Bagside af forsiden. Billederne er behandlet i Adobe Photoshop CS6 64 bit Fra Adobe Systems Incorporated.

Transkript

1

2 Bagside af forsiden Billedet på forsiden af denne rapport forestiller en behandsket hånd der udsmider en plasmaportion i en gul risiko affaldspand. Billedet er sammenklippet fra følgende billeder: Ovenstående billede er fundet på Effective Business Communications hjemmeside. [ ]Lokaliseret på: Ovenstående billede er fundet på Carmel Pharma Globals hjemmeside. [ ]Lokaliseret på: Billederne er behandlet i Adobe Photoshop CS6 64 bit Fra Adobe Systems Incorporated.

3 Resume Baggrund Optøet plasma har en holdbarhed på 24 timer, plasma opbevares derfor på de fleste sygehuse nedfrosset. Behandlingen af akutte blødninger sinkes af den tidskrævende optøning. AB-plasma er anvendelig til behandlingen af alle blodtyper og har det højeste indhold af faktor VIII (FVIII). FVIII er labil og anvendes som det bestemmende kvalitetsparameter for plasmaets anvendelighed efter optøning. AB-plasma kan derfor muligvis bevare tilstrækkeligt af sit hæmostatiske potentiale længere end 24 timer fra optøning. Formål I dette studie bestemmes faldet af koagulationsfaktorerne VIII, von Willebrand og fibrinogen i optøet AB-plasma. De 2 mest fremherskende tappemetoder, plasmapherese og fuldblodsfraktionerings indflydelse på plasmaet vil også blive bestemt. Materialer og metoder 15 AB-plasma portioner fra hver tappemetode blev anvendt. Plasmaportionerne blev optøet og opbevaret ved 4±2 C. 0, 24, 48 og 72 timer efter optøning blev der udtaget og nedfrosset en plasmaprøve. Prøverne blev analyseret for FVIII, von Willebrand faktor og fribinogen indholdet. Resultater FVIII resultaterne var gennemsnitlig 136±36 ved optøning, og faldt til 87±19 IU/dL efter 72 timer. FVIII indholdet var signifikant højere i afereseplasmaet de første 24 timer efter optøning. Von willebrand faktor var upåvirket af tappemetode og faldt kun svagt fran 123 til 117 IU/dl efter 72 timer. Fibringen indholdet var højest i afereseplasma og der blev ikke fundet noget klinisk relevant fald efter 72 timer. Konklusion AB-plasma, uanset tappemetode, er anvendeligt til alle akutte blødninger i op til 72 timer efter optøning. Side 2 af 46

4 Indhold Resume... 2 Forord... 5 Indledning... 6 Problembaggrund... 9 Afgrænsning... 9 Kvalitetskrav... 9 Plasma Koagulationsfaktorer Bakteriel kontaminering Problemformulering Metodiske overvejelser Etiske overvejelser Prøve udvælgelse Analyse udvælgelse Statitiske overvejelser Materialer/Metode Apparatur Reagenser Materialer Metode Tappeprocedurer Forberedelse og opbevaring af FFP Optøning af plasma og analyse forberedelse Fælles for alle analyser Faktor VIII Von Willebrand Faktor Fibrinogen Statistiske test Side 3 af 46

5 Resultater FVIII Von Willebrand Faktor Fibrinogen Oversigt over alle resultater Diskussion Metodiske overvejelser Metode FVIII Resultaterne FVIII koncentrationen i A-FFP og F-FFP Konklusion for FVIII resultaterne vwf resultaterne Konklusion for vwf resultaterne Fibrinogen Fibrinogen indeholdet i A-FFP og F-FFP Konklusion for fibrinogen resultaterne Anvendelse af A-FFP og F-FFP efter nuværende holdbarhedsperiode Betydningen for bioanalytikerens arbejdsområde Betydningen af anvendelsen af FFP >24 timer for patienterne Konklusion Perspektivering Litteraturliste Vedlagte bilag: Bilag 1 - Forkastede regressionskurver for FVIII analyse Bilag 2 - Analyseskema for anvendelsen af referencer/ressourcer Bilag 3 - Bekræftelse for udfærdigelsen af den skriftlige besvarelse Side 4 af 46

6 Forord Denne bachelor rapport er skrevet som mit skriftlige produkt i forbindelse med min afgangseksamen på bioanalytiker uddannelse på University College Sjælland i Næstved. Projektet omhandler en immunologisk problemstilling, der har krævet en biokemisk besvarelse og er derfor udført i samarbejde med Immunologisk og biokemisk afdeling på Næstved sygehus. Projektet er udført sammen med Sara Louise Schmidt i perioden d. 8. oktober 2012 til d. 3. januar 2013 og henvender sig primært til bioanalytikere og ansatte i det immunologiske specielle. Jeg vil især gerne fremhæve og rette en stor tak til Sara Louise Schmidt og mine 3 vejledere for deres utrolige engagement, Lektor ved bioanalytikeruddannelsen, Tina Elley, University College Sjælland, Næstved. Samt Bioanalytikerunderviser Solveig Rosendahl og Marianne Birkekjær Christensen, på hhv. immunologisk og biokemisk afdeling, Næstved sygehus. En tak skal gives til alle ansatte på de 2 afdelinger, men særligt: bioanalytiker og superbruger Alice Anker på Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved Sygehus. Samt ledende overlæge, ph.d. Keld Mikkelsen Homburg, kvalitetsbioanalytiker Therese Hvid og bioanalytiker Helle Dunk Jepsen på Klinisk Immunologisk Afdeling, Næstved sygehus. Endelig skal der også gives en stor tak til Haemochrom Diagnostica AB og Triolab A/S som har leveret reagenser for analyserne til særdeles fordelagtige priser. Mikael Lund Fuglsang Larsen Side 5 af 46

7 Indledning I det moderne sundhedsvæsen, hvor behandling og forebyggelse er i hovedsædet, er transfusionsservice og den tilhørende blodkomponents terapi en centralt og essentielt ydelse. Alene i Danmark blev der transfunderet 0,5 millioner blodkomponenter i Blodet opdeles i de 3 hovedkomponenter erytrocytter, trombocytter og plasma, da dette muliggør en mere rationel og effektiv behandling. På denne måde opnås en bedre udnyttelsesgrad af donornes blod 2. Transfusionering af blodprodukter er ikke ukompliceret, da transfusionering på kryds af blodtyperne kan medføre fatale immunologiske reaktioner. Transfusionsprodukterne administreres derfor oftest af specialiserede enheder kaldet blodbanker. Blodbankernes kerneservice består af tapning af donorer samt administrering, opbevaring, bearbejdning, kontrollering og udlevering af de tappede komponenter 3. De nævnte og/eller flere sammenhørende ydelser kan være decentraliseret og spredt ud over flere afdelinger, men er oftest samlet i en central og specialiseret afdeling. I Danmark er blodbanksservicen samlet i en specialiseret afdeling, Klinisk immunologisk afdeling (KIA), der er opdelt i 5 separate nationale afsnit, som varetager de allerede nævnte opgaver i hver deres region. KIA varetager udover blodbanksvirksomhed også: immunologisk diagnostik, transplantationsimmunologi samt administrering af celle og vævsbankvirksomhed som et tværregionalt samarbejde 3. Indenfor blodbanksvirksomhed er det den regionale KIA opgave at sikre sig, at der kan leveres tilstrækkelige blodprodukter af en sådan kvalitet at de kan leve op til de regler, krav og anbefalinger der stilles af; dansk lovgivning 4,5, Sundhedsstyrelsen 6, Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components (EU retningslinjer) 7 og Dansk Selskab for Klinisk Immunologisk transfusionsmedicinske standarder (TMS) 8. De danske blodbanker har sjældent problemer med at levere tilstrækkelige mængder blodkomponenter. Lokal periodisk mangel kan dog forekomme efter behandling af Side 6 af 46

8 særdeles transfusionskrævende patienter. Plasma derimod er den blodkomponent, der transfusioneres mindst og kan holde sig i op til 3 år, hvis opbevaret ved <-25 C. I 2011 medførte dette at 72 % af det tappede plasma blev videresolgt til medicinalfirmaet CLS Behring og kun 21 % blev anvendt til transfusion 1, så mangel på plasma er en sjælden begivenhed. Inden indgivelsen af blodkomponenter kontrolleres patientens blodtype altid som udgangspunkt. Dette gøres for at undgå major og minor uforligelighed, hvor især major uforligelighed skal undgås. Major uforlignelighed er en meget alvorlig immunologisk reaktion hvor recipientens antistoffer reagerer med donor erytrocytterne. Praktisk talt alle mennesker vil have dannet anti-a og anti-b, hvis de ikke selv besidder disse antigener. Ved mødet af recipientens antistoffer og donorens erytrocytter vil der ske en akut hæmolytisk reaktion, som i de værste tilfælde medfører dødelig udgang. Minor uforlig involverer en immunologisk reaktion, hvor indgivede donor antistoffer reagerer med recipientens antigener, denne optræder oftest forsinket og mindre alvorlig. Der kan opstå situationer, hvor det er nødvendigt at behandle uden yderligere forsinkelse. Især traumepatienter skal behandles hurtigt, men der kan man heldigvis anvende erytrocytter og trombocytter af type 0 og plasma af typen AB, da disse er frie for henholdsvis A og B antigener og antistoffer. En forudgående blodtype bestemmelse kan derfor fraviges. Det er muligt at udlevere erytrocytter og trombocytter til kritiske formål uden videre forsinkelse. Det samme gør sig ikke gældende for plasma, da plasmaet skal optøes inden anvendelse. Plasma bliver primært anvendt til profylaksisk og tereapeutisk behandling af hæmostatiske forstyrrelser. Ved akutte blødninger, såsom traume hvor det er særdeles vigtigt at få genoprettet hæmostasen 9,10,11, må patienten ofte vente på plasma transfusion. Patientens vil ved alvorlig koagulopati * fortsætte med at bløde fra indre og ydre læsioner hvilket i værste fald vil have fatale konsekvenser. Plasmaet erstattes i * Tilstand hvor lavt koagulationsfaktor indhold medfører at hæmostasen er utilstrækkelig Side 7 af 46

9 ventetiden med krystalloider og/eller kolloider *, hvilket er en ringere behandling Optøningen af plasma inden brug medfører derfor en kritisk og uhensigtsmæssig forsinkelse, der i sin værste konsekvens vil koste liv. På Rigshospitalet i København, indførte man i 2004 en transfusionspakke til blødning kaldet hemostatic control resuscitation, som involverede indgivelsen af fuldblods ækvivalente blodkomponenter. Johansson et al. 13 bestemte at hurtig indgivelse af plasma mindskede dødeligheden for akut blødende patienter med 30 %. Plasmaportioner opbevares ikke optøet på de fleste danske sygehuse. På disse sygehuse skal plasmaportioner optøs, inden det kan udleveres til patientbehandling. Fra bestillingen til udlevering af det optøede plasma kan der i værste fald gå op til 45 minutter, hvilket sinker livsnødvendig behandling. Hovedårsagen til at plasmaet ikke ligger optøet er, at der fra sundhedsstyrelsens side kun er accepteret en holdbarhed af optøet plasma i 24 timer, når opbevaret ved 1-6 C. Den korte holdbarhed medfører, at der for de fleste sygehuse vil ske et urimeligt stort spild af plasma som følge af kassering. Til sammenligning blev der i 2011 uddateret 758 FFP svarende til 1,74 % i Region Sjælland. Tilsvarende blev 4634 FFP svarende til 4,36 % kasseret i Region Hovedstaden 1, hvor man har optøet plasma i akutberedskab. Antages det, at de 2 regioner kan sammenlignes, vil man skulle kassere ~1500 FFP yderligere i Region Sjælland ved indførelsen af akutplasma. Statistikken dækker alle uddateringer, og derfor også FFP der er uddateret uden at have været optøet. Dette tal forventes ikke at være signifikant, da overskudsplasma sælges til medicinalfirmaet CSL Behring AG 1,4. For at forbedre patientbehandlingen ville en forlænget holdbarhed af plasma kunne afhjælpe denne problemstilling. En forlænget holdbarhed ville for regionerne medfører færre kasserede plasmaportioner og mindske omkostningerne. De * Væskeopløsninger der anvendes til blandt andet at erstatte mistet blod så kredsløbet ikke kollapser. Krystalloider indeholder elektrolytter og væsken fordeles i både væv og blodbane. Kolloider indeholder stoffer der ikke kan passere blodbanen og væsken forbliver deri som følge af osmotisk tryk. Side 8 af 46

10 regioner, der endnu ikke har optøet plasma, vil have større incitament til at implementere denne ordning. For patienter med akut ukontrollabel blødning vil den bedste behandling med blodkomponter kunne opstartes tidligere. Problembaggrund Region Sjælland har tidligere søgt om tilladelse til at forlænge holdbarheden af optøet plasma til 48 timer hos sundhedsstyrelsen (SST). Dette er blevet afslået af 2 grunde. Den første grund omhandler en frygt for at en evt. bakteriel kontamination vil opformeres under den forlængede opbevaring. Den anden grund omhandler formodning om for lave koncentrationer af koagulationsfaktorindholdet efter 24 timers optøning. På trods af dette havde rigshospitalet i ansøgningsperioden akutplasma liggende optøet i 72 timer inden kassering. Andre steder i verden, herunder USA, er det tilladt at opbevare plasma optøet i op til 5 dage, dog skal det navngives til tøet plasma efter 24 timer fra optøning 14. Som beskrevet tidligere er det blodbankernes ansvar at producere og udlevere blodkomponenter, der er både sikre og af høj kvalitet, derfor må omfanget af den SST formodede problemstilling bestemmes, således at der foreligger primærdokumentation, der kan understøtte eller forkaste problemstillingen, så der kan foretages en beslutning på baggrund af valid empiri. Afgrænsning Kvalitetskrav I henhold til EU direktivet 2004/33/EF og Bekendtgørelse om kvalitets- og sikkerhedskrav til blodbankvirksomhed skal Faktor VIII (FVIII) indholdet være gennemsnitlig (efter nedfrysning og optøning) 70 % eller mere af værdien for den frisktappede plasmaportio. 5,15. Det er ikke muligt at undersøge indholdet af FVIII i plasmaet før nedfrysning i dette studie. Resultaterne vil derfor som udgangspunkt kun blive vurderet ud fra det kvalitetskrav der opgives i TMS og EU retningslinjer som angiver at plasmaportionen FVIII koncentrationen skal være gennemsnitlig 70 IU/dL 7,8. Side 9 af 46

11 Plasma Dette studie begrænses til udelukkende at vurdere plasma til akutsituationer. Plasma fra donorer med blodtypen AB kan transfusionernes frit til alle patienter, da plasmaet ikke indeholder A og B antistoffer. Patienter med blodtype AB er også bestemt til at have det største indhold af von willebrand faktor (vwf) og FVIII af alle blodtyperne 16. Derfor vil der ikke blive analyseret på andre blodtyper i dette studie. I Region Sjælland anvender man desuden 2 forskellige tappemetoder til at producere frisk frosset plasma (FFP). Den traditionelle fuldblodstapning hvor blodet opbevares i op til 24 timer ved 22±2 C, inden det separes og plasmaet indfryses. Ved aferese tapning tappes derimod kun plasma, da de cellulære komponenter returneres til donor løbende under tapning. FVIII indholdet forventes at være lavest ved traditionel tapning, da FVIII falder med ~1 % pr. times opbevaring i fuldblod ved opbevaring på CoomboCool plader 17 og plasmaet er fortyndet med en større andel antikoagulans. I dette studie vil der derfor anvendes en stikprøve af FFP fra aferese tapning og fuldblodstapning forkortet til hhv. A-FFP og F-FFP. Koagulationsfaktorer Principielt set kunne det være interessant at vurdere i hvilken udstrækning alle enkeltfaktorerne blev bevaret i plasma efter optøning. Dette er meget ressourcekrævende og ikke muligt at udføre på Næstved sygehus. Studiet er derfor blevet begrænset til følgende 3 koagulationsfaktorer; VIII, vwf og fibrinogen. FVIII er valgt, da den er den mest labile af alle koagulationsfaktorerne og FVIII er den eneste koagulationsfaktor, der stilles krav til i dansk, amerikansk og europæisk lovgivning 5,7,14. FVIII er desuden en essentiel faktor i koagulationskaskaden i det sekundære hæmostaserespons *. vwf er interessant da FVIII er afhængig af stabilisering i et FVIII-vWF kompleks. vwf komplekset tjener yderligere et formål ved at målrette koagulationen; vwf binder sig til blotlagt kollagen ved brud på endothelet og dissacosierer FVIII specifikt ved karlæsionen. vwf molekylet binder sig * Primær respons, dannelsen af et trombocyt agreat, sekundær respons dannelsen af et koagel bestående af krydsbunden fibrin Side 10 af 46

12 herefter til trombocytter og er med til dannelsen af et trombocytagreat. vwf er derfor vigtig i både det primære og sekundære hæmostase respons 18. vwf er herudover den faktor kroppen har mindst overskud af ifølge de amerikanske standarder for sikker kirugi 19. Fibrinogen er interessant, da dette er den faktor, der spaltes som slutprodukt i koagulationskaskaden og laver de holdbare krydsbundne fibrinmatrix i det sekundære hæmostatiske respons, så uden dette protein har koagulationskaskaden kun meget lidt effekt i forbindelse med genopretningen af hæmostasen. Bakteriel kontaminering Der vil ikke vurderes på SSTs Frygt for bakteriel kontaminering. Bekymringen er reel, men ikke overførbar til Region Sjælland. Ved almindelig blodtapning tappes fuldblodet i et lukket system, der efterfølgende fraktioneres til 3 komponenter; Erytrocyttersuspension, buffycoat og plasma. Erytrocyt suspensionerne opbevares i op til 35 dage ved 2-6 C uden der er problemer med bakteriel kontaminering 1. Plasma og erytrocytter er tappet i det samme lukkede system, så det kan udledes at en evt. kontaminering må forekomme efter adskillelse af de 2 komponenter. I litteraturen er langt de fleste tilfælde af sporbar bakterielt kontamination af plasma sket ved optøningen af den frosne plasmaportion i et forurenet vandbad 20. Denne problematik har man imødekommet i Region Sjælland ved at indføre tilsætning af antibakterielt kemikalie til optøningsvandet samt udskiftning og desinficering af vandbadene hver 14 dag 21. Optøning af alle plasmaportionerne sker desuden i en ydre optøningspose, således at vandet ikke får direkte kontakt med plasmaposen. Et studie af Lamboo M et al. havde ikke nogle rapporterede kontaminationer af 60,000 transfunderede plasmaportioner, som havde været opbevaret i op til 14 dage 22. Dette afspejles også i statistikken over rapporteret transfusionsrelaterede komplikationer i USA, hvor der ikke er opgivet nogle dødsfald som følge af bakterielle kontaminationer fra plasma de sidste 5 år 23. På denne baggrund vil problematikken med bakteriel kontaminering ikke blive behandlet i denne rapport. Side 11 af 46

13 Problemformulering Hvordan ændres indholdet af koagulationsfaktorerne FVIII, vwf og Fibrinogen i frisk frosset plasma over 72 timer efter optøning? Hvorledes påvirker dette anvendeligheden af plasmakomponenten som transfusionsprodukt? Samt hvilken forskel er der på indholdet af de målte koagulationsfaktorer i apherese plasma og fraktioneret fuldblodsplasma? Metodiske overvejelser Etiske overvejelser Formålet med forsøget i denne rapport er at lave en koncentrationsbestemmelse af koagulationsfaktor indholdet af optøet plasma efter 24 timer. Forsøget er derfor et kvalitets forsøg, og der skal ikke søges om tilladelse til udførelsen af forsøget fra den nationale videnskabsetiske komité i henhold til punkt 2.5 i Vejledning om anmeldelse, indberetningspligt m.v.(sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter) 24. Prøve udvælgelse I KIA anvendes der kun frisk frosset plasma (FFP) fra ikke transfunderede mænd til rutinetransfusion. Ved at anvende plasma fra mænd, der ikke har modtaget transfusion, mindskes risikoen for Transfusion related acute lung imboli med op til 75 % 25. Dette er fordi kvinder og mænd, der har modtaget transfusion, kan have udviklet alloantistoffer af typen HLA (Human leukocyt antistoffer) ved mødet med kropsfremmede celler. HLA kan danne mikrothromber i lungerne, og disse embolier er den transfusionkomplikation, der medfører flest alvorlige transfusionskomplikationer i Danmark 26 og flest dødsfald i USA. Ud fra dette grundlag vil der ikke blive anvendt kvindeligt plasma i forsøget. Stikprøven er på 30 plasmaportioner. Størrelsen er herved tilstrækkelig til alle statistiske analyser og ligger indenfor budgettets rammer. Resultaterne heraf bør herved kunne overføres til AB-plasmaportioner i almindelighed. Stikprøven vil bestå af en ligelig fordeling af A- FFP og F-FFP portioner, således at der også kan laves en sammenligning af de 2 produkter. Side 12 af 46

14 Selve udvælgelsen af plasmaet er foretaget på transfusioncenteret i Næstved af KIA s personale, så det opfylder vores krav omkring type og tappemetode. FFP er herudover udtaget så tiden, for hvor længe FFPen har været frosset, er repræsentativ for hele lageret. Stikprøven repræsenterer derfor også dag til dag variationerne i tapningen. Vi ikke har været involveret i prøveudtagelsen eller foretaget anden sortering af prøverne. Analyse udvælgelse På klinisk biokemisk afdeling i Næstved (KBA) findes der 2 forskellige validerede vwf analyser. Den ene analyse bestemmer mængden af vwf, hvor den anden bestemmer den funktionelle aktivitet af vwf. Scott et al 25. bestemmer dog ikke nogen signifikant forskel på mængden af vwf antigen i plasma efter 120 timers optøning, men finder et signifikant fald i vwf aktiviteten. På denne baggrund vælges det at anvende vwf aktivitets analysen, da denne er mere relevant for bestemmelsen af anvendelsen af produktet. Der findes ingen validerede alternativer til FVIII og fibrinogen analysen. Statitiske overvejelser Data vil blive vurderet for om resultaterne er normaltfordelt. Til dette formål vil der blive lavet et probitplot til alle datasæt for målingen ved optøning. Resultatet heraf vil herefter være gældende for de efterfølgende tider. Probitplottet vil blive visuelt vurderet og blive godkendt, hvis det tegner en forholdsvis retlinje uden systematiske afvigelser, vurderingen heraf vil bestemme om data skal opgives som gennemsnit eller median, og om der til sammenligning skal anvendes en parret t-test eller wilcoxon test. Resultaterne for 24, 48 og 72 timer efter optøning vil blive sammenlignet med resultatet fra umiddelbart efter optøning. For at sammenligne indholdet af koagulationsfaktorne i A-FFP og F-FFP vil der blive bestemt, om data er normaltfordelt for de 2 plasmatyper. En F-test vil efterfølgende bestemme, om der er signifikans forskel på variansen. Data vil blive analyseret med en uparret t-test med ens eller uens varians for normaltfordelte data, eller mannwhitney test for ikke normaltfordelte data. Side 13 af 46

15 Der vil også blive lavet en grafisk afbildning, hvor den enkelte plasmaportions Koagulationsfaktor indhold pr. dag tegnes, så det kan aflæses om der er nogle specielle tendenser. Endelig vil data blive repræsenteret i tabeller med tilhørende procentvise ændringer. Side 14 af 46

16 Materialer/Metode Apparatur Til aftapning af A-FFP blev der anvendt en blodcelleseperator (PCS2, Haemonetics, Braintree, USA). Til opbevaring af A-FFP og F-FFP inden modtagelse på Transfusionscenteret i Næstved blev der anvendt tempererede Compocool plader (Fresenius Kabi, Tyskland). Optøning af plasmaportioner skete i en plasmainkubator (Helmer labs, Noblesville, USA) på immunologisk afdeling. Efter aftapning af plasma til prøveglas blev plasmaportionen svejset (Fenwal Hematron III, Baxter Healthcare corporation, Deerfield, USA). Prøveglassene blev frosset ved - 80⁰C på immunologisk afdeling (ARCTIKO UPUL 580, Arctiko A/S, Esbjerg, Danmark) og opbevaret i -80⁰C på biokemisk afdeling (Dometic BR 700, Hosingen, Luxemborg). Ved optøning af prøveglas blev der anvendt en varmeblok på biokemisk afdeling (Thermo Rack, Ljungberg & Kögel AB, Sollentuna, Sverige). Alle analyserne blev udført på biokemisk afdelings koagulationsanalyseapparatet (STA-R, Diagnostica Stago, Asniéres Sur Seine, Frankrig). Reagenser FVIII kalibreringsmaterialet (Coagulation reference, Technoclone GMBH, Vienna, Østrig) blev anvendt før analyse samt normale og abnormale kontroller (HemosIL, Normal Control ASSAYED og Special Test Control level 2, Instrumentation laboratorie SpA, Milano, Italien). FVIII analysen blev udført ved brug af et samlet kit (Chromogenix, COAMATIC Factor VIII kit, Instrumentation laboratorie SpA, Milano, Italien). Der blev anvendt vwf normale og abnormale kontroller (HemosIL, Calibration Plasma og Normal Control ASSAYED og Special Test Control level 2, Instrumentation laboratorie SpA, Milano, Italien). vwf kittet (HemosIL, von Willebrand Factor Activity kit, Instrumentation laboratorie SpA, Milano, Italien) blev anvendt til vwf analysen. Fibrinogens normale og abnormale kontroller blev anvendt (NKP normal multi control og OKP Abnormal multi control level 1, Medirox AB, Nyköping, Sverige). Til Side 15 af 46

17 fibrinogen analysen blev reagenset (STA Fibrinogen 5, Diagnostica Stago, Asniéres Sur Seine, Frankrig) anvendt. Til alle opløsninger blev der anvendt vand (MEDICA R200, ELGA LabWater, Marlow, UK), der opfylder kravene for type I vand fra Clinical and Laboratory Standards Institut 27. Materialer Tappeposer til A-FFP (E + CPD ml Ref 623, Haemonetics, Braintree, USA) og til F-FFP (Leucoflex LCR-Diamant - LQT6281LE MacoPharma, Mouvaux, Frankrig) blev anvendt. Optøning af plasmaportioner skete i plastik poser (Helmer Labs, Noblesville, USA). Efter optøning blev der i plasmaportioner monteret en transfusionskobling (Connect Z - ref , CODAN Medizinische Geräte, Lensahn, Tyskland). Der blev anvendt tørglas uden tilsætningsstoffer (Terumo Liquidraw 4 ml VF-054SLI, Terumo corporation, Tokyo, Japan). Metode Tappeprocedurer Procedurerne til indsamling af A-FFP og F-FFP bliver udført forskelligt, hvor A-FFP tappes ved plasmaferese og F-FFP tappes som fuldblod, der efterfølgende fraktioneres. Som tidligere nævnt er plasmaferese en aftapning, hvor fuldblodet bliver tappet og centrifugeret med det samme, hvorefter plasma overføres i en tappepose. Processen repeteres indtil 600 ml plasma er blevet aftappet. Inden modtagelse på Transfusionscentret i Næstved opbevares A-FFP på tempererede Compocool plader i højst 24 timer inden separation og frysning. På Transfusionscenteret sker der en separation af opsamlingsposen, der bliver delt i to lige store satellitposer inden indfrysning i en -40 ⁰C fryser i 45 min., hvorefter A-FFP overflyttes til en karantænefryser på 30 ⁰C. F-FFP derimod bliver tappet som fuldbold i en tappepose og opbevaret på Compocool plader inden modtagelse på Transfusionscenteret. Her vil der efterfølgende ske en centrifugering af fuldblodet og fraktionering af Side 16 af 46

18 delkomponenterne inden for 24 timer efter tapning. Plasmaet indfryses på samme måde som ved A-FFP. Begge plasmaprodukter kan opbevares nedfrosset ved -25 ⁰C eller mindre i op til 3 år, og må først frigives når screeningen for smittemarkørerne for Humant Immundefekt Virus type 1 og 2, Hepatitis B og C foreligger som et negativt resultat 4,5. Forberedelse og opbevaring af FFP Der blev indsamlet tredive plasmaprodukter fra raske mandlige donorer med blodtypen AB, heraf 15 portioner A-FFP og 15 portioner F-FFP. Portionerne er indsamlet på Immunologisk afdeling på Næstved sygehus, hvor afdelingen har trukket data ud om holdbarhedsdatoen på alle A-FFP og F-FFP, der forefindes i afdelingens frysere. Derved findes der plasmaprodukter, der er repræsentativ for alle opbevarings tider for FFP. I de tilfælde, hvor der er forekommet dubleanter af satelitposerne fra A-FFP, er den ene portion A-FFP erstattet med en anden portion fra samme tidsperiode. Portionerne er pakket, mærket med projekt navn og stillet separat i -30⁰C fryser indtil projekt start. Optøning af plasma og analyse forberedelse 480 prøveglas blev klargjort til anvendelse af prøveaftapning af de tredive plasmaportioner. Mærkning er prøveglassene er således, at der for hver plasmaportion er 16 prøveglas fordelt på følgende måde; 3 analyser + reserveglas for tid 0, 24, 48 og 72 timer. Glassene blev alle mærket med en unik stregkode. De tredive FFP portioner blev optøet i en plasmainkubator ved 37 ⁰C i 16 min. på immunologisk afdeling. Før montering i plasmainkubatoren, omsluttes plasmaportionerne i to plastik poser. Immunologisk afdeling råder over en plasmainkubator med fire optøningspladser, hvilket medførte, at optøningsprocessen skete over flere tidspunkter. Derfor blev hver plasmaportion mærket med dato, optøningstidspunkt og et sekventielt nr. Efter optøning blev plasmaportionerne isat en transfusionskobling, så den optøede plasmaportion råder over et langt slangestykke, hvor plasmaet kan aftappes fra. Portionernes tilhørende prøveglas, der Side 17 af 46

19 er mærket for tid 0, blev fyldt op med 1,5-2 ml velblandet plasma i hvert glas. Prøvematerialet blev herved udtaget i overensstemmelse med afdelingens procedure for kvalitetskontrol 28. Plasmaportionerne svejses og opbevares på køl ved 4 ⁰C ± 2 ⁰C. Prøveglassene fordeles i stativer efter tid og analyse, og sættes i -80 C fryseren. Efter 24 timers opbevaring vendes plasmaposen forsigtigt 10 gange, og der klippes et stykke af slangestykket, hvorefter et spildglas fyldes, således at slangestykket tømmes for ublandet plasma. Derefter fyldes 1,5-2 ml. velblandet plasma i hvert prøveglas mærket med tid 24. Plasmaportionerne svejses igen og opbevares på køl ved 4 ⁰C ± 2 ⁰C i 24 timer. Prøveglassene fordeles i stativer efter tid og analyse og sættes i -80 C fryseren. Denne proces gentager sig efter 48 og 72 timer. Fælles for alle analyser Før analyse blev koagulationsanalyseapparatet og varmeblokken på biokemisk afdeling rengjort, efterset og vedligeholdt i henhold til afdelingens anbefalinger 29. Under prøveanalysering blev der analyseret kontroller ved hver ny påsætning af reagens med samme lot. nr. samt til slut efter den sidste prøve. Efter analyse blev alle resultater udskrevet. Faktor VIII FVIII analyseprincippet er et kromogent kinetisk assay, hvor reagenset består af Ca 2+ og fosforlipider og FIa. FIa aktiverer F til Fa. Denne proces forløber langsomt, men ved tilsætning af prøvematerialet vil processen forløbe hurtigere, da FVIII er en stærk stimulerende cofaktor til FIa. Konversionsraten er derfor ligefrem proportional med prøvens indhold af FVIII og bliver målt ved, at Fa hydrolyserer det kromogene substrat, S Herved frigøres en pna kromoforgruppe, som bliver aflæst spektrofotometrisk ved 405 nm over et minut. Hydrolysen af substratet kan forårsages af trombin, men forhindres ved en syntetisk trombinhæmmer, I-2581, der er tilsat substratet 30,31. Reaktionen kan ses i figur 1. Side 18 af 46

20 Fig 1: Reaktionsforløbet starter ved tilsætning af FVIII holdigt materiale. Substratet S hydrolyseres hvorved det kromogene stof pna frigives. Reaktionshastigheden er direkte propertionel med mængden af FVIII og kan måles spektrofotometrisk. Efter opstart af STA-R blev kalibrator, normal og abnormal kontrol klargjort i henhold til producentens vejledning 32,33. Kalibrator, normal og abnormal kontrol rekonstitueret ved tilsætning af 1 ml vand ved afpippetering. Herefter blev kalibratoren og kontrollen homogeniseret ved forsigtigt at vende prøven 10 gange. Hvorefter kalibratoren henstod i 10 min. og kontrollerne henstod i 30 min. med påskruet låg ved stuetemperatur. Efter henstand i 10 min. blev kalibratoren vendt 10 gange igen og analyseret i flere fortyndinger for at beregne en standardkurve. Efter kalibrering blev den normale og abnormale kontrol analyseret. Først efter de 30 min. blev Faktor VIII reagenset rekonstitueret ved at præparere kittets tre enkeltdele; S I-2581, Factor reagent og Buffer, stock solution, i henhold til Haemochrom Diagnostica AB specifikke STA-R vejledning. Reagenserne blev straks herefter påsat STA-R. FVIII prøvematerialet blev herefter hentet fra fryseren i interval på 8, som blev optøet i 15 min. ved 37⁰C i varmeblokken på biokemisk afdeling. Herefter blev prøveglassene vendt 10 gange inden påsætning på apparatet. Der blev løbende optøet og påsat nyt prøvemateriale indtil alle prøver var analyseret 30. Resultaterne for FVIII-analysen er svaret i et forhold af normalaktivitet, der er defineret som 1 IU/mL. Resultaterne er efterfølgende omregnet til IU/dL ved brug af formlen:, hvor R er resultatet. Von Willebrand Faktor vwf-aktivitetens analyseprincip er et kinetisk, immunoturbidimetrisk assay, hvor kittet består af et latexreagens med bundne monoklonale antistoffer, der er rettet mod en funktionel epitop på vwf, glykoprotein Ib-receptor. Ved tilsætning af Side 19 af 46

21 Fig 2: De antistof coated latexperler vil binde sig til vwf epitoperne. Denne antigen/antistof reaktion danner agglutinater.agglutiationsgraden kan måles spektrofotometrisk. prøvematerialet vil antistofferne binde sig til vwf, hvorved der sker agglutinationer af latexreagenset. Graden af agglutinationerne er direkte proportional med vwfaktiviteten i prøvematerialet og bliver målt i forhold til reducering af det transmitteret lys, som er forårsaget af agglutinaterne 34. Reaktionen er afbilledet i fig 2. Efter opstart af STA-R, blev de normale og abnormale kontroller rekonstitueret ved samme fremgangsmåde som ved FVIII. Herefter blev vwf-reagenset klargjort ved at tilsætte tris bufferen til latexreagenset og lade reagenset henstå i 30 min. ved stuetemperatur. Reagenset blev herefter påsat STA-R. Den normale og abnormale kontrol blev vendt 10 gange efter henstand i 30. min og derefter analyseret. vwf prøvematerialet blev herefter hentet fra fryseren i interval af 8, som blev tøet i 15 min. ved 37⁰C i varmeblokken på biokemisk afdeling. Herefter blev de vendt 10 gange inden påsætning på apparatet. Der blev løbende optøet nyt prøvemateriale indtil alle prøver var analyseret 34. Resultaterne for vwf-analysen er svaret i et forhold af normalaktivitet, der er defineret som 1 IU/mL. Resultaterne er efterfølgende omregnet til IU/dL ved brug af formlen:, hvor R er analyseresultatet. Fibrinogen Analyseprincippet for fibrinogen er en kvantitativ bestemmelse af plasmaet, hvor der anvendes Clauss metode, som er baseret på en øget viskositet i fortyndet prøvemateriale, efter tilsætning af overskud af calcium-trombin. Koagulationstiden er herved direkte afhængig af prøvematerialets koncentration af fibrinogen. Mængden af fibrinogen måles gennem bevægelsen af en stålkugle, der pendler frem og tilbage i Side 20 af 46

22 testmaterialet med en bestemt hastighed. Viskositeten vil øges når trombin spalter fibrinogen til uopløselige fibrin, så der dannes et koagel, hvorved bevægelsen vil mindskes og til sidst stoppe. Fibrinogen indholdet beregnes herefter som en funktion af tiden fra reagenstilsætning stilstand af stålkuglen 35. Reaktionen er afbilledet i fig 3. Fig 3: Reaktionsforløbet efter tilsætning af calcium-trombin. Trombinen spalter fibrinogen til uopløseligt fibrin, hastigheden hvorved koaglet dannes er direkte propertionelt med mængden af fibrinogen. Fibrinogen reagenset blev klargjort dagen forinden, ved at tilsætte 4 ml vand og vendt 10 gange. Det henstod i 30 min. ved stuetemperatur. Reagenset blev vendt 10 gange efter henstand og blev påsat STA-R. På analyse dagen blev der lavet en vedligeholdelse og opstart af apparatet, STA-R, hvorefter de normale og abnormale kontroller blev rekonstitueret ved tilsætning af 1 ml vand ved afpipppetering. Herefter blev kontrollerne homogeniseret ved at vende dem 10 gange og henstod i 15 min. med påskruet låg ved stuetemperatur. Inden analysering blev den normale og abnormale kontrol analyseret. Fibrinogen prøvematerialet blev hentet fra fryseren 20 prøveglas ad gangen, som blev tøet i 15 min. ved 37⁰C i varmeblokken på biokemisk afdeling. Herefter blev de vendt 10 gange inden påsætning på apparatet. Der blev løbende optøet nyt prøvemateriale, og dette fortsattes indtil alle prøver var analyseret 35. Resultaterne for fibrinogen-analysen er svaret i µmol/l og er efterfølgende omregnet til g/l ved brug af formlen:, hvor R er analyseresultatet. Statistiske test Hele datasættet De statistiske test blev udført i computerprogrammet Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation), hvor der blev lavet en grafisk præsentation af et /Y-plot. Probitplottene viste at alle resultater var normalfordelte. Alle data blev Side 21 af 46

23 sammenlignet med en parret t-test og fik udregnet middelværdi og standarddeviation (SD). A-FFP og F-FFP for sig A-FFP og F-FFP var normalfordelte. Til sammenligning af varianser mellem A-FFP og F- FFP blev der anvendt F-test. Ved normalfordelte data blev der benyttet en uparret t- test med ens eller forskellig varians og fik udregnet middelværdi og SD. Side 22 af 46

24 IU/dL Mikael Lund Fuglsang Larsen 13. december 2012 Resultater FVIII På fig. 4 er alle tredive donorers FVIII koncentration vist 0, 24, 48 og 72 timer efter optøning. Den stiplede linje angiver minimumsgennemsnittet af FVIII på 70 IU/dL 4, og de 2 sorte streger angiver reference intervallet på IU/dL af plasmaportionerne har fald i FVIII koncentration fra tid 0 til 24 timer, 25 af plasmaportionerne har et fald fra tid 24 til 48 timer og 18 plasmaportioner har et fald fra tid 48 til 72 timer. To af analyserne for tid 48 mislykkes, henholdsvis en F-FFP og en A-FFP, pga. manglende reagens til at omanalysere en uacceptabel regessionsberegning, (se bilag 1). Ved alle efterfølgende beregninger, hvor de to manglende resultater skulle have været parret, er de samhørende resultater udgået FVIII indhold over tid Tid 0 Tid 24 Tid 48 Tid 72 Figur 4: angiver de tredive plasmaportioners FVIII indhold, de røde streger er A-FFP og de blå streger F-FFP. På y-aksen er værdien IU/dL repræsenteret og på x-aksen angives tid efter optøning. Den stiplede linje angiver mindste accepterede koncentration på 70 IU/dL. og de 2 brede sortestreger angiver referenceværdien for raske personer. Side 23 af 46

25 Tabel 1 Tid 0 ± SD (n=30) Tid 24 ± SD (n=30) Tid 48 ± SD (n=28) Tid 72 ± SD (n=30) FVIII (IU/dL) 136 ± ±24* 94 ± 20* 87 ± 19* % forskel fra 0,00 % -22,06 % -30,88 % -36,03 % tid 0 P værdi P<0,0001 P<0,0001 P<0,0032 * Signifikant forskellig fra tid 0 Resultaterne for FVIII koncentrationen blev indsat i et probitplot og visuelt aflæst, hvor der kunne ses en tilnærmelsesvis ret linje uden systematisk afvigelser. Der blev ved parret enhalet T-test påvist signifikant forskel tiderne imellem: 0t-24t (P<0,0001), 24t-48t (P<0,0001) og 48t-72t (P=0,0032). I tabel 1 ses FVIII koncentrationen, der opgives som gennemsnit ±SD. Ved tid 0 var 136±36 IU/dL; ved tid 24 var 106±24 IU/dL; ved tid 48 var 94±20 IU/dL og ved tid 72 var 87±19 IU/dL. Yderligere ses det i tabellen, at der er en procentvis afvigelse fra tid 0. Ved tid 24 var der et fald på 22,06 %, ved tid 48 et fald på 30,88 % og ved tid 72 et fald på 36,03 %. Prøvepopulationen består af ligeligt fordelte A-FFP og F-FFP, hvor brugen af probitplot viste, at A-FFP og F-FFP var normaltfordelte. Der blev udført en F-test for at sammenligne variansen mellem A-FFP og F-FFP. Der var ikke signifikant forskel på variansen for tid 0 (P=0,3869), tid 24 (P=0,4819), tid 48 (P=0,3524) og tid 72 (P=0,1210). Ved en uparret T-test med ens varians havde A-FFP et signifikant højere indhold af FVIII ved tid 0 (P=0,0423) og tid 24 (P=0,0364), men ikke ved tid 48(P=0,1086) og tid 72 (P=0,2754). Resultaterne for A-FFP og F-FFP er præsenteret i tabel 2, ved tid 0 havde A-FFP et gennemsnitligt FVIII indhold på 147±33 IU/dL, F-FFP havde et FVIII indhold på 125±36 IU/d. Ved tid 24 havde A-FFP et gennemsnitligt FVIII indhold på 114±23 IU/dL, F-FFP, havde et FVIII indhold på 98±23 IU/dL. Ved tid 48 havde A-FFP et gennemsnitligt FVIII indhold på 99±21 IU/dL, F-FFP havde et FVIII indhold på 90±19 IU/dL. Ved tid 72 havde A-FFP et gennemsnitligt FVIII indhold på 89±22 IU/dL, F-FFP havde et FVIII indhold på 85±19 IU/dL. Yderligere ses i tabellen den procentvise afvigelse fra tid 0 for både A-FFP og F-FFP. Ved tid 24 faldt A-FFP 22,45 % og F-FFP 21,60 %. Ved tid 48 Side 24 af 46

26 faldt A-FFP 32,65 % og F-FFP 28,00 %. Ved tid 72 faldt A-FFP 39,46 % og F-FFP 32,00 %. Middelværdien for A-FFP var ved tid 0 17,60 % højere, tid 24 16,33 % højere, tid 48 10,00 % højere og tid 72 4,71 % højere sammenlignet med F-FFP. Tabel 2 A-FFP - FVIII (IU/dL) % forskel fra tid 0 F-FFP - FVIII (IU/dL) % forskel fra tid 0 Tid 0 ± SD (n=15) Tid 24 ± SD (n=15) Tid 48 ± SD (n=14) Tid 72 ± SD (n=15) 147 ± ± ± ± 22 0,00 % -22,45 % -32,65 % -39,46 % 125 ± ± 23 90± ± 19 0,00 % -21,60 % -28,00 % -32,00 % P-værdi 0,0423 0,0364 0,1086 0,2754 Von Willebrand Faktor På fig. 5, er alle otteogtyve donorers vwf-aktivitet vist over de fire målingstider 0t, 24t, 48t og 72t efter optøning. De 2 sorte streger repræsenterer referenceværdien på IU/dL 37. To af A-FFP portionerne blev ikke analyseret for vwf aktivitet, da det anvendte reagens blev opbrugt, og der ikke forefandtes mere på afdelingen med samme lot. nr. Side 25 af 46

27 IU/dL Mikael Lund Fuglsang Larsen 13. december vwf aktivitet over tid Tid 0 Tid 24 Tid 48 Tid 72 Figur 5: De otteogtyve plasmaportioners vwf aktivitets afbilledet hvor A-FFP er med rødstreg og F-FFP med blå streg. På y-aksen er der repræsenteret værdien i IU/dL og på x-aksen er prøverne adskilt efter tidsperiode. De 2 sorte streger angiver referenceværdien for raske personer. Resultaterne for vwf aktiviteten, blev indsat i et probitplot, hvor der visuelt kunne aflæses en tilnærmelsesvis lige linje uden systematisk afvigelse. Der blev ved parret enhalet T-test ikke påvist signifikant forskel mellem tiderne 0t-24t (P=0,1365), 0t-48t (P=0,4936). Ved 0t-72t (P=0,0011) blev der påvist signifikant forskel. I tabel 3 ses vwf aktiviteten, der ved tid 0 var 123±43 IU/dL; ved tid 24 var 120±38 IU/dL; ved tid 48 var 123±40 IU/dL og ved tid 72 var 117±43 IU/dL. Yderligere ses det i tabellen, at der er en procentvis afvigelse fra tid 0. Ved tid 24 var der et fald på 2,44 %, ved tid 48 var der ingen forskel og ved tid 72 et fald på 4,88 %. Tabel 3 Tid 0 ± SD (n=28) Tid 24 ± SD (n=28) Tid 48 ± SD (n=28) Tid 72 ± SD (n=28) vwf (IU/dL) 123 ± ± ± ± 43* % forskel fra 0,00 % -2,44 % 0,00 % -4,88 % tid 0 P værdi 0,1365 0,4936 0,0011 * signifikant forskelligt fra tid 0 Side 26 af 46

28 g/l Mikael Lund Fuglsang Larsen 13. december 2012 Prøvepopulationen består af tretten A-FFP portioner og femten F-FFP portioner, hvor den visuelle aflæsning af probitplot viste en tilnærmelsesvis lige linje uden systematisk afvigelse. F-test blev udført på A-FFP mod F-FFP og viste ingen signifikant forskel på variansen for tid 0 (P=0,2577), tid 24 (P=0,4807), tid 48 (P=0,4388) og tid 72 (P=0,4447). Ved en uparret T-test med ens varians var der ingen signifikant forskel på vwf aktiviteten ved tid 0 (P=0,4536), tid 24 (P=0,4001), tid 48(P=0,4316) og tid 72 (P=0,4355). Fibrinogen På fig. 6, er alle tredive donorers fibrinogen koncentration vist over fire målingstider 0t, 24t, 48t og 72t efter optøning. De 2 sorte linjer repræsenterer reference intervallet 2,21-4,42 g/l. 38 5,5 Fibrinogen indhold over tid 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 Tid 0 Tid 24 Tid 48 Tid 72 Figur 6: De tredive plasmaportioners er afbilledet med A-FFP afbilledet med røde streger og F-FFP afbilledet med blå streger. På y-aksen er værdien g/l repræsenteret og på x-aksen er prøverne adskilt efter tidsperiode. Side 27 af 46

29 Tabel 4 Tid 0 ± SD (n=30) Tid 24 ± SD (n=30) Tid 48 ± SD (n=30) Tid 72 ± SD (n=30) Fibrinogen (g/l) 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,6* % forskel fra tid 0,00 % 0,00 % 0,00 % 0,00 % 0 P værdi 0,2221 0,2093 0,0135 * Signifikant forskellig for tid 0 Resultaterne for fibrinogen blev indsat i et probitplot, hvor der kunne aflæses en tilnærmelsesvis lige linje uden systematiske. Der blev ved parret t-test ikke påvist signifikant forskel mellem tiderne 0t-24t (P=0,2221), 0t-48t (P=0,2093), der blev påvist signifikant forskel ved 0t-72t (P=0,0135). I Tabel 4 ses middelværdien for alle tider var 3,2±0,6 g/l. Derudover er der ingen procentvis afvigelse fra tid 0 til alle tiderne. Prøvepopulationen består af ligeligt fordelte A-FFP og F-FFP, hvor brugen af probitplot viste, at A-FFP og F-FFP var normalfordelte. F-test viste signifikant forskel på variansen mellem A-FFP og F-FFP ved tid 0(P=0,0013), tid 24 (P=0,0026), tid 48 (P=0,0020) og tid 72 (P=0,0029). Ved en uparret T-test med uens varians havde A-FFP et højere gennemsnit indhold af fibrinogen end F-FFP ved tid 0(P=0,0284), tid 24 (P=0,0435), tid 48 (P=0,0310) og tid 72 (P=0,0196). Resultaterne er præsenteret i tabel 5. Ved alle tider havde A-FFP et gennemsnitligt fibrinogen indhold på 3,4±0,8 g/l. F-FFP havde ved tid 0 et gennemsnitlig fibrinogen indhold på 3,0±0,3 g/l. Ved tid 24 og 48 på 3,0±0,4 g/l og ved tid 72 på 2,9±0,4 g/l. Yderligere ses det i tabellen, at der kun er en procentvis afvigelse fra tid 0 ved tid 72 for F-FFP, hvor der var et fald på 3,33 %. En sammenligning mellem A-FFP og F-FFP viste, at gennemsnittet for fibrinogen i A- FFP var 11,76 % højere ved tid 0, 24 og 48. Ved tid 72 var det 14,71 % højere end F- FFP. Side 28 af 46

30 Tabel 5 A-FFP - Fibrinogen (g/l) % forskel fra tid 0 F-FFP - Fibrinogen (g/l) % forskel fra tid 0 Tid 0 ± SD (n=15) Tid 24 ± SD (n=15) Tid 48 ± SD (n=15) Tid 72 ± SD (n=15) 3,4 ± 0,8 3,4 ± 0,8 3,4 ± 0,8 3,4 ± 0,8 0,00 % 0,00 % 0,00 % 0,00 % 3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,4 3,0 ± 0,4 2,9 ± 0,4 0,00 % 0,00 % 0,00 % -3,33 % P værdi 0,0284 0,0435 0,0310 0,0196 Oversigt over alle resultater Tabel 6 viser alle resultaterne for FFP over tid, samt den procentvise afvigelse i forhold til tid 0, som præsenteret tidligere i afsnittet. Tabel 7 viser alle resultaterne for A-FFP og F-FFP over tid, samt forskellen på A-FFP og F-FFP i %, som præsenteret tidligere i afsnittet. VWF aktiviteten er ikke opgivet, da der ikke blev påvist signifikant forskel på de 2 plasmatyper. Tabel 6 Tid 0 ± SD (n=30) Tid 24 ± SD (n=30) Tid 48 ± SD (n=30) Tid 72 ± SD (n=30) Anbefalede Værdier 8 FVIII (IU/dL) 136 ± ± 24* 94 ± 20 * 87 ± 19* 70 IU/dL % fald fra tid 0-22,06 % -30,88 % -36,03 % vwf (IU/dL) 123 ± ± ± ± 43 * - % fald fra tid -2,44 % 0,00 % -4,88 % 0 Fibrinogen 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,6* - (g/l) % fald fra tid 0,00 % 0,00 % 0,00 % 0 *signifikant forskelligt fra tid 0, n=28 Side 29 af 46

31 Tabel 7 FVIII A-FFP (IU/dL) FVIII F-FFP (IU/dL) Forskel mellem A-FFP og F-FFP Fibrinogen A- FFP (g/l) Fibrinogen F- FFP (g/l) Forskel mellem A-FFP og F-FFP n=14 Tid 0 ± SD (n=15) Tid 24 ± SD (n=15) Tid 48 ± SD (n=15) Tid 72 ± SD (n=15) Anbefalede Værdier ± ± ± ± IU/dL 125 ± ± 23 90± ± IU/dL 17,60 % 16,33 % 10,00 % 4,71 % - 3,4 ± 0,8 3,4 ± 0,8 3,4 ± 0,8 3,4 ± 0,8-3,0 ± 0,3 3,0 ± 0,4 3,0 ± 0,4 2,9 ± 0,4-11,76 % 11,76 % 11,76 % 14,71 % - Side 30 af 46

32 Diskussion Metodiske overvejelser Der er blevet udgivet utallige artikler omkring anvendelsen af FFP efter 24 timer, men studierne har været meget varierende. Variablerne har omfattet blodtype, henstand og opbevaringstemperatur inden separering af fuldblod. Temperaturen hvor FFP er nedfrosset, optøet og opbevaret. Endelig har valget af koagulationsfaktorer været forskellige. Hovedårsagen til dette skal ses i lyset af, at de 2 væsentlige organisationer European Committee on Blood Transfusion og American association of blood banks (AABB) stiller specifikke kvalitetskrav, men kun overordnede krav til tapning, fraktionering og opbevaring. Dette medfører megen frihed i blodbanksdriften. Derved opstår de mange variabler, der medfører, at kun de færreste artikler er direkte sammenlignelige med danske tilstande. På denne baggrund vurderes det, at den eneste mulighed for at besvare problemformuleringen var et kvantitativt eksperimentelt studie. Kvaliteten af resultaterne af dette studie er essentiel, da dette studie skal anvendes til argumentation overfor SST. Derfor har der været stor fokus på ensartet og korrekt behandling af alle prøver. Et punkt kunne have været ændret med positiv indflydelse på kvaliteten. Alle prøver i dette forsøg er blevet nedfrosset efter udtag fra den optøede plasmaportion. I den daglige drift findes kun få prøver, der skal analyseres for vwf aktivitet og FVIII koncentration. Analysen opstartes kun engang hver 14 dag så dobbeltfrysning var nødvendig. Reagenserne er tillige meget dyre, og FVIII reagenset er kun holdbart i 4 timer efter rekonstituering 30. Det var ikke muligt at klargøre analysen dagligt da budgettet ikke tillod kassering af ubrugt reagens. Dobbeltfrysning er derfor blevet anvendt og vil være kilde til bias. Omfanget af denne bias vil forsøgt blive bestemt for de enkelte koagalationsfaktorer, men der vil ikke blive korrigeret for denne. Anvendeligheden af resultaterne er derfor ikke påvirket, da denne bias ikke er i vores favør. Side 31 af 46

33 Metode Ved FVIII analysen blev der fundet en hidtil ukendt fejlkilde, der ledte til forkastelsen af flere analyse resultater. FVIII analysen fra Chromogenix er en chromogen analyse, der bestemmer FVIII indholdet ved at måle fraspaltningen af en chromofor. Denne fraspaltning leder til en linær kurve, men i enkelte tilfælde blev der observeret en parallelforskydning af måleresultaterne. Parallelforskydningen ledte til, at der blev tegnet en regressionslinje som et gennemsnit af de 2 parallelle kurver, men godkendt da R 0,98. Resultaterne blev som følge manuelt kasseret og reanalyseret. Som konsekvens var der ikke nok reagens til at reanalysere 2 prøver, som derfor ikke er med i dette datasæt. (eksempel på kurverne kan ses i Bilag 1). FVIII koncentrationen bør kunne måles med en præcision på 2,4 % og en akkuratesse på 4,9 % for at kunne måle forskelle af klinisk relevans 39. FVIII analysen på KBA i Næstved lever ikke op til dette. På KBA Næstved er analysens akkuratesse valideret til 6,7 % for normalt niveau. Præcision er valideret til 4 %. Både præcisionen og akkuratessen ligger over det ønskede, men Wayne L et al. har lavet en sammenligning af 3 forskellige assaytyper. Resultater viste at det chromogene assay fra chromogenix er det bedste af de 3 med den laveste CV 5,9 % og en akkuratesse på 6,7 % *40. Resultaterne kan derfor ikke forventes bedre. vwf aktiviteten bør kunne måles med en præcision på 1,3 % og en akkuratesse på 6,9 % for at kunne måle forskelle af klinisk relevans 39. Ved valideringen af analysen kunne KBA i Næstved ikke leve op til dette, med en præcision på 6,4 % og akkuratesse på 3,9 % for normale kontrol. For vores formål kan der accepteres en større spredning, da der beregnes gennemsnit på en større population. Fibrinogen indholdet bør kunne måles med en præcision på 5,4 % og en akkuratesse på 4,8 % for at kunne måle forskelle af klinisk relevans 39. Ved valideringen af * Beregnet ud fra opgivede værdier: sand værdi 150 %, målt værdi 140 %. Beregning: Side 32 af 46