Naturlægemidler ANALYTISK KEMI

Transkript

1 AALYTISK KEMI aturlægemidler De sidste årtier er forbruget af naturlægemidler steget drastisk i de vestlige lande. Det har givet anledning til at undersøge kvaliteten af nogle af de naturlægemidler, der findes på markedet. Her gives en analytisk kemisk vurdering af kvaliteten af præparater, der indeholder Hypericum Perforatum L. Af Anette Gemal Jensen, anje@dfh.dk, Claus Cornett, cc@dfh.dk og Steen Honoré Hansen, shh@dfh.dk, DFH I 1992 blev registrerede naturlægemidler underlagt samme lovgivning som andre lægemidler, hvilket betyder, at der stilles samme krav for dokumentation til fremstillingsprocessen og de kemiske specifikationer for indholdsstoffer [1]. Kravene adskiller sig dog på et væsentligt punkt fra almindelige lægemidler. Der kræves ikke kliniske og toksikologiske undersøgelser, hvis der ved henvisning til bibliografiske data kan dokumenteres, at sådanne plantepræparationer har været anvendt i traditionel medicin med en anerkendt virkning og et acceptabelt sikkerhedsniveau [2]. Almindelige lægemidler indeholder ofte et til to aktive indholdsstoffer med fastlagte dosisvirkningskurver, dvs. at effekten efter indtagelse af en bestemt dosis af lægemidlet er kendt. Da de aktive indholdsstoffer er kendte, kan kvaliteten derfor let bedømmes ved at bestemme mængden af selve stofferne samt eventuelle urenheder. For naturlægemidler er det væsentligt sværere at definere kvaliteten, idet der ofte mangler viden om identiteten af indholdsstoffer i de planteekstrakter, som anvendes. Kendskabet til hvilke indholdsstoffer, der kan tilskrives aktiviteten, er begrænset, og dosisvirkningsforhold for planteekstrakterne kendes kun sjældent. Mængden af indholdsstoffer er påvirket af en række faktorer såsom tid og sted for høstning af plantemateriale, plantens udviklingsstadie ved høsttidspunktet, hvilke dele af planten der anvendes og tørrings og opbevaringsforhold. Ligeledes er fremstillingsprocessen væsentlig, idet brug af forskellige ekstraktionssolventer og metoder vil føre til ekstraktion af forskellige indholdsstoffer. Ønskes ekstrakter med en ensartet kvalitet er det vigtigt, at disse parametre er nøje fastlagte. Standardisering Standardisering bruges til at definere kvaliteten af naturlægemidler. Der standardiseres ofte på aktive indholdsstoffer, dvs. det garanteres, at naturlægemidlet indeholder en given mængde af et eller en gruppe af aktive indholdsstoffer. Kendes de aktive indholdsstoffer ikke, kan der standardiseres på markørstoffer, som er karakteristiske indholdsstoffer i planteekstrakten, der ikke nødvendigvis besidder den biologiske aktivitet. Omfattende analytiskkemiske undersøgelser kan være nødvendige for at fastlægge naturlægemidlernes kvalitet, bl.a. for at sikre at det relative indhold af forskellige aktive indholdsstoffer ikke varierer fra batch til batch. I det følgende vil problemerne omkring standardisering og kvaliteten af naturlægemidler, der indeholder ekstrakter af planten Hypericum perforatum L. (prikbladet perikon), blive belyst. Ekstrakter af H. perforatum har i århundreder været anvendt til behandling af forskellige sygdomstilstande. De sælges nu hovedsageligt til behandling af sindstilstande som tristhed, modløshed og nedtrykthed, da de har antidepressive egenskaber. Flere kliniske undersøgelser har vist, at disse ekstrakter kan være ligeså effektive som visse syntetisk fremstillede antidepressiva [3,4,5,6,7,8]. Ekstrakter af H. perforatum har en lang række forskellige indholdsstoffer. Et udvalg er vist i figur 2. I Danmark er alle registrerede naturlægemidler standardiseret på et indhold af 0.3% af en gruppe af indholdsstoffer kaldet hypericiner. Hypericiner består hovedsagelig af protopseudohypericin, pseudohypericin, protohypericin og hypericin. Gruppen blev tidligere Figur 2. Indholdsstoffer i Hypericum perforatum L. Figur 1. Hypericum perforatum L. (prikbladet perikon). 16

2 AALYTISK KEMI antaget for at være de aktive indholdsstoffer. Standardiseringen på et bestemt indhold af hypericiner er imidlertid måske ikke så relevant, da effekten ikke kan tilskrives denne gruppe, men nærmere hyperforin og adhyperforin. De hæmmer effektivt genoptagelsen af neurotransmitterne dopamin, serotonin og noradrenalin fra den synaptiske spalte til den presynaptiske neuron, en mekanisme man ved modvirker visse depressive tilstande [9,10,11,12]. LCMRMS og LCMSMS til identifikation af indholdsstoffer Virkningen af naturlægemidler må formodes at afhænge af art og mængde af indholdsstoffer, hvorfor det er nødvendigt at tilegne sig viden om disse. Den hidtidige procedure har været at isolere og efterfølgende karakterisere stofferne en meget besværlig og tidskrævende procedure. Ved at koble HPLC online med MR og MS er det nu muligt at opnå tilstrækkelige informationer til hurtig identifikation og strukturopklaring af indholdsstoffer i ekstrakter. Et af problemerne ved koblingen er at finde solventer og buffere, som er kompatible med begge systemer. For MR er det ideelt at bruge uorganiske buffere, som ikke bidrager med uønskede signaler til solventbaggrunden. Sådanne buffere kan dog ikke anvendes til MSsystemer, da det her må tilstræbes, at bufferne er flygtige. Man må derfor gå på kompromis ved valg af buffere, og der anvendes ofte buffere som trifluoreddikesyre, myresyre, eddikesyre og ammoniumacetat, som alle er flygtige buffersubstanser. Med LCMRMS var det muligt at identificere 15 indholdsstoffer i en ekstrakt af H. perforatum [13]. To af disse stoffer var ikke tidligere beskrevet i planten. For at opnå anvendelige 1 HMR spektre blev der brugt stopflowteknik, idet LCflowet blev stoppet ved hver top i chromatogrammet (figur 3). Figur 4 viser et 1 HMRspektrum af hyperosid. I to andre LCMSMSeksperimenter blev der hhv. anvendt en vand/acetonitrilgradient og i det andet blev vand erstattet med deutereret vand (D 2 O). Ved at beregne forskellen mellem masserne af molekyler med bundne protoner og bundet deuterium opnås information om antallet af udskiftelige protoner i molekylerne. Ved at anvende MSMS opnås yderligere informationer om fragmenter, for flavonglykosider opnås der f.eks. viden om masserne af aglykonen og sukkerdelen. 1 Quercetingalacturonide 2 Quercetinrutinoside (Rutin) 3 Quercetingalactoside (Hyperoside) 4 Quercetinglucoside (Isoquercetrin) 5 Quercetinarabinoside 6 Quercetinrhamnoside (Quercetrin) 7 Quercetin 8 I3II8biapigenin 9 I3 II8 biapigenin (Amentoflavone) 10 Protopseudohypericin 11 Pseudohypericin 12 Protohypericin 13 Hypericin 14 Hyperforin 15 Adhyperforin Figur 4. 1 HMR spektrum af hyperosid. Ved at anvende disse koblede teknikker var det muligt hurtigt og effektivt at identificere stoffer i en kompleks matrix og dermed undgå den meget tidskrævende procedure med isolering af indholdsstoffer. Standardisering på hypericiner Den kvantitative bestemmelse af totalindholdet af hypericiner foregår ofte ved spektrofotometriske målinger ved 590 nm, thvor hypericinerne absorberer, idet de i opløsning har en meget Figur 3. Chromatogram af Hypericum ekstrakt. Kolonne: Apex ODS, 5 µm, pakket i en mm ID kolonne. Eluent: A [acetonitril:0.1% eddikesyre (5:95 v/v)]; B [acetonitril:20 mm ammoniumacetat (95:5)]. Gradient:010 min 1020% B; 1020 min 20100% B; 2030 min 100% B. Detektion: 254 nm. 17

3 AALYTISK KEMI naturlægemidler, samt når resultaterne fra analyse af forskellige produkter skal sammenlignes [15]. En mulig fejlkilde kan forekomme, når riboflavin anvendes som farvestof i overtrukne tabletter, idet riboflavin pga. høj lysabsorbans i samme bølgelængdeområde som hypericinerne kan forhindre omdannelsen af protoformerne. Figur 5. Chromatogram af Hyperikumekstrakt. Identiteten af toppene; 1 protopseudohypericin, 2 pseudohypericin, 3 protohypericin and 4 hypericin. Parametre: Separation blev lavet på en Knauer kolonne mm ID pakket med Apex1 ODS, 5 µm. Mobilfaser: eluent A [0.02M ammoniumacetat (ph 7): acetonitril:methanol (50:37.5:12.5) v/v/v] og eluent B [acetonitril:methanol (3:1) v/v]. Gradient: 020 minutter fra 95 40% A. Flowhastighed: 1 ml/ min. Detektion: UV/VIS ved 590 nm. karakteristisk rød farve. Der er ikke mange stoffer, der absorberer ved denne bølgelængde, og det antages, at der kun måles på hypericinerne. Metoden bruges i den Europæiske Farmakopé, og den samlede mængde af hypericiner beregnes ud fra en værdi på 870 for den specifikke absorbans for stoffet hypericin [14]. Protopseudohypericin og protohypericin omdannes til hhv. pseudohypericin og hypericin, når opløsningerne af ekstrakten belyses (figur 2). Protopseudohypericin og protohypericin har en lavere absorbans ved 590 nm end pseudohypericin og hypericin, og ved bestemmelse af indholdet af total hypericin er det væsentligt for resultatet, at opløsningerne har været effektivt belyst før den kvantitative bestemmelse. Er protoformerne ikke omdannet til pseudohypericin og hypericin, vil bidraget fra disse to stoffer være mindre, end hvis de er omdannet til pseudohypericin og pseudohypericin. Derfor er det vigtigt, at belyse prøverne i så lang tid at det sikres, at protoformerne er omdannet til pseudohypericin og hypericin, før man laver den kvantitative bestemmelse mhp. standardisering af Standardisering vha. HPLC eller ved spektrofotometri? Vha. HPLC kan bidraget fra de fire kendte hypericiner måles specifikt. Figur 5 viser et chromatogram, hvor prøven er blevet belyst efter separationen på kolonnen. Det er gjort ved at lede udløbsvæsken fra kolonnen gennem en gennemsigtig teflonslange, som er viklet rundt om en UVlampe, før eluatet passerer UVdetektoren. Derved måles de toppe, der svarer til protopseudohypericin og protohypericin i deres omdannede form som pseudohypericin og hypericin. I chromatogrammet ses en stor top, der elueres meget hurtigt. Bidraget fra toppen er relativt stort, og en undersøgelse af ni udvalgte naturlægemidler, der indeholdt H. perforatum viste, at den udgjorde 3040% af den samlede mængde stoffer med absorbans ved 590 nm. Stoffernes identitet er endnu ikke klarlagt, men det er muligt, at de tilhører samme gruppe stoffer som hypericin, f.eks. i form af glykosider, da de også absorberes ved den høje bølgelængde. Hvordan standardiseringen foretages er således meget vigtig. Indholdet af hypericiner i fire forskellige naturlægemidler bestemt ved hhv. spektrofotometriske målinger og ved brug af en HPLCmetode er evalueret (tabel 1). Ved HPLCmetoden blev hypericin brugt som referencestandard, og ved begge metoder var opløsningerne belyst før den kvantitative bestemmelse. Resultaterne viser, at der opnås meget forskellige resultater, alt efter hvilken metode der bruges. Ved at sammenligne de opnåede mængder med de deklarerede mængder står det klart, at producenterne må formodes at have anvendt en spektrofotometrisk metode til at standardisere præparaterne. På pakningerne er standardiseringsmetoden ikke angivet, hvilket tyder på, at et indhold på 0.3% hypericiner kan dække over store forskelle. Renheden af referencestoffer En korrekt bestemmelse af koncentrationen af relevante indholdsstoffer til brug ved standardisering er grundlæggende afhængig af anvendelsen af referencestoffer med en veldefineret kvalitet. Renheden er ofte kun undersøgt ved brug af HPLC med UVdetektion og mangler en egentlig styrkebestemmelse. Desuden kan referencestofferne kun købes i små mængder til en meget høj pris. Kvantitativ MR er en metode til præcis bestemmelse af renheden af referencestoffer, og den er beskrevet i den amerikanske Farmakopé (USP 23) [16]. Der skal anvendes et andet stof med en veldefineret renhed som intern standard, og begge stoffer skal have specifikke signaler for givne protoner i molekylerne, som ikke falder sammen med andre signaler i et protonspektrum. Renheden beregnes derefter ud fra formlen: Figur 6. 1 HMRspektrum af en hypericinstandard og phenoxyeddikesyre som intern standard. Singletten ved 2.37 ppm svarer til de seks protoner (to methylgrupper) i hypericinmolekylet og singletten ved 4.7 ppm til de to protoner i methylengruppen i phenoxyeddikesyre. X = hypericin, IS = intern standard, w x = afvejet mængde af hypericin, w IS = afvejet mængde af phenoxyeddikesyre, PM x = M W (X)/n X, PM IS = M W (IS)/n IS, n X = antallet af integrerede protoner (hypericin) og n IS = antallet af integrerede protoner (intern standard) (USP23). Figur 6 viser et 1 HMR spektrum af en hypericinreference med phenoxyeddikesyre som intern standard. Undersøgelsen viste, at hypericinreferencen havde en renhed på 86%. Ved 18

4 AALYTISK KEMI hypericiner og giver anledning til at foreslå, at standardiseringen af disse naturlægemidler ændres til at inkludere hyperforinerne. Hvorvidt standardiseringen stadig skal inkludere en standardisering på hypericinerne kan diskuteres. Ekstrakterne indholder også store mængder af stofgruppen flavonoider, og det bliver for tiden diskuteret om denne gruppe af stoffer også bidrager til den antidepressive effekt [17]. Da det er sandsynligt, at hyperforin og adhyperforin bidrager væsentligt til den antidepressive effekt af Hypericumekstrakter, har vi udviklet en hurtig metode, hvor man samtidig kan bestemme indholdet af hypericiner og hyperforiner. Metoden giver også mulighed for at vurdere fordelingen af flavonoider. Metoden er baseret på ikkevandig kapillarelektroforese, hvor der for at vende det elektroosmotiske flow er tilsat en positiv ladet polymer hexadimethrinbromid (HDB). Hypericinerne og hyperforinerne er lipofile stoffer, der ikke kan opløses i en vandig buffer. Vi forsøgte derfor først at anvende et almindeligt ikkevandigt kapillarelektroforesesystem, men her var det ikke muligt at separere stofferne. Da stofferne ønskedes negativt ladede anvendtes en basisk buffer, men da der normalt anvendes en positiv spænding over kapillaret, resulterede det i, at de negativt ladede ioner migrerede mod anoden, hvilket gav lange migreringstider (figur 8A, side 20). Ved at bruge en negativ spænding ville de negativt ladede ioner nu migrere i den rigtige retning, men det elektroosmotiske flow () ville have den forkerte retning (figur 8B). Ved at tilsætte den positivt ladede polymer HDB til elektroforesemediet var det muligt at ændre retningen af, så der kunne opnås hurtige migreringstider (figur 8C). Figur 7. Den daglige indtagelse af hypericiner og hyperforiner ved maksimal anbefalet dosis. sammenligning viste et HPLCchromatogram fra producenten med UV/VISdetektion ved 590 nm kun urenheder svarende til 2,3%. Dette eksempel viser tydeligt behovet for en mere veldefineret styrkebestemmelse af de naturstoffer, der anvendes som referencestoffer til brug ved kvantificering af indholdsstoffer i naturlægemidler [15]. Kvaliteten af naturlægemidler der indeholder H. perforatum Forsøg tyder på, at hyperforin og adhyperforin bidrager væsentligt til den antidepressive effekt af ekstrakter af Hypericum [3,4,5,6,7,8]. Udvalgte naturlægemidler på det danske marked er derfor blevet undersøgt for indholdet af hypericiner og hyperforiner, for at se om der findes en korrelation mellem de to grupper indholdsstoffer. Der blev fundet væsentlige variationer i forholdet mellem indholdet af hyperforiner (hyperforin og adhyperforin) og hypericiner (protopseudohypericin, pseudohypericin, protohypericin og hypericin) i ni udvalgte registrerede naturlægemidler, der indeholdt H. perforatum. Der var ingen korrelation mellem indholdet af de to stofgrupper i præparaterne, og ved sammenligning af visse præparater var der en forskel på op til en faktor 8 mellem indholdet af hyperforiner og hypericiner. Ser man på den daglige maksimale indtagelse, som anbefales af producenterne (figur 7) ses, at hvor indtagelsen af hypericiner er nogenlunde konstant i præparat 18, varierer indtagelsen af hyperforiner med en faktor op til 8. Ved brug af præparat 9 ses en relativ lav indtagelse af begge grupper af indholdsstoffer. Resultaterne viser, at kvaliteten af naturlægemidlerne på det danske marked er meget varierende mht. indholdet af de formodede aktive indholdsstoffer hyperforiner. Det sætter spørgsmålstegn ved den nuværende standardisering på 0.3% Præparat A Præparat B Præparat Præparat C D HPLC Spektrofotometri Deklareret 250 Tabel 1. Indholdet af hypericiner i 4 udvalgte præparater bestemt ved henholdsvis en HPLCmetode og ved spektrofotometriske målinger. 19 t Samtidig bestemmelse af hypericiner og hyperforiner

5 AALYTISK KEMI A CE med positiv spænding B CE med negativ spænding C CE med negativ spænding og HDB tilsat elektroforesemediet for at vende det electroosmotiske flow Figur 8. Illustration af princippet bag kapillarelektroforese, hvor der er tilsat HDB til elektroforesemediet for at vende det elektroosmotiske flow. Vha. et 50 μm IDkapillar kunne fire hypericiner separeres, dog ikke adhyperforin fra hyperforin. En samlet koncentration af de to stoffer kunne dog bestemmes. Den samlede analysetid var mindre end 12 minutter. Ved at bruge et 25 μm IDkapillar kan analysetiden nedsættes til 5 minutter. Figur 9 viser et elektroferogram af en prøve af hhv. friske blade og friske blomster plukket fra samme plante i Danmark i blomstringsperioden. Det ses tydeligt, at fordelingen af hypericiner, hyperforiner og også flavonoider er forskellig i de to prøver. Det blev også vist, at fordelingen også varierede mellem to prøver af H. perforatum indsamlet på to forskellige steder i landet. Metoden er velegnet til en kvalitativ såvel som en kvantitativ bestemmelse af indholdsstoffer i H. perforatum. Resultater fra bestemmelse af hypericiner og hyperforiner i blade, blomster og knopper i planter indsamlet på forskellige steder i Danmark viste, at selv om der bruges samme fremstillingsprocedurer, vil kvaliteten af ekstrakter af H. perforatum altid være afhængig af det plantemateriale, der tages i brug. Undersøgelserne viser, at fordelingen er meget forskellig i blade, blomster og knopper og mellem planter indsamlet forskellige steder. Det er derfor interessant videre at undersøge fordelingen af indholdsstoffer som funktion af f.eks. årstidsvariationen. Konklusion Mange parametre har indflydelse på kvaliteten af naturlægemidler, og flere af dem kan ikke kontrolleres (naturlig variation mellem planter, årstidsvariation mv.). For at opnå en ensartet kvalitet af naturlægemidler er det i første omgang nødvendigt at kende indholdsstofferne, og ved at koble HPLC online med MR og MS (og MSMS) fås en hurtig metode, der giver tilstrækkelig information til identifikation og også strukturopklaring af en lang række indholdsstoffer. Derved undgås den tidskrævende procedure med isolering for karakterisering af indholdsstoffer. For at sikre en ensartet kvalitet af planteekstrakter, dvs. at fordelingen af indholdsstoffer er nogenlunde ensartet, er det vigtigt at fremstillingsprocedurerne er nøje fastlagte. Desuden bør standardiseringen foretages på aktive indholdsstoffer, analysemetoderne til dette skal være valide, og der skal anvendes referencestoffer med en kendt styrke. Ønskes en uddybende beskrivelse af emnet henvises til ph.d. afhandlingen»quality assessment of herbal remedies Focus on phytopharmaceuticals containing Hypericum perforatum L. and Ginkgo biloba L.«af Anette Gemal Jensen. Figur 9. Elektroferogram af ekstrakter lavet på friske Hyperikumblade og blomster indsamlet i Danmark. CEbetingelser: 50 µm ID 48.5 cm kapillar med UVdetektion (300, 350 og 590 nm). Elektroforesemedium: 50 mm ammoniumacetat, 150 mm natriumacetat i methanol/dmso/mf (3:2:1) med 0.002% HDB. Identitet af toppene: 1 protopseudohypericin, 2 protohypericin, 3 pseudohypericin, 4 hypericin, 5 hyperforin og 6 adhyperforin. Flavonoider. Referencer 1. Sundhedsstyrelsens vejledning af 30. september 1992 vedrørende registrering af naturlægemidler. The Danish Medicines Agency, De Europæiske Fællesskabers Tidende. Rådets direktiv af 26. januar 1965 om tilnærmelse af lovgivning om medicinske specialiteter. (65/65/EØF). 3. Schrader E. Equivalence of St John s wort extract (ZE 117) and fluoxetine: a randomized, controlled study in mildmoderate depression. Int. Clin. Psychopharmacol. 2000; 15: Harrer G, Schmidt U, Kuhn U and Biller A. Comparison of equivalence between St John s wort extract LoHyp57 and fluoxetine. ArzneimForsch/ Drug Res. 1999; 49: Vorbach EU, Arnoldt KH and Hubner WD. Efficacy and tolerability of St. John s wort extract LI 160 versus imipramine in patients with severe depressive episodes according to ICD10. Pharmacopsychiatry 1997; 30 (Suppl): Philipp M, Kohnen R and Hiller KO. Hypericum extract versus imipramine or placebo in patients with moderate depression: randomised multicentre study of treatment of eight weeks. BMJ 1999; 319: Woelk H. Comparison of St John s wort and imipramine for treating depression: randomised controlled trial. BMJ 2000; 321: Vorbach EU, Hüber WD and Arnoldt KH. Effectiveness and tolerance of the Hypericum extract LI 160 in comparison with imipramine: randomized doubleblind study in 135 outpatients. J. Geriatr. Psychiatry eurol. 1994; 7 (Suppl 1): Chatterjee SS, öldner M, Koch E and Erdelmeier. Antidepressant activity of Hypericum perforatum and hyperforin: the neglected possibility. Pharmacopsychiatry 1998; 31 (suppl): Müller WE, Singer A, Wonnemann M, Hafner U, Rolli M and Schäfer C. Hyperforin represents the neurotransmitter reuptake inhibiting constituent of Hypericum extract. Pharmacopsychiatry 1998; 31 (Suppl.): Chatterjee SS, Bhattacharya SK, Wonnemann M, Singer A and Müller WE. Hyperforin as a possible antidepressant component of Hypericum extracts. Life Sci. 1998; 63 (6): Jensen AG, Hansen SH and ielsen EØ. Adhyperforin as a contributor to the effect of Hypericum perforatum L. In biochemical models of antidepressant activity. Life Sciences 2001; 68 (14): Hansen SH, Jensen AG, Cornett C, Bjørnsdottir I, Taylor S, Wright B and Wilson ID. Highperformance liquid chromatography online coupled to highfield MR and mass spectrometry for structure elucidation of constituents of Hypericum perforatum L. Analytical Chemistry 1999; 71 (22): European Pharmacopea 3rd Ed. Supplement. Hypericum Hyperici herba. Council of Europe, Strasbourg Cedex, France, Jensen AG, Cornett C, Gudiksen L og Hansen S. Characterization of extracts of Hypericum perforatum L. Using an online HPLC system with UV/VIS and fluorescence detection before as well as after photochemical derivatization of the effluent. Phytochemical Analysis 2000, 11; United States Pharmacopeia. The ational Formulary (F18). United States Pharmacopeial Convention: Rockville; Butterweck V, Jürgenliemk G, ahrstedt A, Winterhoff H. Flavonoids from Hypericum perforatumco2 extract on dopamine and serotonin release in the rat central nervous system. Planta Med. 2000; 66: