Lang projektbeskrivelse (ca. 5 sider)

Transkript

1 09.10 Lang projektbeskrivelse (ca. 5 sider) Titel og navn: Læge Cathrine Bach Projekttitel: Udvikling af metode til måling af føtal DNA i den gravides plasma og benyttelse af disse metoder til monitorering af placentafunktionen. Resumé: Forringet placentafunktion vides at have etiologisk betydning for fosterets udvikling, ligesom den spiller en rolle i udviklingen af præeklampsi og andre obstetriske komplikationer. I dag har man ingen metoder, der med høj prædiktiv værdi på et tidligt tidspunkt i graviditeten kan udpege hvilke kvinde, der er i risiko for at udvikle placentainsufficiens eller præeklampsi. I teorien skulle forekomsten af føtal- eller placental DNA i moderens blod være en optimal parameter for placentafunktionen, idet mængden af dette må afspejle mændgen af lyserede trofoblastcelle fra placenta og dermed vitaliteten af placentas diffusionsoverflade. Dette projekts overordnede formål er udvikling af en metode til bestemmelse af føtal DNA i den gravides blod. Vi vil initielt udvikle en metode til specifik analyse af fosterderiveret DNA i moderens blod og herefter applicere denne teknik på en bestemt problemstilling, nemlig monitorering af foster og placentafunktion. Baggrund: Gennem adskillige årtier har det været kendt, at der under graviditeten passerer celler fra fosteret over i moderens blod, hvor de kan findes under det meste af graviditeten. Fundet har vakt betydelig interesse, idet man har forestillet sig, at disse celler kunne danne basis for en metode til prænatal diagnostik, uden man skulle foretage indstik på moderkagen med risiko for utilsigtet abort. Problemet har dog været at antallet af intakte føtale celler i moderens blod er yderst lavt, omkring 1: maternelle celler. Derimod påviste man for en del år siden, at der moderens blod findes fosterderiveret frit DNA (Wataganara et al. 2004). Ved kvantificeringsforsøg blev det vist, at der i moderens blod findes DNA sv.t. omkring 100 fosterceller for hver intakte fostercelle (Maron JL et al. 2007). Mens fundet af føtale celler i maternelt blod fra starten vakte stor interesse, netop med udsigt til risiko-fri prænatal diagnostik for øje, vakte fundet af små mængder frit føtalt DNA i en årrække ikke synderlig interesse. Billedet ændrede sig dog efterhånden som PCR teknologien blev bedre, hvorved man fik bedre mulighed for at studere dette DNA. De initiale studier af fosterderiveret DNA blev således gennemført ved analyse af DNAsekvenser stammende fra det humane Y-kromosom, idet påvisning af Y-kromosomderiveret DNA fra gravide kvinder, der bar drengefostre, måtte stamme fra fostret. Det er således blevet påvist, at foster DNA et består af rimeligt korte fragmenter, dog lange nok til at de kan analyseres med PCR-teknik. Der er ligeledes blevet påvist at foster DNA et findes tidligt i forhøjet mængde ved tilstande som præeklampsi og HELLP, ligesom det er fundet forhøjet ved truende præterm fødsel, placenta prævia, hyperemisis gravidarum og 1 af 6

2 invasiv placenta (Leung TN et al. 1998, Lo YM et al. 1999, Lau TW et al. 2002, Tong YK et al. 2006). De tidligere studier er dog baseret på relativt små undersøgelser ligesom resultaterne viste stor variation i de målte værdier af føtal DNA, især måleresultaterne fra gruppen af gravide med præeklampsi viste stor spredning. De tidligere undersøgelser inkluderede udelukkende gravide med præeklampsi, der ventede drengefostre. I et enkelt af studierne sammenlignes disse gravide med en gruppe kontroller med en blanding af drenge- og pigefostre ellers er studierne udelukkende baseret på gravide, der venter drengefostre hos såvel forsøgspersoner som kontroller. Netop det faktum, at metoden kun kan bruges, når der ventes drengefostre, er formentlig årsagen til at den obstetriske anvendelse af teknikken har stået en del stille de seneste år. På det seneste er det imidlertid godtgjort, at det foster-dna, der findes i moderens blod stammer fra placenta, formentlig afgivet fra trophoblast-laget ved cellelyse eller fra eksport af beskadigede kerner fra syncytotrofoblastcellelaget. Efterhånden som placentafunktionen aftager frigives en øget mængde af beskadige celler fra placenta, der diffunderer over i moderens blod, hvor det kan registreres i form af stigning i føtal/placental DNA. Det faktum, at det er placentalt DNA, der findes i moderens serum, åbner nye muligheder for specifik analyse af dette DNA. Grunden hertil er, at placenta som et relativt primitivt organ har inaktiveret en lang række gener, der er aktive i moderens blodceller. I placenta er denne inaktivering i vid udstrækning opnået ved kemisk modifikation af DNA et i form af syntetisering af methylgrupper på basen cytosin på de relevante geners regulatorregioner. Der blev for nogle år siden fundet et velegnet gen på kromosom 18 (RASSF1A), der er total methyleret i placenta og umethyleret i moderens blodceller (Chiu RW et al. 2007, Hyland CA et al. 2009). Vi ønsker i herværende projekt med udgangspunkt i RASSF1A at udvikle en metode, der med tiltrækkelig præcision i moderens blod kan måle mængden af methyleret RASSF1A eller andre genregioner, der er udtalt differentielt metylerede mellem placenta og maternelle blodceller, således at vi kan måle foster-dna i den gravides blod uafhængigt af om den gravide venter et drenge- eller et pigefoster. Herefter vil vi anvende disse methyleringer til monitorering af placentafunktionen i et klinisk forsøg. Projektets forløb: Projektet vil forløbe i følgende delprojekter: 1). Initialt vil vi benytte Y-kromosom DNA hos kvinder, der bærer drengefostre, til udvikling af en gold standard metode til detektering af fosterderiveret DNA i maternelt blod, idet Y- kromosomderiveret DNA med sikkerhed er DNA stammende fra fostret. Herefter vil vi med udgangspunkt i genet RASSF1A (der er kendt methyleret i placenta og umethyleret i maternelt blod) udvikle metoder, der med tilstrækkelig præcision kan afgøre, om der i moderens plasma findes en forhøjet mængde methyleret RASSF1A promotor. Ved at krydskøre en serie hvor der måles hhv Y-kromosom DNA og RASSF1A, vil vi visualisere om RASSF1A er valid nok som markør for mængden af fosterderiveret DNA i maternelt blod. 2 af 6

3 Ansøgeren vil selv forestå projektets laboratorie arbejde. Der oplæres i relevante laboratorie teknikker herunder PCR på Klinisk Genetisk Afdeling, Vejle Sygehus. Laboratoriearbejdet vil undervejs blive superviseret af professor Steen Kølvraa. Såfremt RASSF1A ikke giver signifikante resultater vil vi søge efter yderligere gener, hvis promotorregioner er fuldt methylerede i placenta og ikke-methylerede i maternelle blodceller. Når vi har fundet en valid markør for mængden af fosterderiveret DNA i maternelt blod vil vi forsøge at fastlægge et normal niveau for fosterderiveret DNA gennem graviditeten. Dette gøres gennem en række blodprøver på gravide kvinder (ca. 50 gravide) på forskellige tidspunkter gennem graviditeten. Herudover vil vi forsøge at optimere PCR metoden evt. i form af digital PCR. Vi vil desuden forsøge at optimere forholdene omkring prøvetagning og behandling af blodprøverne for at minimere lysering af maternelle celler i forbindelse med prøvetagning, transport og proces, og hermed at få den maksimale fraktion af foster DNA i forhold til den maternelle DNA fraktion. Vi vil forsøge at kortlægge den optimale prøveprocesing udfra tiltag som forsigtig blødprøvetagning, hurtig transport, forsigtig centrifugering og evt tilsætnig af en smule fixativ (f.eks. paraformaldehyd) hvilket stabiliserer de maternelle celler og dermed resulterer i en højere andel af føtalt DNA i plasma i forhold til den maternelle fraktion. Der er således en række forhold omkring prøvetagning, der kan resultere i en unødvendig høj procent af maternelt DNA i forhold til føtalt DNA, der skal klarlægges. Denne proces skal sikre os blodprøver med en så høj koncentration af føtalt DNA i forhold til maternelt DNA som muligt. 2). Validering af forekomsten af føtal DNA i moderens blod som parameter for placentafunktionen. Serien forudgås af en række systematiske kortlæggelser af dag-til-dag variation i mængden af placental-dna, døgnvariationer i placental-dna og stabiliteten af den placentale DNA efter blodprøvetagning. Projektets praktiske udførelse indebærer opsamling af blodprøver fra en række gravide (20-30) med tegn på placentainsufficiens og en tilsvarende gruppe kontrolkvinder. Patientgruppen skal herefter stratificeres efter graden af placentainsufficiens og mængden af føtal DNA i serum måles hos såvel patienter som kontroller og stratificeres efter graviditetstidspunkt. Samarbejdspartnere: Projektet udføres som et samarbejde mellem Gynækologisk-Obstetrisk afdeling, Regionshospitalet Horsens, Forskningsenheden ved Regionshospitalet Horsens, Klinisk Genetisk afdeling, Vejle Sygehus og Gynækologisk-obstetrisk afdeling, Skejby Sygehus. Patienter: Patient-rekruttering: Til første del af projektet der indeholder dels metodeudvikling dels fastlæggelse af normal niveau for fosterderiveret DNA hos gravide rekrutteres gravide på forskellige tidspunkt i graviditeten f.eks. i forbindelse med ultralydsskanning i uge 12, 19 eller senere i graviditeten. Kvinderne får udleveret skriftligt materiale og såfremt, de indvilliger i at 3 af 6

4 deltage, tages blodprøve, som anonymiseres. Til metodeudvikling vil initialt bruges kvinder, der vides at vente drengebørn. Til det kliniske forsøg validering af forekomsten af føtal DNA i moderens blod som parameter for placentafunktionen rekrutteres ca gravide med verificeret mistanke om vægtafvigelse > 20 % ved ultralydsskanning. De gravide får udleveret skriftligt materiale og hvis de ønsker at deltage vil de få taget blodprøve. Der inkluderes et lignende antal gravide med normal vægtskanning. I forbindelse med inklusion af patienter vil disse få udleveret et spørgeskema indeholdende spørgsmål af obstetrisk karaktér, helbredsmæssigeoplysninger mm der kunne tænkes at influere på værdien af fosterderiveret DNA. Disse oplysninger vil blive gemt i en dertil oprettet database og vil senere blive sammenholdt med DNA værdier og graviditetsudfald. Statistiske analyser: Data vil blive bearbejdet med relevante statistiske analyser. Der ønsker inkluderet et antal forsøgspersoner, der detekterer en signifikant forskel i niveauet af føtal DNA hos hhv bormale gravide og gravide med placentainsufficiens, hvis en sådan forskel findes. For at kunne beregne dimensioneringen (styrken) af forsøgsdesignet er det nødvendigt med kendskab til fordeling af måleresultaterne samt spredningen af dem. På forhånd haves ingen konkret viden om de forventede målinger og spredning af disse, idet de tidligere undersøgelser små, med stor spredning i værdirne af føtal DNA og udelukkende har været baseret på Y-kromosom føtal DNA. Vi vil efter inkludering af de første 20 deltagere i hver gruppe foretage en interim analyse og herudfra lave en styrkeberegning på deltagerantallet. Inklusionskriterier: Gravide Eksklusionskriterier: Rygere. Stofmisbrugere. Medicinsk lidelse på inklusionstidspunktet. Infektion tidligt i graviditeten. GDM. Tidligere Præeklampsi. Tidligere IUGR. Etiske perspektiver: I første del af projektet anonymiseres blodprøverne. I anden del af projektet, hvor kvinderne følges med blodprøver op gennem graviditeten kan blodprøverne selvsagt ikke anonymiseres, idet vi skal måle flere værdier på den samme kvinde og sammenholde de målte værdier med graviditetsudfaldet, hvorfor vi også skal have tilladelse til journalindsigt fra de medvirkende kvinder. Hvis der måles værdier af forhøjet 4 af 6

5 fosterderiveret DNA i forhold til vores initialt definerede normalområde, vil vi ikke informerer kvinden herom, da der foreligger en potentiel risiko for forhøjet fosterderiveret DNA har betydning for graviditetsudfaldet, men en sådan sammenhæng er ikke videnskabeligt bevist. Prøvetagningsmæssigt drejer det sig om blodprøver, hvilket ikke repræsenterer en risiko for deltagerne og anses som helt ufarlig for fostrene. Projektplan: Marts 2011 Februar Oplæring i laboratorieteknik. Indsamling af data og databearbejdelse. Udvikling af metode til detektering af fosterderiveret DNA. Optimering af forhold omkring genetisk analyse. Klinisk forsøg. Obligatoriske kurser: Grundkursus i sundhedsvidenskabelig forskning. Biostatistik. Anden kursus aktivitet herunder kursus i PCR teknik. Formidlingsaktivitet: Løbende afholdes foredrag for personalet i deltagende afdeling med information projektets resultater. Foredrag for samarbejdspartnerer. Deltagelse i relevante kongresser. Marts Marts Udarbejdelse af PhD afhandling, publikationer mm. Økonomi: Løn PhD stud. (3år) Drift, reagenser lab. Bioanalytiker assistance kr kr kr. Finansiering: Der er fra Region Midtjyllands Forskningsfond ydet et stipendium på kr. Derudover støttes projektet økonomisk af Kvindeafdelingen, Regionshospitalet Horsens. 5 af 6

6 Referencer: 1. Wataganara T, Bianchi DW. Fetal cell-free nucleic acids in the maternal circulation: new clinical applications. Ann N Y Acad Sci jun; 1022: Maron JL, Bianchi DW. Prenatal diagnosis using cell-free nucleic acids in maternel body fluids: a decade of progress. AM J Med. Genet C Semin Med Genet Feb 15; 145 C: Leung TN, Zhang J, Lau TK, Hjelm NM, Lo YM. Maternel plasma fetal DNA as a markar for preterm labour. Lancet 1998 Dec 12; 352: Lo YM, Leung TN, Tein MS, Sargent IL, Zhang J, Lau TK, Haines CJ, Redman CW. Quantative abnormalities of fetal DNA in maternel serum in preeklampsia. Clin. Chem Feb; 45: Lau TW, Leung TN, Chan LY, Lau TK, Canh KC, Tam WH, Lo YM. Fetal DNA clearance from maternel plasma is impaired in preeclampsia. Clin. Chem Dec; 48: Tong YK, Lo YM. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acida. Clin. Chem. Acta 2006 Jan; 363: Epub 2005 Aug Chiu RW, Chim SS, Wong IH, Wong CS, Lee WS, To KF, Tong JH, Yuen RK, Shum AS, Chan JK, Chan LY, Yen JW, Tong YK, Weiwe JF, Ferlotte C, Leung TN, Lau TK, Lo KW, Lo YM. Hypermethylation of RASSF 1A in human and the rhesus placentas. Am J Pathol Mar; 170: Hyland CA, Gardener GJ, Davies H, Ward CM, Hyett JA. Evaluation of non-invasive prenatal RHD genotyping of the fetus. Med J Aust Jul 6; 191: Projekttitel: Den lange projektbeskrivelse skal indeholde: 1) baggrund, 2) hypoteser, 3) materialer og metoder, 4) forskningsplan, 5) perspektiver, og skal klart beskrive ansøgerens egen andel i forskningen. Den lange projektbeskrivelse må fylde 5 sider referencer kommer udover. 6 af 6