Anvendelse af Enzymer i Fødevarer

Transkript

1 SRP-øvelse ved Det Natur- og Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet Anvendelse af Enzymer i Fødevarer Øvelsesvejledning 2013 Henriette Erichsen, Anni Bygvrå Hougaard, Karsten Olsen og Jeanette Otte Institut for Fødevarevidenskab SCIENCE, KU 1

2 Praktiske informationer Øvelsen kan laves af maksimalt 12 elever per uge. Der arbejdes i 4 hold med 3 elever på hvert hold. Det praktiske arbejde foregår i laboratorium A410, A408 og A405, som findes på 4.sal i den gule bygning på Rolighedsvej 30. Teoriundervisningen foregår ligeledes på Rolighedsvej 30, på 5. sal i lokale A507. Oversigt over øvelsen Hvert hold laver 2 mælkeprøver: A. Uden tilsætninger B. Med laktase-enzymproduktet Lactozym Disse to mælkeprøver gøres klar tidligt den første dag, og skal stå i køleskab til næste dag, hvor de analyseres. På Figur 2 (side 4) ses et flowskema over de forberedelser og analyser som skal laves på mælkeprøverne. Foruden disse, skal der fremstilles standardkurver til brug ved bestemmelse af glukose- og laktoseindholdet i mælkeprøverne. Standardkurverne fremstilles på øvelsens første dag. De anvendte analysemetoder er beskrevet i det følgende med både en kort teoretisk introduktion og en beskrivelse af fremgangsmåden: 0) Fremstilling af mælkeprøver (s. 5) 1) Laktosebestemmelse ved HPLC analyser (s. 6-8) 2) Glukose-bestemmelse med glukoseoxidase assay (s. 9-12) 3) Frysepunktssænkning bestemt med cryoskop (s. 13) 4) Sødhed bedømt ved sensorisk test (triangel test) (s ) Derudover gives teoretisk undervisning om bl.a. enzymers anvendelse i fødevarer, mælk, kulhydrater og sødhed samt omkring de metoder, der anvendes til at analysere mælkeprøverne med. 2

3 Indledning Enzymer findes overalt, og langt de fleste reaktioner i naturen kræver aktivitet af mindst et enzym for at kunne forløbe i betydeligt omfang under de naturlige betingelser. Enzymer virker som katalysatorer og sænker reaktionens aktiveringsenergi, så den forløber ved lavere temperatur og/eller over kortere tid end den ukatalyserede reaktion. Enzymerne bliver, som alle katalysatorer, ikke selv forbrugt ved reaktionen. For efterhånden mange år siden blev det muligt at producere enzymer i ren koncentreret form, og dermed blev det også muligt at udnytte enzymernes aktivitet i f.eks. fødevareproduktion, så ernæringsmæssige og funktionelle egenskaber kan designes og ændres. I dag bruges kommercielle enzymer fx til fremstilling af brød, øl og visse mælkeprodukter. I mange lande er der stor interesse for at producere laktose-fri eller laktose-reduceret mælk, fordi mange mennesker ikke kan tåle laktose (mælkesukker). Laktosen kan f.eks. fjernes med et enzym, β-galaktosidase (også kaldet laktase), som hydrolyserer disakkaridet laktose til dets to monosakkarider, galaktose og glukose (se figur 1). Figur 1: Hydrolyse af laktose til galaktose og glukose katalyseret af β-galaktosidase. I denne øvelse tilsættes laktase til skummetmælk og efterfølgende analyseres hvilken effekt enzymtilsætningen har haft på mælkens indhold af laktose og glukose, samt effekten på mælkens frysepunkt og smag. Øvelsen illustrerer således, hvordan enzymer kan anvendes til at ændre en fødevares ernæringsmæssige, funktionelle og sensoriske egenskaber. Analysemetoden til bestemmelse af mælkens indhold af glukose er desuden baseret på flere reaktioner katalyseret af enzymer. 3

4 Tirsdag Enzym til skummetmælk (200 µl Lactozym til 200 ml mælk, opbevares på køl natten over). Onsdag Varmebehandling Vandbad 90 C, 15 min. Nedkøling Koldt vand, til ca. stuetemperatur. Smagstest (ca. 140 ml) Opdeling af prøver til analyser Hæld ca. 60 ml mælk over i et bægerglas, og sæt resten på køl til smagstest. Udtag 5,0 ml fra bægerglasset til et 10 ml rør, resten bruges til bestemmelse af frysepunktssænkning Frysepunktssænkning (ca. 10 ml) Fældning af proteiner Tilsæt 300 µl 1,0 M HCl til 10 ml-røret. Ryst røret let. Tjek at ph er ca. 4,5. Centrifugering Prøverne centrifugeres ved 2000 g, 15 min, stuetemperatur. Husk at balancere centrifugen!! Supernatanten* overføres til et rent rør. 300 µl af supernatanten* udtages og overføres til et centrifugefilter. Glukoseoxidase assay Centrifugér prøverne ved g, 20 min, stuetemperatur. Husk at balancere centrifugen!! 50 µl af filtratet* overføres til eppendorfrør, tilsæt 450 µl Milli-Q vand og mix grundigt. HPLC analyse Figur 2: Flowskema over forberedelse af prøverne til de forskellige analyser. *Se forklaringer side 5. 4

5 0) Fremstilling af mælkeprøver Materialer Til dette forsøg anvendes skummetmælk. Der anvendes følgende enzym: Lactozym Pure 1500 L S (β-galactosidase, laktase) Enzymet er et kommercielt produkt fra Novozymes A/S; databladet kan findes i Bilag 1 (sammen med databladet for det enzym, der bruges til bestemmelse af glucose). Fremgangsmåde Dag 1: 200 ml mælk afmåles og overføres til hver af to sutteflasker, som mærkes med hold nr. og prøvenavn (A og B). Til mælk A tilsættes ingenting (Kontrol). Til mælk B tilsættes 200 µl Lactozym Pure. Begge flasker opbevares på køl (ca. 5 C) til næste dag. Notér gerne hvor lang tid mælken har stået fra enzymtilsætning til varmebehandling. Mens mælken står på køl fremstilles opløsninger til standardkurverne for lactosebestemmelsen (side 6) og glucosebestemmelse (side 9). Dag 2: Varmebehandling af mælken sker ved at sætte flaskerne i et vandbad på 90 C i 15 min, derefter køles mælken til omkring stuetemperatur i en balje med is og vand. Mælken er nu klar til de øvrige analyser. Der hældes ca. 30 ml mælk over i et bægerglas, resten sættes på køl og skal bruges til smagstesten. Det første, der herefter skal ske, er klargøring til HPLC-analysen, som er beskrevet på side 7. 1) HPLC analyse for glucose (side 7) laves først 2) Glucosebestemmelse (side 11) laves når apparatur er ledigt 3) Frysepunktssænkning (side 13) laves når apparatur er ledigt 4) Smagstest for sødhed (side 14) laves samlet til sidst *Ordforklaringer (ord markeret med * i Figur 2) Supernatant: Væsken over bundfaldet efter centrifugeringen. Filtrat: Væsken, der under centrifugeringen har passeret filteret og nu ligger i bunden af røret. 5

6 1) Laktosebestemmelse ved HPLC analyser Teori Teori om HPLC gives i en af de teoretiske præsentationer. Da mælk indeholder en del proteiner som vil influere på analysen og i sidste ende ødelægge HPLC-kolonnen, skal prøverne forberedes grundigt til denne analyse (se figur 2). Når enzymet har haft tid til at katalysere omdannelsen af laktose til glukose og galaktose (prøve B) varmebehandles mælkeprøverne. Dette sker dels for at inaktivere enzymet og dels for at opnå en denaturering af en del proteinerne i mælken, så de bliver lettere at fjerne senere. Når prøverne er kølet noget ned tilsættes syre så ph sænkes til ca. 4,5. Herved opnås udfældning af det meste af proteinet i mælken, idet ph kommer under det isoelektriske punkt for mælkens primære proteiner, kaseinerne. Det sidste protein fjernes ved en centrifugering over et filter, der tilbageholder alt med en molekylevægt større end 10 kda ( g/mol). Koncentrationen af laktose i mælkeprøverne bestemmes ved hjælp af en standardkurve lavet på en række opløsninger med kendt koncentration af laktose. Fremgangsmåde Fremstilling af laktose standardopløsninger (tirsdag morgen) Der fremstilles en standardkurve baseret på analyse af 5 prøver med kendt laktosekoncentration. Disse opløsninger fremstilles ved fortynding af en stamopløsning som er lavet på forhånd. Stamopløsningen har en laktosekoncentration på 10 mg/ml, og standardopløsningerne skal have følgende koncentrationer: 0,5 mg/ml; 1,0 mg/ml; 2,0 mg/ml; 5,0 mg/ml og 10 mg/ml. Standardopløsningerne fremstilles i 10 ml glasrør med skruelåg i henhold til tabellen nedenfor ved at afpipettere de angivne mængder stamopløsning og Milli-Q vand. Koncentration (mg/ml) 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0 Volumen stamopløsning (ml) 0,25 0,5 1,0 2,5 =stamopløsningen Volumen Milli-Q vand (ml) 4,75 4,5 4,0 2,5-6

7 Når laktosestandardopløsningerne er fremstillet overføres 1 ml af hver opløsning til en HPLC vial som lukkes og mærkes med hold nr. og laktosekoncentration. Forberedelse af mælkeprøverne (onsdag morgen) En oversigt over prøveforberedelsen kan ses i flowskemaet i figur 2. Efter behandling af mælkeprøverne med enzym, varmebehandling og nedkøling, hældes lidt af hver mælkeprøve over i et bægerglas (ca. 60 ml), hvorfra der udtages 5,0 ml til et 10 ml glasrør. Der tilsættes 300 µl 1,0 M HCl til mælken og prøverne rystes let, der skal ske en tydelig udfældning i prøven på dette tidspunkt. Tjek evt. at ph er ca. 4,5; især hvis der ikke sker en udfældning. Derefter centrifugeres prøverne ved 2000 g i 15 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten (den klare øverste væske) overføres til et rent glasrør med en Pasteur-pipette (tynd glaspipette), undgå så vidt muligt at få fnuller med. Herfra overføres 300 µl til et centrifugefilter, og der centrifugeres ved 5000 g i 20 minutter ved stuetemperatur. 50 µl af filtratet (gennemløbet) overføres til et HPCL-glas, og der tilsættes 450 µl Milli-Q vand og blandes grundigt på whirl-mixer. Prøverne er nu klar til analyse. Husk at mærke prøverne med hold nr. og prøvenavn (A, B). HPLC apparatet Apparatet består af en række komponenter fra firmaet Agilent, de fleste fra 1100 serien. Aflæs og notér komponentens serienummer. Pumpe: Agilent series 1200, nr: Autosampler: Agilent series 1200, nr: RI- detektor: Agilent series 1100, nr: Kolonne: Forkolonne: Kromatografibetingelser Mobilfase: 5 mm H 2 SO 4 Flow rate: 0,6 ml/min Kolonnetemperatur: 75 C Detektor: Refraktiv indeks detektor (RID) Injektionsvolumen: 20 µl 7

8 Beregninger Ud fra resultaterne (de udleverede kromatogrammer) laves en standardkurve ved at afbilde arealet af toppen for laktose i de 5 laktoseopløsninger mod koncentrationen af laktose i samme prøver. Lav en lineær regression (tendenslinje) og få vist formlen for funktionen. Herefter kan koncentrationen af laktose i mælkeprøverne beregnes ved hjælp af denne formel. Husk at korrigere for at prøverne er blevet fortyndet undervejs. Resultaterne kan skrives ind i tabellerne nedenfor. Koncentration laktose (mg/ml) 0,5 1,0 2,0 5,0 10,0 Areal af laktose top (arbitrær enhed) Ligning for tendenslinje: Korrelationskoefficient for tendenslinje (r 2 ): Laktose i prøve (mg/ml) Mælk A Laktose i mælk (mg/ml) Laktose i prøve (mg/ml) Mælk B Laktose i mælk (mg/ml) 8

9 2) Glukose-bestemmelse med glukose oxidase assay Teori I denne analyse oxideres glukose først til glukonolakton ved hjælp af glukose oxidase. I denne proces dannes også hydrogenperoxid (H 2 O 2 ) et mol H 2 O 2 per mol glukose der oxideres. Hydrogenperoxid reagerer herefter med et overskud af phenol og 4-aminoantipyrine og danner et farvet kompleks, som kan måles ved 505 nm. Denne sidste reaktion katalyseres af enzymet peroxidase. Der skulle gerne være et lineært forhold mellem mængden af glukose og farveintensiteten - men også med hvor hurtigt farven udvikles ( A/min). Disse reaktioner og flere detaljer omkring metoden er givet i artiklen af Vasilarou & Georgiou (2000), udleveret sammen med anden litteratur forud for øvelsen. Fremgangsmåde Standardkurve (tirsdag eftermiddag) 1. Fremstil en 0,2 M stamopløsning af glukose: Der skal afvejes 3,60 g glukose i en 100 ml målekolbe og den fyldes op til stregen med Milli-Q vand (Figur 3). Figur 3: Fremstilling af glukose stamopløsning 2. Fremstil kalibreringsopløsninger med 2, 4, 8, 12 og 16 mm glukose: Udtag 1 ml, 2 ml, 4 ml, 6 ml og 8 ml af glukose stamopløsningen (opløsning 1) i hver af 5 stk. 100 ml målekolber og fyld op til stregen med Milli-Q vand (se figur 4). Det sidste stykke op til stregen kan med fordel fyldes med en plastik eller Pasteur-pipette. 9

10 Figur 4: Fremstilling af glukose standardrække 3. Enzymopløsningen er fremstillet på forhånd på følgende måde: Phenol, 4-aminoantipyrin, glukose oxidase og peberrods-peroxidase er opløst i phosphat puffer (0,1 M). Kemikalierne er afvejet og overført til en 250 ml målekolbe. Derefter er tilsat ca. 200 ml Milli-Q vand og ph er justeret til 7,5. Der er tilsat 125 IU (international units) glukose oxidase (Gox) og IU peberrods-peroxidase til opløsningen, og volumen er justeret til 250 ml i målekolben med Milli-Q vand. [Kemikalier: 0,176 g phenol, 0,127 g 4-aminoantipyrin, 3,55 g Na 2 HPO 4 Enzymer: 125 IU (12,5 mg) glukose oxidase (Gox, Gluzyme Mono); IU (84,7 mg) peberrodsperoxidase (Peroxidase, Sigma)] 4. Måling på prøverne: Spektrofotometeret er tændt på forhånd og det relevante program åbnet og klar til brug, programmet er lavet således at absorbansen måles ved 505 nm over 2 min. Der anvendes 0,5 ml Milli-Q vand blandet med 2,5 ml enzymopløsning (punkt 3) som blank prøve til nulstilling. Udtag 0,5 ml af 2 mm glukose opløsningen (punkt 2) og overfør det til en kuvette, tilsæt 2,5 ml enzymopløsning (punkt 3) og bland grundigt. Hurtigst muligt placeres kuvetten i spektrofotometeret, og der måles ved 505 nm over 2 min. Dette gentages med de øvrige 10

11 glukose-opløsninger (4, 8, 12 og 16 mm). Skriv filnavnene for de enkelte filer i tabellen nedenfor (så I kan finde dem når de skal eksporteres til Excel). Opløsning 2 mm 4 mm 8 mm 12 mm 16mM Filnavn Hældning (ΔA/min) Beregninger Indtegn alle kurver over absorbansændringerne i et koordinatsystem mod tid (X) og hældningerne (ΔA/min) præsenteres via tendenslinjer i Excel (angiv r 2 ). Noter hældningerne i tabellen ovenfor. Lav standardkurven ved at indtegne hældningerne (ΔA/min) i et koordinatsystem mod koncentrationen af glukose og beregn hældningen af den nye linje (dvs. hastighedskonstanten) vha. en tendenslinje. Angiv ligning og r 2 for denne linje nedenfor. Ligning for tendenslinjen: Korrelationskoefficient (r 2 ): Måling på mælkeprøverne (onsdag formiddag) Næste dag laves punkt 4 igen, men denne gang med mælkeprøverne. Målingerne skal laves på det samme spektrofotometer som ved målingerne på standardopløsningerne tirsdag. Da der ikke kan måles på farvede og uklare prøver, såsom mælk, foretages disse målinger på en del af prøven, hvor proteinerne er fældet, og der er opnået en klar opløsning (resten af supernatanten efter første centrifugering i flowdiagrammet i figur 2). Prøven skal fortyndes 10 gange inden måling, dette gøres ved at udtage 500 µl af supernatanten overføre til et nyt rør og derefter tilsætte 4,5 ml Milli-Q vand. Derefter udtages 0,5 ml af den fortyndede prøve til en kuvette og tilsættes 2,5 ml enzymopløsning og blandes grundigt. Der måles straks ved 505 nm over 2 min på spektrofotometeret. Dette måles to gange på hver af mælkeprøverne. Husk at notere filnavnet i tabellen, så I får resultaterne og prøverne kombineret rigtigt. 11

12 Beregninger For hver prøve omregnes hældningen til en glukose-koncentration ved hjælp af ligningen for standardkurven. Husk at korrigere for fortyndingen af mælkeprøverne i beregningerne. Notér i skemaet nedenfor: Mælkeprøve Mælk A Mælk B Hældning [Glucose] Hældning [Glucose] ( A/min) mm ( A/min) mm Filnavne 1 2 Gennemsnit Glucose i mælk (mm) 12

13 3) Bestemmelse af frysespunktssænkning med cryoskop Teori For vandige opløsninger, fx af sukkermolekyler, er vands kemiske potential lavere end for rent vand, og ligevægt mellem tilstandsformerne opnås derfor ved en lavere temperatur end rent vands frysepunkt. Denne effekt kaldes frysepunktssænkning. For tynde opløsninger (ideal fortynding) er der en lineær sammenhæng mellem frysepunktssænkningen, T, og koncentrationen af opløste molekyler i opløsningen. Mælks frysepunkt ligger normalt i området - 0,51 til -0,54 C. Fremgangsmåde Ca. 15 ml af hver af de to mælkeprøver (A og B) i bægerglassene tempereres 5 min ved stuetemperatur inden der måles på dem. Dernæst måles prøverne der laves dobbeltbestemmelser. Vejledning til Cryoskopet ligger ved apparatet. Når cryoskopet tændes kører det en selv-test, som afslører om det fungerer korrekt. Når denne test er overstået kan målingerne begyndes. (Dette er gjort på forhånd) 2 ml af hver prøve hældes op i de glas, der står ved apparatet, sættes ned i hullet og der trykkes på start. Temperaturen i apparatet falder nu drastisk, og der kan høres nogle høje lyde. Efter et par minutter angives frysepunktssænkningen for prøven på displayet. Denne noteres i skemaet nedenfor. Frysepunkt ( C) Mælkeprøve Mælk A Mælk B 1 2 Gennemsnit 13

14 4) Sødhed bestemt ved triangeltest Teori Triangeltesten er en såkaldt diskriminativ sensorisk test, dvs. den benyttes til at bestemme om der er forskel på smagen (eller farven, konsistensen, lugten etc.) af to prøver. Et prøvesæt i en triangeltest består af tre prøver, hvoraf de to er ens, og testen går ud på at finde ud af hvilken prøve der adskiller sig fra de to øvrige. Testen udføres normalt således at alle mulige kombinationer af de to prøver bedømmes, hvilket betyder at der er seks mulige kombinationer (f.eks. giver prøverne A og B følgende mulige kombinationer: ABB, BAA, AAB, BBA, ABA og BAB). Prøverne bedømmes ved at smage på dem i rækkefølge fra venstre mod højre, og så angive hvilken prøve, der er den afvigende. Det er også muligt at gå tilbage og smage på de tidligere prøver, hvis man er i tvivl, men ofte vil det være bedst, at følge sin første indskydelse. Fremgangsmåde I denne øvelse er der to forskellige mælkeprøver, der skal testes mod hinanden, og det giver som nævnt ovenfor 6 mulige kombinationer. For at teste alle kombinationer og rækkefølger med tre deltagere på hvert hold, må hver deltager smage på fire prøvesæt. Prøverne mærkes med tilfældige trecifrede talkoder som evt. kan findes i en tabel (vedlagt som Bilag 2), og her skal anvendes to sæt a tre numre, for at numrene ikke kommer til at afsløre for den vågne deltager, hvilken prøve der er afvigende (se eksempel i tabellen nedenfor, men brug andre numre i jeres test!). Sæt med to A er Sæt med to B er Mælk A Mælk B

15 Der skal bruges 18 prøver af hver mælk til testen (6 med hver kode for mælken), Mærk glassene og stil dem op, så I er sikre på at få kombineret koder og prøver rigtigt. Notér koderne i tabellen i Bilag 3, med numrene fra tabellen ovenfor kunne tabellen i bilag 3 se således ud: Dommer nr. Test nr. Prøvekoder (ordnet) Testkombination AAB ABB BAB AAB BBA ABA ABB ABA BAA BBA BAA BAB Rækkefølgen af testkombinationerne skal være tilfældig, bare sørg for at alle kombinationer kommer to gange og at numrene på de to ens prøver ikke står i samme rækkefølge i de to sæt. Prøverne hældes op i engangs-snapseglas. Der er ikke mere end ca. 7 ml mælk til hver prøve!. Til sidst sættes prøverne op til smagningen, med fire sæt a tre prøver til hver smagsdommer, i den rigtige rækkefølge til testen, så alle kombinationer afprøves. Hvert hold udfører testen på et andet holds prøver for at undgå genkendelse af prøvekoderne, og til sidst samles alle data for alle hold for at få et tilstrækkeligt stort antal bedømmelser til at kunne vurdere om prøverne rent faktisk er forskellige. Brug skemaet i Bilag 4 til besvarelse af testen. Resultaterne gøres op ved at tælle antallet af korrekte besvarelser, dvs. der hvor den afvigende prøve er korrekt identificeret. Derefter benyttes en tabel (vedlagt som Bilag 5) til at aflæse om antallet af rigtige svar er højt nok til at sige med en vis sikkerhed, at der er forskel på de to prøver. 15

16 BILAG 1 16

17 17

18 BILAG 2 18

19 BILAG 3 Bilag 3: Oversigtstabel over koder og prøvekombinationer til triangeltest Dommer nr. Test nr. Prøvekoder (ordnet) Testmønster

20 BILAG 4 Bilag 4: Skema til besvarelse af triangeltest Navn Hold nr. Instruktioner Smag på prøverne fra venstre mod højre. To af prøverne er identiske; bestem hvilken prøve der er den afvigende prøve. Hvis du ikke kan smage forskel skal du gætte. Sæt med tre prøver (skriv prøvenumrene) Afvigende prøve Kommentarer 20

21 21 BILAG 5