Bachelorprojekt 3. januar 2012 PÅVISNING AF CARBAPENEMASEAKTIVITET

Transkript

1 1

2 Indholdsfortegnelse Bilagsliste 3 Forord 4 Resumé 5 Introduktion 6 Problemformulering 8 β-lactam-antibiotika 9 Carbapenem-antibiotika 9 Carbapenemaseproducerende bakterier 9 ESBL og AmpC 11 MALDI-TOF-MS 11 KPC-MBL confirmid kit 12 Modificeret Hodge Test 13 ChromID CARBA 13 Metodiske overvejelser 13 Materiale og metode 15 Prøvematerialer 15 Forberedelse og fremstilling af bakteriemateriale 16 MALDI-TOF-MS 16 KPC-MBL confirmid kit 18 Modificeret Hodge Test 19 ChromID CARBA 20 Resultater 21 MALDI-TOF-MS 21 KPC-MBL confirmid kit 23 Modificeret Hodge Test 23 ChromID CARBA 23 Diskussion 24 MALDI-TOF-MS 24 KPC-MBL confirmid kit 29 Modificeret Hodge Test 30 ChromID CARBA 31 Andre metoder 33 Forskelle og ligheder mellem metoderne 33 Konklusion 35 Perspektivering 36 Litteratur 37 2

3 Bilagsliste Bilag 1 - Bakterieliste med resultater Bilag 2 - Materialer Bilag 3 - EUCAST-foreskrift Bilag 4 - Beregning af sensitivitet og specificitet Bilag 5 - Figur med ertapenem-produkter Bilag 6 - Evidensskema Bilag 7 - Bekræftelse for udfærdigelse 3

4 Forord Dette er et bachelorprojekt på bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland, der er udarbejdet af en bioanalytikerstuderende. Praktisk arbejde i forbindelse med projektet er udført på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Slagelse Sygehus. Projektet har til formål at undersøge fire fænotypiske metoder til detektion af carbapenmaseproducerende bakterier med fokus på metodernes sensitivitet og specificitet. På nuværende tidspunkt findes der ikke en metode til påvisning af disse resistente bakterier, som nu også forekommer i Danmark. Opgaven er henvendt til andre bioanalytikerstuderende, ansatte på mikrobiologiske afdelinger og andre med interesse for emnet. Jeg vil gerne takke Anne Bonde for overlevering af genotypebestemte carbapenemaseproducerende stammer. Disse stammer kom fra Danmarks Tekniske Universitet, DTU Food (Henrik Hasman og Lisbeth Andersen), Statens Serum Institut (Anette Hammerum), Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Næstved Sygehus, samt Odense Universitets Hospital (Ulrik Justesen). I projektet indgår også stammer tilsendt fra en græsk hospital (Alkiviadis Vatopoulus og Panagiota Giakkoupi). Desuden vil jeg takke Frank Hansen fra SSI for god mailkorrespondance og svar på spørgsmål i forbindelse med projektet. Til Søren Lehmann fra Bruker Daltonics Scandinavia AB Chemical Analysis Division skal lyde en særlig tak for hjælpen med opsætning af MALDI-TOF-MS-udstyret, samt vejledning i tolkning af MALDI-TOF-MS-resultaterne. Tak til Rimtas Dargis, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Slagelse, for hjælp med udførsel af arbejdet på MALDI-TOF-MS. En stor tak til mine vejledere Charlotte Birk Olsen og Janne Fønns Møller, samt personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Slagelse Sygehus, for forståelse, hjælpsomhed og hensynstagen i forbindelse med projektet. 4

5 Resumé Baggrund Carbapenemaseproducerende bakterier er et stigende problem i verden, og der ses nu også tilfælde af de resistente bakterier i Danmark. Der findes på nuværende tidspunkt ikke overvågning og systematisk screening af CPB herhjemme, og der findes endnu ikke en standardiseret, sensitiv og specifik metode til påvisning af resistens overfor carbapenem-antibiotika. Formål Formålet er at undersøge muligheden for, at en af metoderne Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOD-MS), KPC-MBL confirmid kit (KPC-MBL-kit), Modificeret Hodge Test (MHT) eller ChromID CARBA (ChromID) kan anvendes som screeningsmetode eller konfirmatorisk test i påvisning af carbepenemresistens. Materialer og metoder Udvalgte stammer af Enterobacteriaceae og Pseudomonas species, samt kvalitetskontroller afprøves ved analyse på MALDI-TOF-MS, der påviser carbapenemaseaktivitet. Desuden afprøves stammerne med diskdiffusion (KPC-MBL-kit), kløverbladstest (MHT) og chromagar (ChromID), der påviser carbapenemresistens. Resultater Ved MALDI-TOF-MS og KPC-MBL-kittet forekom ingen falsk positive resultater, og metoderne havde begge en specificitet på 100 %. Alle metoder påviste falsk negative resultater, dog havde ChromID en høj sensitivitet og specificitet på henholdsvis 92,9 % og 93,9 %. Konklusion MALDI-TOF-MS egner sig som konfirmatorisk test, idet den påviser carbapenemase-aktivitet med en specificitet på 100 %. ChromID egner sig som screeningsmetode, idet den opnår en høj sensitivitet og specificitet i påvisning af carbapenemresistens. 5

6 Introduktion Over hele verden er resistente mikroorganismer et stigende problem for folkesundheden og sundhedssektoren. (Kempf 2012, Sparbier 2011, Hrabák 2011) Siden 2000 er der i mange lande rapporteret om spredning af Enterobacteriaceae-isolater, for eksempel Escherichia coli, der producerer extendedspectrum β-lactamase (ESBL), og som dermed er i stand til at hydrolysere næsten alle cefalosporiner. I 1993 identificeredes den første carbapenemaseproducerende bakterie af Enterobakteriaceae. (Nordmann, Naas, Poirel 2011) Infektioner med carbapenemaseproducerende bakterier kan behandles med carbapenem-antibiotika, men ofte har behandlingen kun ringe eller ingen effekt. (Statens Serum Institut 2012a) Enterobacteriaceae og Pseudomonas sp. er resistente overfor carbapenem-antibiotika, fordi de har eller har erhvervet sig et eller flere carbapenemase-gener. Gennem genetisk ekspression har bakterierne egenskaber, som gør dem i stand til at beskytte sig imod carbapenem-antibiotika. Resistensen kan skyldes enzymatisk nedbrydning af antibiotika, effluxpumper, porintab eller ændringer i cellevæggens overflade. Denne resistensudvikling identificeres nu over hele verden. (Nordmann, Naas, Poirel 2011) Der er senest set store udbrud af Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC)- og Oxacillinase β- lactamase (OXA)-producerende Klebsiella pneumoniae i Holland, Polen og Italien. Verona Integron-kodet Metallo-β-lactamase (VIM)- og KPC-producerende bakterier forekommer endemisk i Grækenland, mens New Delhi Metallo-β-lactamase (NDM) har en høj forekomst i Pakistan og Indien. (Statens Serum Institut 2012a) En årsrapport fra The Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme (DANMAP) viser en stigende forekomst af carbapenemaseproducerende bakterier (CPB) i Danmark. (Statens Serum Institut 2011) European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) og Centers for Disease Control (CDC) i USA anbefaler, at patienter, som er overflyttet fra udlandet eller som mistænkes for at være en del af et udbrud, screenes for CPB. (Statens Serum Institut 2012a) Der findes på nuværende tidspunkt ikke overvågning og systematisk screening af CPB i Danmark, men de seneste år har mikrobiologiske afdelinger i hele landet indsendt CPB-isolater til Statens Serum Institut (SSI) til identifikation og genotypebestemmelse. I 2008 detekteredes det første tilfælde af VIM-producerende Klebisiella pneumoniae i Danmark. I 2009 observeredes KPC-2- produktion for første gang. Begge patienter havde forinden været indlagt i Grækenland. For første 6

7 gang fik en patient i Danmark, som havde været indlagt i Bosnien-Hercegovina, i 2010 konstateret NDM-1. Dette tilfælde var også et af de første i Europa, som havde forbindelse til Balkan. I 2011 blev endnu et NDM-1 tilfælde fundet, og endvidere syv tilfælde af OXA-48 blev konstateret hos patienter fra Libyen. Siden 2008 er der registreret i alt 15 tilfælde af CPB i Danmark. Kun med undtagelse af ét enkelt tilfælde har alle tilfælde af CPB været importeret fra udlandet. (Statens Serum Institut 2012a) Risiko for spredning af CPB er en væsentlig problemstilling for verdens sundhedsorganisationer. CPB kan bæres i tarmen uden symptomer, og der findes ikke nogen dokumenteret behandling til at fjerne denne bærertilstand. CPB er svære at behandle og har potentiale til at etablere og sprede sig endemisk både på sygehuse og i samfundet. ECDC opfordrer derfor til systematisk overvågning af disse bakterier i alle europæiske lande. (Statens Serum Institut 2012a) Der er på den baggrund opstået en efterspørgsel efter en implementérbar metode, som hurtigt, billigt og med stor sensitivitet og specificitet kan detektere CPB. (Kempf 2012) På nuværende tidspunkt er CPB svære at finde, og de detekteres kun i lille omfang rutinemæssigt på landets mikrobiologiske afdelinger. Carbapenem-antibiotikaet, Meropenem, indgår i resistensbestemmelse af gram-negative stave. Hvis bakterien viser nedsat følsomhed for denne tablet, bliver der udført en udvidet resistensbestemmelse, hvor bakterien testes for ESBL. Denne metode er ikke målrettet CPB, og man kan ikke udelukke, at positive CPB ikke ville blive opdaget. Problemstillingen udfordrer sundhedssektoren, og danner grundlag for udvikling af en brugbar metode til påvisning af carbapenemaseproduktion. (Kempf 2012) Det er også en velkendt problematik, at behandling med antibiotika kan medføre øget resistensudvikling. (Statens Serum Institut 2012c) Det er vigtigt at kende bakteriens resistensmønster, for at kunne afgøre om en patient kan have gavn af antibiotisk behandling. (Sparbier 2011) Nogle antibiotika kan vise sig effektive in vitro, mens virkningen in vivo kan vise sig anderledes i negativ retning. Desuden kan behandling på baggrund af påvisning af et carbapenemasegen være uden virkning, da bakterien ikke nødvendigvis udtrykker sit gen. Da penicillin-derivater, som ampicillin og piperacillin, cefalosporiner, monobactamer og carbapenem-antibiotika ikke har væsentlige bivirkninger, benyttes de i stort omfang til behandling af infektioner. (Sparbier 2011) Forbruget af bredspektrede antibiotika på de danske sygehuse er steget fra 50 % af totalforbruget i 2002 til 66 % i Det svarer til en stigning på 67 %. Hos de praktiserende læger er stigningen 78 %. (Statens Serum Institut 2012c) I takt med denne stigning udvikles der i højere grad resistens imod disse 7

8 antibiotika. Det viser sig også som et voksende problem verden over. (Sparbier 2011) For at undgå unødig brug af antibiotika vil det i fremtiden kræve endnu mere fokus på problemstillingen og ikke mindst en metode, hvor man hurtigt og nemt kan påvise bakteriers resistens. Der findes på nuværende tidspunkt ikke en standardiseret, fænotypisk metode, der kan stå alene, til at påvise CPB rutinemæssigt på de kliniske mikrobiologiske afdelinger (Kempf 2012, Hrabák 2011) i Danmark. De fænotypiske metoder, der findes i dag, er baseret på diskdiffusions assays, E-test eller automatiserede mikrobiologiske systemer, som for eksempel Vitek 2. (Sparbier 2011) Der er imidlertid udviklet PCR-metoder, som kan påvise carbapenemasegener. Metoden kan påvise alle kendte gener, men ulemperne ved metoden er, at den er kostbar og kræver personale med erfaring indenfor molekylærbiologi. Desuden er metoden ikke i stand til at påvise nyopståede carbapenemasegener. (Kempf 2012) Derfor er der opstået efterspørgsel af en ny fænotypisk test til direkte påvisning af carbapenemase-aktivitet i bakterien. I dette bachelorprojekt er der fokus på fire fænotypiske metoder. Ved hjælp af Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) ønskes det at bestemme bakteriestammernes carbapenemase-aktivitet. Desuden undersøges KPC-MBL confirmid kit (KPC-MBL-kit), Modificeret Hodge Test (MHT), samt ChromID CARBA (ChromID) for deres evne til at påvise CPB. Nordmann P., Poirel L. og Dortet L. har i september 2012 udgivet en artikel, hvor en ny metode til detektion af CPB beskrives. Metoden, Carbapenemase Nordmann-Piorel (Carba NP), er designet til at påvise hydrolyse af β-lactamringen i carbapenem-antibiotika. Princippet i metoden går ud på, at ph-indikatoren, phenolrød, skifter farve fra rød til gul eller orange, hvis en stamme producerer carbapenemase. Metoden er hurtig og har en høj sensitivitet og specificitet. (Nordmann, Poirel, Dortet 2012) Problemformulering Hvordan er metoderne af henholdsvis Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry, KPC-MBL confirmid kit, Modificeret Hodge Test og ChromID CARBA til påvisning af carbapenemaseaktivitet i Enterobacteriaceae og Pseudomonas sp. og hvordan er metodernes sensitivitet og specificitet? 8

9 β-lactam-antibiotika β-laktam-antibiotika er en stor gruppe af bredspektrede antibiotika, som består af en β-lactamring og i nogle tilfælde en sekundær ringstruktur, som er forbundet med β-lactamringen. De inddeles i undergrupperne penicilliner, cefalosporiner, cephamyciner, monobactamer og carbapenemer i forhold til deres sekundære ringstruktur og deres virkemåde. β-lactam-antibiotika virker på den måde, at de binder sig til transpeptidaser eller proteinbindende proteiner (PBP), som indgår i syntetiseringen af peptidoglycanlaget i bakteriernes cellevæg. (Degré 2004) Carbapenem-antibiotika Meropenem, doripenem og ertapenem er de tre carbapenem-antibiotika, der findes i Danmark på nuværende tidspunkt. (Medicin.dk) Carbapenem-antibiotika er β-lactam-antibiotika, der kan inducere β-lactamaseproduktion, og derfor kan bruges til behandling af infektioner forårsaget af CPB. Carbapenem-antibiotika kan lysere bakterien ved at binde sig til PBP på cellevæggen. De kan også penetrere bakteriens cellevæg gennem poriner i ydremembranen. (Sparbier 2011) Figur 1. Carbapenemaseproducerende bakterier CPB er bakterier, der producerer enzymet carbapenemase. Carbapenemaser er en stor gruppe carbapenem-hydrolyserende β-laktamaser, der medfører resistens overfor carbapenem-antibiotika. (Kempf 2012, Hrabák 2011) Årsagen til carbapenemantibiotikaresistens kan skyldes forskellige mekanismer i bakterierne. (Se figur 1) Efflux-pumper, som pumper antibiotikummet ud af cellen, gør bakterien i stand til ikke at blive påvirket af antibiotikummet. En anden egenskab er tab af porin, som gør bakterien impermeabel for molekyler udefra. Viser resistent bakterie med gen der koder for a. effluxpumpe. b. enzym, der ødelægger antibiotikum og c. kemisk ændring eller inaktivering af antibiotikum. Billedets kilde: 2.html 9

10 Desuden kan bakterien forhindre interaktion mellem cellevæg og antibiotikum ved at ændre PBP på sin overflade. Endvidere kan bakterien enzymatisk modificere eller ødelægge aktiviteten af antibiotikummet. (Sparbier 2011) (Se figur 1) De hyppigst forekommende carbapenemaser er Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), Oxacillinase β-lactamase (OXA), Verona integron-kodet metallo-β-lactamase (VIM) og New Delhi metallo-β-lactamase (NDM). (Statens Serum Institut 2012a) Enzymerne er kodet af gener, der ofte kan overføres fra bakterie til bakterie ved horisontal spredning, når bakterien deler sig. Samtidig kan de også spredes klonalt ved vertikal spredning, hvor en bakterie modtager gener fra fremmede bakterier. Dette sker især ved overførsel af plasmider eller transposoner mellem organismerne. (Nordmann, Naas, Poirel 2011) De forskellige carbapenemaser er opdelt i fire grupper af β-lactamaser på baggrund af deres gener. (Se tabel 1) Gruppe A er β-laktamaser, som effektivt hydrolyserer carbapenemer og delvis hæmmes af clavulansyre. Nogle bakterier har generne i kromosomet, mens andre har generne som et plasmid. (Kempf 2012, Nordmann, Poirel, Dortet 2012) KPC er klinisk det mest kendte enzym i denne gruppe. KPCproducerende bakterier er ofte multiresistente, og behandlingsmulighederne er derfor begrænsede. (Nordmann, Poirel, Dortet 2012) Gruppe B er β-laktamaser, der hører til gruppen af metallo-β-lactamaser (MBL), fordi zink, Zn 2+, indgår i det aktive site. (Kempf 2012) VIM og NDM-1 er de mest kendte i denne gruppe. Disse enzymer kan hydrolysere alle β-laktam-antibiotika undtagen aztreonam. MBL bliver hæmmet af etylen-diamin-tetra-eddikesyre (EDTA), men ikke af clavulansyre. I gruppe C findes sjældne β-laktamaser, som skyldes kromosomale gener, der koder for cefalosporinase. Enterobakteriaceae, der producerer dette enzym, kan have lidt udvidet aktivitet overfor carbapenem-antibiotika, men deres kliniske rolle er endnu ukendt. (Nordmann, Poirel, Dortet 2012) Gruppe D er β-laktamaser, der hører til gruppen af oxacillinaser (eller OXA-type β-lactamaser). Denne gruppe er serine-site enzymer. (Kempf 2012) Gruppen er speciel, fordi de kun svagt hydrolyserer carbapenem-antibiotika og spredspektrede cefalosporiner. Enzymernes aktivitet hæmmes ikke af EDTA eller clavulansyre. Bakterier, der producerer enzymet af typen OXA-48 er de sværeste at identificere og derfor kan deres reelle prævalens være undervurderet. (Nordmann, Poirel, Dortet 2012) 10

11 ESBL og AmpC Extended-spectrum β-lactamase (ESBL) findes primært i E. coli og K. pneumoniae. Der findes flere hundrede varianter af ESBL og størstedelen har serin, som deres aktive site. De tilhører gruppe A. (Bradford 2001) (Se tabel 1) ESBL er enzymer, der kan nedbryde næsten alle β-lactam-antibiotika, herunder penicilliner og cefalosporiner. Oftest bæres bakterien i tarmen, hvor den ikke er patogen. Kun i tilfælde, hvor bakterierne spredes til andre steder i kroppen, som for eksempel urinvejene, kan bakterierne skabe en behandlingskrævende infektion. (Statens Serum Institut, 2012b) Indtil for få år siden havde ESBL-producerende bakterier (ESBL-PB) en lav forekomst i Danmark, men overvågning af denne gruppe bakterier viser at forekomsten er stigende. Fundet af ESBL-PB i Danmark er nu på højde med forekomsten i mellemeuropæiske lande, og de detekteres i højere grad her end i de andre nordiske lande. I Danmark foretages overvågningen af ESBL af Statens Serum Institut i samarbejde med landets mikrobiologiske afdelinger. Bakterierne påvises ved resistensbestemmelse og types ved hjælp af PCR og gensekventering. Hvert år rapporteres fundene til i den årlige DANMAP-rapport, samt ECDC. Det er muligt at behandle ESBL-PB med carbapenem-antibiotika, men der har været tilfælde, hvor bakterierne også var resistente overfor disse. (Statens Serum Institut, 2012b) AmpC er et enzym, der tilhører gruppe C, og som oftest detekteres i forbindelse med ESBL-PB. Ved en mutation kan bakterier overekspressionere deres kromosomale AmpC-gen, der øger deres modstandsdygtighed overfor oxyimino-β-lactam-antibiotika og cefamycin. De er følsomme overfor carbapenem-antibiotika, men har de porintab, er de også resistente overfor disse antibiotika. AmpC-genet kan også være plasmidbåret, og har en sammenhæng med mutationer i ESBL-gener. (Phillippon 2002) Tabel 1. Enzym Undergruppe Inhibitor Aktivt site A KPC Carbapenemase Clavulansyre Serin ESBL B MBL Metallo-β-laktamase EDTA Zink C Cefalosporinase AmpC Serin D Oxalinase OXA Serin Viser grupperingen af β-lactamaser og carbapenemaser med deres enzym, inhibitor og aktive site. MALDI-TOF-MS Metoden MALDI-TOF-MS har de seneste år været benyttet som en standardiseret metode til identifikation af bakterier, og benyttes endnu ikke som en standardiseret metode til 11

12 resistensbestemmelse. MALDI-TOF-MS bygger på et masse-spektrometri-princip, hvor proteiner ioniseres i lufttomt rum. Med laser skydes der på proteinerne, som bliver til ioniserede partikler, der flyver gennem det lufttomme rum. De ioniserede partiklers størrelse kan udledes af det tidsrum de flyver. (Burckhardt, Zimmermann 2011) Resultaterne fremkommer som en graf i et koordinatsystem med intensitet på y-aksen overfor massen af partiklerne på x-aksen. Grafens toppe angiver de molekyler, der findes i prøven, samt deres masse. (Se bilag 5) Med massespektrometri er det muligt at påvise β-lactamasers aktivitet, fordi hydrolysering af β-lactam-ringen medfører en lavere top i forhold til udgangspunktet, som er ren ertapenem. Hydrolyse medfører en ændring af en top på + 18 Dalton og efterfølges ofte af decaboxylering, der medfører en ændring af toppen på 44 Dalton. Det forventes at der fremkommer fire toppe, som alle er udgaver af ertapenem. (Se bilag 5) Toppen ved 450 Da er ertapenem i hydrolyseret og decaboxyleret udgave uden natrium. Ved 476 Da ses en top, som er ertapenem uden natrium. Ertapenem med ét natriummolekyle giver en top ved 498 Da, mens ertapenem med to natriummolekyler frembringer en top ved 521 Da. (Burckhardt, Zimmermann 2011) KPC-MBL confirmid kit KPC-MBL confirmid kit indeholder tabletter udviklet til at påvise resistensmekanismer ved diskdiffusionsmetode. Metoden påviser resistens i forhold til bakteriernes resistensmønstre overfor de fire forskellige tabletterne med de tilsatte reagenser. Tabletterne indeholder henholdsvis meropenem 10 µg (MRP10), meropenem 10 µg + borsyre (MRPBO), meropenem 10 µg + cloxacillin (MRPCX) og meropenem 10 µg + dipicolinsyre (MRPDP). (Rosco Diagnostica, KPC-MBL confirmid kit, indlægsseddel 2012) Borsyre hæmmer KPC og AmpC, og cloxacillin hæmmer AmpC, mens dipicolinsyre hæmmer MBL. Udover de fire tabletter i kittet, valgte vi desuden at teste temocillin 30 µg, da dette bruges til at finde OXA-48-producerende bakterier. Metoden er udviklet i forhold til, at reisistens over for carbapenem-antibiotika kan skyldes fire årsager. Organismen kan hyperproducere AmpC. AmpC-enzymer bliver inhiberet af cloxacillin. Dette bliver brugt til at skelne imellem AmpC og KPC, da begge bliver inhiberet af borsyre. Organismen kan også producere MBL, der hydrolyserer carbapenem-antibiotika effektivt. MBL bliver inhiberet af dipicolinsyre. Bakterien kan endvidere producere KPC-enzym. KPC-enzymer bliver inhiberet af borsyre, men da borsyre også inhiberer AmpC, kræver resultataflæsningen, at man ser på zonestørrelsen omkring tabletten med borsyre og zonestørrelsen omkring cloxacillintabletten. Den fjerde årsag kan være, at bakterien producerer en oxacillinase som for eksempel 12

13 OXA-48. Ved negativt resultat i de andre synergitests og ingen hæmningszone ved temocillin 30 µg må det formodes at være en OXA-48-producerende bakterie. (Rosco Diagnostica, KPC-MBL confirmid kit, indlægsseddel 2012) Modificeret Hodge Test Modificeret Hodge test er en tilpasset udgave af den oprindelige Hogde Test. (Amjad 2011) Ved henholdsvis at udså en testbakterie, en negativ kontrol og en positiv kontrol i tre streger ud fra en meropenemtablet med en indikatorstamme som baggrund kan CPB påvises. Bakterier med carbapanemaseproduktion påvises ved vækst i en kløverformation. ChromID CARBA ChromID CARBA-agar er et selektivt, kromogent medium, der kan bruges til screening af CPB. Pladen er udviklet til Enterobacteriaceae, og kan især detektere KPC- og NDM-1-producerende stammer. Pladen består af et næringsmedium tilsat antibiotika, der gør selektion af CPB mulig. Desuden indeholder pladen tre kromogene substrater, som får kolonier af E. coli eller Klebsiella, Enterobacter, Serratia og Citrobacter (KESC-gruppen) til henholdsvis at vokse med lyserøde eller blå-grønne kolonier. (BioMéreux, ChromID CARBA, indlægsseddel 2012) Metodiske overvejelser Til projektet blev der udvalgt 52 isolater. Søgekriteriet for de negative stammer var, at stammerne skulle være meropenem-følsomme. De positive stammer skulle være kendte og velkarakteriserede stammer, der før har udvist resistens over for carbapenem-antibiotika. Herudover blev der udvalgt stammer, der havde ESBL- og AmpC-gener, da det var hypotesen, at disse stammer kunne have indflydelse på metodernes evne til at detektere falsk positive og negative resultater. Stammerne er hovedsageligt Enterobacteriaceae, men der er også udvalgt syv Pseudomonas sp.. Det er velkendt problem, at det er svært at påvise sande positive resultater for carbapenemaseaktivitet i disse stammer på grund af andre resistensmekanismer. (Dortet, Poirel, Nordmann 2012) Kontrolstamme Klebsiella pneumoniae American Type Culture Collection (ATCC) 1705 blev udvalgt som positiv kontrol, og Klebsiella pneumoniae ATCC-stamme 1706 blev udvalgt som negativ kontrol til alle forsøg, fordi disse stammer blev anvendt til MHT af Amjad et al. Escherichia coli ATCC-stamme blev i nærværende studie anvendt som indikatorstamme til MHT, fordi Amjad et al anvendte kontrolstammen i undersøgelse af MHT. 13

14 Årsagen til at stammekollektion starter med stamme nummer 2, er at nummer 1 var en Staphylococcus sp. For at bekræfte at stammen ikke var blevet taget forkert op af fryseren ved udsåning, blev den originale frysestamme fundet igen, og den blev sået om. I forsøget med MALDI-TOF-MS blev stammerne opslæmmet i antibiotikaopløsning baseret på HPLC-vand og inkuberet i en time. Herefter blev de centrifugeret og analyseret på MALDI-TOF- MS. Antibiotikummet, der blev anvendt var ertapenem, fordi dette antibiotikum passede til den matrix, der benyttes på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Slagelse (KMA-S). Inkubationstiden var en time, fordi producenten, Bruker Diagnostica, anvender denne inkubationstid. For at undersøge om KPC-MBL-kittet kunne detektere MBL-producerende bakterier, blev metoden afprøvet på agarplader beriget med zink, så zink ikke kunne være den begrænsende faktor for bakteriernes enzymaktivitet. De 4 tabletter blev lagt i hjørnerne af en firkant, mens temocillintabletten blev lagt i midten af pladen. Stammerne blev sået ud på ChromID CARBA-agarpladerne. Den positive kontrolstamme Klebsiella pneumoniae ATCC 1705 og den negative kontrolstamme Klebsiella pneumoniae ATCC 1706 blev anvendt. Producenten, BioMérieux, anbefaler dog at Klebsiella pneumoniae ATCC anvendes som negativ kontrolstamme til ChromID. Der findes ingen begrundelse for denne anbefaling, så ATCC 1706 blev bibeholdt som negativ kontrolstamme i nærværende undersøgelse af metoden. Til behandling af resultaterne i projektet er der anvendt beregning af sensitivitet og specificitet. Resultaterne er af kvalitativ art, og det er derfor muligt at vurdere deres diagnostiske sensitivitet og specificitet. Sensitivitet angiver en metodes evne til at angive antal sande positive resultater, der er det samme som antal syge personer. Specificitet er en metodes evne til at angive antal sande negative resultater, og angiver derfor antal raske personer. (Lyngbye 2001) Formålet i dette projekt været at undersøge muligheden for at finde en sensitiv og specifik metode til påvisning af CPB. Der skelnes mellem konfirmatorisk test og screeningsmetode med fokus på metodernes evne til at påvise carbapenemaseaktivitet. 14

15 Materialer og metode Prøvematerialer Til forsøgene blev der anvendt i alt 52 isolater (Se bilag 1), der blev opbevaret i minus 80 C fryser på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Slagelse Sygehus. 45 (87 %), af stammerne tilhørte Enterobacteriaceae familien. Der blev udvalgt henholdsvis 21 Klebsiella pneumoniae, 1 Klebsiella oxytoca, 16 Escherichia coli, 3 Enterobacter species, 2 Citrobacter freundii, 1 Proteus mirabilis og 1 Morganella morganii. Resten af isolaterne omfatter 7 (13 %) Pseudomonas species. Som kontrolstammer blev Klebsiella pneumoniae ATCC 1705 (Microbiologics, Inc., USA) anvendt som positiv kontrol, og Klebsiella pneumoniae ATCC 1706 (Microbiologics, Inc., USA) blev anvendt som negativ kontrol. Kontrolstamme Escherichia coli ATCC (Microbiologics, Inc., USA) blev anvendt som indikatorstamme til MHT. Stammerne der blev anvendt i dette projekt er kendte og velkarakteriserede. Stammerne 2-8 er ikke carbapenemaseproducerende og udvalgt på baggrund af et dataudtræk fra laboratoriesystemet MADS på KMA, Slagelse Sygehus. Søgekriteriet var meropenem-følsomme stammer, som var nedfrosset i afdelingens egen kollektion af frysestammer. Nummer 9 er en kvalitetskontrolstamme, der ikke producerer carbapenemase. Nummer 25 er ESBL-producerende ATCC-stamme. Nummer 10 og 11 er stammer fra Herning Hospital udvalgt på grund af ESBL og AmpC-gener. Nummer 12-15, 21, 24, 26 og 27 er oprindeligt fra Hvidovre Hospital og er udvalgt på baggrund af ESBL og AmpC-gener. Fra Norge er nummer blevet udvalgt, fordi de har AmpC-gener. Stammerne 20, 22, 23, kommer fra DTU Food, Henrik Hasman og Lisbeth Andersen, og er taget med i projektet, fordi de har ESBL og carbapenemasegener. Fra et græsk hospital, Alkiviadis Vatopoulus og panagiota Giakkoupi, er ESBL- og carbapenemaseproducerende stammer, nummer 38-41, oprindeligt tilsendt et tidligere projekt på KMA i Slagelse. Nummer med ESBL-, AmpC og/eller carbapenemasegener kommer fra SSI, Anette Hammerum. De resterende stammer, nummer 28, 29, 36, 37 og 53, kommer fra mikrobiologiske afdelinger på henholdsvis Nykøbing Falster Sygehus, Slagelse Sygehus, Esbjerg Sygehus, Næstved Sygehus og Odense Universitetshosptial, Ulrik Justesen, og er udvalgt på grund af deres ESBL- eller carbapenemaseproduktion. 15

16 Forberedelse og fremstilling af bakteriemateriale Bakteriemateriale blev taget fra frysebouillon og blev udsået med tretrinsspredning på 5 % blodagar (SSI, København). Pladerne blev inkuberet i varmeskab (Struers, Rødovre) ved 35 C i ca timer. For at opnå renkultur blev stammerne omsået fra en enkeltliggende koloni. Renkulturerne blev anvendt inden for 6 timer efter inkubation (Burckhardt, Zimmermann 2011). MALDI-TOF-MS Fremstilling af matrix Basalt organisk opløsningsmiddel (OS) blev blandet af 560 µl 50 % acetonitril (Sigma-aldrich, Germany) 35 µl 2,5 % tri-flour-eddike-syre (TFA) (Merck KGaA, Germany) og 525 µl HPLCvand (Merck KGaA, Germany). Matrix blev fremstillet af udportioneret HCCA ([α-cyano-4- hydroxycinnamic acid])-krystaller (Bruker Daltonik GmbH, Germany) og 250 µl OS. Protokol forefindes i D4 på KMA-S. Forberedelse af antibiotika opløsning Til 5 ug ertapenem (MSD, Frankrig) i fast form blev 500 µl HPLC-vand (Merck KGaA, Germany) tilsat. Herefter blev opløsningen fortyndet med HPLC-vand 1:10 svarende til en antibiotisk koncentration på 1 ug/ml. (Personlig korrenpondance med Rimtas Dargis 2012). Fremgangsmåde For hver stamme blev 30 µl ertapenem-opløsning overført til 1,5 ml effendorp-rør (SARSTEDT, Germany). Til hvert rør blev tilsat 1 µl kolonimateriale ved hjælp af øjepodenål. Prøverne blev inkuberet ved 36 C i 1 time og samtidig mixet ved 700 rpm. Efter inkubation blev prøverne centrifugeret i 90 sekunder ved x g. 1 µl af supernatanten blev afsat på targetpladen (Bruker Daltonik GmbH, Germany). Pladen blev tørret ved stuetemperatur. På hvert spot blev tilsat 1 µl matrix, targetpladen blev tørret og derefter analyseret på MALDI-TOF (Burckhardt, Zimmermann 2011, Sparbier 2012). Aflæsning og fortolkning af resultater Et resultat blev fortolket positivt for carbapenemase-aktivitet, hvis toppene for ertapenem på 476, 498 og 521 Dalton (Da) forsvandt fuldstændig efter inkubation (Se figur 2). Samtidig skulle der 16

17 observeres for forekomsten af andre toppe, som indikerede et resistensmønster i prøven (Se bilag 5). Dette blev medtaget i tolkning og vurdering af positive resultater. Ved negativt resultat viste toppene på 476, 498 og 521 Da nogenlunde samme højde som toppen på 450 Da eller højere (figur 4). Disse toppe blev aflæst og tolket ved hjælp af bilag 5. Figur 2 viser eksempel på et positivt resultat fra MALDI-TOF MS, hvor der observeres carbapenemase-aktivitet, da toppene for ertapenem på 476, 498 og 521 Dalton (Da) forsvandt fuldstændigt efter inkubation. Massespektre i figuren afspejler et resistent mønster på grund af toppe 471 og 487, som fremgår i tabellen 1. Figur 2. Viser spektrum for et positivt resultat af stamme nummer 46 indeholdende ESBL + CARBA. Figur 3 viser eksempel på et negativt resultat fra MALDI-TOF MS, hvor der ikke observeres carbapenemase-aktivitet. Toppene på 476, 498, 514 var synlige og lige høje med toppen på 450. Massespektre i figuren afspejler et sensitivt mønster (Se bilag 5) og er beskrevet af Burckhardt & Zimmermann og Sparbier et al. Figur 3. Viser spektrum for et negativt resultat af stamme nummer 2. 17

18 KPC-MBL confirmid kit Fremgangsmåde: På BD iso-resistensplade blev stammerne udsået efter EUCASTmetoden. Temocillin blev lagt i midten, mens meropenem 10ug, meropenem 10ug+dipicolinsyre, meropenem 10ug+borsyre og meropenem 10ug+cloxacillin blev lagt i hvert hjørne af en firkant mindst 15 mm fra kanten (se figur 5). Pladerne blev inkuberet i varmeskab ved 35 C i timer (Rosco Diagnostica: Indlægsseddel, 2012). Efter inkubation blev hæmningszoner aflæst og målt ifølge EUCAST forskrift. Figur 5 illustrerer, hvorledes tabletterne bliver afsat på BD-iso-resistenspladen ved KPC-MBL metoden. Figur 5. Klebisiella pneumoniae afprøvet med KPC-MBL confirmid-kittet opsat på BDiso-resistensplade. Aflæsning og fortolkning af resultater: For et positivt resultat blev der tolket på følgende måde. (Se tabel 3) Ved tilstedeværelse af β- laktamase AmpC+ porin-tab skulle zonestørrelsen for MRPCX være 5 mm i forhold til MRP10. Et positivt resultat for KPC skulle zonestørrelsen for MRPBO være 4 mm og for MRPCX være < 4 mm i forhold til MRP10. For MBL positivt resultat skulle zonestørrelsen for MRPDP være 5 mm i forhold til MRP10. Et negativt resultat for KPC og MBL, hvor carbapenemase-aktivitet ikke blev udtrykt, skulle alle zoneforskelle være indenfor 3 mm for hvert antibiotikum (Se tabel 2). Temocillin blev udelukkende anvendt til påvisning af OXA-48, hvor et positivt resultat fremkom ved ingen zone omkring temocillin. Ved et negativt resultat blev der derimod dannet en hæmningszone omkring temocillin, der er 12 mm i forhold til MRP10 (Rosco Diagnostica, KPC-MBL confirmid kit, indlægsseddel 2012) Tabel 3 illustrerer hvorledes de hæmningszoner for de pågældende antibiotika skal tolkes. MRPCX med en zone på 5 mm MRP10 indikerer AmpC + porin-tab. KPC positiv, hvis zonestørrelse for MRPBO er 4 mm og MRPCX er < 4 mm i forhold til MRP10. MBL positiv, hvis zonestørrelse for MRPDP er 5 mm i forhold til MRP10. For OXA-48 positiv ses ingen zone omkring temocillin. KPC og MBL negativ vil alle zoneforskelle være indenfor 3 mm for hvert antibiotikum. 18

19 Modificeret Hodge Test Fremgangsmåde Der blev efter EUCAST-forskrift fremstillet en baktieriesuspension af Escherichia coli ATCC svarende til 0,5 McFarland. (Se bilag 3) Opløsningen blev fortyndet 1:10 med 0,9 % NaCl-opløsning og blev udsået på BD iso-res efter EUCAST. På pladerne blev der med nummer 1, 2 og 3 angivet hvor de respektive bakterier skulle afsættes for at skelne mellem negativ kontrol, positiv kontrol og teststreg. En 10 ug meropenemtablet blev placeret i midten af pladen. Teststamme, positive og negative kontroller blev opsamlet fra kolonier og påført fra kanten af pladen og ind til meropenm-tabletten. Pladerne blev inkuberet Figur 6. a. b. ved 35 C i timer. (Amjad 2011). Aflæsning og fortolkning af resultater Ved positiv MHT ville standardstammen (E. coli) under inkubation vokse ind mod stregen af testbakterien med retning mod meropenemtabletten og danne en karakteristisk kløverbladsvækst, som illustreres på billede a ved pilen (Se figur 6). Ved et negativt resultat, ville indikatorstammen (E. coli) derimod ikke vokse ind mod stregen af testbakterien og meropenem og danne en kløverbladsvækst, som ses på billede b ved pilen (Se figur 6). (Amjad A. 2011) På billederne ses a. Positiv MHT. b. Negativ MHT. Numrene 1, 2 og 3 viser henholdsvis positiv kontrol, negativ kontrol og testbakterien Tabel 3. Resistensmekanisme MRPBO MRPDP MRPCX Temocillin AmpC + porin-tab MRP10 4 mm <= 3 mm 5 mm 12 mm KPC MRP10 4 mm <= 3 mm <= 3 mm 12 mm MBL MRP10 < 4 mm 5 mm <= 3 mm 12 mm OXA-48 MRP10 <= 3 mm <= 3 mm <= 3 mm Ingen hæmning Hvis der er 3 mm forskel imellem alle zoner = AmpC, KPC og MBL negativ. Fortolkning af zonestørrelse for antibiotika, der er gældende for den enkelte resistensmekanisme. 19

20 ChromID CARBA Fremgangsmåde Der blev efter EUCAST-forskrift fremstillet en baktieriesuspension svarende til 0,5 McFarland. (Se bilag 3) Denne opløsning fortyndes 1:10 med 0,9 % NaCl-opløsning. 10 µl af fortyndingen blev afsat på en ChromID TM CARBA-plade (BioMerieux, Frankrig). Bakteriesuspensionen blev strøget ud med tretrinsspredning. Pladerne blev inkuberet i varmeskab ved 35 C i timer. Aflæsning og fortolkning af resultater For et positivt resultat skelnedes der mellem E. coli og en gruppe af Klebsiella, Enterobacter, Serratia og Citrobacter (KESC-gruppen), som var baseret på den fremkommende farve. (Se figur 4) Kun carbapenemase producerende bakterier kunne fremvokse på ChromID CARBA. Et resultat blev tolket positivt, når der på ChromID CARBA fremkom kolonierne i farverne blå-grøn til blågrå hos Klebsiella, Enterobacter, Serratia og Citrobacter (KESCgruppen). Ligeledes blev et positivt resultat for E. coli tolket ved, at der fremkom lyserøde til bourgognefarvede kolonier eller transparente kolonier med et lyserødt til bourgognefarvet centrum. Ved negative resultater observeredes der ingen bakterievækst. (BioMéreux, ChromID CARBA, indlægsseddel 2012) Figur 4: a. b. c. Figur 4 viser ChromID CARBA agarplader fra eget forsøg. Billede a illustrerer et positivt resultat for carbapenemase-aktivitet af KESCgruppen, hvor kolonierne i blå-grøn til blå-grå farver blev udtrykt på pladen. Billede b viser ligeledes et positivt resultat med carbapenemase-aktivitet af E. coli, hvor kolonier med lyserøde til bourgognefarvede eller transparente med et lyserødt til bourgognefarvet centrum blev udtrykt på pladen. På billede c observeres ingen bakterievækst. Det bliver derfor tolket som et negativt resultat. Figuren viser a. Positiv for CPE af KESC-gruppen: Blågrønne-blågrå kolonier. b. Positiv for CPE af E. coli-arter med lyserøde til bourgognefarvede kolonier. c. Negativ ved ingen vækst på pladen. 20

21 Resultater MALDI-TOF Af de 16 carbapenemaseproducerende stammer, blev 8 påvist positive (Se bilag 1). Ud af 36 carbapenem-følsomme stammer blev alle 36 påvist negative for carbapenemase-aktivitet. MALDI- TOF-MS opnåede en sensitivitet på 50 % og en specificitet på 100 %. (Se tabel 4) (Se også bilag 4). Nedenfor vises eksempler af MALDI-TOF-MS resultater. Figur 7 viser spektrum for ren ertapenem i MALDI-TOF MS. Positive og negative resultater ses på figur 2 og 3 i materiale og metode afsnittet under fortolkning af resultater for MALDI-TOF-MS. Figurerne 8 og 9 illustrerer falske negative resultater, hvor der ses en svag nedbrydning af ertapenem. Figurerne 10 og 11 viser negative resultater for carbapenemase-aktivitet med en svag nedbrydning af carbapenem. Figur 7 viser et resultat af ren ertapenem uden bakteriemateriale efter en times inkubation. På figuren ses der toppe på 476, 498 og 520, der indikerer, at ertapenem stadigvæk er intakt, da disse toppe undtaget 520 er på højde med top på 450. Figur 7. Viser spektrum for ren ertapenem Figur 8 viser et resultat af bakteriestamme nr. 35 efter inkubation. Der ses toppe på 476, 498 og 513, som indikerer svag nedbrydning af ertapenem, fordi toppene er lavere end toppen på 450. Figur 8. Viser et falsk negativt resultat af stamme nummer 35 indeholdende carbepenemasegen. 21

22 Figur 9 viser bakteriestamme nummer 38 efter inkubation. På figuren ses der toppe på 476, 498 og 514, som indikerer svag nedbrydning af ertapenem, fordi disse toppe er lavere end toppen på 450. Figur 9. Viser et falsk negativt resultat af stamme nummer 38 indeholdende ESBL- og carbapenemasegener. Figur 10 viser et resultat af bakteriestamme nr. 22 efter inkubation. På figuren ses der toppe på 476, 498 og 513, som indikerer en svag nedbrydning af ertapenem, da disse toppe er lavere top på 450. Figur 10. Viser stamme nummer 22 indeholdende ESBL-gen. Spektret illustrerer svag nedbrydning af carbapenem. Figur 11 viser et resultat af stamme nummer 45 efter inkubation. På figuren ses der toppe på 476, 498 og 514, som indikerer svag nedbrydning af ertapenem, da disse toppe er lavere end toppen på 450. Figur 11. Viser stamme nummer 45 med AmpC-gen. Spektret viser svag nedbrydning af carbapenem. 22

23 KPC-MBL confirmid kit Ud af i alt 17 stammer, inklusiv positiv kontrol, med carbapenemaseproduktion, blev 12 stammer detekteret korrekt. Af i alt 37 stammer, der ikke havde carbapenemaseaktivitet, blev alle 37 korrekt identificeret. Testen opnåede en sensitivitet og specificitet på henholdsvis 70,6 % og 100 % (Se tabel 4). Tabel 4. KPC-MBL MHT ChromID CARBA MALDI-TOF Sensitivitet % 70,6 % 76,9 % 92,9 % 50 % Specificitet % 100 % 68,6 % 93,9 % 100 % Viser resultater for sensitivitet og specificitet af KPC-MBL confirm ID-kittet, MHT, ChromID CARBA og MALDI-TOF-MS. Se også bilag 4. Modificeret Hodge Test Ud af 16 velkarakteriserede stammer med carbapenemaseproduktion, blev 10 stammer påvist korrekt, mens 24 stammer blev identificeret korrekt af de 36 stammer, der var følsomme overfor carbapenem-antibiotika. Følgende stammer: 2, 33, 38 og 46 som uaflæselige. Sensitivitet og specificitet på testen var henholdsvis 76,9 % og 68,6 %. (Se tabel 4) ChromID CARBA Pseudomonas sp. er ikke talt med i behandlingen af resultaterne, da pladen er fremstillet primært til Enterobacteriaceae. Testen kunne påvise 13 sande positive ud af 14 stammer med carbapenemaseproduktion, inklusiv positiv kontrol, mens 31 sande negative blev påvist korrekt ud af i alt 33 negative stammer, inklusiv negativ kontrol. Metoden opnåede en sensitivitet og specificitet på henholdsvis 92,9 % og 93,9 %. (Se tabel 4) Det var uoverensstemmelse ved flere af metoderne. Tabel 5 viser isolater, der gav falske resultater, som enten er falsk negativ eller positiv. Stammerne er inddelt efter resistensgen, hvor carbapenemase-gener er placeret øverst, ESBL-gener i midten og AmpC-gener til sidst. For hver metode afsættes der et kryds, der indikerer enten falsk negativt eller positivt resultat. For MHT fremkom der i alt 11 falske positive resultater, mens for KPC+MBL fremkom der i alt 5 falske negative resultater. Ved MALDI-TOF fremkom der i alt 8 falske negative resultater (Se tabel 5). 23

24 Tabel 5. Nummer Art Resistensgen MALDI KPC-kit MHT ChromID FP FN 30 K. pneumonia CARBA X X X X + 31 K. pneumoniae CARBA X + 32 E.coli CARBA X + 33 Pseudomonas sp. CARBA X + 35 P. aeruginosa CARBA X X X + 36 K. pneumoniae CARBA X + 38 K. pneumoniae CARBA X + 43 E. coli CARBA X X + 53 P. aeruginosa CARBA X X X + 11 E.coli ESBL X + 27 P. mirabillis ESBL X + 28 K. pneumonia ESBL X + 50 E.coli ESBL X + 51 E.coli ESBL X + 16 C. freundii AmpC X + 17 E. cloaceae AmpC X + 18 K. oxytoca AmpC X + 19 M. morgana AmpC X + 20 E. coli AmpC X + 45 K. pneumoniae AmpC X + Viser falske positive og falske negative resultater for KPC-MBL confirmid-kittet, MHT, ChromID CARBA og MALDI-TOF- MS i forhold til resistensgen Diskussion På baggrund af det voksende antal fund af multiresistente bakteriestammer, er der skabt et øget fokus på problemstillingerne omkring disse bakterier. (Kempf 2012, Sparbier 2011, Nordmann, Poirel, Dortet, 2012, Statens Serum Institut 2012c) Multiresistente bakterier medfører et øget forbrug af resurser for sundhedsvæsenet. Smittede patienter, der ofte kun er bærere af bakterierne, skal indlægges i isolation, så yderligere smitte undgås. Har patienten en infektion med CPB er den ofte svær at behandle og behandlingsperioden trækker ofte ud. Kritiske infektioner med ringe eller ingen mulighed for behandling kan medføre døden for patienten. (Amjad 2011) Det er derfor vigtigt at der udvikles en hurtig, sensitiv, specifik og billig metode til at detektere carbapenemaseproducerende bakterier med. (Kempf 2012) MALDI-TOF-MS I undersøgelse af stammerne på MALDI-TOF-MS indgår en analyse af ren ertapenem, som er inkuberet, centrifugeret og analyseret på samme måde, som prøverne med bakteriemateriale. Prøven 24

25 med ren ertapenem er en nulprøve, der angiver ertapenem-produkter uden hydrolysering eller decarboxylering. (Se figur 7) Toppen ved 450 er konstant, og vil også forblive intakt ved inkubation med bakteriemateriale. Toppen viser et ertapenemderivat, som fremkommer i alle tilfælde, fordi ertapenem ikke er et rent stof. (Personlig korrespondance med Søren Lehmann, Bruker Diagnostica) I projektet påviser metoden carbapenemaseaktivitet med en sensitivitet på 50 %. Nummer 30, 31, 33, 35 (Se figur 8), 36, 38 (Se figur 9), 53 og ATCC 1705 blev påvist negative, selvom de har carbapenemasegener. (Se tabel 4) Da stammernes evne til at nedbryde ertapenem afhænger af deres enzymers aktivitet, spiller inkubationstiden af stammerne en afgørende rolle. Tiden er afgørende for hvor meget ertapenem bakterierne når at nedbryde inden MALDI-TOF-MS udføres. I nærværende studie blev stammerne inkuberet i 1 time efter anbefalinger fra Bruker Diagnostica. (Personlig korrespondance med Søren Lehmann, Bruker Diagnostica) Stamme nummer 30, 33, 35 og 38, der har henholdsvis generne GES-1, VIM-2, IMP-1 og VIM, blev detekteret falsk negative. (Se tabel 4) Den korte inkubationstid kan være årsag til den lave sensitivitet. Bachelorprojektet viser, at der i en fremtidig forbedring af protokollen til metoden, må tages højde for inkubationstiden. At producenten Bruker Diagnostica anbefaler 1 times inkubation uanset hvilket carbapenemasegen bakterien har, kan skyldes at de måske ikke har oplevet lav sensitivitet. Det kan skyldes at de har udvalgt og arbejdet med stammer, som ikke har GES-, IMP- og VIM-gener. På baggrund af forudgående studier foretager Burckhardt et al en afprøvning af MALDI-TOF-MS med forskellige inkubationstider. Studiet mangler beregning af sensitivitet og specificitet, men viser en sammenhæng mellem carbapenemasegener med svag aktivitet og inkubationstid. Et studie af Kempf et al efterprøver studiet af Burckhardt et al og understøtter teorien i nærværende studie ved at påvise stor sensitivitet ved længere inkubationstid. Metoden afprøves af Kempf et al på stammer af K. pneumoniae og A. baumannii med imipenem som antibiotikum. En inkubationstid på 2 timer og en inkubationstid på 4 timer resulterer i en sensitivitet på henholdsvis 95 % og 100 %. Undersøgelser bekræfter at længere inkubationstid gør metoden mere sensitiv og specifik, og Kempf et al beskriver også at årsagen hertil kan være svagere aktivitet for nogle carbapenemaser. I en anden undersøgelse af Sparbier et al udføres MALDI-TOF-MS som i nærværende studie med ertapenem og 1 times inkubation. På baggrund af tidligere undersøgelser argumenterer Sparbier et al for, at 1 times inkubation er tilstrækkeligt til detektion af carbapenemaseaktivitet, og det beskrives til fordel for MALDI-TOF-MS, at metoden vil kunne give et endeligt svar indenfor 2 timer. Der er ikke beregnet sensitivitet og specificitet i undersøgelsen. Vurdering af toppenes ændring på grund af hydrolyse af ertapenem bliver beskrevet meget nøje, og der lægges vægt på 25

26 årsagerne til de fremkomne eller forsvundne toppe. Årsagerne er af kemisk karakter, og giver en god forståelse for princippet bag MALDI-TOF-MS. Der mangler dog en reel vurdering af metodens evne til at påvise carbapenemaseaktivitet. Nærværende studie har vist, at carbapenemaseproducerende bakterier med lav aktivitet kan være svære at påvise. Sparbier et al foreslår også, at metoden valideres yderligere og testes med stammer, der har lav carbapenemaseaktivitet, før metoden kan bruges i klinisk diagnostik. Der var yderligere to falsk negative stammer, nummer 31 og 36, der begge har KPC-2-genet. (Se tabel 5) Grunden til at disse bakterier detekteres falsk negative kan ikke have samme grund, som bakterierne med GES-, IMP- og VIM-genet. NDM- og KPC-producerende bakterier hydrolyserer ertapenem på en time og kræver en til halvanden times inkubation. (Kempf 2012 Burckhardt, Zimmermann 2011) Årsagen kan være at bakterierne ikke har haft de optimale betingelser for enzymaktivitet under inkubationen. Bruker anbefaler HPLC-vand, fordi det anvendes i deres forsøg med metoden i Bremen med gode resultater. (Personlig korrespondance med Søren Lehmann, Bruker Diagnostica) Fordele ved at benytte HPLC-vand kan være, at man undgår unødvendigt mange ioner fra saltvandet, når MALDI-TOF-MS udføres. Tolkningen af MS-kurverne bygger på vurdering af definerede toppe, som indikerer de molekyler, som det analyserede stof består af. Man kan forestille sig, at mange natrium- og kloridioner kan interferere med ionprodukterne af ertapenem, der fremkommer efter inkubation med bakterien. En ulempe ved HPLC-vand kan være at reagenset ikke har den optimale ph. Det har ikke været muligt at finde oplysninger om ph for HPLC-vand, men da bakterier vokser bedst ved en neutral ph på 6-8, er det vigtigt at de opbevares ved ph inden for dette område. For at kende ph i opløsningen kunne den have været målt. I studierne af Kempf et al og Burckhardt et al er der anvendt 0,45 % NaCl-opløsning (saltvand), hvori bakteriemateriale opslæmmes inden inkubation. Ingen af studierne begrunder, hvorfor der er anvendt saltvand. En anden årsag til falsk negative resultater i nærværende projekt kunne være, at renkulturerne som bakteriematerialet stammer fra, er udsået fra én koloni, der ikke havde carbapenemasegenet. Hvis denne årsag skulle elimineres, kunne renkultur udsået fra én enkeltliggende koloni have været erstattet af en et skrab eller dyp i flere kolonier. Bakteriemateriale med udgangspunkt i sådan et 26

27 præanalytisk trin ville have øget muligheden for at dyrke videre på en koloni, der havde carbapenemasegenet. Der er dog risiko for, at undersøgelsen ikke kommer til at tage udgangspunkt i materiale fra renkulturer. At der arbejdes med velkarakteriserede stammer og renkulturer af disse er grundlæggende, vigtige elementer for at kvalitetssikre projektet. MALDI-TOF-MS opnår i nærværende studie en specificitet på 100 %. Aflæsning af toppene fra MALDI-TOF-MS er i nærværende studie en subjektiv vurdering, hvor det vurderes om ertapenemprodukterne er blevet nedbrudt af bakterierne. En lavere top påviser hydrolysering af ertapenem. Hvis forudsætningen for at et resultat tolkes positivt ændres, kan det have indflydelse på specificiteten. Ligesom i nærværende undersøgelse har Burckhardt et al tolket stammerne positive for carbapenemase, hvis toppene for ertapenem forsvandt fuldstændigt efter inkubation. Resultaterne fra MALDI-TOF-MS er i begge undersøgelser vurderet manuelt, og der har i nærværende projekt ikke været en klar retningslinje, som resultaterne kunne aflæses efter. Bachelorprojektet har vist tydelige carbapenemasenegative og carbapenemasepositive stammer, men også nogle stammer, hvor det er svært at afgøre om de skulle tolkes negative eller positive. Stammerne, som for eksempel nummer 22 og nummer 45, så ud til at kunne hydrolysere ertapenem, men de havde en nedsat aktivitet, som gjorde at de ikke fuldstændigt nedbrød antibiotikummet. (S figur 10 og 11) ESBL- og AmpC-gener kan medføre delvis nedbrydning af ertapenem, og positiv tolkning af sådanne resultater, kan medføre falsk positive resultater og en ringere specificitet. Hrabák et al og Kempf et al opnår begge de højeste specificiteter på 100 % efter tilstrækkelig inkubation, og tillægger også falsk positive resultater, at stammerne producerer andre β-lactamaser. Hrabák et al har, for at undgå en subjektiv tolkning af resultaterne, benyttet en software, FlexAnalysis 3.0. Det har ikke været muligt at benytte et computerprogram til aflæsning af resultater i nærværende projekt, og der findes heller ikke en manual til tolkning af MALDI-TOF- MS resultater på nuværende tidspunkt. Erfaringer med aflæsning af MS-kurverne i dette projekt viser, at der kan være brug for et automatisk og standardiseret aflæsningsprogram, så tolkningen af resultaterne ikke bliver subjektive. Det vil gøre resultaterne mere valide og lette aflæsningen. Der blev ikke påvist falsk positive stammer i nærværende studie. Havde det været tilfældet, kunne det have skyldes impermeabilitet og/eller effluxpumper. Mekanismerne er velkendte barrierer i udvikling af metoder til detektion af CPB. MALDI-TOF-MS påviser ikke resistens overfor 27