Metodesammenligning af p-albumin målt med bromcresol green og s-totalprotein målt med biuretreaktion i forhold til myelomatose patienter.

Transkript

1 Metodesammenligning af p-albumin målt med bromcresol green og s-totalprotein målt med biuretreaktion i forhold til myelomatose patienter. Projektet er udarbejdet af Mona Paaske, BN I samarbejde med Nanna Toft Lorentzen og Lonnie Rikke Lauridsen Fussinger på Klinisk Biokemisk Afdeling, Slagelse. Professionsbachelorprojekts vejledere: K-vejleder: Ida Enø Jensen, Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Slagelse. I-vejleder: Kim Blanksø Pedersen, Adjunkt, cand. Scient. ved University College Sjælland, Næstved. Bioanalytikeruddannelsen UCSJ, Næstved: Den 8. oktober januar 2014.

2 Metodesammenligning af p-albumin målt med bromcresol green og s-totalprotein målt med biuretreaktion i forhold til myelomatose patienter. Method Comparison of p-albumin measured with bromocresol green and s-total protein measured with biuretreaktion compared to multiple myeloma patients. Billedet fra forsiden er fundet på: Projektet er udarbejdet af Mona Paaske, BN I samarbejde med Nanna Toft Lorentzen og Lonnie Rikke Lauridsen Fussinger på Klinisk Biokemisk Afdeling, Slagelse. Professionsbachelorprojekts vejledere: K-vejleder: Ida Enø Jensen, Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk Afdeling, Slagelse. I-vejleder: Kim Blanksø Pedersen, Adjunkt, cand. Scient. ved University College Sjælland, Næstved. Bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland, Næstved: Den 8. oktober januar 2014 Ordoptælling: anslag uden mellemrum Undertegnet bekræfter hermed, at der ikke er benyttet uretmæssigt hjælp samt at opgaven er udfærdiget af mig. Dato: den 3. januar 2014 Underskrift: Mona Paaske 2

3 Resumé: Baggrund: Baggrunden for dette projekt er, at sammenligne to analysemetoder. Da Klinisk Biokemisk Afdeling i Slagelse har skiftet Cobas 6000, Roche ud med Dimension Vista 1500, Siemens, hvor man blandt andet måler analysen p-albumin. Men da der samtidig er blevet ændret på metoden for udregningen af M-komponenter, før brugte man Albumin målt ved med Bromcresol Green på Cobas 6000, Roche til nu, hvor man måler totalprotein på Dimension Vista 1500, Siemens. Blev det derfor til, at vi skulle måle p-albumin på Cobas 6000, Roche og s-totalprotein på Dimension Vista 1500, Siemens i stedet. Formål: Formålet med dette projekt er, at be- eller afkræfte Lyngbye s teori. Denne teori siger, at ved Myelomatose kan bestemmelsen af albumin foretages korrekt med en automatiseret bromkresolgrønt (BCG)-metode 1. samt undersøge om det har nogen betydning, at p-albumin er blevet skiftet ud med s-totalprotein til beregningen af M-komponenten. Materialer og metoder: Der blev målt henholdsvis p-albumin og s-totalprotein på 100 patienter med en positiv M-komponent og 100 donorer blev anset for at være raske. Målingerne for p-albuminen blev foretaget på Cobas 6000, Roche på klinisk biokemisk afdeling i Nykøbing F. og s-totalproteinen blev målt på Dimension Vista 1500, Siemens på kliniske biokemisk afdeling i Slagelse. Der blev indhentet data fra patienter, der var blevet undersøgt for s-totalprotein, p-albumin og M- komponent i år Der blev udvalgt 300 tilfældige patienter, som havde prøvesvar for p-albumin og s-totalprotein samt ikke havde fået påvist en positiv M-komponent. På baggrund af analysesvarerne for s-totalprotein blev der beregnet et referenceinterval. Resultater: Der er blevet udfærdiget grafer for normalfordelingerne på p-albumin, s-totalprotein og procentdelen af hvad p-albumin udgør af s-totalproteinen samt fordelingen af forekomsten af Myelomatose, hvor inddelingen er sket efter alder. Ved normalfordelingskurvene er det henholdsvis donor, patienter der bliver sammenlignet samt donor, patienter og referencegruppen. Der blev ligeledes beregnet referenceinterval på baggrund af de resultater fra referencegruppen. Konklusion: Det er ikke muligt at sammenligne p-albumin og s-totalprotein. Dog er det beregnet referenceinterval for s-totalprotein er højere end det fra NORIP. Hvilke kan skyldes, at deres data er fra hele norden, ligesom der ikke er taget højde for køn og alder samt at vores patienter er syge. Det kan ligeledes fastslås, at det har ikke nogen betydning for beregningen af M-komponenten, at p-albuminen er udskiftet med p-totalproteinen. Da denne bliver beregnet ved hjælp af forholdsregning. 3

4 Forord: Til udarbejdelse af dette bachelorprojekt, vil jeg gerne takke Transfusion centeret i Næstved for tilladelsen til at indsamle donormateriale og med hjælpen til at indhente oplysninger om donorernes køn og alder samt et stor tak til personalet på de kliniske immunologiske i Nykøbing F. og Slagelse for at tappe donorerne og til donorerne som gjorde det muligt, at vi kunne få prøvemateriale til vores projekt. Ligeledes vil jeg takke de kliniske biokemiske afdelinger i henholdsvis Roskilde og Slagelse for hjælpen med indsamlingen af de positive M-komponenter. De kliniske biokemiske afdelinger i henholdsvis Nykøbing F. og Slagelse skal også have en tak for deres tålmodighed og deres vejledning til apparaturerne, så vi kunne få analyseret vores prøver for p-albumin og s-totalprotein. Der skal også lyder en stor tak til vejlederne, Ida Enø Jensen, Bioanalytikerunderviser på klinisk biokemisk afdeling på Slagelse Sygehus og Kim Blanksø Pedersen, Adjunkt, cand. Scient. Ved University College Sjælland, Næstved. En tak til Mikala Klok Jørgensen, Kemiker på de kliniske biokemiske afdelinger på Nykøbing F., Slagelse og Næstved Sygehus, der tog sig tid til at lade sig interviewe. Dette interview gav os en ny vinkel til, hvordan vi kunne gribe vores projekt an og samtidig stadig kunne anvende vores resultater ligesom Lars Engers Pedersen, Kemisker på de kliniske biokemiske afdelinger på Nykøbing F., Slagelse og Næstved sygehus skal have en tak for at finde patientdata frem til os, så det gjorde det muligt for os, at beregne referenceintervaller for s-totalprotein og den procentmæssige del af, hvor meget p-albumin udgjorde af s-totalprotein. Til sidst vil jeg takke mine medstuderende, Lonnie Rikke Lauridsen Fussinger og Nanna Toft Lorentzen, for et godt samarbejde både til forberedelserne til projektet, i laboratorierne på Slagelse og Nykøbing F. sygehuse samt til udarbejdelsen af dele af projektet. 4

5 Indholdsfortegnelse: RESUMÉ:... 3 FORORD:... 4 INDHOLDSFORTEGNELSE:... 5 INDLEDNING:... 7 PROBLEMFORMULERING:... 8 METODISKE OVERVEJELSER:... 8 TEORI: MYELOMATOSE: ALBUMIN: TOTALPROTEIN: M-KOMPONENT: MATERIALER OG METODE: PRØVEMATERIALE: METODE: MÅLING AF P-ALBUMIN PÅ COBAS 6000, ROCHE: MÅLING AF S-TOTALPROTEIN PÅ DIMENSION VISTA 1500, SIEMENS: KVALITETSSIKRING: RESULTATBEHANDLING: LITTERATURSØGNING: FEJLKILDER: RESULTATER: DISKUSSION: KONKLUSION:

6 PERSPEKTIVERING: LITTERATURLISTE: BILAG: BILAG 1: ANALYSESKEMA TIL ANVENDT LITTERATUR BILAG 2: KONTROLLERNE BILAG 3: GODKENDELSE/TILLADELSEN FRA TRANSFUSIONSCENTRET BILAG 4: RESULTATER GRAFER

7 Indledning: Dette projekt tog udgangspunkt i Lyngbyes udtalelse om, at man ved Myelomatose kan bestemmelsen af albumin foretages korrekt med en automatiseret bromkresolgrønt (BCG)-metode. 1. Da Cobas 6000, Roche, som benytter bromcresol green til bestemmelsen af p-albumin er blevet udskiftet til Dimension Vista 1500, Siemens på klinisk biokemisk afdeling på Slagelse sygehus. Dimension Vista 1500, Siemens benytter bromcresol purple i stedet for bromcresol green. Derfor ønskede vi lavet en metodesammenligning af de to analysemetoder, ved at analysere vores patientog donorprøver for p-albumin på begge apparater. Duly, E.B. et al. 2. der tidligere havde afprøvet begge analyser og ifølge deres resultater var bromcresol purple klart bedre i forhold til bromcresol green. De mener, at det er derfor bromcresol green er blevet erstattet af bromcresol purple på mange laboratorier. 2. Derfor ønskede vi, at undersøge dette nærmere. Var der en forskel på de to analysemetoder og var den ene bedre end den anden. Men projektet tog en drejning, da det viste sig, at man ikke længere brugte p-albumin til bestemmelsen af M-komponenten, men derimod s-totalprotein. Det viste sig, at der er kommet flere patienter som skal undersøges for M-komponent. Da M-komponenten er blevet en fast analyse til udredning af kræft. 3. Derfor er der blevet udført en kvalitetssikring af analysen. Da man tidligere tastede alle prøvesvarene for p-albumin ind manuelt, er det nu blevet muligt, at få overført prøvesvarene for s-totalproteinen elektronisk. Betydningen for dette er, at risikoen for evt. tastefejl nedsættes og rent tidsmæssigt bliver processen hurtigere samt kvaliteten løftet. 19. Derfor blev projektet ændret til, at vi skulle sammenligne s-totalprotein og p-albumin. For at kunne be- eller afkræfte Lyngbye s teori, ligesom vi ville undersøge rent teoretisk, om det havde nogen betydning for bestemmelsen af M-komponenten, at man nu bruger s-totalprotein i stedet for p-albumin. Men ifølge Dansk Selskab for Klinisk Biokemi har dette skift ingen betydning, da M-komponenten bliver beregnet ved hjælp af forholdsregning. 4,5,19. Til resultatbehandlingen blev der indhentet prøvesvar fra patienter, som var blevet undersøgt for s- Totalprotein, p-albumin og M-komponent. Der blev udvalgt 300 tilfældige patienter, der ikke havde fået påvist en positiv M-komponent, men havde prøvesvar på p-albumin og s-totalprotein. 7

8 s-totalproteinsvarerne skulle bruges til at beregne et referenceinterval. Denne gruppe patienter vil blive omtalt i projektet som referencegruppen. Ifølge The International Federation af Clinical Chemistry (IDCC) 1. skal der minimum benyttes 120 prøver til bestemmelsen af et referenceinterval. Da en del analyser er inddelt efter alder og køn, bør der være minimum 120 til hver. Det vil sige ved f.eks. p-albumin bør der være minimum 120 kvinder i alderen under 40 år, 120 stk. fra år og 120 stk. 70 år, det sammen gælder for mændene. 1. Vi valgte, at medtage referencegruppen til beregningen af referenceintervallerne, da vores population af donor blot var på 100 i alt. Derved ville vores beregninger ikke have været lige så valid som denne gruppes. Der skal der dog tages forbehold til dette referenceinterval, da de udvalgte patienter ikke anses for at være raske, ligesom der heller ikke er blevet taget højde for deres alder og køn. Problemformulering: Hvordan kan man sammenligne p-albumin og s-totalprotein målt på patienter, der har udviklet M- komponenter? og hvordan ligger referenceintervallerne på de målte populationer af patienter og donorer, samt de indsamlede data fra referencegruppen? Metodiske overvejelser: Til besvarelsen af problemformuleringen blev der indsamlet 100 prøver fra henholdsvis donorer og patienter samt 300 tilfældige patienter (referencegruppen) der opfyldte vores krav. Af litteratur blev der blandet andet søgt på PubMed og blandt andet Myelomatose Foreningens hjemmeside for, at opnå mere viden om Myelomatose, p-albumin, s-totalprotein og M-komponenter samt brugt vores lærebøger. De krav vi havde til vores populationer var, at: Donorerne: ingen - da disse anses for at være raske, men der skulle dog indhentes en tilladelse fra Transfusionscentret af etiske årsager. Patienterne: de skulle have en positiv M-komponent. Referencegruppen: de skulle have prøvesvar på p-albumin, s-totalprotein og M-komponenten samt at denne skulle dog ikke være påvist. 8

9 Da man normalt tager prøven for M-komponent i et rødt gelglas 31. og p-albumin i et Li-Heparin glas 30., blev alle prøver taget i et rødt gelglas, der indeholder gel + Clot. Act. (Terumo Venosafe TM, Leuven Belgien) for at minimere forskellighederne mellem prøverne fra patienterne og donorerne så meget som muligt. Prøverne fra patienterne blev sat til side, når der var påvist en positiv M-komponent. Disse prøver blev afpipeteret over i et 4 ml perlemors glas (producent: Terumo Europe, Leuven Belgien) og sat på køle ved 2-5 C til senere analysering. Donorprøverne stod i ca. 30 min. før de blev centrifugeret. Derefter blev de ligeledes afpipeteret over i et 4 ml perlemors glas og sat på køle ved 2-5 C til senere analysering. Prøverne fra donorerne og patienterne blev først analyseret for s-totalprotein på Vista Dimension 1500, Siemens på klinisk biokemisk afdeling, Slagelse. Derefter blev prøverne pakket og sendt til Nykøbing F. s klinisk biokemisk afdeling. Her skulle prøverne analyseres for p-albumin på Cobas 6000, Roche. Men da chaufføren som skulle transportere disse prøver fra Slagelse til Nykøbing F., satte dem ved en fejl af på klinisk biokemisk afdelingen i Næstved. Betød dette, at vi selv måtte afhente dem i Næstved dagen efter og analysere dem en dag senere end planlagt. Der vil blive beregnet et nyt referenceinterval på baggrund af de prøvesvar fra referencegruppen på s-totalprotein samt lavet normalfordelingskurver på p-albumin og s-totalprotein og en fordeling af forekomsten af Myelomatose. Denne fordeling er inddelt i de aldersgrupper som Myelomatose foreningen oplyser vedr. om forekomsten af sygdommen. 7. De referenceintervaller som vil blive beregnet for s-totalprotein og den procentmæssige del p-albuminen udgør af s-totalproteinen, er der ikke blevet taget højde for alder eller køn, som det ellers anbefales af The International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Ifølge deres anbefalinger skal der mindst anvendes 120 prøver fra kvinder og 120 fra mænd. 1. Referenceintervallerne kan beregnes på to måder. Den første, hvis der er normalfordeling bruges der et referenceinterval, det vil sige, at 95% af den raske befolkning er inde for dette interval (x ± 2*SD). Den anden måde er, at man kan benytte en non-parametrisk metode. Her fastsættes referenceintervallet ved hjælp af 0,025 og 0,975-fraktilerne (r 1 = 0,025*n+1 og r 2 =0,975*n+1). Da det forventes, at 95% af den raske befolkning vil befinde sig inden for dette interval. 6. 9

10 Teori: Myelomatose: Der findes en del former for kræft, hvor af Myelomatose blot er en enkelt en af dem. Ved Myelomatose dannes der maligne myelomceller (plasmaceller) i knoglemarven, heraf det dansk navn Knoglemarvskræft. Der vil ofte være 20-30% flere af disse maligne myelomceller i knoglemarven end normalt og derved nedsættes dannelsen af erytrocytter på grund af pladsmangel, dette kan føre til anæmi. Myelomatose kan være latent, derved kan patienterne være symptomfri i en længere periode og er derfor ikke behandlingskrævende før symptomerne er fremtrædende eller hvis der sker en kraftig stigning af M-komponenterne. Denne sygdom må derfor heller ikke forveksles med knoglekræft. 29. Myelomatose er ikke en arvelig kræftsygdom som 5 % af de andre kræftformer er. 8. Men der er dog blevet påvist, at der er sket en kromosomforandring. Disse kromosomforandringer kan have betydning for sygdommens prognose, fx ved kromosom 17 kan der være sket en deletion som medfører en aggressiv sygdom eller kromosom 14 som indeholder arvematerialet til dannelsen af antistoffer. 7,8. Ifølge Myelomatose Foreningen rammes der omkring 300 personer hvert år i Danmark af myelomatose, hvilke gør at dette er den næsthyppigste hæmatologiske kræftsygdom. Den konstateres primært hos patienter som er over 60 år, dog ses den i sjældne tilfælde hos patienter under 40 år. 7,9. Myelomatose er en kræftsygdom som ikke kan heldbredes, men med den rette behandling vil man kunne leve længe med den i flere år eller holde den i ro. Der er dog en risiko for at den vil bryde ud igen. 7. Sygdommen kan inddeles i tre stadier ved hjælp af de to proteiner p-albumin og Beta-2-mikroglobulin (β2m). Inddelingen kan se således ud: Stadie I: normal albumin og β2m er lav ingen symptomer, ingen behandling. Stadie II: lav albumin og β2m er middelhøj en del har symptomer, behandling. Stadie III: β2m er høj sygdommen meget udbredt og er behandlingskrævende. 7. β2m kan bruges som er en markør for, hvor fremskredne sygdommen er og kan ligeledes bruges til, at fortælle om ens prognose samt nyrefunktion. β2m bliver modificeret ved forskellige sygdomme, dette sker ved at position 58 forsvinder Denne form ses ofte ved inflammatoriske tilstande. β2m er et protein som er en del af MCH I-molekylet, der bliver dannet i alle kerneholdige celler og 10

11 findes på overfladen af de hvideblodceller (leukocytter). Mængden af β2m vil derfor øges, når disse celler enten bliver dannet eller destrueret. 10,11. β2m kan også forekomme i urinen, da den normalt bliver filtreret i nyrerne ved glomerulær filtration. Størstedelen af β2m bliver nedbrudt i tubuluscellerne. Men niveauet af β2m vil stige, hvis tubulusfunktion er defekt eller den glomerulær filtrationen er nedsat. 1. Albumin: Albumin er et vigtig protein som bliver dannet i leveren, som udgør ca % af leveren proteinsyntesekapacitet. Niveauet af albumin styres ved hjælp af en feedbackmekanisme. Halveringstiden for albumin er på døgn, hvilke betyder, at dens levetid er længere end de fleste proteiners. Albuminen bruges som en uspecifik sygdomsmarkør, da kroppen ved kroniske og inflammatoriske tilstande nedsætter produktionen af p-albumin. Betydningen af en lav albumin bliver ofte forbundet med en dårlig prognose. Albuminen fungere som transportør for hydrofile stoffer fx calcium og magnesium, hormoner, fedtsyrer, lægemidler og har betydning for plasmas kolloidosmotiske tryk. Idet det udgør 60% af plasmaprotein og 80% af plasmaen kolloidosmotisk tryk samt udgør 50% af totalproteinet. 1. Det er derfor vigtigt at måle albumin niveauet, når man enten får medicin eller kommer op i alderen, da niveauet kan falde. Hvis niveauet for albumin er lav, øges det frie lægemiddel og man kan få en overdosis/intoksikation på grund af manglende bindingssteder/transportør. 1,10. Referenceintervallet for albumin er opdelt efter alder, fra år, år og 70 år. Dette interval er faldende med alderen. Børn er ikke inkluderet, da nyfødt har 10-20% lavere albumin niveau end voksne og børn i alderen op til 14 år har % højere albumin niveau, mens de unge fra år har det samme niveau som de voksne. Ligesom brugen af p-piller kan få albuminen til at flade lidt og under graviditet falder albuminen ligeledes med ca % i 2. og 3. trimester. 33. Det er ikke kun hos ældre eller dem i medicinsk behandling, som bør få tjekket sit albumin niveau. Da for lavt albumin kan forårsage underernæring, tarm-, lever- og nyresygdomme, ascitis (væskeansamling i bughulen), ødemer og for højt albumin niveau kan betyde dehydrering. 10. Albumin benyttes også som et lægemiddel, blandet hvis dialysepatienter får blodtryksfald og har for meget væske i kroppen. Samt de patienter som skal have tømt deres ascitis får albumin, dette gives for hver tredje liter ascitis væske for at forhindre ubalance i organismen. 11

12 Totalprotein: Serum Totalprotein består af p-albumin, globuliner og da det er serum er koagulationsfaktorerne ikke tilstede. Globulinerne består af proteiner med en globulær struktur, deraf navnet globuliner (se figur 1). Denne form for protein er for det meste hydrofile. 11. Disse globulinger kan inddeles i α, β og γ-globuliner. α- og β-globulinerne er transportør for blandt andet fedtstoffer. γ-globulinerne består af de proteiner som danner antistoffer, også kendt som immunglobuliner. 11. FIGUR 1 VISER ET GLOBULÆRT PROTEIN TEGNET AF Et komplet immunglobulin består af 2 tunge kæder og 2 lette kæder (se figur 2) samt udgør ca. 20 % af plasmaproteinerne hos raske mennesker. Immunglobulinerne kan deles i 5 grupper, IgG(γ) IgA(α) IgM(µ) IgE(ε) - IgD(δ) og de lette kæder kan deles op i to Lambda(κ) og Kappa(λ). Forskellen på Lambda og Kappa er, at Lambda forekommer som dimer, hvorimod Kappa er monomer. 11. IgG udgør ca. 85%, IgM udgør ca. 5% og IgA udgør ca.10% af immunglobulinindholdet i plasmaen, hvilket gør at det er de tre Ig-typer der oftest bliver testet for. IgE testes der primært for ved en allergisk reaktion, mens IgD s funktion er stadig uvis. Dog vides det, at den sammen med IgM giver signaler til FIGUR 2 VISER EN IMMUNGLOBULIN + DE FRIE LETTE KÆDER TEGNET AF B-cellerne som herefter bliver aktiveret

13 M-komponent: En monoklonal komponent (M-komponent) er et protein, der bliver dannet af en plasmacelle som der er blevet duplikeret i knoglemarven. Dette protein er et antistof uden nogen funktion og er blevet dannet af en klon, også kaldet et paraprotein. 10,13. Ved denne kloning bliver antistoffet ensformigt med hensyn til immunglobulintypen og antigenspecificeteten samt forhindre andre antistoffer i at blive dannet og derved bliver immunforsvaret svækket. Hvilke kan betyde, at patienter med myelomatose er sårbare over for andre sygdomme såsom influenza og lungebetændelse. 11. M-komponenten kan være et komplet immunglobulin, dvs. at det består af to tunge og to lette kæder. Disse typer kan inddeles i IgG, IgM, IgA (tunge kæder), Kappa og Lambda (de frie lette kæder = FLC) 4. Kæderne bliver dannet adskilt i plasmacellerne. De bliver samlet til et komplet immunglobulin, hvorefter de frigives til blodet. Hos nogle myelomatosepatienter ses der også de frie lette kæder, da plasmacellerne ikke kan danne et komplet immunglobulin. Normalt bliver de frie lette kæder udskilt ved glomerulær filtrering og nedbrydes i de tubulære celler, men bliver produktionen af de frie lette kæder for høj, vil dette kunne påvirke nyrernes evne til denne filtrering. 1. De frie lette kæder ophober sig i nyrernes tubuli og aflejrer sig i organerne i organismen. Ophobningen af de frie lette kæder i nyrernes tubuli kan medføre nyreinsufficiens og aflejringen i organerne kan blandt andet medføre kraftnedsættelse, smerter og lammelse % af patienterne med myelomatose har nyrepåvirkning, når diagnosen bliver stillet. Under sygdommen vil ca.50 % af patienterne udvikle nyrepåvirkning. Ved behandling kan i de fleste tilfælde mindske dannelsen af de frie lette kæder og nyrefunktionen kan genoprettes. Der er 20 % af myelomatose patienterne som ikke har M-komponenter i blodet, men derimod i urinen. 14. I urinen er de lette kæder bedre kendt som Bence-Jones protein. 13. Inden for myelomatose er forekomsten af IgG-typen den hyppigste, nemlig ca. 60%, derefter er det IgA med 20% og let-kæde myelomatose herunder Lambda eller Kappa er ligeledes ca. 20%

14 En oversigt for hvor længe immunglobulinerne og de frie lette kæder er i kroppen under normale forhold: Ig og FLC Kappa Lambda IgG IgA IgM 16. Halveringstid 2-4 timer 3-6 timer ca. 20 dage 6 dage 5 dage Sådan kan et prøvesvar se ud, når der er blevet analyseret for om M-komponent er tilstede eller ej. FIGUR 3 VISER PRØVESVAR, EN HVOR DER ER IKKE ER PÅVIST EN M-KOMPONENT OG EN HVOR DER ER

15 Materialer og metode: Prøvemateriale: Populationen til dette projekt bestod af 100 prøver fra patienter og 100 prøver fra donorer, således at vi kunne sammenligne en syg og en rask population. Prøverne er taget i et 3,5 ml rødt gelglas, der indeholder gel + Clot Act. (Terumo Venosafe TM, Leuven Belgien) hvilket betød, at vores prøvemateriale blev serum. Metode: Til eksperimentet er der indsamlet 100 prøver med positive M-komponenter på de kliniske Biokemisk afdeling på Slagelse og Roskilde sygehus og 100 donorprøver på de kliniske Immunologiske afdelinger på Nykøbing F. og Slagelse sygehus. Men inden donorprøver kunne blive indhentet, skulle der først gives tilladelse fra Transfusionscentret, Næstved af etiske årsager. Prøverne er taget i 3,5ml rød gelglas, der indeholder gel + Clot. Act. (Terumo Venosafe TM, Leuven Belgien), hvor efter de er henstillet 30 min, således at prøvematerialet havde tid til at koagulere. Herefter er prøverne centrifugeret ved en G-værdi på G-værdien bliver beregnet ud fra følgende formel: G = A * n 2 * r Efter centrifugering blev prøverne kørt på Capillarys af personalet på afdelingen, for at teste dem for M-komponent. Testes de positive, bliver de samtidig typebestemt. Herefter er prøverne stillet i køleskab ved 2-5 C. Vi er herefter mødt ind for, at afpipetterer serum over i et 4 ml perlemors glas (producent: Terumo Europe, Leuven Belgien). Det afpipetteret serum er dernæst blevet stillet i køleskab ved 2-5 C forud for analyseringen. Derud over er der indsamlet 100 donor prøver fra de kliniske Immunologiske Afdelinger i Nykøbing F. og Slagelse. Prøverne har ligeledes stået i 30 min. før centrifugeringen ved 3000 G, opbevaret i køleskab ved 2-5 C indtil vi mødte ind for at afpipettere dem over i et 4 ml perlemors glas, derefter blev de sat på køl igen sammen med patientprøverne til senere analysering. 18. Grunden til at vi opbevare dem på køl, er at holdbarheden er 5 måneder ved 2-8 C. Ved frysning ville der være en risiko for, at nogle af proteinerne kunne have ændret struktur. 18,19. Donor- og patientprøverne fik nyt nummer og derved blev de anonymiseret. Så det ikke var muligt for andre at kæde prøvesvarene på p-albumin og s-totalprotein sammen med hverken donorerne eller patienterne. 15

16 Der blev ligeledes indhentet patientdata fra året Disse patienter var blevet undersøgt for s- Totalprotein, p-albumin og M-komponent. Der blev udvalgt 300 tilfældige patienter som ikke havde fået påvist en positiv M-komponent og hvor der forelå prøveresultater på de to andre analyser. Der blev beregnet et referenceinterval ud fra prøvesvarerne for denne gruppe. Dette referenceinterval er dog med forbehold, da der ikke er taget højde for køn, alder og der samtidig formodes, at de ikke er raske. Måling af p-albumin på Cobas 6000, Roche: Analyseprincip: På Cobas 6000, Roche bruges en kolorimetrisk metode til analysering af P-albumin. Princippet går ud på, at der tilsættes en citratbuffer til prøven, der gør at ph-værdien falder. Når ph når 4,1. får albumin et kationisk karakter, der gør, at det bindes til et anionisk farvestof. Derved opstår et blågrønt kompleks imellem bromcresolgreen (BCG) og albumin. Farveintensitet er direkte proportionelt med koncentrationen af p-albumin der måles fotometrisk. På den måde kan den målte absorbans omregnes til g/l. Til analysering for p-albumin, anvendes apparaturet Cobas 6000 C-501(Roche). Analysen udføres på serum fra de indsamlede positive M-komponenter og serum fra donor prøver. Til analysen på Cobas 6000, Roche bruges et kit bestående af 2 reagenser R1; Citratbuffer: 95% mmol/l, med ph 4,1 samt konserveringsmiddel og R2; Citratbuffer: 95% mmol/l, med ph 4,1. Bromcresol green: 0,66 mmol/l samt konserveringsmiddel og NaCl Diluent 9%. 20. Ved analysering på Cobas 6000, Roche blev der fra hver prøve brugt 2µl. De 2 µl blev blandet med 100µl R1 og 20µl R2 og 30µl diluent. Analysetypen er en 2-Point-End, hvor reaktionstiden er 10 min. Absorbans måles på to målepunkter med bølgelængder på henholdsvis 505 og 570 nm (sekundær/primær). 20. Det anvendte Lot nr. var: ph 4, Albumin + BCG -> albumin-bcg kompleks Måling af s-totalprotein på Dimension Vista 1500, Siemens: Analyseprincip: s-totalprotein-metoden der er en in vitro-diagnostik analyse til måling af det totale protein indhold i serum. Selve princippet går ud på, at Kobber ion reager i en basis opløsning med proteinets peptidbinger. Der dannes et blå kobber ion proteinkompleks, der er proportionalt med koncentrationen af total protein i prøven. Reaktionstiden er 3,8 min og absorbansen bliver målt ved 540 og 700 nm. Dettes måles ved hjælp af en endepunktsteknik. 16

17 Til analysering af p-totalprotein, anvendes apparaturet Dimension Vista 1500 (Siemens). Analysen udføres på serum fra de indsamlede positive M-komponenter og serum fra donor prøver. Total protein (TP) reagens på Dimension Vista 1500, Siemens består af et TP Flex -reagenskassette med reagens 1: Kaliumnatriumtartrat 1,089 g/ml, NaOH og reagens 2: Kobbersulfat 0,015 mol/l. 21. Det anvendte Lot nr. var: 13073BB Cu ++ OH- + Protein > kompleks Absorberes ved 540 nm Kvalitetssikring: For at kvalitetssikre er der inden påbegyndelse af analyserne, er der blevet analyseret to interne kontroller. Ligger disse inden for intervallet som hedder middelværdien +/- 2 SD, accepteres kontrollernes resultater. Cobas 6000, Roche Der analyseres to interne kontroller dagligt, de hedder Multigual Unassayed Level 1 (MUL1) og Multigual Unassayed Level 3 (MUL3). Derudover analyseres der to ekstern kontroller. Den ene en gang om ugen, HK, som er en frysetørret Human Kontrol. Mens den anden, FHK, køres 1 gang om måneden, og er en Flydende Human Kontrol prøve. Begge eksterne kontroller produceres af Dansk institut for Ekstern Kvalitetssikring for laboratorier i sundhedssektoren (DEKS). Kalibreringen er lineær 2-punkts kalibrering. 20. Dimension Vista 1500, Siemens Der analyseres to interne kontroller dagligt, de hedder Immunology Controls, Level 1 og Immunology Controls, Level 3. Derudover analysere der 1 ekstern kontrol, HK12 en gang om ugen. Denne eksterne kontrol produceres af Dansk institut for Ekstern Kvalitetssikring for laboratorier i sundhedssektoren (DEKS). Kalibreringen er lineær 2-punkts kalibrering. 19,21. Resultatbehandling: Alle rådata fra analyseringen af serum prøverne blev skrevet ind i Excel til sammenligning og videre bearbejdning samt de data som blev fundet på de 300 patienter som udgør vores referencegruppe. 28. Der vil være en kvantitativ validering, hvor der vil blive set på diagrammer som viser fordelingen af resultaterne. Der vil der blive lavet normalfordeling af henholdsvis s-totalprotein og p- Albumin, som vil vise om der er en forskel på donorernes og patienternes prøvesvar. Der vil ligeledes blive beregnet, hvad p-albumin udgør af s-totalproteinen i procent. Ligesom der vil blive lavet en normalfordelingskurve over dette samt beregnet et referenceinterval der kan fortælle, hvor mange procent p-albuminen udgør af s-totalproteinen hos 95% af den raske befolkningen. Der vil 17

18 ligeledes blive lavet nogle statistiske beregninger over forekomsten af sygdommen Myelomatose. Disse grafer og beregninger skal bruges til videre diskussion samt at kunne vise os, om vores resultater stemmer overens med den fundne teori. 6. Litteratursøgning: Til belysning af teorien bag projektet, blev der fremsøgt litteratur, i form af artikler på PubMed og hente informationer fra de referencer Lyngbye har brugt til sin teori, samt informationer fra forskrifter ved de forskellige anvendte apparater. Mikala Klok Jørgensen, Kemiker på de kliniske biokemiske afdelinger på Nykøbing F., Slagelse og Næstved sygehus blev interviewet torsdag den 19. december 2013., klokken 13 til 14 på Slagelse sygehus. I dette interview gav Mikala Klok Jørgensen nogle ideer til, hvordan vi kunne give vores projekt an og samtidig anvende de resultater vi havde. 19. Lars Engers Pedersen, Kemiker på de kliniske biokemiske afdelinger på Nykøbing F., Slagelse og Næstved sygehus, der hjalp med at finde patientdata frem til os som muliggjorde, at vi kunne beregne et referenceinterval for s-totalprotein. 28. De fundne artikler, retningslinjer og lærebøgerne mm. skal give indsigt i og forståelse af teorien bag denne sygdom samt analysemetoderne. Der er blevet søgt på følgende ord på PubMed: Søgeord Hits Free full text Multiple myeloma Multiple myeloma + albumin Multiple myeloma + totalprotein Multiple myeloma + albumin + totalprotein Bromcresol green Bromcresol green + multiple myeloma 2 1 Bromcresol green + multiple myeloma + albumin 2 1 Bromcresol green + multiple myeloma + totalprotein 1 1 Bromcresol green + multiple myeloma + albumin + totalprotein 1 1 Albumin Totalprotein

19 Fejlkilder: Da det ikke er gruppen selv, der har taget prøverne i Slagelse. Har der været opbevaring og transport før vi har modtaget prøvematerialet. Det må derfor forventes, at man systematisk har forholdt sig til den gældende vejledning (PAV præanalytiske vejledning). 18. Dog kan vi ikke udelukke, at det ikke forholder sig således og må derfor tage forbehold til de præanalytiske forbehandlinger. Samtidig er det ikke muligt, at udføre de to analyser på samme dag, da Dimension Vista 1500, Siemens befinder sig i Slagelse og Cobas 6000, Roche i Nykøbing F. Ifølge den præanalytiske vejledning kan prøverne holde sig i 5 måneder ved 2-8 C og 2,5 måned ved C. Hvis der er et lavere skred i bias, kunne det muligvis være indikator på, at der over tid kunne være et mindre fald i værdien. Ligesom hvis prøverne blev frosset ned, kunne dette få en betydning for resultaterne. Da der er usikkerhed på om proteinerne har samme struktur, når de bliver tøet op igen. 18,19. 19

20 % BACHELORPROJEKT AFLEVERINGSDATO: DEN 3. JANUAR 2014 Resultater: Til beregning af forekomsten af sygdommen i procent blev patienterne delt op efter alder. I teorien var der oplyst, hvilken alder den primært bliver konstateret og det er efter dette, at inddelingen er sket. Forekomsten af sygdommen < Alder FIGUR 4 VISER FORDELINGEN AF FOREKOMSTEN AF SYGDOMMEN MYELOMATOSE På figurerne nedenunder bliver der set på normalfordelingen af s-totalprotein. Figur 5a viser normalfordelingen for hele populationen for henholdsvis donorerne og patienterne. Figur 5b viser normalfordelingen for en gruppe af populationen for henholdsvis donorerne og patienterne i alderen år. 20

21 Antal prøver Antal prøver Antal prøver BACHELORPROJEKT AFLEVERINGSDATO: DEN 3. JANUAR a. Normalfordeling af s- Totalprotein for hele populationen 5b.Normalfordeling af s- Totalprotein aldersgruppe år Koncentrationen i [g/l] Donor Patient Koncentrationen i [g/l] Donor Patient FIGURERNE 5A + 5B VISER NORMALFORDELINGEN AF S-TOTALPROTEINET I HENHOLDSVIS HELE PO- PULATIONEN OG EN UDVALGT GRUPPE Figuren nedenunder viser normalfordelingen af s-totalprotein for alle 3 populationer; donorerne, patienterne og referencegruppen Normalfordeling af s-totalprotein Referencegruppe Donor Patienter Koncentrationen er målt i [g/l] FIGUR 6 VISER NORMALFORDELINGEN AF S-TOTALPROTEIN Ifølge NORIP er referenceintervallet for s-totalprotein er [62-78 g/l] 22., mens det beregnet referenceinterval for s-totalprotein der er baseret på referencegruppens prøvesvar, blev [63 81 g/l]. Til beregning af referenceintervallet kan der benyttes følgende formler: 6. 21

22 Antal prøver Antal prøver BACHELORPROJEKT AFLEVERINGSDATO: DEN 3. JANUAR 2014 Ved non-parametrisk statistik kan der beregnes et referenceinterval med fraktil 0,025 og fraktil 0,975. Hvilket betyder, at inden for dette område befinder 95% af den raske befolkning: Disse udregninger er baseret på vores resultater. R 1 = 0,025 * ( ) = 7,5 63 R 2 = 0,975 * ( ) = 293,5 81 [63 81 g/l] Eller Ved normalfordelings-statistik kan denne formel benyttes: X ±2 SD - (X = 72 - SD = 4,44) 72 ± (2*4,44) = 63, ,9 81 [63 81 g/l] På figurerne nedenunder bliver der set på normalfordelingen af p-albumin. Figur 7a viser normalfordelingen for hele populationen for henholdsvis donorerne og patienterne. Figur 7b viser normalfordelingen for en gruppe af populationen for henholdsvis donorerne og patienterne i alderen år. 7a. Normalfordelingen af p- Albumin for hele populationen 7b.Normalfordeling af p- Albumin aldersgruppe år Donor Patient Donor Patient Koncentrationen i [g/l] Koncentrationen i [g/l] FIGURERNE 7A + 7B VISER NORMALFORDELINGEN AF P-ALBUMIN HOS HENHOLDSVIS HELE POPU- LATIONEN OG EN UDVALGT GRUPPE 22

23 Antal prøver BACHELORPROJEKT AFLEVERINGSDATO: DEN 3. JANUAR 2014 Ifølge NORIP er referenceinterval for p-albumin: år [37-48 g/l] år [37-46 g/l] 70 år [35-46 g/l] Figuren nedenunder viser normalfordelingen af p-albumin for alle 3 populationer; donorerne, patienterne og referencegruppen. Normalfordeling for p-albumin Koncentretionen i [g/l] Referencegruppen Donor Patienter FIGUR 8 VISER NORMALFORDELINGEN FOR P-ALBUMIN Figuren nedenunder viser normalfordelingen af, hvor stor en procentdel p-albumin udgør af s-totalprotein. Denne beregning er sket ved, at der er blevet beregnet procentdelen ved følgende formel: p-albumin / s-totalprotein * 100 = hvad p-albuminen udgør i procent. 6. Hvorefter procentdelen bliver sorteret i størrelsesorden med den mindste først. Derefter blev de opdelt med et interval på fem og på baggrund af dette, er der blevet lavet nedenstående kurve. 23

24 Antal prøver BACHELORPROJEKT AFLEVERINGSDATO: DEN 3. JANUAR 2014 Normalfordeling for procentdelen af hvor meget Albumin udgør af Totalprotein Referencegruppen Donor Patienter Koncentrationen i [g/l] FIGUR 9 VISER PROCENTFORDELINGEN AF, HVAD ALBUMIN UDGØR AF TOTALPROTEINEN HOS DE TRE POPULATIONER Dette referenceinterval er blevet beregnet på baggrund af den procentmæssige fordeling som er blevet udregnet for referencegruppen for at vise, hvor 95% af den raske befolkning ville befinde sig. Dette referenceinterval er blevet beregnet på baggrund af resultaterne for referencegruppen. Referenceinterval 6. : X ±2 SD (X = 61,34 - SD = 5,34) 61,34 ± (2 * 5,34) = 50, [51-72 %] 24

25 Diskussion: Ifølge både Myelomatose foreningen og kræften bekæmpelse er forekomsten af denne sygdom størst hos patienter over 60 år, den kan dog forekomme hos få mellem og meget sjældent før de 40 år. Dette stemmer umiddelbart overens med vores resultater (se figur 4). Her kan det ses, at der ikke er nogle under 40 år som har sygdommen, mens der er 17 % af patienterne der er mellem år og 83% af dem er over 60 år. 7, 9. Der blev beregnet et referenceinterval for s-totalproteinen, hvor der blev brugt en referencegruppe på 300 tilfældige udvalgte patienter. De var blevet undersøgt for s-totalprotein, p-albumin og M- komponent som ikke var påvist. Da den raske population på 100 donorer ikke ville være ligeså valide som denne gruppe på 300. Men der skal tages forbehold til dette referenceinterval, da referencegruppe må anses for at være syge ligesom der ikke er taget højde for køn og alder. Det Nordiske Reference Interval Projekt, NORIP har beregnet et referenceinterval ud fra data fra Danmark, Sverige, Norge og Finland. 22. Det beregnet referenceinterval for serum totalprotein er [63-81 g/l] og intervallet fra NORIP er [62-78 g/l] 22. (se figur 6). Forskellen kan skyldes, at det er patienter som er blevet brugt til denne udregning. Men bliver der lavet et referenceinterval på baggrund af vores donorer som anses for at være raske. Så vil dette referenceinterval også være højere end det fra NORIP. Kan dette skyldes, at der kun er 100 donorer og derfor er dette referenceinterval ikke så pålideligt eller er det fordi NORIP er data fra hele norden? Kigger man derimod på referenceintervallet for protein, er dette [60-80 g/l]. 32. Dette referenceinterval er fra Region Sjælland og stemmer mere overens med vores resultater end NORIP gør. På figur 5a + 5b ses der sammenligning mellem patienter og donor for s-totalprotein og på figur 7a + 7b ses der en sammenligning af p-albumin. Figur 5a viser, at s-totalprotein topper samme sted, men ser man derimod på normalfordelingen af p-albuminen (figur 7a). Fremgår det, at patienterne topper før donorerne. Kan dette skyldes, at fordi patienterne er syge at deres albumin er lavere end donorernes?? For at kunne påvise om denne påstand var sand, blev der udtaget en gruppe af patienterne og donorerne i alderen fra år. Disse blev sammenlignet og her viste det sig, at begge grafer toppede samtidig (se figur 5b og figur 7b). Referenceintervallet for p-albumin, er opdelt efter alder og det falder jo ældre man bliver. 22. På baggrund af de faldende referenceinterval for p-albumin, kan det fastslås at dette kan være årsagen til, at patienterne topper før donorerne. 25

26 Men ser man derimod på figur 8, så dækker referencegruppeover hele område. Der hvor både kurven for donorerne og patienter er. Men da det er tilfældige patienter som vi intet kender til, udover at de er blevet undersøgt for de tre analyser, som vi har med i dette projekt. Så ud fra kurven, må det anslås, at denne referencegruppes alder spænder vidt. Ifølge både Busher, J.T 23. og Johnson, C.W et al. 24. udgør p-albuminen mere end 50% af s-totalproteinen og i den kliniske ordbog 33. under Albumin, står der, at det udgør ca.70% af s-totalproteiner; hvorimod Lyngbye siger, at det udgør ca. halvdelen. 1. Disse udtalelser sammenlignet med vores resultater, så udgør det samlede p-albuminen mere end 50 % af s-totalproteinen (se figur 9). Når der er blevet beregnet et referenceinterval for denne procentfordeling, er det baseret på referencegruppens procentfordeling, så vil dette interval være [51-72%]. Som det fremgår af grafen (figur 9) er patienterne under dette interval. Dette kan dog skyldes, at de har et lavt albumin niveau pga. deres sygdom. Men når intervallet er på [51-72%] burde det give en retningslinje for, hvor stor en andel p-albumin udgør af det samlede s-totalprotein. Dog er det patientdata som er benyttes til denne beregning, men størstedelen af donorerne befinder sig inden for dette interval. Betyder det, at Lyngbye s udtalelse om, at p-albumin udgør ca. halvdelen ikke stemmer?? Ifølge den præanalytiske vejledning skal de røde gelglas centrifugeres ved 3000 G. samt opbevares i køleskab ved 2-5 C. 18. Men de kliniske immunologiske afdelinger i Nykøbing F. og Slagelse fik af vide, at prøverne skulle centrifugeres ved 3000 omdrejninger i 10 min. Prøverne er dels sendt fra klinisk biokemisk afdeling i Roskilde og klinisk immunologisk afdeling i Nykøbing F., under denne transport kan vi ikke være sikker på, hvilken temperatur prøverne er blevet opbevaret ved. Ligesom da prøverne skulle sendes fra kliniske biokemisk afdeling i Slagelse og til klinisk biokemisk afdeling i Nykøbing F., blev de sat af på klinisk biokemisk afdeling i Næstved. Der måtte vi selv afhente prøverne i Næstved for at være sikker på, at de kom til Nykøbing F. Under denne transport blev de opbevaret i en grå transportkasse ved stuetemperatur. Kan disse temperatur skift have betydning for prøverne?? Ud fra vores resultater virker det ikke til, at det har haft betydning på vores prøver. Der skulle ansøges om tilladelse om tapning af donorer fra Transfusioncentret, Næstved af etiske årsager (bilag 3). Da man ikke måtte tappe donorerne til hvad som helst, på grund af at de var frivillige donorer. Det ville være noget andet, hvis de fik penge for det. Hvad ville der sker, hvis vi fandt noget?? 26

27 Burde man ikke skulle kontakte Transfusionscentret, Næstved og fortælle om dette fund på tappenr. xx? Ville dette ikke være det mest etiske korrekte at gøre?? På den måde ville Transfusionscentret, Næstved kunne tilbageholde den portion blod fra denne donor, indtil det var blevet screenet for evt. sygdomme. Hvis der ikke blev fundet ydereligere end det lave Albumin, så kunne det blive frigivet igen. Men fandt man derimod noget, burde man kontakte donoren og destruere den pågældende portion blod. Da albumin er et protein som vi alle har i vores blod, krævede dette ikke donorernes tilladelse. 25. Men den bruges ligeledes som en uspecifik sygdomsmarkør. 19. Ville det være etisk korrekt at undlade at videregive denne information? både over for donor og for de patienter som skal modtage erytrocytter, trombocytter og plasma fra donoren. Er det derfor etisk korrekt at anonymisere donorerne i sådan et projekt? Hvis det er rigtigt, burde donorerne ikke skulle give deres tilsagn til at deltage og have retten til, at have den mulighed for at selv bestemme om de ønsker resultaterne for dette projekt oplyst eller ej?? På klinisk biokemisk afdeling i Slagelse har man optimeret analysen for M-komponenten ved, at ændre beregningsgrundlaget fra p-albumin til s-totalprotein. Dette er sket på baggrund af, at der er kommet flere kræft patienter som skal have undersøgt, om hvorvidt de har en positiv M-komponent eller ej. p-albuminen blev før i tiden tastet ind manuelt, men nu er det muligt at overfører s-totalproteinsvarene elektronisk. Umiddelbart har dette skift ikke betydet noget for udregningen af M-komponenten, da man beregner M-komponenten ved hjælp af forholdsregning. Det har betyder dog, at der er sket en kvalitetsløft af analysen og risikoen for evt. tastefejl er nedsat, ligesom proceduren er blevet hurtigere

28 Konklusion: Det kan hermed konkluderes, at det ikke er muligt at sammenligneanalysemetoderne p-albumin og s-totalprotein med hinanden. Ligesom det kan konkluderes, at det beregnet referenceinterval for s-totalprotein [63-81 g/l] er højere end den fra NORIP [62-78 g/l], som er et referenceinterval der er udarbejdet på baggrund af data fra hele norden. Men når det sammenlignes med de retningslinjer fra Region Sjælland som har et bredere referenceinterval [60-80g/L], så stemmer det mere overens med vores beregnet referenceinterval. Uanset hvilke af de tre referenceintervaller vi kigger på, så ligger patienterne over dem, hvilke kan skyldes, at vores patienter er kræftpatienter. Da denne patientgrupper ofte har problemer med nyrefunktionen. Det kan ligeledes konkluderes, at det har ingen betydning for beregningen af M-komponenten, at man har skriftet fra p-albumin til s-totalprotein. Dette skyldes, at det bliver beregnet ved hjælp af forholdsregning. Enten forholdet mellem toppen for p-albumin og toppen af m-komponenten eller resultatet af s-totalproteinet og hele arealet som fremkommer ved analyseringen af M-komponenten. Til sidst kan det konkluderes, at vi sagtens kunne have været forsat med det oprindelige projekt. Da det ikke havde nogen betydning for det, om hvordan man beregner M-komponenterne. Dette var blot for at sikre, at vi havde nogle patienter med positive M-komponenter og derved vidste, at de var syge. Perspektivering: I fremtiden kunne det være spændende, at se på hvilken type af de positive M-komponenter der forekommer hyppigst. Undersøge om det er IgG som teorien siger og om typen har nogen indflydelse på prognosen af Myelomatosen. 16. Ligesom det kunne være spændende, at undersøge om udskiftningen har en betydning for beregningen af M-komponenten evt. ved at udarbejde en valideringsrapport og sammenligne den med andre validringsrapporter ved samme analyse. Til vores projekt bruger vi serum, det vil sige at koagulationsfaktorerne opbrugt. Derfor ville jeg undersøge, om det ville have en indflydelse på resultaterne, hvis de var tilstede. Der er blevet sammenlignet med s-totalprotein og p-totalprotein ved hjælp af normalfordelingskurve. Som det fremgår af denne, så topper begge kurve samme sted. 28

29 Antal prøver BACHELORPROJEKT AFLEVERINGSDATO: DEN 3. JANUAR 2014 Normalfordeling for s-totalprotein og p- totalprotein Koncentrationen målt i [g/l] p-totalprotein s-totalprotein Men resultaterne for s-totalprotein er lavere end p-totalprotein. Er det fordi p-totalproteinsvarerne er fra donorer og s-totalproteinsvarerne er fra patienter eller er det fordi koagulationsfaktorerne ikke er tilstede? Til denne graf er der blevet brugt resultater for p-totalprotein som er blevet målt på klinisk Immunologisk afdeling i Nykøbing F. De havde målt p-totalprotein på nogle af deres donorer og s-totalprotein er taget fra vores referencegruppe. Det kunne ligeledes være spændende, at undersøge procentdelen som s-albumin udgør af p-totalprotein. Hvilke kunne gøres ved at indsamle donorprøver og analysere dem for både p-albumin og s-totalprotein. Derved kunne det fastslås, om det udgør ca. 50 % som Lyngbye skriver 1. eller er det som Busher, J.T. 23. og Johnson, C.W. et al. 24. siger at det er mere end de 50% eller om det er oppe mod de 70% som der står i den kliniske ordbog? 33. Det er umiddelbart de udtalelser fra Busher, J.T. 23. og Johnson, C.W: et al. 24. samt den kliniske ordbog 33., der stemmer overens med vores resultater og beregning af referenceintervallet. Som tidligere nævnt gik vores projekt først ud på, at vi skulle lave en metodesammenligning mellem analyserne for p-albumin med analysemetoderne Bromcresol green og Bromcresol Purple. Er der forskel på disse?? Er den ene bedre end den anden?? Ifølge artiklen af Duly, E.B et al. 2. så mener de, at bromcresol purple er den bedste og allerede er blevet implementeret på en del biokemiske afdelinger. Hvorimod Lyngbye mener, at den korrekte måde er ved at benytte bromcresol green

30 Clase, C.M. et al. 26. mener ligeledes, at Bromcresol Purple er mere specifik med hensyn til bindingerne til non-albuminproteiner end Bromcresol green er. Dog kan denne forskel minimeres, men kan ikke helt elimineres. Hvorimod Bush, V and Reed, R.G 27. mener, at Bromcresol green ikke var påvirket af, at albuminen var kovalent bundet til bilirubin, men det var Bromcresol purple. De kunne ikke fastslå, om det var en metabolit eller en ændring af albuminen, som forhindrede Bromcresol purple i at binde sig. Alle fire påpeger, at Bromcresol purple har en lavere referencegrænse end Bromcresol green. Ifølge Lyngbye er bromcresol purples nedre referencegrænse på 35 g/l og bromcresol greens nedre referencegrænse er på 40 g/l. Dette er en forskel på 5 g/l, og denne forskel er de andre enig med Lyngbye i. 1,2, 26,

31 Litteraturliste: 1. Dansk laboratorie medicin en håndbog Lyngbye, J. Nyt Nordisk forlag Arnold Busck, København K. 2.udgave Measurement of serum albumin by capillary zone electrophoresis, bromocresol green, bromocresol purple, and immunoassay methods Duly, E.B, Grimason, S., Grimason, P, Barnes, G. and Trinick, T.R. Lokaliseret på 3. Pakkeforløb for myelomatose Lokaliseret på 4. Dansk retningslinje for M-komponent analyser af DSKB/DMSG 2012 Lokaliseret på 5. DSKB NYT, medlemsblad for Dansk Selskab for Klinisk Biokemi, nr.1 marts Lokaliseret på 6. Statistik for bioanalytiker Lauritsen, O. S. Odontologisk Boghandel & Forlag, København N. 2.udgave, 16.oplag Myelomatose Lokaliseret på 8. Arvelig forhold Kræftens Bekæmpelse Lokaliseret på 9. Hvad er myelomatose af NMSG Nordic Myeloma Study group Lokaliseret på 31