato, efter rekonstruktion 1 uge ved stuetemperatur eller 3 uger på køl, skal være en klar væske ellers kasseres. LOT ASB1P LOT ASD7H 16

17 Fælles Kalibratorer: Elia IgG Calibrators ( 5 strips, Art. No ) (Der kalibreres automatisk hver 28. dag) Produkt ID: Indhold: Humant IgG (0, 4, 10, 20, 100, 600 µg/l); PBS indeholdende BSA, rensemiddel og natriumazid (0,095 %). Klar til brug. Symbol: Cal-0, Cal-4, Cal-10, Cal-20, Cal-100, Cal-600. Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Åbnet: Ved 20 C i 8 timer. Uåbnet: Til udløbsdato. LOT GPND Elia Calibrator Well ( Art. No ; 4 x 12 brønde) (Der kalibreres automatisk hver 28. dag) Produkt ID: Indhold: IgG-kalibratorbrønd belagt med monoklonale museantistoffer. Symbol: Gcal Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Åbnet: Ved 20 C i 8 timer. Uåbnet: Til udløbsdato. Fælles Kurvekontroller: Elia IgG Curve Controls ( Art. No ; 5 strips) (Der er til 6 analyseringer af kurvekontroller i en strip)(der blev brugt 3 strip) Indhold: Humant IgG (20 µg/l); PBS indeholdende BSA, rensemiddel og natriumazid (0,095 %). Klar til Brug. Symbol: CC-1 Opbevaring: 2-8 C Holdbarhed: Åbnet: Ved 20 C i 8 timer. Uåbnet: Til udløbsdato. LOT GRFA 17

18 Fælles Interne kontrol Elia ANA Positive Control 250 fra Thermo Fischer. (Der blev brugt 1 kontrol) Produkt ID: Analyseres hver 10. dag. LOT H89X Fælles Eksterne kontrol Quality-club Elia Autoimmunity fra Thermo Fischer Produkt ID: Indhold: Humant serum. Reagens til 4 analyser. Rekonstitution: 200 µl serum µl samplediluent Opbevaring: Ved 4-8 C Analysering: 12 gange om året. Nequas: Analyseres hver 3. måned til CTD. 18

19 Metode Til forsøget indsamledes patientprøver, der var analyseret for henholdsvis ANA, CCP, MPOs eller PR3s på Nykøbing Falster og Slagelse Biokemiske Afdeling. Der var forinden udarbejdet en kort beskrivelse af proceduren med afpipetering og nedfrysning for at sikre samme behandling af alle prøver. ANA serum blev nedfrosset ved -20 C, da det er rutine på Slagelse Biokemisk Afdeling for disse prøver og CCP,MPO og PRS blev nedfrosset ved -80 C. I forbindelse med forsendelse blev alle prøver sendt på tøris og straks ved ankomst lagt i -80 C fryser. Til dette forsøg blev der udvalgt serum fra patienter med analyseresultater, der ligger tæt på kategoriernes grænser, altså dem hvor der ved små analytiske forskelle ville kunne være en klinisk signifikant forskel i forhold til diagnosticeringen. Derudover blev der også udvalgt prøver, der repræsenterer en stor del af analyseområdet, både i det positive, negative og tvivlsomme område. Det ovenstående var primært gældende for ANA og CCP da der her var prøver at vælge imellem, men for ANCA-MPO og ANCA-PRS analyserede vi de prøver vi havde, da der her var få positive prøver af hver kategori. Hvis prøverne var visuelt hæmolyserede eller der var kraftige udfældninger, der kunne ses eller blev opdaget i forbindelse med afpipetteringen, blev disse prøver fravalgt til brug i forsøget, da dette kunne skabe interferens der ikke havde noget med dette forsøgs lipid interferens at gøre. Ved visuel mistanke om lipæmiske serum prøver analyseredes disse på Dimension Vistas HIL indeks for at se, om prøverne var lipæmiske, og hvis dette var tilfældet blev prøven kasseret. Der blev efter udvælgelsen kasseret 1 prøve pga. lipæmi. Efter optøning enten ved stuetemperatur eller ved 37 C i Thermo Rack, blev 300µL serum afpipetteret i hvert af de 3 mærkede Liquid Draw glas, 1. glas uden tilsat lipid, i 2. glas blev tilsat 6 µl kunstig lipid og i 3. glas blev der tilsat 30µL kunstig lipid. Derefter blev analyserne bestilt på ImmunoCAP information Data Manager(IDM), hvorefter de velblandede serumprøverne blev sat over til analysering på ImmunoCAP 250, med brug af analysevejledningen fra biokemisk afdeling Slagelse. (Tohn, 2014a) Serumprøverne der skulle analyseres for ANA og CCP blev analyseret over 2 dage og ikke som planlagt på 1 dag. PRS og MPO blev dog analyseret på 1 dag. Resultaterne af analyseringen er statistisk behandlet ved hjælp af Differens Plot med Bias vist, da det ud fra dette er muligt at vurdere overensstemmelsen imellem analysesvarerne uden tilsat lipid og med tilsat lipid. 19

20 Tabel 2: Kappa Tabel fra "Statistiske metoder i biomedicin" Kappa værdi Fortolkning 0,0 < K < 0,2 Svag 0,2 < K < 0,4 Rimelig 0,4 < K < 0,6 Moderat 0,6 < K < 0,8 God 0,8 < K < 1 Næsten perfekt (Sindt, 2013) (Statnoter, 2015) Udover at analysesvaret udgives kvantitativt, udgives det også som kategoriske data af IDM. Vi har i ANOVA måttet vælge prøver fra som lå udenfor måleområdet, da der her fremkommer en talværdi der hedder under eksempelvis 0,2 og over 32. Nedenfor ses en tabel med måleområde for alle analyserne, samt hvilken kategori inddeling der er i de forskellige analyser. Tabel 3: Oversigt over de 4 forskellige analysers måleområder, kategori inddeling og impræcision fra Klinisk Biokemisk afdeling i Slagelse. Måleområde Negativ kategori Tvivlsom kategori Positiv kategori Total analytisk impræcision ANA 0,03 til > 32 Ratio < 0,7 Ratio 0,7-1,0 Ratio > 1,0 Ratio 12 % CCP 0,4 til < 340 ku/l < 7 ku/l > 7 ku/l < 10 ku/l > 10 ku/l 19 % MPOs 0,2 til > 134 IU/ml < 3,5 ku/l 3,5-5,0 ku/l 5,0 ku/l 14,7 % PR3s 0,2 til > 177 IU/ml < 2,0 ku/l 2,0-3,0 ku/l > 3,0 ku/l 11,7 % (Tohn, 2014a) (Tohn, 2014b) (Tohn, 2014c) (Tohn, 2013). I diskussionen er resultaterne holdt oppe imod andre forsøgsbeskrivelser, resultater og viden fra de følgende 4 artikler. "Evaluating Interference caused by Lipemia" af Martin H. Kroll, "Lipemia: causes, interference mechanisms, detection and management." af Nora Nikolac, "Assay-specific Difference in lipemic Interference in native and intralipid-suplement samples." af J.A. Bornhorst et al., samt "Heterogeneity of manufacturers' declarations for lipemia interference An urgent call for standardization" af Nora Nikolac et al. 20

21 Pilotforsøg For at finde den lipid mængde der skulle tilsættes serum lavede vi et pilotforsøg. Vi tappede Lipid emulsion fra Smof kabiven med sommerfugl ned i liquid draw glas, hvorefter det blev sat på køl. Derefter blev 20 serumprøver poolet, hvorefter de blev udportioneret med 1 ml serum i hver af 8 liquid draw glas. Der blev så tilsat forskellige mængder lipid til de 8 liquid draw glas, hvorefter dette blev blandet. Prøverne blev analyseret på Dimension Vista for HIL indekset, som går fra 1-8 hvor 8 svarer til en kraftigt lipæmisk prøve. I tabellen nedenfor ses hvilke mængder lipid, der blev tilsat serum. Til selve det primære forsøg var der 300µL serum til hver analyse og den tilsatte mængde lipid blev derfor omregnet til at være henholdsvis 6µL og 30µL for at have hvad der svarer til et Lipid HIL indeks på 4 og 8.(Bkn, 2015) Tabel 4: Oversigts tabel over pilotforsøget, med serum og den tilsatte lipid. Prøve Serum i µl Tilsat Lipid i µl CV% Forsøg Ved CV% forsøget tog vi 3 ANA positive serum prøver der var i et lavt, middel og højt måleområde. De 3 prøver blev hver især analyseret for ANA på ImmunoCAP gange samme dag for at få den intraserielle CV%. ANA, CCP, MPOs og PR3s skulle hver især analyseres på en dag og var derfor uafhængige af dag til dag variationen. Derudover analyserede vi på den samme prøve, tilsat lipid i 2 koncentrationer og dermed var den biologiske variation heller ikke en faktor i vores forsøg. I den totale impræcision fra afdelingen er både dag til dag og biologisk variation medregnet. Holdbarhedsforsøg Ud over selve forsøget, pilot forsøget og CV% forsøget, indeholdt forsøget også et holdbarhedsforsøg, da de oprindelige analysesvar for de anvendte serum patient prøver, blev fundet frem i forbindelse med udvælgelse af prøvemateriale. ANA serum blev frosset ved -20 C og CCP, MPOs og PR3s blev frosset ved - 21

22 80 C. Der er for at sammenligne overensstemmelsen lavet et differens plot med analysesvar fra Før frys prøverne og Lipid 0µL. Derudover er der indsat Bias linje i forhold til nul linje. 22

23 Resultater I dette afsnit er derførst en tabel med en samlet oversigt over resultaterne fra den ANOVA, der blev lavet på ANA, CCP, MPOs og PR3s. Derefter vil der for hver af de 4 analyser være differensplot for lipid 0µL/lipid 6µL og lipid 0µL /lipid 30µL og dernæst Kappa for L0/L6 og L0/L30. I ANOVA og differensplottet er alle resultater indeholdende < eller > tegn udelukket, da der ikke er et reel tal og dette er udenfor måleområdet. ANOVA for ANA, CCP, MPOs og PR3s Analyseresultaterne fra serum med lipid 0µL, 6µL og 30µL, blev sammenlignet med en ANOVA test. Ved en P-værdi <0,05 forkastes vores hypotese, om at der ikke er en forskel, på analyseresultater altså en forskel på analysesvaret uden og med tilsat lipid. ANA analyseresultaterne viser i ANOVA signifikant forskel på prøverne, mens for der ingen signifikant forskel er på CCP, MPOs og PR3s ANOVA resultatet. Tabel 5: ANOVA for ANA, CCP, MPOs og PR3s. Der ses en signifikant forskel ved ANOVA for ANA. ANOVA Gennemsnit Gennemsnit Gennemsnit P - Værdi Lipid 0µL (L0) Lipid 6µL (L6) Lipid 30µL (L30) ANA L0/L6/L30 3,5 Ratio 3,7 Ratio 3,9 Ratio 0,01 CCP L0/L6/L30 75,9 ku/l 75,1 ku/l 79,8 ku/l 0,09 MPOs L0/L6/L30 36,5 ku/l 35,5 ku/l 37,2 ku/l 0,33 PR3s L0/L6/L30 4,4 ku/l 5,3 ku/l 4,0 ku/l 0,42 Bonferroni korrigeret T-test Da det ikke er muligt at se hvor den signifikante forskel ligger i ANOVA for ANA, er er derfor udført en Bonferoni korrigeret t-test på ANA analyseresultaterne. Signifikant niveauet forbliver 0,05 og P-værdien x med antal T-test der udføres. Tabel 6: Bonferroni korrigeret t-test. ANA P-værdi ved t-test Bonferoni korrigeret P-værdi (P-værdien x med antal t-tests) Lipid 0µL/lipid 6µL 0,011 0,022 Lipid 0µL/lipid 30µL 0,173 0,35 (Altman, 1991) 23

24 Differencen mellem L0 og L30 Differencen mellem L0 og L6 ANA Differensplot Nedenfor ses 2 differensplot for ANA med henholdsvis Lipid 0 µl overfor Lipid 6 µl og Lipid 0 µl overfor Lipid 30 µl. På begge differensplot ses også Bias ved den røde linje. 6 4 ANA Lipid 0µL og 6µL Middelværdien af L0 og L6 Ratio Figur 4: ANA L0 og L6 Differensplot. Punkterne i differensplotet ligger både over og under nul linjen ved værdierne under 15 Ratio, ved de høje værdier over 15 Ratio ses der en tendens til at målingerne ligger under nul linjen, hvilket viser en tendens til jo højere måleværdi, jo større difference ved tilsætning af lipid. Bias er -0,23. Se eventuelt Bilag 4 for rådata. 6 ANA Lipid L0 og L Middelværdien af L0 og L30 Ratio Figur 5: ANA L0 og L30 Differensplot. Der ligger punkter lige omkring linjen, men de fleste punkter ligger under nul linjen, der ses en tendens til generelt højere værdier ved L30 end ved L0. Der ses en tendens til jo højere måleværdi jo større difference. Bias er -0,44.(Bilag 4) 24

25 Lipid 0 µl Lipid 0 µl ANA Kappa Nedenfor ses 2 Kappa skemaer for henholdsvis L0/L6 og L0/L30 med de beregnede Kappa værdier. Tabel 7: Kappa for ANA L0/L6 Lipid 6 µl Kappa ANA Negativ Tvivlsom Positiv Sum Negativ Tvivlsom Positiv Sum p0 0,92 pt 0,60 K 0,80 Ovenfor ses lipid 0µL overfor lipid 6µL, der er en Kappa værdi på 0,8 som er Næsten perfekt. Tabel 8: Kappa for ANA L0/L30. Lipid 30 µl Kappa ANA Negativ Tvivlsom Positiv Sum Negativ Tvivlsom Positiv Sum p0 0,89 pt 0,62 K 0,72 Ovenfor ses lipid 0µL overfor lipid 30µL, der er en Kappa værdi på 0,72 som er God. 25

26 Differncen mellem L0 og L30 Differncen mellem L0 og L6 CCP Differensplot Nedenfor ses 2 differensplot for CCP med henholdsvis Lipid 0 µl overfor Lipid 6 µl og Lipid 0 µl overfor Lipid 30 µl. På begge differensplot ses også Bias ved den røde linje 50 CCP LIpid 0µL og 6µL Middelværdie af L0/L6 ku/l Figur 6: CCP L0 og L6 Differensplot. På differensplottet lipid 0µL overfor lipid 6 µl, ligger punkterne på begge sider omkring nul linjen. Bias er på 3,4 så gennemsnittet af differencerne er positive, men den ene outlier der ligger på 237/204 gør at Bias bliver positiv, uden denne outlier er bias på -1,7 og dermed negativ. 60 CCP Lipid 0µL og 30µL Middelværdi af L0/L30 ku/l Figur 7: CCP L0 og L30 Differensplot Punkterne ligger både over og under nul linjen, efter middelværdien 150 ligger alle punkter under nul linjen og der ses en tendens til at målesvar i dette område er højere ved L30. 26

27 Lipid 0 µl Lipid 0 µl CCP Kappa Nedenfor ses to Kappa skemaer for CCP L0/L6 og L0/L30 med de udregnede Kappa værdier. Tabel 9: Kappa for CCP L0/L6 Lipid 6 µl Kappa CCP Negativ Tvivlsom Positiv Sum Negativ 7 7 Tvivlsom 0 0 Positiv Sum p0 1 Pt 0,71125 K 1 Ovenfor ses lipid 0µL overfor lipid 6µL, med en Kappa værdi på 1 som er perfekt overensstemmelse. Tabel 10: Kappa for CCP L0/L30 Lipid 30 µl Kappa CCP Negativ Tvivlsom Positiv Sum Negativ Tvivlsom 0 Positiv Sum p0 0,98 pt 0,71 K 0,91 Ovenfor ses tabel 8 med analyseresultater inddelt i kategorier, vurderet med en Kappa. Kappa værdien var på 0,91 som er næsten perfekt. 27

28 Differencen mellem L0 og L30 Differencen imellem L0 og L6 MPOs Differensplot Nedenfor ses 2 differensplot for MPOs med henholdsvis Lipid 0 µl overfor Lipid 6 µl og Lipid 0 µl overfor Lipid 30 µl. På begge differensplot ses også Bias ved den røde linje. 7 MPOs L0 og L Middelværdien af L0 og L6 ku/l Figur 8: MPOs L0 og L6 Differensplot I differensplottet for MPOs L0/L6 ligger alle punkter omkring nul linjen, der er en enkelt måling der har en difference på 5,7. Bias er på -0,98, men hvis difference punktet på 5,7 fjernes, er bias på 0,16. 5 MPOs L0 og L Middelværdien af L0 og L30 ku/l Figur 9: MPOs L0 og L30 differensplot. Målepunkterne ligger både på den positive og negative side af nul linjen. Bias er -0,66. 28

29 Lipid 0 µl MPOs Kappa Nedenfor ses en samlet Kappa for MPOs L0/L6 og L0/L30 da de kategoriske resultaterne var fuldstændig ens. Tabel 11: Kappa for MPOs L0 Lipid 6 µl og Lipid 30 µl Kappa MPOs Negativ Tvivlsom Positiv Sum Negativ 5 5 Tvivlsom 0 0 Positiv 7 7 Sum p0 1 Pt 0,51 K 1 Ovenfor ses tabel 10 med analyseresultater for MPOs inddelt i kategorier, vurderet med en Kappa. Kappa værdien var på 1 som er perfekt overensstemmelse imellem analyseresultaterne. 29

30 Difference mellem L0 og L30 Differencen mellem L0 og L6 PR3s Differensplot Nedenfor ses 2 differensplot for PR3s med henholdsvis Lipid 0 µl overfor Lipid 6 µl og Lipid 0 µl overfor Lipid 30 µl. På begge differensplot ses også Bias ved den røde linje. 3 PR3s Lo og L Middelværdi af L0 og L6 ku/l Figur 10: PR3s L0 og L6 Differensplot I differensplottet for PR3s L0/L6 ligger alle positive analyse punkter under nul linjen, der er en tendens til at Lipid 6µL målingen er højere end uden tilsat lipid i Lipid 0µL. Bias ligger på -0, PR3s L0 og L Middelværdi af L0 og L30 ku/l Figur 11: PR3s L0 og L30 Differensplottet for PR3s L0/L30 har en Bias på 0,23. Målepunkterne ligger fordelt omkring nul linjen. 30

31 Lipid 0 µl PR3s Kappa Nedenfor ses en samlet Kappa for PR3s L0/L6 og L0/L30 da de kategoriske resultaterne var fuldstændig ens. Tabel 12: Kappa for PR3s L0/L6 og L0/L30. Lipid 6 µl og 30 µl Kappa for PR3s Negativ Tvivlsom Positiv Sum Negativ 3 3 Tvivlsom Positiv 3 3 Sum p0 1 pt 0,5 K 1 Ovenfor ses tabel 10 med analyseresultater for PR3s, inddelt i kategorier, vurderet med en Kappa. Kappa værdien var på 1 som er perfekt overensstemmelse imellem analyseresultaterne. Pilotforsøg Nedenfor ses resultatet af pilotforsøget. Her er en oversigt over pilotforsøget, med serum mængde, den tilsatte lipid mængde og hvilket HIL resultat der kom fra Dimension Vista. Tabel 13: Pilotforsøge, Hil indeks på Vista. Prøve Serum i µl Tilsat Lipid i µl Vistas HIL indeks resultat for Lipid

32 Intra serial CV% Herunder ses resultaterne fra det intraserielle CV% forsøg, i det høje niveau kom alle *resultaterne ud over måleområdet, og kun 3 af dem som en talstørrelse, de sidste 2 kun som "Above" denne CV% fra et område udenfor måleområdet. Tabel 14: CV% Prøve Oprindeligt resultat Middel SD CV% Højt niveau 23 Ratio 37 Ratio 2,7 *7,2 Middel niveau 6,3 Ratio 6,1 Ratio 0,33 5,4 Lavt niveau 2,4Ratio 2,3 Ratio 0,08 3,7 32

33 Differencen mellem Før frys og L0 Differencen mellem Førfrys og L0 Holdbarhedsforsøg Ved holdbarhedsforsøget, er der lavet differensplot over de 4 forskellige analysegrupper ANA, CCP, MPOs og PR3s, med analyseresultater fra Før frys og lipid 0µL Holdbarhedsforsøg ANA -20 C Middelværdi af Før frys og L0 Ratio Figur 12: ANA Før frys og lipid 0µL. Ved ANA holdbarhedsforsøget med Før frys og lipid 0µL prøverne, er punkterne fordelt både over og under nul linjen, fra 7,75 Ratio er alle analyseresultater dog under nul linjen, hvilket vil sige at analyseresultatet efter frys(l0) måler højere end Før frys resultaterne. Bias er på -0, Holdbarhedsforsøg CCP -80 C Middelværdi Før frys og L0 ku/l Figur 13: CCP Før frys og lipid 0µL. Ved holdbarhedsforsøget med CCP er alle analyseresultater er fordelt over og under nul linjen. Bias er på 1,5. 33

34 Difference mellem Før frys og L0 Difference mellem Før frys og L0 Holdbarhedsforsøg MPOs -80 C Middelværdi af Før frys og L0 ku/l Figur 14: MPOs Før frys og lipid 0µL. De fleste analyseresultater ved holdbarhed for MPOs ligger over nul linjen, undtagen 1 punkt der ligger lige under nul linjen. Bias er på 7,1, hvilket primært skyldes punktet på 110 ku/l med en difference på 22. 1,5 Holdbarhedsforsøg PR3s -80 C 1 0,5 0-0, ,5 Middelsværdi af Før frys og L0 ku/l Figur 15: PR3s Før frys og lipid 0µL. Der er kun 3 analyseresultater, der fordeler sig både over og under nul linjen. Bias er på 0,15. 34

35 Diskussion Diskussionen opdeles i 4 afsnit med analyserne ANA, CCP, MPOs og PR3s. Hvert afsnit vil starte med en kort præsentation af resultaterne der derefter diskuteres. Der diskuteres først ud fra ANOVA's resultater, derefter ud fra differensplottet og til sidst ud fra Kappa resultaterne. Alle resultater holdes op imod resultater og citater fra de 4 artikler, der er inddraget i rapporten. ANA diskussionen er uddybet grundigt og de følgende diskussioner af CCP, MPOs og PR3s resultaterne er kortere diskussioner. Dette da de lægger sig op af nogle af de samme resultater fra ANA, undtaget ANOVA for ANA analysesvarene. Diskussion ANA ANOVA Ved ANOVA'en for ANA var der for Lipid 0µL, Lipid 6µL og Lipid 30µL blev der påvist en signifikant forskel, P-værdi = 0,01.Dette stemmer overens med det N. Nikolac skriver i artiklen "Lipemia: causes, interference mechanisms, detection and management" at lipid kan interfererer uspecifikt i immunanalyser. (Nikolac, 2014) Det er ikke umiddelbart muligt at se, om der både er en signifikant forskel ved prøverne med 6µL lipid og ved 30µL lipid. Ved at lave en Bonferoni korrigeret t-test ses det at den signifikante forskel ligger imellem serum prøverne Lipid 0µL og 30µL, P-værdi på 0,01 og signifikansniveauet er 0,025. Ved Lipid 0µL og 6µL er P-værdien 0,17. Det vil sige, at der kun ses interferens ved den høje koncentration af tilsat lipid, som svarer til 8 på HIL indekset (Dimension Vista). Ved Lipid 6 µl, som svarer til 4 på HIL indekset (Dimension Vista) ses ikke en signifikant forskel. Der ses ved enkelte prøver i ANA en difference på mellem 1,51 og 5,4 imellem L0 og L30. I forhold til den procentvise stigning i analyseresultatet er der 2 analyseresultater, der har en stigning på henholdsvis 25,7% og 29%. Disse to prøver kan være grunden til at ANOVA viser at der er en signifikant forskel. ANA har en total analytisk impræcision på 12%. Så de 2 ovenstående prøver er altså ikke kun et udtryk for den analytiske impræcision. Begge disse meget store procentvise stigninger på de 2 analysesvar ligger dog i et område, hvor der ikke er tvivl om at prøven er positiv uanset stigningen, det vil dermed sige at det ikke har nogen klinisk signifikans. Ved ANA Lipid 0µL og Lipid 30 µl ses en stigning i analyseresultaterne ved næsten alle analysesvar, dette kan også være årsagen til at der ved ANOVA for ANA er en signifikant forskel. 35

36 Diskussion ANA Kappa I Kappa for ANA viser en sammenligning af resultater for L0/L6 prøverne en Kappa på 0,80, der er en næsten perfekt sammenhæng imellem analyseresultaterne. For prøverne L0/L30 ligger Kappa på 0,72 og der er god overensstemmelse imellem analyseresultaterne. Der er ikke umiddelbart fundet nogen sammenlignelige undersøgelser for kunstig lipids indflydelse på ImmunoCAP 250 analysen ANA, men N. Nikolac at lipæmi kan interferere ikke specifikt i forskellige immunanalyser dette kunne være i forbindelse med antigen-antistof bindingerne. (Nikolac, 2014) Interferensen i antigen-antistofbindingen sker ved at lipiderne blokerer bindingsstederne, hvorved der skulle komme et falsk for lavt analysesvar, da autoantistofferne så ikke ville kunne bindes til antigenerne i de coatede brønde. Dette kunne godt være tilfældet, da der er en prøve der skifter til en lavere kategori, altså går fra positiv til tvivlsom. Dette gør sig både gældende i L0/L6 og i L0/L30 og det er ikke den samme prøve, der skifter fra positiv til tvivlsom. Der er dog ikke nogen klar tendens, da der i samme analysering i L0/L6 også ses en prøve, der stiger og går fra gruppen "negativ" til "tvivlsom" og en der går fra "tvivlsom" til "positiv". I L0/L30 er der på samme måde 1 prøve der skifter fra "negativ" til "tvivlsom" og 2 prøver der går fra "tvivlsom" til "positiv". Kategoriskiftet ses ved prøver der ligger i måleområdet omkring grænsen for analysens kategoriskift. Der er på grund af ovenstående ikke nogen klar tendens og da der både er kategoriskift der går fra positiv til tvivlsom og tvivlsom til negativ, samtidig også kategoriskift fra negativ til tvivlsom og fra tvivlsom til positiv, kan årsagen ikke udelukkende være blokering af bindingssteder imellem antigen og antistof. Diskussion ANA Differensplot På differensplottet for Lipid 0µL/Lipid 6µL ses punkterne fordelt både over og under nul linjen og der er en Bias på -0,23. På differensplottet for Lipid 0µL/Lipid 30µL ses analyseresultaterne primært under nul linjen og der er en Bias på -0,44. På L0/L30 differensplottet ses der en tendens til at ANA med tilsat lipid 30µL, gennemgående har et højere analyseresultat, end patient serum prøverne uden tilsat lipid, hvilket kan være årsagen til at ANOVA giver en P-værdi på 0,01, og altså viser en signifikant forskel på analyseresultatet L0 og L30. Derudover ser der ud til at være en lille tendens til at der ved de højere måleresultater er en større differens, altså at serum patient prøven med lipid 30µL, har et højere analyseresultat end uden tilsat lipid. Diskussion CCP ANOVA Ved ANOVA ses en P-værdi på 0,09, altså højere end 0,05, hvilket gør at hypotesen om, at der ikke er signifikant forskel på analyseresultaterne for serum patient prøverne uden tilsat lipid og efter tilsætning af 6µL og 30 µl lipid, holder. Dette er i modstrid med hvad N. Nikolac skriver, at lipid interfererer med immun analyser. Dette kan enten skyldes at denne immunanalyse ikke er sårbar overfor lipid interferens eller det kan skyldes, at der i forsøget bruges kunstig lipid som ifølge Bornhorsts forsøg ikke viser samme interferens 36

37 som naturligt lipid. Dette kan skyldes den sammensætningen af lipid der er eller de forskellige molekylestørrelser. (Nikolac, 2014) (Bornhorst, 2004) Diskussion CCP Kappa Ved Kappa var der ved sammenligningen Lipid 0µL med Lipid 6 µl en Kappa på 1, hvilket er en næsten perfekt overensstemmelse i følge resultatskemaet i Tabel 1. Kategoriresultaterne var fuldstændig ens, dvs. at alle prøver faldt i samme kategorier, selvom de ikke havde præcis samme kvalitative værdi. Ved Lipid 0µL og Lipid 30µL blev Kappa 0,91 og dermed næsten perfekt ifølge resultatskemaet i Tabel 1. Der var en prøve der gik fra kategorien negativ til tvivlsom. Her er altså i modsætning til hvad N. Nikolac skriver ikke nogen interferens, den forskel der er i analyseresultatet kan være et udtryk for impræcisionen der er på 19% for CCP analysen. Diskussion CCP Differensplot Ved differensplottet for CCP L0/L6 ligger analyseresultaterne på begge sider af nul linjen. Indtil 50 ku/l ligger resultaterne tæt på nul linjen, efter 50 ku/l ligger analyseresultaterne stadig på begge sider af nul linjen, men der er større differencer end ved måleområdet under 50 ku/l. Dette kan skyldes at ved højere koncentrationer af antistoffer bliver disse mere påvirket af mængden af lipid i serum patient prøven. Det kan dog også skyldes, at ved højere koncentrationer af antistoffer er analysen mindre præcis. Dette har ikke den store kliniske effekt, da CCP resultatet er CCP positiv, når resultatet ligger over 10 ku/l. Det har ikke den store kliniske betydning om resultatet er 140 ku/l eller 150 ku/l. Ved differensplottet for L0 og L30 Ligger punkterne på begge sider af nul linjen, omkring 30 ku/l stiger nogle af differenserne og efter 155 ku/l ligger alle punkter under nul linjen, hvilket indikerer at ved høje koncentrationer af antistoffer er analyseresultatet højere ved serum patientprøven med 30µL tilsat lipid. Analyseresultaterne kan være af samme årsag som ved differensplottet for CCP L0/L6. Diskussion MPOs Ved ANOVA for MPOs sås ingen signifikant forskel og ved Kappa for MPOs var der næsten perfekt overensstemmelse, der var ingen prøver der skiftede kategori. Ved differensplottet for MPOs L0/L6 ligger punkterne både over og under nul linjen, Bias er på -0,98, dette skyldes primært et analyseresultat der 37

38 ligger på 118 ku/l som har en difference på -5,72. Analyseresultaterne for MPOs er i modstrid til hvad Nikolac skriver om lipid interferens. (Nikolac, 2014) Men Prøvemængden er meget lille og det er et stort usikkerhedsmoment i forhold til hvor repræsentativt dette er for analysen generelt. Det er dog samme analysemetode som ANA og CCP hvor der var en større prøvemængde, den eneste forskel er at brøndene for de enkelte analyser er coatede med forskellige antigener. Det er naturligvis ikke uvæsentligt da bindings affiniteten har stor betydning for analyseresultatet. Diskussion PR3s Ved ANOVA for PR3s var der ingen signifikant forskel og ved differensplottet for L0/L6 ligger 3 ud af de 4 analyseresultater under nul linjen, det vil sige at analyseringen med 6µL har målt højere end serum patient prøven uden lipid i alle positive prøver, det har dog ingen klinisk betydning da alle 3 patient serum prøver i begge tilfælde ender i den positive kategori, hvilket også ses ved Kappa værdien der er 1, hvilket giver en næsten perfekt overensstemmelse. Ved PR3s var der bare 3 positive analyser indsamlet og som beskrevet ovenfor i MPOs er denne prøvemængde for lille til at drage nogle konklusioner. Diskussion Impræcision De forskellige analyseresultater der er ved diverse Lipid 0µL, Lipid 6µL og Lipid 30µL prøver kan i stedet for en signifikant forskel imellem analyseresultaterne, være et udtryk for ImmunoCAP 250's analyseusikkerhed. I vores forsøg med intraseriel CV% hvor vi analyserede 3 ANA positive patientprøver 5 gange hver i en analysegang. De 3 prøver var fordelt på en med et højt, lavt og middelniveau af autoantistoffer. Der blev fundet en intraseriel CV% på 3,7 for det lave antistofniveau, 5,3 for middel antistofniveauet og 7,2 for det høje amtistofniveau. Der ses en tendens til en stigende CV% i takt med at autoantistofmængden stiger, altså en øget usikkerhed når niveauet af autoantistoffer stiger, men usikkerheden ligger stadig inden for den totale impræcision på 12%, der er valideret fra Slagelse Biokemisk afdeling og der er derfor kun tale om en tendens, det kan lige såvel være et udtryk for denne impræcision. I forhold til vores intraserielle CV% er der ikke taget højde for kørsel af analysesvar på forskellige dage, da planen var at analysere alle prøver inden for samme analyse på samme dag. Derudover er der kun analyseret for intraseriel CV% for ANA og ikke for både MPOs, PR3s og CCP, men den intraserielle CV% er højst sandsynligt lavere end den totale analytiske impræcision opgivet af Klinisk Biokemisk Afdeling Slagelse(kilde alle D4). Den intraserielle CV% tager ikke højde for biologisk variation og heller ikke for dag til dag variation. 38