(19) DANMARK (11) DK B1 (12) PATENTSKRIFT
|
|
- Lone Kristensen
- 8 år siden
- Visninger:
Transkript
1 (19) DANMARK (11) DK B1 (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 8.: C 07 K 14/135 C 12 N 15/45 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (86) International ansøgning nr: PCT/US88/03784 (86) International indleveringsdag: (85) Videreførelsesdag: (83) Deponering af mikroorganismer. (30) Prioritet: US (73) Patenthaver: Pharmacia & Upjohn Company, 301 Henriette Street, Kalamazoo, Michigan 49001, USA (72) Opfinder: Michael Wathen, 3183 St. Anthony Drive, Portage, Michigan 49002, USA (74) Fuldmægtig: Budde, Schou & Ostenfeld A/S, Vester Søgade 10, 1601 København V, Danmark (54) Benævnelse: Polypeptid indeholdende fragmenter fra de to human respiratorisk syncytial virus-glycoproteiner F og G, vaccine indeholdende dette og ekspresslonssystem indeholdende en DNA-sekvens, der kan udtrykke polypeptidet (56) Fremdragne publikationer: Ingen (57) Sammendrag: DNA-præparater koder for hidtil ukendte, kimære glycoproteiner, der kan anvendes til frembringelse af virus-specifikke immun-responsreaktioner mod human respiratorisk syncytial virus. DNA-præparaterne omfatter strukturelle gener, der koder for glycoproteinerne, og ekspressions- og repli kat ions-pl a sm ider, der indeholder strukturgenerne. værtsceller transformeret med de ovennævnte DNA-præparater, vacciner fremstillet ud fra glycoproteinerne samt fremgangsmåder til beskyttelse af mennesker ved podning med disse vacciner er også beskrevet.
2 Den foreliggende opfindelse angår DNA-præparater, der koder for hidtil ukendte, kimære glycoproteiner, der kan anvendes til frembringelse af virus-specifikke immunrespons-reaktioner mod human respiratorisk syncytial virus, 5 HRSV. DNA-præparaterne omfatter strukturelle gener, der koder for glycoproteinerne og ekspressions- og replikationsplasmider, der indeholder de strukturelle gener. Opfindelsen angår også værtsceller, der er transformeret med de ovennævnte DNA-præparater samt, vacciner fremstillet ud fra 10 glycoproteinerne. HRSV blev opdaget i 1956 og findes verden over. Den forårsager sygdomme i det øvre og nedre respiratoriske system, navnlig hos spædbørn og mindre børn. Cirka 30 procent af hospitalsindlagte småbørn med akut respiratorisk sygdom 15 har respiratorisk syncytial virusinfektion. Hos ældre børn og voksne er sygdommen mildere. Hos spædbørn kræver denne alvorlige lidelse ofte hospitalsindlæggelse. Infektioner med respiratorisk syncytial virus vedrører alle segmenter af det respiratoriske system og er i almin- 20 delighed forbundet med feber, hoste, løbende næse og træthed og diagnosticeres klinisk som bronchitis, bronchiolitis, lungebetændelse, croup eller virusinfektion. Hos ældre børn og voksne er viruset i almindelighed begrænset til replikation i den øvre del af åndedrætssystemet. Spædbørn kan an- 25 gribes mere alvorligt, når viruset angriber lungerne, og beskadigelse af lungerne kan være permanent. Primær infektion med respiratorisk syncytial virus forekommer tidligt i livet, i almindelighed inden 4 års alderen. Blandt børn har sygdom forårsaget, at dette virus 30 har tendens til at forekomme mindst ån gang om året i forholdsvis skarpt definerede udbrud af flere måneders varighed. Epidemier er skarpt afgrænsede, i almindelighed i 3 til 5 måneder. Ved undersøgelser af familier har det vist sig, at børn i de tidlige skoleår hyppigt indfører viruset i hjemmet 35 og inficerer yngre medlemmer af familien mere alvorligt end 1
3 andre familiemedlemmer. Den kliniske konsekvens af infektionen er alvorligst den første gang og bliver mildere hos ældre individer, der er immunologisk bedre beskyttede. Sekundære virkninger af respiratorisk syncytial virus 5 kan strække sig fra en svag infektion til alvorlig lungebetændelse og dødsfald. Inflammation af åndedrætssystemet er ansvarlig for de fleste symptomer. Fuldstændig helbredelse sker i de fleste tilfælde i løbet af &n til tre uger under produktion af antistoffer, der synes at vedvare livet igen- 10 nem. I De Forenede Stater har ca. 30 procent af 1 år gamle spædbørn og 95 procent af fem år gamle børn cirkulerende respiratorisk syncytialt virus-antistof. Gen-infektioner hos ældre spædbørn, børn og voksne med antistoffer er for det meste milde sygdomme i den øvre del af det respiratoriske 15 system i form af forkølelser. Omend lave udbytter af virus i cellekultur har hindret HRSV-research, er viruset blevet grundigt studeret. HRSV er et paramyxovirus, der indeholder en enkelt negativ streng af RNA, der transkriberes i 10 overvejende monocistroniske 20 budbringere. Budbringerne er blevet isoleret og translateret in vitro. Produkterne er blevet karakteriseret ved gelelektroforese, peptidkortlægning og immuno-udfældning som værende af samme art som strukturelle proteiner, der isoleres fra virioner. De strukturelle proteiner omfatter et hoved-nucleo- 25 capsid-protein (N; molekylvægt ca ), et nucleocapsidphosphoprotein (P; molekylvægt ca ), et stort nucleocapsid-protein (L; molekylvægt ca ), et indesluttet matriksprotein (M; molekylvægt ca ), et matriksglycoprotein (ca ) og to indesluttede glycoproteiner, 30 fusions-glycoproteinet (F; molekylvægt ca til ) og et andet, methionin-fattigt glycoprotein (G; molekylvægt ca til ). Desuden vides et viralt kodet protein på ca dalton og andre små proteiner at være til stede i inficerede celler, jfr. Collins et al., Identification of 35 a tenth mrna of HRSV and assignment of polypeptides to the 10 viral genes, J. of Virol. 12, (1984) og deri 2
4 3,. angivne referencer. Yderligere arbejder, der beskriver den molekylære biologi med hensyn til HSRV, omfatter følgende: (1) Collins et al., Nucleotide Sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory Syncytial 5 virus, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ål, (december 1984), der angiver gensekvensen for F-glycoproteinet, (2) Collins et al., The la Protein Gene of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mrna and a Related Polycistronic Transcript, Virology, 141, (1985), der angiver gensekvensen for 1A-proteinet, (3) Collins et al., The Envelope-Associated 22K Protein of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mrna and a Related Polytranscript, J. of Virol., 54, (nr. 1), (april 1985), der angiver gensekvensen for 22K- 15 proteinet, (4) Wertz et al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, $2, (juni 1985), der angiver gensekvensen for G-glycoproteinet, og (5) Collins et al., Correct 20 Sequence for the Major Nucleocapsid Protein mrna of Respiratory Syncytial Virus, Virology, 146, (1985), der angiver gensekvensen for 00 -proteinet. F- og G-glycoproteinerne af HRSV har lignende modstykker i de andre paramyxovira. Ligesom HRSV har andre 25 paramyxovira et F-glycoprotein, der er associeret med fusion af cellemembraner, jfr. P.W. Choppin og A. Scheid, Rev. Infect. Dis. 2., (1980) og Merz et al., J. Exp. Med. 151, (1980). Det aktive paramyxovirus F-protein består af disulfid-forbundne underenheder, F1 og F2, der 30 dannes ud fra en inaktiv precursor (F0) ved en specifik indre spaltning med cellulære proteaser, jfr. Scheid og Choppin, Virol. BO., (1977). Det andet hoved-glycoprotein for de fleste paramyxovira betegnes HN-proteinet og er associeret med disse viras hæmagglutinin- og neuraminidase- 35 aktiviteter. Omend HRSV-G-proteinet ikke har de ovennævnte enzymatiske aktiviteter, er både G- og HN-glycoproteinerne
5 associeret med tilknytningen af virus. Disse glycoproteiner er også strukturelt lignende, idet de har en usædvanlig hydrofob signal-anker-region ved deres amino-terminal, jf. Wertz et al., PNAS Az, (1985) og Elango et al., 5 J. Virol. U., (1986). Der findes ingen tilgængelige effektive vacciner til bekæmpelse af HRSV. Talrige forsøg er blevet gjort på at opnå en virksom vaccine mod HRSV. Friedewald et al., Journal of the American Medical Association, 204, (20. maj ), beskriver propageringen af respiratorisk syncytial virus i okseembryonisk nyrevævskultur. Virus, der dyrkes ved 34*C eller 28'C, får ikke nedsat infektivitet eller virulens. HRSV, der dyrkes ved 26'C, omend associeret med en nedsættelse af infektivitet for voksne, kan ikke komme i 15 betragtning til anvendelse til prævention af infektion hos voksne, eftersom viruset har begrænset infektivitet og er dårligt immunogent. Kim et al., Pediatrics, AR, (november 1971) angiver, at inaktiveret respiratorisk syncytial virus-vaccine 20 fremstillet ud fra virus, der er dyrket ved 26'C, stimulerer udviklingen af høje niveauer af serum-antistof hos spædbørn og børn fra 6 måneder til 13 år, men hindrer ikke infektion. McIntosh et al., Pediatric Research, R, (1974) diskuterer to eksperimentelle, levende respiratoriske syn- 25 cytial virus-vacciner, &I fremstillet ud fra virus dyrket ved 26'C, og den anden fremstillet ud fra en temperaturfølsom mutant, der vokser godt ved 32 C og slet ikke ved 37 C eller højere. Den første vaccine er utilfredsstillende, eftersom den ikke beskytter mod infektion, når intervallet 30 mellem vaccination og udsættelse for infektion er større end 4 måneder. Den anden vaccine er også utilfredsstillende derved, at den øjensynligt mister sin temperaturfølsomhed hos nogle vaccinerede individer. Craighead, Journal of Infectious Diseases, 121, (juni 1975) diskuterer forsøg udført i 1966, hvor flere grupper af forskere hos spædbørn og mindre børn afprøvede 4
6 et formaldehyd-behandlet alun-udfældet virus dyrket i vævskultur. Ved påfølgende udsættelse for vild virus udviste modtagerne af vaccinen et accentueret mønster af åndedrætssystemlidelser. Craighead konkluderer, at immunisering med 5 formaldehyd-behandlet virus forøger sygdommens alvor. Wright et al., Journal of Pediatrics, AA, (juni 1976) beskriver bedømmelsen hos spædbørn af en temperaturfølsom, levende attenueret respiratorisk syncytial vaccine. Omend denne vaccine, når den indgives i et dosis- 10 niveau, der er tilstrækkeligt højt til at inficere alle seronegative spædbørn, forårsager mild sygdom i det øvre respiratoriske system, opnås der ved nedsættelse af dosen ikke et acceptabelt niveau med hensyn til infektivitet. Viruset er også genetisk ustabilt, eftersom der er tegn på 15 tab af temperaturfølsomhed hos én vaccineret person. Der er tegn på potensering af naturlig sygdom med denne vaccine, og gen-infektion forekommer blandt de vaccinerede individer. I US patentskrifterne nr og nr beskrives en fremgangsmåde til attenuering af virioner ved 20 seriepassage gennem humane diploide lunge-fibroblaster, og i US patentskrift nr beskrives en metode til produktion af immunogenisk aktive HRSV-proteiner på cellemembranerne af udsatte celler, der dyrkes i kultur. Disse celler injiceres dernæst i en værtsorganisme til fremkaldelse 25 af et immunrespons. Det rekombinante vaccinia-virus-ekspressionssystem vides særskilt at udtrykke G- og F-glycoproteinerne af HRSV, jfr. Ball et al., Expression of the Major Glycoprotein G of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia 30 Virus Vectors, P.N.A.S., USA, fil, (1986) og Olmsted et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individuel Contributions of the F and G Glycoproteins to Host Immunity, P.N.A.S., USA, $2, (1986). Disse 35 to glycoproteiner er også påvist at inducere immunobeskyttelse hos pattedyr mod en udsættelse for levende HRSV-virus, 5
7 jfr. Stott et al., Human Respiratory Syncytial Virus Glycoprotein G Expressed from Recombinant Vaccinia Virus Vector Protects Mice Against Live-virus Challenge, Journal of Virology, 2, (1986), Walsh et al., Immunization with 5 Glycoprotein Subunits of Respiratory Syncytial Virus to Protect Cotton Rats Against Viral Infection, Journal of Infectious Diseases, (1987), Wertz et al., Expression of the Fusion Protein of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors and Protection 10 of Vaccinated Mice, Journal of Virology, (1987), og Elango et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1986). 15 Den foreliggende opfindelse angår et polypeptid, der indeholder en signalsekvens og mindst ft immunogent fragment fra begge humane respiratoriske syncytiale virus-glycoproteiner F og G. Anvendelsen af dette protein som en vaccine, fremgangsmåder til hindring af HRSV-beslægtet sygdom og 20 fremstilling af dette protein under anvendelse af rekombinant-teknik omfattes også af den foreliggende opfindelse. De i det følgende definerede udtryk anvendes i nærværende beskrivelse. Udtrykket "cellekultur" refererer til samlingen af voksende celler afledt fra enten en multicel- 25 lulær plante eller et multicellulært dyr, der tillader cellerne at forblive levedygtige uden for den oprindelige plante eller det oprindelige dyr. Udtrykket "i nedadgående retning" identificerer sekvenser, der strækker sig længere i ekspressionsretningen, og kodningsregionen er f.eks. i nedadgående 30 retning fra initieringskodonen. Betegnelsen "mikroorganisme" omfatter både enkelte cellulære prokaryote og eukaryote organismer, f.eks. bakterier, actinomycetes og gærarter. Udtrykket "operon" er en komplet enhed af genekspression og -regulering, herunder strukturelle gener, regulator-gener 35 og kontrolelementer i DNA, der genkendes af regulator-genprodukt. Udtrykket "plasmid" refererer til en autonomt selv- 6
8 replikerende, extrakromosomal cirkulær DNA og omfatter både ekspressions- og ikke-ekspressionstyperne. Når en rekombinant mikroorganisme eller cellekultur beskrives som vært for et ekspressionsplasmid, omfatter udtrykket "ekspressionsplasmid" 5 både extrakromosomal, cirkulær DNA og DNA, der er blevet inkorporeret i værtkromosomet eller -kromosomerne. Når et plasmid opretholdes af en værtcelle, replikeres plasmidet enten stabilt af cellerne under mitose som en autonom struktur eller som en inkorporeret del af værtens genom. Udtrykket 10 "promotor" er en region af DNA, der er involveret i bindingen af RNA-polymerasen til initiering af transkription. Udtrykket "DNA-sekvens" refererer til et enkelt- eller dobbeltstrenget DNA-molekyle, der er sammensat af nucleotidbaser, adenosin, thymidin, cytosin og guanosin. Udtrykket "i det væ- 15 sentlige rent" refererer til en sammensætning af protein, der ikke indeholder andet paramyxovirus-protein end det ønskede rekombinante kimære glycoprotein. Skønt de i det væsentlige rene proteiner kan være forurenet med lave niveauer af værtcellebestanddele, er proteinet frit for for- 20 urenende strukturelt og ikke-strukturelt viralt protein, der produceres af replikerende paramyxovira. Udtrykket "egnet vært" refererer til en cellekultur eller mikroorganisme, der er kompatibel med et rekombinant plasmid og vil tillade plasmidet at replikere til inkorporering i dets genom eller 25 til at blive udtrykt. Udtrykket "i opadgående retning" identificerer sekvenser, der skrider frem i modsat retning af ekspressionen. Eksempelvis er den bakterielle promotor i opadgående retning fra transkriptionsenheden, medens initierings-kodonen er i opadgående retning fra kodningsre- 30 gionen. Den foreliggende opfindelse omfatter en række molekylære, genetiske manipulationer, der kan opnås på en række forskellige, kendte måder. Manipulationerne kan opsummeres som opnåelse af en cdna af proteinet, kloningen og replike- 35 ringen af cdna'et i E. coli og ekspressionen af den ønskede cdna i en egnet vært. De følgende beskrivelser vil i detaljer 7
9 angive de forskellige metoder, der er tilgængelige til at udtrykket proteinet, og efterfølges af specifikke eksempler på foretrukne metoder. De specifikke sekvens- og basenummererings-positioner for et bestemt polypeptid, glycoprotein 5 FG, er angivet i skema 9. Generelt kan den nomenklatur og de generelle laboratorieprocedurer, der kræves i forbindelse med den foreliggende opfindelse, findes i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 10 Cold Spring Harbor, New York, 1982 (Maniatis). Alle E. coli-stammer dyrkes på Luria-næringsmedium (LB) med glucose, Difco's Antibiotic Medium nr. 2 og M9- medium suppleret med glucose og syre-hydrolyserede caseinaminosyrer. Stammer med resistens over for antibiotika holdes 15 ved de lægemiddelkoncentrationer, der er beskrevet i Maniatis. Transformationer udføres i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet af Rowekamp og Firtel, Dev. Biol., 22, (1980). Alle enzymer anvendes i overensstemmelse med fabri- 20 kantens instruktioner. Transformanter analyseres ved kolonihybridisering som beskrevet i Grunstein og Wallis, Methods in Enzymology, Efter hybridisering fjernes sonderne og opbevares, og filtrene vaskes i 0,1% SDS, 0,2x SSC i i alt 3 timer med 25 5 ændringer på hver 400 ml. Filtrene lufttørres grundigt, monteres og autoradiograferes under anvendelse af Kodak X- OMAT AR-film og Dupont Cronex Lightnening Plus-intensificerings-sigter i 16 timer ved -70 C. Til sekvensbestemmelse af plasmider fremstilles renset 30 plasmid-dna i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet i Maniatis. Ende-mærkede DNA-fragmenter fremstilles og analyseres ved de kemiske sekvensbestemmmelsesmetoder ifølge Maxam og Gilbert med de modifikationer, der er beskrevet af Collins og Wertz, J. Virol., (1985). 35 Nucleotidstørrelser er angivet i enten kilobaser (kb) eller basepar (bp). De pågældende værdier er anslåede 8
10 værdier, der hidrører fra agarosegel-elektroforese. Det første trin til opnåelse af ekspression af protein er opnåelse af den DNA-sekvens, der koder for proteinet fra cdna-kloner. Denne sekvens klones derpå i et ekspressions- 5 plasmid, der er i stand til at dirigere transkription af genet og tillade effektiv translation af transkriptionen. Biblioteksmetoden til opnåelse af cdna-kodende protein er beskrevet generelt i Maniatis og specifikt i Collins og Wertz, cdna Cloning and Transcriptional Mapping of Nine 10 Polyadenylated RNAs Encoded by the Genome of HRSV, Proc. Natl. Acad. USA A2, (1983) og de dermed relaterede publikationer N. Elango et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Ex- 15 pressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1986) og R.A. Olmstead et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributions of the F and G glycoproteins to Host Immunity, 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1986). Kloner fremstilles ved indsætning af cdna i PstIspaltet pbr322, til hvilket homopolymere dele af dgtp enzymatisk er blevet tilført ved 3'-enderne ved spaltningsstedet. Homopolymerdele af dctp sættes enzymatisk til 3'- 25 endestillingerne af cdna-molekylerne i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet af Mainatis. Ideelt set bør der tilføres rester af dctp eller dgtp til maksimering af kloningseffektiviteten. cdna'en og plasmidet sammenføres og transformeres i E. coli. Klonerne indeholdende cdna med 30 fuld længde detekteres med sonder af mærket viral cdna eller oligonucleotider, der er komplementære til dele af gensekvenserne, efterfulgt af restriktionsenzymanalyse og DNAsekvensbestemmelse. Oligonucleotider syntetiseres kemisk i overensstem- 35 melse med phosphoramidit-triester-metoden i fast fase, der først er beskrevet af Beaucage og Caruthers, Tetrahedron 9 DK B1
11 Letters, 22 (20), (1981), under anvendelse af et automatiseret synteseapparat som beskrevet i Needham-Van- Devanter et al., Nucleic Acids Res., 22, (1984). Rensning af oligonucleotider sker enten ved nativ acrylamid- 5 gelelektroforese eller ved anionbytnings-hplc som beskrevet af Pearson og Regnier, J. Chrom., 255, (1983). Sekvensen af de syntetiske oligonucleotider kan verificeres ved anvendelse af den kemiske nedbrydningsmetode ifølge Maxam og Gilbert, Grossman og Moldava, eds., Academic 10 Press, New York, Methods in Enzymology, Z, (1980). Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af et klonet gen i et prokaryotisk system er det essentielt at konstruere ekspressionsvektorer, der som et minimum indeholder en kraftig promotor til dirigering af mrna-transkription, 15 et ribosom-bindingssted til translations-initiering, og en transkriptionsterminator. Eksempler på regulatoriske regioner, der er egnede til dette formål, er promotor- og operator-regionen af E. coli-tryptophan-biosyntesevejen, der er beskrevet af Yanofsky, Kelley og Horn, J. Bacteriol., 158, (1984) og den venstrevendte promotor af phag lambda (PL) som beskrevet af Herskowitz og Hagen, Ann. Rev. Genet., (1980). Proteinerne produceret i E. coli vil ikke foldes på korrekt måde på grund af tilstedeværelsen af cystein-rester 25 og på grund af manglen på egnede post-translationelle modifikationer. Under rensning fra E. coli skal de udtrykte proteiner først denatureres og dernæst renatureres. Dette kan udføres ved opløseliggørelse af de E. coli-producerede proteiner i guanidin-hc1 og reduktion af alle cystein-rester- 30 ne med fi-mercaptoethanol. Proteinet renatureres derpå enten ved langsom dialyse eller ved gelfiltrering, jfr. US patentskrift nr Detektering af proteiner opnås ved metoder, der er kendte i teknikken, f.eks. radioimmunobestemmelser eller 35 Western blotting-metoder eller immunoudfældning. Rensning fra E. coli kan ske under anvendelse af metoder, der er 1 0
12 beskrevet i US patentskrift nr Ekspression af heterologe proteiner i gær er velkendt og beskrevet. Methods in Yeast Genetics, Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) er et anerkendt værk, 5 der beskriver de forskellige metoder, der anvendes til produktion af proteiner i gær. Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af et gen i gær er det essentielt at forbinde genet til et kraftigt promotor-system som i prokaryoten og også at tilvejebringe 10 effektiv transkriptions-terminerings-/polyadenylerings-sekvenser fra et gær-gen. Eksempler på egnede promotor-forbindelser omfatter GAL1,10, jfr. Johnston og Davis, Mol. and Cell. Biol., A, (1984), ADH2, jfr. Russell et al., J. Biol. Chem. 258, (1983), PHO5, EMBOJ (1982) og MFal. Et multikopi-plasmid med en selektiv markør såsom Lue-2, URA-3, Trp-1 eller His-3 er også ønskeligt. MFal-promotoren foretrækkes. MFal-promotoren i en vært af a-associerings-typen er konstitutiv, men mangler diploider eller celler med a-associations-typen. Den kan imidlertid 20 reguleres ved forøgelse eller formindskelse af temperaturen i værter, der har en ts-mutation ved ft af SIR-stederne. Virkningen af en sådan mutation ved 35 C på en celle af a- typen er en aktivering af det normalt "tavse" gen, der koder for a-associerings-typen. Ekspressionen af det "tavse" a- 25 associations-type-gen ophæver igen virkningen af MFal-promotoren. Ved formindskelse af væksttemperaturen til 27 C reverseres hele processen, dvs. at a-associerings-typen fjernes, og MFal aktiveres, jfr. Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones og 30 Broach, eds., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, (1982). Polyadenylerings-sekvenserne tilvejebringes ved 3'- endesekvenserne af ethvert af de højt udtrykte gener, f.eks. ADH1, MFal eller TPI, jfr. Alber og Kawasaki, J. of Mol. 35 and Appl. Genet. 1, (1982). Et antal gærekspressionsplasmider såsom YEp6, YEp13 1 1
13 DK Bi og YEp24 kan anvendes som vektorer. Et gen, der har interesse, kan fusioneres til enhver af de ovennævnte promotorforbindelser og dernæst ligateres til plasmiderne til ekspression i forskellige gær-værter. Disse plasmider er fuld- 5 stændigt beskrevet i litteraturen, jfr. Botstein et al., Gene, A, (1979) og Broach et al., Gene, 1, (1979). Der anvendes to metoder ved transformering af gærceller. I itt tilfælde omdannes gærceller først til proto- 10 plaster under anvendelse af zymolyase, lyticase eller glusulase, efterfulgt af tilsætning af DNA og polyethylenglycol (PEG). De PEG-behandlede protoplaster regenereres derpå i et 3%'s agarmedium under selektive betingelser. Enkeltheder ved denne metode er angivet i offentliggørelserne af Beggs, 15 Nature (London), 275, (1978) og Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7, (1978). Den anden metode involverer ikke fjernelse af cellevæggen. I stedet behandles cellerne med lithiumchlorid eller -acetat og PEG og anbringes på selektive plader, jfr. Ito et al., J. Bact. 153, (1983). cdna'en kan ligateres til forskellige ekspressionsvektorer til anvendelse ved transformation af værtscellekulturer. Vektorerne indeholder alle gensekvenser til initiering af transkription og translation af de proteiner, der er 25 forenelige med den værtscelle, der skal transformeres. Desuden indeholder vektorerne fortrinsvis en markør til tilvejebringelse af en phenotypisk egenskab til udvælgelse af transformerede værtsceller, f.eks. dihydrofolat-reduktase eller metallothionein. Desuden kan en replikationsvektor 30 indeholde en replikon. Illustrerende eksempler på cellekulturer, der kan anvendes til produktionen af proteiner, er celler af insekteller pattedyroprindelse. Pattedyrs-cellesystemer vil ofte være i form af monolag af celler, omend der også kan anvendes 35 pattedyrs-cellesuspensioner. Illustrerende eksempler på pattedyrs-cellelinjer omfatter VERO- og HeLa-celler, kine- 12
14 sisk hamsterovarie-cellelinjer (CHO), WI38, BHK, COS-7 eller MDCK-cellelinjer. Som angivet ovenfor indeholder den vektor, der anvendes til at transformere værtscellen, fortrinsvis gensekvenser 5 til initiering af transkriptionen og translationen af proteinets gensekvens. Disse sekvenser betegnes som ekspressions-kontrolsekvenser. Når værtscellen er af pattedyr- eller insektoprindelse, opnås illustrerende, anvendelige ekspressions-kontrolsekvenser fra SV-40-promotoren, jfr. Science, , (1983), CMV I.E.-promotoren, jfr. Proc. Natl. Acad. Sci. Al, (1984), metallothionein-promotoren, jfr. Nature, 296, (1982) eller baculovirus-polyhedrinpromotoren (insektceller), jfr. Virol., 131, (1983). Plasmidet eller replikerende eller integrerende DNA-materiale 15 indeholdende ekspressions-kontrolsekvenserne spaltes under anvendelse af restriktionsenzymer og indstilles i størrelse som nødvendigt eller ønskeligt og ligateres med cdna, der koder for proteiner, under anvendelse af metoder, der er velkendte i teknikken. 20 Ligesom i tilfældet med gær skal der, når der anvendes højere dyre-værtsceller, inkorporeres polyadenylerings- eller transkriptions-terminator-sekvenser fra kendte pattedyrsgener i vektoren. Et eksempel på en terminator-sekvens er polyadenylerings-sekvensen fra oksevæksthormon-genet. 25 Yderligere gen-sekvenser til regulering af replikation i værtscellen kan inkorporeres i vektoren, f.eks. sådanne, der findes i okse-papillomavirus-type-vektorer, Saveria- Campo, "Bovine papilloma-virus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA Cloning Vol. II - A practical approach, Glover, 30 ed., IRL Press, Arlington, Virginia, (1985). Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes til at udtrykke proteiner i kinesiske hamsterovarie-celler (CH0), er en overføringsvektor psvcow7, der replikerer i både CHOog E. coli-celler under udnyttelse af ampicillin-resistens, 35 og dihydrofolat-reduktase-gener som markører i henholdsvis E. coli- og CHO-celler. Plasmid psvcow7 tilvejebringer også 13
15 den polyadenylerings-sekvens fra oksevæksthormon, der er nødvendig til ekspression i CHO-celler. Plasmid psvcow7 spaltes, og der indsættes en viral promotor og cdna'er. Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes ved 5 dannelse af rekombinant baculovirus til ekspression af proteiner i insektceller, er pac373, jfr. Smith et al., Mol. Cell. Biol., 2, (1983). Plasmidet replikerer i E. coli-celler under udnyttelse af ampicillin-resistens og tilvejebringer det eukaryotiske promotor- og polyadenyle- 10 rings-signal fra baculovirus-polyhedrin-genet til ekspression af gener. Plasmid pac373 spaltes, og en cdna indsættes stødende op til promotoren. Dette nye plasmid cotransficeres med baculovirus (Autograpa californica kerne-polyhedrosisvirus)-dna i insektceller ved calciumphosphat-fældning. 15 Rekombinant baculovirus, i hvilket pac373-polyhedvin-genet indeholdende en cdna er erstattet med det residente virale polyhedrin-gen ved homolog rekombination, detekteres ved "dot blot"-hybridisering under anvendelse af 32P-mærket cdna som en sonde, jfr. Summers og Smith, a Manual of Methods 20 for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M University, College Station, TX, (1986). Insektceller inficeret med rekombinant baculovirus kan også differentieres ved hjælp af deres okklusions-negative morfologi, eftersom indsætningen af cdna'en i polyhedrin-genet 25 hindrer syntesen af dette okklusions-dannende protein. Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes i forbindelse med okse-papilloma-virus (BPV) til ekspression af proteiner, er ptfw9 (plasmidet ptwf9 er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten. Plasmid ptfw9 opret- 30 holdes i en E. coli-vært og er deponeret ved Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, den 17. november 1986 og har fået deponeringsnummeret NRRL B-18141). Plasmidet replikerer i E. coli under udnyttelse af ampicillin-resistens og tilvejebringer muse-metallothionein-promo- 35 toren og SV40-polyadenylerings-signalet til ekspression af gener. Plasmid ptfw9 spaltes, og en cdna indsættes stødende 14
16 op til promotoren. Dette nye plasmid spaltes derpå for at tillade indsætning af BPV. Det rekombinante plasmid transficeres i dyreceller ved calciumphosphat-fældning, og foci af transformerede steder udvælges. 5 Værtscellerne er kompetente eller gøres kompetente til transfektion ved forskellige metoder. Der findes flere velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller. Disse omfatter følgende: calciumphosphat-fældning, fusion af de modtagende celler med bakterielle protoplaster indeholdende 10 DNA'en, behandling af de modtagende celler med liposomer indeholdende DNA'en og mikroinjektion af DNA'en direkte i cellerne. De transficerede celler dyrkes ved metoder, der er velkendte i teknikken, jfr. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson og Ross, 15 Inc. (1977). Rekombinante glycoproteiner udtrykt i et af de ovennævnte eukaryotiske ekspressionssystemer isoleres fra cellesuspensioner dannet ved sprængning af værtscelle~et ved kendte mekaniske eller enzymatiske metoder. Proteiner, der er udformet til at blive udskilt fra cellerne, isoleres 20 fra medierne uden sprængning af cellerne. Til rensning af glycoproteiner er det en hjælp først at påføre den cytoplasmiske fraktion på en lentil-lectin-søjle, der specifikt vil binde glycoproteiner. De eluerede glycoproteiner påføres dernæst på en affinitetssøjle indeholdende antistof. 25 Et typisk glycoprotein kan opdeles i tre regioner. Ved aminoterminalenden findes der en hydrofob region, der betegnes som signalsekvensen. Denne sekvens af aminosyrer signalerer transporten af glycoproteinet til cellemembranen. Efter transporten fjernes signalsekvensen ved spaltning. I 30 nedadgående retning fra signalsekvensen findes det extracellulære domæne af det modne glycoprotein. Dette er den immunogene del af glycoproteinet, eftersom det er tilgængeligt for antistoffer. Ved carboxy-terminalenden af glycoproteinet findes den hydrofobe anker-region, der bevirker, at glyco- 35 proteinet bibeholdes i cellemembranen. HRSV F er et typisk glycoprotein derved, at det indeholder en amino-terminal 15 DK B1
17 16 DK B1 signalsekvens og carboxy-terminal ankersekvens, jfr. Collins et al., PNAS fil, (1984). HRSV G-glycoproteinet er imidlertid usædvanligt, eftersom dets aminoterminale ende fungerer både som en signal- og en anker-region, jfr. Wertz 5 et al., PNAS, (1985). Et glycoprotein kan udformes til at blive udskilt fra celler i de omgivende medier. Dette udføres ved at forårsage en tidlig terminering af glycoproteinet forud for transkription af anker-regionen, jfr. Lasky et al., Biotech- 10 nology, a, (1984). Tidlig terminering kan opnås ved indsætning af et universalt translationelt terminator-oligonucleotid på et passende sted i genets DNA. Disse oligonucleotider er kommercielt tilgængelige. Tidlig terminering kan også opnås ved ændring af aflæsningsrammen, hvorved der 15 dannes en translationel termineringskodon. Det nedenfor beskrevne kimære glycoprotein består af signal- og extracellulære domæner af HRSV F forbundet til det extracellulære domæne af HRSV G og vil blive betegnet som FG. Hovedparten af det extracellulære domæne af G glyco- 20 proteinet er indeholdt i den kodningsregion, der spændes over af DdeI (nucleotid-stilling 302) og FoKI (nucleotidstilling 850)-restriktionsenzymstederne. Denne sekvens koder ikke for signal/ankerregionen af glycoproteinet. Hovedparten af det extracellulære domæne af F-glycoproteinet er indeholdt 25 i kodningsregionen forud for NsiI (nucleotid-stilling 1479)- restriktionsenzynstedet. Denne sekvens koder for signalregionen og hovedparten af den antigene region, men ikke ankerregionen af glycoproteinet. Til indsætning af G-glycoproteinsekvensen i F-glyco- 30 proteinet fordøjes plasmidet G-16 indeholdende HRSV gpg med DdeI og FoKI, og enderne gøres stumpe med Klenow-polymerase. 550 bp-fragmentet isoleres dernæst ved agarosegel-elektroforese. Plasmidet pgpf-4 indeholdende HRSV gpf-genet fordøjes med NsiI. Enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase og 35 dephosphoryleres med bakteriel alkalisk phosphatase. 550 bp-fragmentet fra G-16 ligateres derpå i pgpf-4-plasmidet
18 17 DK B1 og transformeres i E. coli HB101. /.1 af klonerne, pgpfg-1, der isoleres fra transformationen, verificeres som havende de korrekte forbindelser ved hjælp af Maxim-Gilbert-sekvensbestemmelse. 5 Når det er korrekt anbragt i en eukaryotisk ekspressionsvektor, er det ovenfor beskrevne FG-gen udformet til at udtrykke et kimært glycoprotein, der vil transporteres til cellens overflade og sekreteres i medierne. De ovennævnte restriktions-enzymsteder vælges, efter- 10 som de tillader ekspressionen af en stor andel af de relevante regioner af F- og G-glycoproteinerne. Andre dele af glycoproteinerne kan imidlertid udtrykkes ved udvælgelse af andre restriktionsenzymsteder i F- og G-kodningssekvenserne til fusion af disse gener. Eksempelvis kan restriktionsen- 15 zymerne Alul, HincII eller Hinfl anvendes til spaltning ved 5'-enden af gpg-genet. Restriktionsenzymerne HphI, MboII eller XhoII kan anvendes til spaltning ved 3'-enden af gpggenet. Enzymerne kan anvendes i enhver kombination af to, idet ft enzym hidrører fra hver gruppe, til dannelse af 20 immunogene proteinfragmenter. For gpf-genet kan HinfIII, HincII, AvaII, SspI eller Hphi-restriktionsenzymerne anvendes i stedet for NsiI. Linker-oligonucleotider kan tilsættes til korrektion af aflæsningsrammen i forbindelsesregionerne. To oligonucleotider, der vil korrigere de to mulige ram- 25 meændringer, er SalI-forbindelsesstykkerne GGTCGACC og CGGTCGACCG CCAGCTGG GCCAGCTGGC der er kommercielt tilgængelige. Når der ønskes en ankerregion i glycoproteinet, tilsættes et linker-oligonucleotid 30 også ved den anden forbindelse til at tillade syntese af gpf-ankerregionen. Alternative strategier kan udformes til ekspression af et FG-fusionsprotein ved indsætning eller deletion af forskellige sekvenser. Hovedkriteriet for proteinet er bibeholdelsen af en signalsekvens og de immunolo- 35 gisk betydningsfulde regioner af de to glycoproteiner. Indsætning af FG-gen i CHO-, BPV- eller baculovirus-
19 ekspressionsvektorer er allerede beskrevet. Det kimære FG-glycoprotein frembyder fordele i forhold til ekspressionen af de individuelle glycoproteiner. Eftersom FG er et enkelt protein, kræver det halvdelen af 5 arbejdet og reagenserne til rensning sammenlignet med de særskilte F- og G-glycoproteiner. Det kimære FG-glycoprotein sekreteres også i medierne til lettelse af rensningen. F- glycoproteinet kan udformes som et sekreteret glycoprotein ved afskæring forud for anker-regionsekvenserne. HRSV G- 10 glycoproteinet indeholder imidlertid en signal/anker-region ved dets amino-terminale ende. Afskæring af dette glycoprotein vil derfor ikke tilvejebringe en sekreteret form. Signal/anker-regionen kan erstattes med en signalregion fra et fremmed glycoprotein, men herved vil der indføres fremmede 15 proteinsekvenser i den potentielle vaccine. HRSV F- og G-glycoproteinerne er blevet udtrykt under anvendelse af et vaccinia-virus-ekspressionssystem, og disse rekombinante vira er blevet anvendt som vacciner ved beskyttelse af bomuldsrotter ("cotton rats") mod HRSV-infektion, 20 jfr. Olmsted et al., PNAS $2, (1986). Vacciniavirus, der udtrykker F-glycoproteinet, er signifikant mere immunugent og tilvejebringer bedre beskyttelse end vacciniavirus, der udtrykker G-glycoproteinet, jfr. Olmsted et al., se ovenfor. Vaccination med begge vira synes ikke at have 25 en additiv effekt i forhold til F alene, jfr. Olmsted et al., se ovenfor. I modsætning hertil synes det sekreterede FG-glycoprotein at være mere immunogent og at tilvejebringe bedre beskyttelse end en sekreteret form af F-glycoproteinet. Vaccination af bomuldsrotter med FG-proteinet giver også en 30 højere procentdel af neutraliserende antistof som defineret ved ELISA til neutralisationsforholdet. t forsøg er udformet til sammenligning af immunogeniteten af FG og afskåret F (Ft). Eftersom de rekombinante glycoproteiner ikke kan detekteres i ConA (et lectin, der 35 binder glycoproteiner)-rensede ekstrakter ved hjælp af Commasie-blue-farvning af proteiner, der er elektroforesebe- 18
20 handlet i SDS-PAGE-geler (formodentlig mindre end 1% af proteinet), anvendes der en indirekte metode til bestemmelse af ækvivalente mængder af glycoproteinerne. Densitometeraflæsninger af autoradiogrammer indeholdende 35S-methionin- 5 mærket protein, der er blevet elektroforesebehandlet på en SDS-PAGE-gel, anvendes til bestemmelse af den relative mængde af FG og Ft i prøverne (FG og Ft indeholder det samme antal methioniner). Disse samme prøver undersøges dernæst ved hjælp af ELISA, og det findes, at ækvivalente mængder af FG 10 reagerer 3 gange bedre end Ft ved den anvendte ELISA-analyse. Mængden af FG eller Ft i prøverne fremstillet til vaccination bestemmes dernæst ved hjælp af ELISA og equaliseres i overensstemmelse med det ovennævnte forhold. Grupperne ved den anvendte undersøgelse er FG, Ft (høj dosis), Ft (lav dosis) 15 og gp50 (negativ kontrol). Bomuldsrotterne vaccineres tre gange i Freund's adjuvans, idet der anvendes 500 pg totalt protein pr. dosis. Mængden af specifikt glycoprotein i FGgruppen er ækvivalent med lavdosis-ft-gruppen. Højdosis-Ftgruppen modtager 3 gange mere specifikt glycoprotein. En 20 sammenfatning af de fra denne undersøgelse opnåede data er angivet i det følgende: LUNGE TITER ELISA-TITER NEUTRAL TITER ELLMEITML Gruppe (pfu/gm lunge) (50% ende pt) (50% ende pt) Forhold FG < ,53 Ft høj 2,0 x ,91 Ft lav 6,1 x ,85 gp50 2,7 x 10 5 < ND (ikke bestemt) Den ovenfor omtalte undersøgelse viser effektiviteten af det kimære FG-glycoprotein under anvendelse af rå præparater af FG i Freunds's adjuvans. Til påvisning af effektiviteten af FG til at inducere høje titere af neutralise- 35 rende antistof og beskyttelse af bomuldsrotter mod RSV-påvirkning, foretages der en undersøgelse under anvendelse af
21 mere rensede præparater af FG sammensat i et adjuvans, der er acceptabelt til human anvendelse (alun). FG renses til 50%'s homogenitet under anvendelse af en totrinsmetode, der involverer kationbytning og monoklonale antistof-affinitets- 5 søjler. Ft-glycoproteinet renses til 50%'s homogenitet ved lentil-lectin-chromatografi, efterfulgt af monoclonalt antistof-affinitetschromatografi. Bomuldsrotter vaccineres to gange med disse glycoproteiner adsorberet i alun (2,5 mg pr. dosis). Ln gruppe rotter vaccineres intranasalt med 10 levende RSV som en positiv kontrol. hl gruppe rotter vaccineres med alun-adjuvanset som en negativ kontrol. Rotter fra hver gruppe afprøves for serum og neutraliserende antistof. Rotterne udsættes for RSV, og lungerne analyseres for viruset. 15 Gruppe Serum antistof Neut. antistof 20 Antal in- ficeret total Gennemsnitlig lungetiter hos inficerede rotter Etg FG + alun /7 5 Etg FG + alun /6 1 Etg FG + alun /7 3,5 x Etg FG + CFA /7 1,0 x Etg FT + alun /7 3,0 x Etg FT + alun /7 6,7 x 10 2 alun-indhold < /7 9,7 x 104 RSV I.N /7 50 Konventioner, der anvendes til at repræsentere plas- 30 mider og fragmenter i de følgende skemaer nr. 1-6, skal være synonyme med konventionelle cirkulære fremstillinger af plasmider og deres fragmenter. I modsætning til de cirkulære figurer repræsenterer de enkeltlinjede figurer i skemaerne både cirkulær og lineær dobbeltstrenget DNA med initiering 35 eller transkription forekommende fra venstre til højre (5' til 3'). Stjerner (*) repræsenterer brodannelse af nucleotider til fuldstændiggørelse af den cirkulære form af plas-
22 miderne. Fragmenter har ikke nogen stjernemarkeringer, eftersom de er lineære stykker af dobbeltstrenget DNA. Endonuclease-restriktionssteder er angivet over linjen. Gen-markører er angivet under linjen. Linjestykker angivet under 5 diagrammerne, der repræsenterer plasmidet eller fragmenter, anvendes til at angive antallet af basepar mellem to punkter på DNA'en. Den relative afstand mellem markører angiver ikke faktiske afstande, men skal blot indikere deres relative positioner på den illustrerede DNA-sekvens. 10 Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler. Eksempel i WB. e n I- e CO I en Iffil. 15 Til opnåelse af maksimal ekspression af F-glycoproteinet skal de G-C-nucleotider, der anvendes til at indsætte cdna'en i plasmidet pbr322, fjernes fra 5'-enden (i forhold til den oprindelige mrna) af cdna'en. Til bekvem indsætning af gpfg-cdna'en i den foretrukne ekspressionsvektor for 20 CHO-celler, psvcow7 (beskrevet nedenfor), er det nødvendigt at tilføre et BamHI-sted i opadgående retning fra proteinkodningssekvensen. Til opnåelse af dette indsættes cdna'en af F-glycoprotein i puc12 (PL Pharmacia Labs, Piscataway, NJ). Metoder til syntese af cdna-klonen F5-25, der indeholder 25 hele sekvensen for F-glycoproteinet, er blevet beskrevet, jfr. Collins et al., Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, jfr. J. Virol., fil, (december 1984). 30 A. Konstruktion af tgpf2 - Skema 1 cdna'en af F-glycoproteinet flankeres af PstI-steder (skema 1), men der findes imidlertid også indre PstI-steder. Plasmidet pf5-25 fordøjes derfor partielt med Pst/ og fragment 1 (1,9 kb) isoleret fra en gel. Fragment 1 ligateres 35 til plasmidet puc12 (Bethesda Res. Labs., Rockville, MD), der er blevet fordøjet med PstI. Et plasmid med 5'-enden af 21
23 22 DK B1 gpf-genet stødende op til XbaI-stedet i puc12 udvælges og betegnes pgpf2 (4,6 kb). Denne orientering verificeres ved spaltning med NsiI og HindIII, der danner et fragment på ca. 400 bp. 5 B. Konstruktion af pgpf3 _og pgpf4 - Skema ^, Til fjernelse af G-C-nucleotiderne fra 5'-enden af cdna'en åbnes pgpf2 med XbaI, og enderne behandles med bakteriel alkalisk phosphatase til dannelse af fragment Fragment 3 fordøjes derpå med Salt, der afskærer et lille stykke mellem Xba/- og PstI-stederne, og behandles med Klenow-enzym til afglatning af enderne. Efter behandling med Klenow-enzym fordøjes fragment 3 med Lambda-exonuclease, der kræver et 5'-phosphat og efterlader et 3'-overhæng. På 15 grund af fjernelsen af 5'-phosphatet på den ende, der befinder sig i opadgående retning fra gpf, vil exonucleasen fordøje i nedadgående retning mod gpf-sekvensen. Exonucleasen gives tilstrækkelig tid til fjernelse af nucleotider udover G/C-hale-regionen ind i leder-sekvensen. En syntetisk sekvens 20 indeholdende de første 15 baser af ledersekvensen hybridiseres til fragment 4, og de manglende baser udfyldes med Klenow-enzym, og enderne ligateres med T4-ligase, hvorved der fås pgpf3 (4,6 kb), der transformeres i E. coli, og sekvensen verificeres. 25 Til fjernelse af G-C-nucleotiderne fra 3'-enden af cdna åbnes pgpf3 med HindIII og behandles med exonucleasen Bal 31 i et tilstrækkeligt tidsrum til fordøjelse gennem G- C-nucleotiderne. Enderne gøres stumpe med Klenow-enzym, og cdna-klonen befries for vektor-dna'en ved digestion med 30 BamHI. cdna-fragmentet isoleres fra en gel og ligateres til plasmid puc12, der er blevet fordøjet med BamHI og Hincil (HincII er foreneligt med stumpe ender) til dannelse af pgpf4. Plasmidet transformeres i E. coli, og en passende klon, der er tilstrækkeligt fordøjet med Ba131, identificeres 35 ved sekvensbestemmelse. Alternativt kan G-C-nucleotiderne fjernes ved fordøjelse med et restriktionsenzym, der har et
24 unikt sted i opadgående retning fra G-C-nucleotiderne. For gpf vil en sådant enzym være HaeII. Eftersom HaeIII spalter i opadgående retning fra F-genets normale translations-terminations-signal, vil et universelt translations-termina- 5 tioms-oligonucleotid (New England Biolabs) ligateres på F- cdna'en efter fordøjelse med HaeIII. DNA'en vil dernæst fordøjes med BamHI og behandles som beskrevet ovenfor til dannelse af pgpf Eksempel 2 23 Klon G2B-16 indeholdende hele kodningsregionen for HRSV-G-glycoproteinet er blevet beskrevet, jfr. Wertz et 15 al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, PNAS,.112., (1985). Klon G2B-16 indeholdende G-glycoprotein-cDNA'en fordøjes med DdeI og FoKI, og enderne gøres stumpe med E. coli-dna-polymerase 20 (Klenow-fragment). DNA'en elektroforesebehandles derpå i en 1,5%'s agarose-gel. 550 bp-fragmentet (fragment 4) indeholdende den relevante region af G-genet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 25 B. Indsætning af G-cDNA-fragmentet i HRSV-F-4ycoproteingenet Plasmidet pgpf4 (Skema 2) fordøjes med Nsil. Enderne gøres stumpe med T4 DNA-polymerase og dephosphoryleres dernæst med bakteriel alkalisk phosphatase. 550 bp-fragmentet 30 af G-cDNA'en ligateres derpå i plasmid pgpf4 til dannelse af det kimære FG-gen (pgpfg-1). Plasmidet transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges for korrekt orientering af G-cDNA'en i F-genet ved fordøjelse med Hinfl, der vil danne forbindelsesfragmenter på 875 bp og 186 bp. Den 35 ukorrekte orientering af G-fragmentet vil give forbindelsesfragmenter på 650 bp og 400 bp ved Hinfl-fordøjelse. Forbin-
25 delsesregionerne af en på korrekt måde orienteret klon verificeres derpå som værende korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvensbestemmelse. Ifølge det ovenstående eksempel vil der dannes et 5 gen, der koder for et kimært glycoprotein indeholdende signal- og immunogen-regionen af F-glycoproteinet forbundet til den immunogene region af G-glycoproteinet. Eftersom den anden forbindelse (G til F) bevirker et rammeskift og translations-termination, vil der ikke være nogen anker-region 10 til stede i glycoproteinet. Eksempel 3 Anvendelse af DNA-oligonucleotid-forbindelsesled til regulering af aflæsningsrammen af et kimært HRSV-FG-glvcopro- 15 tein - Skema 4 Såfremt restriktionsenzymer, der er forskellige fra de, der er angivet i eksempel 2, anvendes til forbindelse af F- og G-generne, kan der forekomme et rammeskift ved den første forbindelse mellem F og G, hvilket fører til tidlig 20 translationel terminering af glycoproteinet. Dette kan undgås ved anvendelse af oligonucleotid-forbindelsesled, der vil gendanne den korrekte aflæsningsramme. 24 A. Fremstilling af HRSV-G-glvcoprotein-genqt 25 Klon-plasmid G2B-16 indeholdende G-glycoproteincDNA'en fordøjes med HphI, og enderne gøres stumpe med T4- DNA-polymerase. SalI-forbindelsesledet CGGTCGACCG GCCAGCTGGC 30 (New England Biolabs) ligateres til enderne af DNA'en. DNA'en fordøjes med Sall og elektroforesebehandles i en 1,5%'s agarosegel. 410 bp-fragmentet (fragment 5) indeholdende den relevante region af G-genet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 35
26 25 aenet Plasmidet pgpf4 fordøjes med NsiI, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase. SalI-forbindelsesledet, der 5 er angivet ovenfor, ligateres til enderne af pgpf4-dna'en. DNA'en fordøjes med Sall og elektroforesebehandles i en 1%'s agarosegel. 4,4 kb-fragmentet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 4,4 kb-pgpf4-dna-fragmentet og 410 bp-g-fragmentet ligateres sammen til dannelse af pgpfg og transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges for den korrekte orientering af G-cDNA'en i F-genet ved fordøjelse med Hinfl, der vil danne forbindelses-fragmenter på 768 bp og 220 bp. Den ukorrekte orientering af tifragmentet vil give forbindelsesfragmenter på 555 bp og bp ved Hinfl-fordøjelse. Forbindelses-regionerne af denne klon verificeres derpå som korrekte ved Maxam-Gilbert-sekvensbestemmelse. Ifølge det ovenstående eksempel vil der dannes et gen, der koder for et kimært FG-glycoprotein svarende til 20 det i eksempel 2 beskrevne. Det kimære glycoprotein, der dannes ifølge dette eksempel, vil indeholde mindre af de immunogene regioner af G-glycoproteinet end det kimære glycoprotein, der dannes ifølge eksempel 2. Kimære glycoproteiner indeholdende andre regioner af de to glycoproteiner 25 kan dannes som beskrevet i eksempel 2 og 3 under anvendelse af de enzymer, der er opregnet i nærværende beskrivelse. Eksempel 4 - I f e - 30 der_ oder for kimære FG-glycoproteiner med fqjskellig længde - Skema 5 Gener, der koder for kimære FG-glycoproteiner indeholdende forskellige regioner af F- og G-glycoproteiner, kan dannes under anvendelse af en kombination af restrik- 35 tionsenzymer og oligonucleotider. Denne procedure tillader F - og G-glycoproteinerne at blive forbundet på ethvert ønsket
Spm. A: Hvad viser data i Figur 1?
Opgave 1 Leptin er et plasma proteinhormon der primært produceres af og secerneres fra fedtceller (adipocytter). Leptin, der er kodet af ob (obecity) genet, er 16 kda stort. Leptins fysiologiske funktion
Læs mereEn forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et:
F2011-Opgave 1. En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: Forward primer: 5 CC ATG GGT ATG AAG CTT TGC AGC CTT
Læs mere(19) DANMARK d2) (12) PATENTSKRIFT
(19) DANMARK d2) (12) PATENTSKRIFT (11) DK 175065 B1 Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.CI 7.: A 61 K 39/02 (21) Patentansøgning nr: PA 1988 05200 (22) Indleveringsdag: 1988-09-16 (24) Løbedag: 1988-09-16
Læs mereBesvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Spm. B:
Besvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Vi må lave et genomisk bibliotek i en lambdafag, cosmid, BAC eller YAC plasmid. Til dette vil vi skære det genomiske DNA partielt med Sau3A, så vi får stykker
Læs mereLøsninger til opgaverne den Spm. A: Spm. B Spm. C:
Løsninger til opgaverne den 12-9-07 Spm. A: Her er vi i en situation at det eneste der kendes til vores receptor er, at den kan binde en ligand, som vi har til rådighed i en radioaktiv mærket version.
Læs meredatp, dctp, dgtp, dttp, [α 32 P]-dCTP urinstofholdig polyacrylamid gel røntgen film
Opgave 1 Denne opgave omhandler osteoblast differentiering. Osteoblast celler er involveret i opbygning af knoglevæv. Osteoblast celler dannes ud fra såkaldte calvarial celler. For at forstå det molekylære
Læs mereBioteknologi A. Gymnasiale uddannelser. Vejledende opgavesæt 1. Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40. 5 timers skriftlig prøve
Vejledende opgavesæt 1 Bioteknologi A Gymnasiale uddannelser 5 timers skriftlig prøve Vejledende opgavesæt 1 Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40 Side 1 af 8 sider pgave 1. Genmodificeret ris Vitamin
Læs mereBesvarelse af opgaverne til den Spm.A: efter TGA TCA Spm. B:
Besvarelse af opgaverne til den 20-9-06 Spm.A: Her vil vi gerne sætte et relativt lille stykke DNA (FLAG) sammen med et relativt stort stykke (PRB1). Det lille stykke er for lille til at vi kan PCR amplificere
Læs mereVelkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Sebastian, Louise og Ana
Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Sebastian, Louise og Ana Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Dagens program 9:00 10:00 Introduktion
Læs mereMaterialeliste: Ready-to-loadTM DNA prøver til elektroforese. Medfølgende reagenser og tilbehør. Egne materialer
Elevvejledning 1 Materialeliste: Ready-to-loadTM DNA prøver til elektroforese A B C D E F Plasmid DNA (uskåret) Plasmid skåret med Bgl I Plasmid skåret med Eco RI Lambda DNA (uskåret) Lambda DNA skåret
Læs mere9 Patent- og Varemærkestyrelsen
(19) DANMARK m 9 Patent- og Varemærkestyrelsen (12) PATENTSKRIFT (10) (51) lnt.ci. : B 28 B 5100 (2006.01) E 01 C 19100 (2006.01) (21) Ansøgningsnummer: PA 2013 00014 (22) Indleveringsdato: 2013-01-10
Læs mere(19) DANMARK (11) DK 175975 B1 (12) PATENTSKRIFT. Patent- og Varemærkestyrelsen
(19) DANMARK (11) DK 175975 B1 (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: A 61 K 39/29 A 61 K 39/395 C 07 K 14/00 C 12 N 7/00 C 12 N 15/00 C 12 Q 1/68 C 12 Cl 1/70 G 01 N 33/576 (21)
Læs mere(19) DANMARK. 2six,l (12) PATENTSKRIFT. Patent- og Varemærkestyrelsen (11) DK 175072 B1
(19) DANMARK (11) DK 175072 B1 2six,l (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: C 12 N 15/38 A 61 K 39/245 C 12 N 15/63 G 01 N 33/569 (21) Patentansøgning nr: PA 1987 02888 (22).
Læs mereCYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm)
Opgave 1 Leveren spiller en central rolle i lipid metabolismen og i opretholdelse af lipid homeostasen i hele kroppen. Lipidmetabolismen er fejlreguleret hos blandt andet svært overvægtige personer samt
Læs mere(19) DANMARK (11) DK 173592 B1 Cb (12) PATENTSKRIFT
(19) DANMARK (11) DK 173592 B1 Cb (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: C 12 N 15/85 C 12 N 15/33 (21) Patentansøgning nr: PA 1982 03869 (22) Indleveringsdag: 1982-08-30 (24)
Læs mereVelkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere:
Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin,
Læs mereDette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia.
Transformation af E.coli K 12 Version 3. marts 2009 (C) Claudia Girnth-Diamba og Bjørn Fahnøe Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages
Læs mereBioteknologi A. Studentereksamen. Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares. Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares.
Bioteknologi A Studentereksamen Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares. Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares. frs111-btk/a-31052011 Tirsdag den 31. maj 2011 kl. 9.00-14.00
Læs mereUndervisningsbeskrivelse fra august 2014
Undervisningsbeskrivelse fra august 2014 Stamoplysninger til brug ved prøver til gymnasiale uddannelser Termin Oktober 2015 Institution Hansenberg Gymnasium Uddannelse Fag og niveau Lærer(e) Hold HTX Bioteknologi
Læs mereUndervisningsbeskrivelse
Undervisningsbeskrivelse Stamoplysninger til brug ved prøver til gymnasiale uddannelser Termin Institution Uddannelse Fag og niveau Lærer(e) Termin hvori undervisningen afsluttes: maj-juni, 2013 Skive
Læs mereStudienummer: MeDIS Exam 2015. Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen
MeDIS Exam 2015 Titel på kursus: Uddannelse: Semester: Videregående biokemi og medicinudvikling Bachelor i Medis 5. semester Eksamensdato: 26-01-2015 Tid: kl. 09.00-11.00 Bedømmelsesform 7-trin Vigtige
Læs mereKlip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' DNA, RNA og protein
Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' Forskere kan lave præcise ændringer
Læs mere1. Cellen og celledelinger. 2. Respiration og gæring
1. Cellen og celledelinger Gør rede for dyrecellens opbygning og beskriv nogle af de processer der foregår i cellen. Beskriv DNA s opbygning og funktion. Beskriv i oversigtsform mitosen, og diskuter mitosens
Læs mereLuftvejsinfektioner (Ekstra fokus på virale) Infektionshygiejnisk perspektiv
Luftvejsinfektioner (Ekstra fokus på virale) Infektionshygiejnisk perspektiv 1. reservelæge, ph.d. Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, AUH Inspireret af tidligere oplæg v. Svend Ellermann-Eriksen, ledende
Læs mereBIOLOGI HØJT NIVEAU. Onsdag den 10. maj 2000 kl. 9.00-14.00
STUDENTEREKSAMEN MAJ 2000 2000-6-1 BIOLOGI HØJT NIVEAU Onsdag den 10. maj 2000 kl. 9.00-14.00 Af de store opgaver 1 og 2 må kun den ene besvares. Af de små opgaver 3, 4, 5, 6 og 7 må kun to besvares. STORE
Læs mere(12) PATENTSKRIFT (11) 1 691 52 B1
(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT (11) 1 691 52 B1 Patentdirektoratet TAASTRUP (21) Patentansøgning nr.: 1147/91 (22) Indleveringsdag: 14 jun 1991 (51) Int.CI.5 C 07 K 15/06 C 12 P 21/00 (24) Løbedag: 03
Læs mereBiologien bag epidemien
Biologien bag epidemien Af Niels Kristiansen, biologilærer, Grindsted Gymnasium Sygdomme kan smitte på mange måder. Enten via virus, bakterier eller parasitter. I det følgende vil vi koncentrere os om
Læs mereCisgen byg med bedre fosfatudnyttelse
Cisgen byg med bedre fosfatudnyttelse Seniorforsker Inger Bæksted Holme Aarhus Universitet, Science and Technology, Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Afgrødegenetik og Bioteknologi Hypotese Det
Læs mereVEROCYTOTOKSIN-PRODUCERENDE BAKTERIOFAGER I E. COLI
VEROCYTOTOKSIN-PRODUCERENDE BAKTERIOFAGER I E. COLI Specialeprojekt i Biologi-bioteknologi, KU Patricia Espenhain Sørensen 13. juni 2017 RATIONALE Verocytotoxin-producerende E. coli (VTEC) / (STEC) - Vigtig
Læs mere(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT. Patent- og Varemærkestyrelsen. (57) Sammendrag: (11) DK 175318 B1
(19) DANMARK (11) DK 175318 B1 (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: A 61 K 39/17 C 12 N 7/00 (21) Patentansøgning nr: PA 1989 03471 (22) Indleveringsdag: 1989-07-13 (24) Løbedag:
Læs mereGenhæmning: et overblik
Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Genhæmning tager et målrettet skridt fremad Målrettet hæmning af det mutante Huntington's chorea-gen,
Læs mereBIOLOGI HØJT NIVEAU. Mandag den 11. august 2003 kl. 9.00-14.00
STUDENTEREKSAMEN AUGUST 2003 2003-6-2 BIOLOGI HØJT NIVEAU Mandag den 11. august 2003 kl. 9.00-14.00 Af de store opgaver 1 og 2 må kun den ene besvares. Af de små opgaver 3, 4, 5 og 6 må kun to besvares.
Læs merePATENT 109646 Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6
PATENT 109646 Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6 Ansøgning nr. 26 43 /65 Indleveret den 25.ma j 19 65 Fremlagt den 18. d e c emb er 19 6 7 DANMARK DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET KØBENHAVN Patentbeskrivelsen
Læs mereGældende fra: April 2014 (Hold SB512) Version: Endelig Side 1 af 5
Molekylærbiologiske analyser og teknikker har viden om teorien og principperne bag udvalgte molekylærbiologiske analyser og teknikker Analyser og analyseprincipper på biomolekylært, celle- og vævs- samt
Læs mereOpgave 1 Listeria. mørkviolette bakteriekolonier, se figur 1a. og b. 1. Angiv reaktionstypen for reaktion. 1 vist i figur 1b.
Opgave 1 Listeria Bakterien Listeria monocytogenes kan være sygdomsfremkaldende for personer, der i forvejen er svækkede. For at identificere Listeria kan man anvende indikative agarplader. Her udnyttes
Læs mereFigur 1: Strukturelt kort over plasmiderne pyeast og pmamal anvendt til undersøgelse af
Opgave 2 juni 1999 DNA rekombination er vigtig for eukaryote celler i forbindelse med meiosen. Samtidig er rekombination mellem fremmed DNA og endogen DNA essentiel i fremstillingen af transgene organismer
Læs mereBakteriers immunsystem
FORSKNING 25 Bakteriers immunsystem åbner døren til en ny æra for biologien Bakteriers immunforsvar mod virus kaldet CRISPR-Cas viser vejen til en teknologi, der rummer et enormt potentiale indenfor bioteknologien.
Læs mereLøsninger til opgaverne den Opgave 2 januar 2003 Spm. 1:
Løsninger til opgaverne den 6-9-06 Opgave 2 januar 2003 Spm. 1: Fidusen er her at vi kender den primære struktur af glukoamylasen fra tre forskellige svampe, en ascomycet, en basidiomycet og en zygomycet.
Læs mereRestriktionsenzymer findes Genkendelsessekvens
Restriktionsenzymer Skanning Restriktionsenzymer findes i bakterier (forsvarsmekanisme) IKKE i eukaryote celler 3-5 - 5-3 - Restriktionsenzyme Genkendelsessekvens Palindromisk Otto, Anna, radar Madam I
Læs mereBrugsvejledning for 7827.10 dialyseslange
Brugsvejledning for 7827.10 dialyseslange 14.06.07 Aa 7827.10 1. Præsentation Dialyseslangen er 10 m lang og skal klippes i passende stykker og blødgøres med vand for at udføre forsøgene med osmose og
Læs mereBILAG I PRODUKTRESUME
BILAG I PRODUKTRESUME 1 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN Ingelvac CircoFLEX injektionvæske, suspension til grise 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING En dosis à 1 ml inaktiveret vaccine indeholder: Aktivt
Læs mereTitle Mevalonat Kinase Defekt (MKD) (eller HYper IgD syndrome)
www.printo.it/pediatric-rheumatology/dk/intro Title Mevalonat Kinase Defekt (MKD) (eller HYper IgD syndrome) Version af 2016 1. HVAD ER MKD 1.1 Hvad er det? Mevalonat kinase mangel er en genetisk sygdom.
Læs merePCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA
PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA PCR til at opkopiere bestemte DNA-sekvenser i en prøve er nu en af genteknologiens absolut vigtigste værktøjer. Peter Rugbjerg, Biotech Academy PCR (Polymerase
Læs mereMagnetfelter og børnekræft - er der en sammenhæng?
NOTAT NP92-961b JKJ/BT-DGR 4. december 1997 Magnetfelter og børnekræft - er der en sammenhæng? Revideret januar 1993 NOTAT NP92-961b 2 1. Om børnekræft I perioden fra 1945 og frem til i dag har udviklingen
Læs merewww.printo.it/pediatric-rheumatology/dk/intro
www.printo.it/pediatric-rheumatology/dk/intro Blau syndrom Version af 2016 1. HVAD ER BLAU SYNDROM/JUVENIL SARKOIDOSE 1.1 Hvad er det? Blau syndrom er en genetisk sygdom. Som patient lider man af en kombination
Læs mereDansk resumé for begyndere
Dansk resumé for begyndere Dansk resumé for begyndere Dette afsnit introducerer bakteriel genregulation for enhver uden forudgående kendskab til dette emne. Alle nødvendige, videnskabelige betegnelser
Læs mereSpm. B: Hvad viser data i Figur 2?
Opgave 1 Kernereceptorer (nuclear receptors) udgør en familie af ligandaktiverede transkriptionsfaktorer, der regulerer transkription af en række gener, som respons på tilstedeværelse af f.eks.lipofile
Læs mereBILAG I PRODUKTRESUME
BILAG I PRODUKTRESUME 1 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN Porcilis PCV, injektionsvæske, emulsion til svin 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING Hver dosis af 2 ml indeholder: Aktivt stof Porcint circovirus
Læs merePATENTSKRIFT. (74) Fuldmægtig: LINGPAT V/OLE JAGTBOE, Letlandsgade 3, 2.mf., 1723 København V, Danmark
(19) DANMARK m " Patent-og Varemærkestyrelsen (12) PATENTSKRIFT (10) (51) lnt.ci.: E 06 C 7148 (2006.01) (21) Ansøgningsnummer: PA2013 00153 (22) Indleveringsdato: 2013-03-18 (24) Løbedag: 2013-03-18 (41)
Læs mereNukleinsyrebaseret vaccine til fisk
Nukleinsyrebaseret vaccine til fisk»og hvad arbejder du så med?«- Udvikling af nukleinsyrebaseret vaccine mod en rabiesbeslægtet virus i fisk - er ikke det forventede svar. Princippet bag den molekylære
Læs mereBiologi A. Studentereksamen. Af opgaverne 1, 2, 3 og 4 skal tre og kun tre af opgaverne besvares
Biologi A Studentereksamen Af opgaverne 1, 2, 3 og 4 skal tre og kun tre af opgaverne besvares 2stx101-BIO/A-28052010 Fredag den 28. maj 2010 kl. 9.00-14.00 Side 1 af 9 sider Opgave 1. Hormonforstyrrende
Læs mereEksamensspørgsmål til BiB biologi B 2015
Eksamensspørgsmål til BiB biologi B 2015 Med udgangspunkt i de udleverede bilag og temaet evolution skal du: 1. Redegøre for nogle forskellige teorier om evolution, herunder begrebet selektion. 2. Analysere
Læs mereSpørgsmål nr. 1. Fedme. Spørgsmål nr.2. Sukker som brændstof. Spørgsmål 3. Søens onde cirkel
Spørgsmål nr. 1 Fedme skal du analysere fordøjelsessystemets form og funktion med fokus på fordøjelse af fedt. Nævnt kort relevante metoder som bruges til undersøgelse af fedme. Endeligt skal du redegøre
Læs mereGAPDH PCR modul Manual
GAPDH PCR modul Manual Katalog nr. 166-5010EDU explorer.bio-rad.com Kopiering kun tilladt til undervisningsbrug Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende
Læs mereBanan DNA 1/6. Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje.
Banan DNA Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje. Baggrundsviden: Om vi er mennesker, dyr eller planter, så har alle organismer DNA i deres celler.
Læs mere11. juli 2005 PRODUKTRESUMÉ. for. Gammanorm, injektionsvæske, opløsning 0. D.SP.NR. 9322. 1. LÆGEMIDLETS NAVN Gammanorm
11. juli 2005 PRODUKTRESUMÉ for Gammanorm, injektionsvæske, opløsning 0. D.SP.NR. 9322 1. LÆGEMIDLETS NAVN Gammanorm 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING Normalt immunglobulin, humant 165 mg/ml Hjælpestoffer
Læs mereVirale luftvejsinfektioner
Virale luftvejsinfektioner Infektionshygiejnisk perspektiv 1. reservelæge, ph.d. Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, AUH Inspireret af tidligere oplæg v. Svend Ellermann-Eriksen, ledende overlæge, professor,
Læs merePATENTSKRIFT. (74) Fuldmægtig: UNGPAT V/OLE JAGTBOE, Letlandsgade 3, 2.mf., 1723 København V, Danmark
(19) DANMARK m " Patent- og Varemærkestyrelsen (12) PATENTSKRIFT (1 O) (51) lnt.ci.: F 16 C 35100 (2006.01) (21) Ansøgningsnummer: PA 2011 00619 (22) lndleveringsdato: 2011-08-17 (24) Løbedag: 2011-08-17
Læs mereFolkeskolens afgangsprøve December 2011. Biologi - Facitliste. Elevnavn: Elevnummer: Skole: Hold: 1/23 B4
Folkeskolens afgangsprøve December 2011 Elevnavn: Elevnummer: Skole: Hold: Elevens underskrift Tilsynsførendes underskrift 1/23 B4 Indledning Mennesket ændrer på dyr og planter Mennesket benytter i dag
Læs mereforebygger og bekæmper smitsomme sygdomme og medfødte lidelser
INFEKTIONS- SYGDOMME S T A T E N S S E R U M I N S T I T U T forebygger og bekæmper smitsomme sygdomme og medfødte lidelser Statens Serum Institut Artillerivej 5 2300 København S TIL DEN GRAVIDE Tel.:
Læs mereProbiotika i akvakultur en strategi til forebyggelse af fiskesygdom
Bettina Spanggaard & Lone Gram Danmarks Fiskeriundersøgelser, Afdeling for Fiskeindustriel Forskning Probiotika i akvakultur en strategi til forebyggelse af fiskesygdom Sygdom hos fisk i opdræt behandles
Læs mereCellekernen (Nucleus) Sebastian Frische Anatomisk Institut
Cellekernen (Nucleus) Sebastian Frische Anatomisk Institut Cellekernen Cellekernens overordnede struktur kernemembranen/nucleolemma kromatin nucleolus Cellecyklus faser i cellecyklus faser i mitosen Størrelse:
Læs mere(19) DANMARK (11) DK 175904 B1 f&bi (12) PATENTSKRIFT
(19) DANMARK (11) DK 175904 B1 f&bi (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) lnt.c1 7.: C 12 N 15/863 A 61 K 39/275 A 61 K 39/285 C 12 N 15/86 (21) Patentansøgning nr: PA 1989 02036 (22) Indleveringsdag:
Læs mereEksamensspørgsmål Biologi C - sygeeksamen den 19. december 2013 Hold: 3bbicfh2
Eksamensspørgsmål Biologi C - sygeeksamen den 19. december 2013 Hold: 3bbicfh2 HF og VUC Nordsjælland. Hillerødafdelingen Lærer: Lisbet Heerfordt, Farumgårds Alle 11, 3520 Farum, tlf. 4495 8708, mail:
Læs mereMiljø- og Fødevareudvalget 2015-16 (Omtryk - 16-12-2015 - Henvendelse om økonomisk betydning for ejendomme vedlagt) MOF Alm.
Miljø- og Fødevareudvalget 2015-16 (Omtryk - 16-12-2015 - Henvendelse om økonomisk betydning for ejendomme vedlagt) MOF Alm.del B Offentligt Bredgade 54 Kaj Bank Olesen Tiphedevej 10 CHR 59544 Rådgivningsbesøg
Læs mereBIOLOGI HØJT NIVEAU. Mandag den 9. august 2004 kl
STUDENTEREKSAMEN AUGUST 2004 2004-6-2 BIOLOGI HØJT NIVEAU Mandag den 9. august 2004 kl. 9.00-14.00 Af de store opgaver 1 og 2 må kun den ene besvares. Af de små opgaver 3, 4, 5 og 6 må kun to besvares.
Læs mereEKSAMENSOPGAVER. Eksamensopgaver uden bilag
EKSAMENSOPGAVER Eksamensopgaver uden bilag Eksaminator: Morten Sigby-Clausen (MSC) 1. Celler, fotosyntese og respiration 2. Den naturlige å og vandløbsforurening 3. Kost og ernæring 4. DNA og bioteknologi
Læs mereBILAG I PRODUKTRESUME
BILAG I PRODUKTRESUME 1 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN Purevax RCP FeLV, lyofilisat og solvens til injektionsvæske, suspension. 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING 1 dosis (1 ml) indeholder: Lyofilisat:
Læs mereDanmarks Tekniske Universitet
Side 1 of 14 Danmarks Tekniske Universitet Skriftlig prøve, den 21/1-2013 Kursus navn: Kursus nr. 27633 Introduktion til Bioinformatik Tilladte hjælpemidler: Alle "Vægtning" Angivet ved de individuelle
Læs mere3y Bioteknologi A. Lærere TK og JM. Eksamensspørgsmål uden bilag
3y Bioteknologi A Lærere TK og JM Eksamensspørgsmål uden bilag 1: DNA, proteiner og gensplejsning Med inddragelse af de vedlagte bilag samt øvelsen med pglo skal du diskutere og vurdere brugen af DNA og
Læs mereBILAG I PRODUKTRESUME
BILAG I PRODUKTRESUME 1/21 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN Purevax RCPCh FeLV. 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING Aktive stoffer: 1 dosis (1 ml) indeholder: Frysetørret pille: Svækket felin rhinotracheitis
Læs mereDet innate virusforsvar. TLR7, TLR8, TLR9, MDA5, RIG I og type I interferoner
Det innate virusforsvar. TLR7, TLR8, TLR9, MDA5, RIG I og type I interferoner A kursus i teoretisk og immunologi TLR3 og LGP 2 Odense, 13. april 2015 Søren T. Lillevang Klinisk Immunologisk Afdeling Odense
Læs mereStruktur og funktion af gener
Molekylærbiologi og genetik S4, F2008 f Malene Munk Jørgensen Emne: Struktur og funktion af gener Link: undervisningsplanen for S4-molekylærbiologi og genetik MMJ, VI niversity ollege Bioanalytikeruddannelsen
Læs mereDER ER IKKE PENGE I RASKE DYR OG MENNESKER!
TØR DU FODRE DIN HUND MED RÅ KOST? ELLER TØR DU VIRKELIG LADE VÆRE? DET HANDLER IKKE OM AT HELBREDE SYGDOMME, MEN OM AT SKABE SUNDHED LIVSSTIL OG IKKE LIVSSTILSSYGDOMME! DER ER IKKE PENGE I RASKE DYR OG
Læs mereLyme Artrit (Borrelia Gigt)
www.printo.it/pediatric-rheumatology/dk/intro Lyme Artrit (Borrelia Gigt) Version af 2016 1. HVAD ER LYME ARTRIT (BORRELIA GIGT) 1.1 Hvad er det? Borrelia gigt (Lyme borreliosis) er en af de sygdomme,
Læs mereSpm. 1.: Hvis den totale koncentration af monomer betegnes med CT hvad er så sammenhængen mellem CT, [D] og [M]?
DNA-smeltetemperaturbestemmelse KemiF2-2008 DNA-smeltetemperaturbestemmelse Introduktion Oligonucleotider er ofte benyttet til at holde nanopartikler sammen med hinanden. Den ene enkeltstreng er kovalent
Læs mereOpgave 1 Slankemidler
Opgave 1 Slankemidler Overvægt er et stigende problem i den vestlige verden, og der er derfor udviklet forskellige slankemidler. Et eksempel på et slankemiddel er Orlistat. Den kemiske struktur af Orlistat
Læs mereALS FORSKNING: GENER OG PIPELINE MEDICIN. Páll Karlsson. Ph.d. Med. Danish Pain Research Center Dept. of Neurology Aarhus University Hospital
: GENER OG PIPELINE MEDICIN Ph.d. Med. Danish Pain Research Center Dept. of Neurology Aarhus University Hospital OSLO, 24 OKTOBER 2015 1 AARHUS M.Sc. i neuro-biologi (2009) fra Aarhus Ph.d. i medicin (2013)
Læs mereUndervisningsbeskrivelse
Undervisningsbeskrivelse Stamoplysninger til brug ved prøver til gymnasiale uddannelser Termin December/januar 13-14 Institution Vestegnen HF VUC Albertslund og Rødovre Uddannelse Fag og niveau Lærer(e)
Læs mereBiologi A. Studentereksamen. Af opgaverne 1, 2, 3 og 4 skal tre og kun tre af opgaverne besvares
Biologi A Studentereksamen Af opgaverne 1, 2, 3 og 4 skal tre og kun tre af opgaverne besvares stx132-bio/a-27082013 Tirsdag den 27. august 2013 kl. 9.00-14.00 Side 1 af 8 sider Opgave 1. Den arvelige
Læs mereEr der flere farver i sort?
Er der flere farver i sort? Hvad er kromatografi? Kromatografi benyttes inden for mange forskellige felter og forskningsområder og er en anvendelig og meget benyttet analytisk teknik. Kromatografi bruges
Læs mereForebyggelse af livmoderhalskræft ved vaccination og screening
Generel information Forebyggelse af livmoderhalskræft ved vaccination og screening Information om HPV og livmoderhalskræft udarbejdet af: Professor, overlæge, dr. med. Susanne Krüger Kjær, Rigshospitalet/
Læs mereEksamensspørgsmål Biologi C maj-juni 2014 Sygeeksamen: 4cbicsy1
Eksamensspørgsmål Biologi C maj-juni 2014 Sygeeksamen: 4cbicsy1 HF og VUC Nordsjælland. Helsingørafdelingen Lærer: Lisbet Heerfordt, Farumgårds Alle 11, 3520 Farum, tlf. 4495 8708, mail: lhe@vucnsj.dk.
Læs mereOliver Hendricks Overlæge, ph.-d. Klinisk lektor Syddansk Universitet
Oliver Hendricks Overlæge, ph.-d. Klinisk lektor Syddansk Universitet Compounds which are chemically foreign or hostile to a biological system Eukaryotic drugs Other chemical compounds Drugs Eukaryotedirected
Læs mereKartoflens genetiske puslespil
Kartoflens genetiske puslespil klassisk forædling og ny teknologi Kartoffelforædling lyder umiddelbart som en stilfærdig beskæftigelse, men forædleren skal være beredt på våbenkapløb med en svamp, klar
Læs mereGenetiske Aspekter af HCM hos Kat. - en introduktion til forskningsprojektet
Genetiske Aspekter af HCM hos Kat - en introduktion til forskningsprojektet Cand. scient. Mia Nyberg, ph.d. stud. mnje@life.ku.dk IMHS, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, Klinisk Biokemisk
Læs mereCaseuge 1.1: Anatomi og fysiologi
Modulplan for modul 1.1, Introduktion til basalfagene, 2017 Vigtigt: Modulplanens læringsmål angiver pensum. I tillæg til læringsmålene for forelæsninger, studiesal, kliniske øvelser og kliniske ophold,
Læs mereIndlægsseddel: Information til brugeren
Indlægsseddel: Information til brugeren Havrix 1440 ELISA U/ml, injektionsvæske, suspension Hepatitis A-virus (inaktiveret) Læs denne indlægsseddel grundigt, inden du får vaccinen - Gem indlægssedlen.
Læs mereOPGAVER ØL -verdens første svar på anvendt bioteknologi
OPGAVER ØL -verdens første svar på anvendt bioteknologi Biotech Academy BioCentrum-DTU Søltofts Plads DTU - Bygning 221 2800 Kgs. Lyngby www.biotechacademy.dk bioteket@biocentrum.dtu.dk SMÅ OPGAVER Nedskriv
Læs merePRODUKTRESUMÉ. for. AviPro IBD LC-75 Vet., pulver til opløsning i drikkevand
2. maj 2012 PRODUKTRESUMÉ for AviPro IBD LC-75 Vet., pulver til opløsning i drikkevand 0. D.SP.NR 21362 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN AviPro IBD LC-75 Vet. 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING Aktivt
Læs mereNyt studie kaster lys over hvorfor nogle hjerneområder nedbrydes før andre i HS Styr på foldningen
Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Nyt studie kaster lys over hvorfor nogle hjerneområder nedbrydes før andre i HS Hvorfor dør kun
Læs mereVi går derfor ud fra, at I ved, at DNA molekyler er meget lange molekyler
DNA-profil analyse Indledning DNA-profil analyser eller i daglig tale DNA-fingeraftryk er en metode, der bruges, når man skal finde ud af, hvem der er far et barn, hvis der altså er flere muligheder. Det
Læs mereBiosensor Niveau 1. Teori
Biosensor Niveau 1 Teori Inden du starter... For at kunne forstå teorien som ligger til grund for en biosensor er det vigtigt at du har styr på nogle generelle mikro/molekyler biologiske principper, begreber
Læs mereDeltagerinformation 10-5-2010 INFORMATION TIL DELTAGERE
INFORMATION TIL DELTAGERE H1N1v vaccination af gravide kvinder. Et kohortestudie til karakterisering af den beskyttende effekt af Influenza A H1N1v vaccine hos gravide kvinder: Vi henvender os til dig
Læs mereBILAG I PRODUKTRESUME
BILAG I PRODUKTRESUME 1/16 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN Nobivac Piro 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING Pr. 1 ml dosis: Aktivt stof 606 (301-911) totale antigen masseenheder af opløseligt parasitantigen
Læs mereBiologi opgave Opsamling: Cellebiologi (Bioanalytiker modul3)
1 Delphine Bonneau Biologi opgave Opsamling: Cellebiologi 1-6 Pelle har spist en kæmpe stor kage, og efterfølgende stiger hans blodsukker. Derfor sender kroppen besked til de endokrine kirtler i bugspytkirtlen
Læs mereVaccination af mink. Unge pelsdyravlere. Januar 2018 Dyrlæge Børge Mundbjerg, Biovet.
Vaccination af mink Unge pelsdyravlere. Januar 2018 Dyrlæge Børge Mundbjerg, Biovet. Hvad kan vi vaccinere mod Hvalpesyge. Virusenteritis. Smitsom lungebetændelse. Botulisme. Hvad kan vi ikke vaccinere
Læs mereBILAG I PRODUKTRESUME
BILAG I PRODUKTRESUME 1 1. VETERINÆRLÆGEMIDLETS NAVN Nobivac L4, injektionsvæske, suspension til hunde 2. KVALITATIV OG KVANTITATIV SAMMENSÆTNING Hver dosis af 1 ml indeholder: Aktive stoffer: Inaktiveret
Læs mereDeltagerinformation 06-11-2009 INFORMATION TIL DELTAGERE
INFORMATION TIL DELTAGERE H1N1v vaccination af gravide kvinder. Et kohortestudie til karakterisering af den beskyttende effekt af Influenza A H1N1v vaccine hos gravide kvinder: Delstudium i ABC (Asthma
Læs mere