HER2 FISH pharmdx Kit Kode K udgave

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Størrelse: px
Starte visningen fra side:

Download "HER2 FISH pharmdx Kit Kode K5331 7. udgave"

Transkript

1 HER2 FISH pharmdx Kit Kode K udgave Direkte in situ fluorescenshybridiseringsanalyse til kvantitativ bestemmelse af HER2 genamplifikation i formalinfikseret, paraffinindstøbt (FFPE ) brystcancervæv og FFPE præparater fra patienter med gastrisk adenocarcinom, herunder gastro esofageal overgang. Analysen er indiceret som et supplement til HercepTest til vurdering af patienter, for hvilke behandling med Herceptin overvejes. Sættet indeholder reagenser til 20 analyser. ( ) K /DK/ULH/ s. 1/50

2 Indhold Side Tilsigtet anvendelse... 4 Resumé og forklaring Bryst... 5 Procedureprincip Bryst... 5 Reagenser Bryst... 5 Medfølgende materialer... 5 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 6 Forholdsregler Bryst... 7 Opbevaring Bryst... 8 Klargøring af prøver Bryst... 8 Paraffinindstøbte snit... 8 BRUGSVEJLEDNING Bryst... 9 A. Klargøring af reagens Bryst... 9 A.1 Forbehandlingsopløsning... 9 A.2 Stringent vaskebuffer... 9 A.3 Vaskebuffer... 9 A.4 Ethanolserie... 9 B. Farvningsprocedure Bryst... 9 B.1 Procedurebemærkninger... 9 B.2 Behandling af væv inden farvning B.3 Farvningsprotokol Kvalitetskontrol Bryst Fortolkning af farvning Bryst Begrænsninger Bryst Præstationskarakteristika Bryst Hybridiseringseffektivitet Analytisk sensitivitet Analytisk specificitet Studier af robusthed Gentagelsesnøjagtighed Reproducerbarhed Analyseportabilitet Klinisk anvendelighed Fejlfinding Bryst Appendiks 1 Bryst Appendiks 2 Bryst Appendiks 3 Bryst ( ) K /DK/ULH/ s. 2/50

3 Resumé og forklaring Gastrisk Procedureprincip Gastrisk Reagenser Gastrisk Medfølgende materialer Nødvendige materialer, der ikke medfølger Forholdsregler Gastrisk Opbevaring Gastrisk Klargøring af prøver Gastrisk Paraffinindstøbte snit BRUGSVEJLEDNING Gastrisk A. Klargøring af reagens Gastrisk A.1 Forbehandlingsopløsning A.2 Stringent vaskebuffer A.3 Vaskebuffer A.4 Ethanolserie B. Farvningsprocedure Gastrisk B.1 Procedurebemærkninger B.2 Behandling af væv inden farvning B.3 Farvningsprotokol Kvalitetskontrol Gastrisk Fortolkning af farvning Gastrisk Begrænsninger Gastrisk Præstationskarakteristika Gastrisk Analytisk sensitivitet Analytisk specificitet Studier af robusthed Gentagelsesnøjagtighed Reproducerbarhed Hybridiseringseffektivitet Fejlfinding Gastrisk Appendiks 4 Gastrisk Appendiks 5 Gastrisk Appendiks 6 Gastrisk Appendiks 7 Gastrisk Referencer Symbolforklaring ( ) K /DK/ULH/ s. 3/50

4 Tilsigtet anvendelse HER2 FISH pharmdx Kit er en direkte in situ fluorescenshybridiserings (FISH) analyse, der er udformet til kvantitativt at bestemme HER2 genamplifikation i formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) brystcancervævspræparater og FFPE præparater fra patienter med gastrisk adenocarcinom, herunder gastro esofageal overgang. HER2 FISH pharmdx Kit er indiceret som hjælp til vurdering af patienter, for hvilke behandling med Herceptin (trastuzumab) overvejes. For brystcancerpatienter er resultater fra HER2 FISH pharmdx Kit beregnet som et supplement til den klinisk patologiske information, der for tiden anvendes til estimering af prognosen for stadie II, noduspositive brystcancerpatienter. Gastrisk eller gastro-esofageal overgangs-adenocarcinom kaldes også gastrisk cancer i dette dokument. Der henvises til side 5 26 for anvendelse til brystcancer. Der henvises til side for anvendelse til gastrisk cancer. Vigtigt: Bemærk forskellene på væv fra brystcancer og gastrisk cancer, især i afsnittene Fortolkning af farvning ( ) K /DK/ULH/ s. 4/50

5 Brystcancer Resumé og forklaring Bryst Det humane HER2 gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) er lokaliseret på kromosom 17 og koder for HER2 proteinet eller p185 HER2. HER2 proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1 2). HER2 genet er til stede i 2 kopier i alle normale diploide celler. I en andel af patienter med brystcancer er HER2 genet amplificeret som en del af den maligne transformationsproces og tumorprogressionen (3 8). HER2 genamplifikation fører almindeligvis til overekspression af HER2 proteinet på overfladen af brystcancerceller (9). Amplifikation af HER2 genet og/eller overekspression af dettes protein er blevet påvist i 25 30% af brystcancere. Denne opregulering er associeret med dårlig prognose, øget risiko for tilbagefald og forkortet overlevelsestid. Adskillige studier har vist, at statusen af HER2 korrelerer med sensitivitet eller resistens over for visse behandlingsregimer af kemoterapi (10). Påvisning af kraftig overekspression af HER2 proteinet eller amplifikation af HER2 genet er essentielt for indledning af behandling med Herceptin, et monoklonalt antistof mod HER2 proteinet. Kliniske studier har vist, at patienter, i hvis tumorer der er kraftig overekspression af HER2 proteinet og/eller amplifikation af HER2 genet, har mest glæde af Herceptin (11). Procedureprincip Bryst HER2 FISH pharmdx Kit indeholder alle nødvendige reagenser til udførelse af en FISH procedure på prøver af formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i Pre Treatment Solution i 10 minutter. Det næste trin involverer proteolytisk fordøjelse ved anvendelse af brugsklart pepsin enten ved stuetemperatur eller ved en temperatur på 37 C. De n optimale pepsin inkubationstid afhænger af vævets fiksering og skal fastsættes af brugeren, men 10 minutter ved stuetemperatur eller 3 minutter ved 37 C vil være passende for de flest e prøver. Efter opvarmningen og det proteolytiske forbehandlingstrin anvender dette kit en brugsklar FISH probemix baseret på en kombination af PNA (peptidnukleinsyre) (12) og DNA teknologi. Denne probemix består af en blanding af Texas Red mærkede DNA prober, der dækker en 218 kb stor region inklusive HER2 genet på kromosom 17 og en blanding af fluoresceinmærkede PNA prober, der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17 (CEN 17). Specifik hybridisering til de to målområder resulterer i frembringelse af et distinkt rødt fluorescenssignal i hvert HER2 genlocus og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver kromosom 17 centromer. For at nedsætte baggrundsfarvning indeholder probemixen også umærkede, blokerende PNA prober. Efter en stringent vask monteres prøverne med Fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI, hvorefter de dækkes med dækglas. Ved brug af et fluorescensmikroskop udstyret med passende filtre (se appendiks 3) lokaliseres tumorcellerne, og der udføres tælling af de røde (HER2) og grønne (CEN 17) signaler. Derefter beregnes forholdet HER2/CEN 17. Normale celler i det analyserede vævssnit vil tjene som intern positiv kontrol for forbehandlings og hybridiseringseffektivitet. For detaljer, se afsnittet Fortolkning af farvning. Der henvises til det interaktive e learning program HER2 FISH pharmdx, der er udviklet med det formål, at give bioanalytikere, patologer og forskere nem adgang til akkurat og hurtig information om, hvordan der opnås optimale resultater med HER2 FISH pharmdx Kit: Reagenser Bryst Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet af tests er baseret på anvendelse af 5 8 dråber (250 µl pr. objektglas af Flaske 2, 10 µl pr. objektglas af Flaske 3 og 15 µl pr. objektglas af Flaske 5). Sættet indeholder materialer til 10 individuelle farvningskørsler. HER2 FISH pharmdx Kit forsendes på tøris. Som en kontrol af at sættets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af kittets komponenter kan være ufrosne. Dette vil ikke påvirke resultaterne opnået med HER2 FISH pharmdx kittet. ( ) K /DK/ULH/ s. 5/50

6 Brystcancer Flaske 1 Flaske 2 Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Flaske 6 Forbehandlingsopløsning (20x) 150 ml, koncentreret 20x MES (2 [N morpholin] ethansulfonsyre) buffer. Pepsin 7,5 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0; indeholder stabilisator og et antimikrobielt stof. HER2/CEN 17 probemix 0,2 ml, brugsklar Blanding af Texas Red mærkede HER2 DNA prober og fluoresceinmærkede CEN 17 PNA prober; leveret i hybridiseringsbuffer med 45% formamid, stabilisator og umærkede, blokerende PNA prober. Stringent vaskebuffer (20x) 150 ml, koncentreret 20x SSC (saltvandsopløsning natriumcitrat) buffer med detergent. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, brugsklar Fluorescensmonteringsmedium med 100 µg/l DAPI (4,6 diamidin 2 phenylindol). Vaskebuffer (20x) 500 ml, koncentreret 20x Tris/HCl buffer. Coverslip Sealant 1 tube, brugsklar Opløsning af aftageligt forseglingsmiddel til dækglas. BEMÆRK: Alle reagenser, inklusive forbehandlingsopløsningen, den stringente vaskebuffer og Fluorescensmonteringsmedium, er formuleret specifikt til brug med dette kit. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96% Xylen eller xylenerstatninger Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område: C) Kalibreret overfladetermometer (område: C) Dækglas (22 mm x 22 mm) Pincet ( ) K /DK/ULH/ s. 6/50

7 Brystcancer Stinkskab Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* Objektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas (se Klargøring af prøve) Farveskåle eller bade Timer (i stand til 2 15 minutters intervaller) Vandbad med låg (der kan holde 65 C til 99 C) Mikrobølgeovn med mulighed for registrering, hvis der udføres forbehandling ved hjælp af en mikrobølgeovn (se B3. Farvningsprotokol. Trin 1: Forbehandling, Metode B) * Varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (82 (±2) C) og hybridisering (45 (±2) C) samme n med et fugtighedskammer til hybridisering kan anvendes som alternativ til Dako Hybridizer. Mikroskopudstyr og tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbeltfilter eller FITC og Texas Red monofiltre se appendiks 3 for detaljer Fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvlampe anbefales Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende) Forholdsregler Bryst 1. Anvendes til in vitro diagnostik 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, forbehandlingsopløsning (20x), indeholder 1 <20% 2 morpholinoethansulfonsyre; Flaske 2, pepsin, indeholder 5 10% propan 2 ol; Flaske 4, stringent vaskebuffer (20x), indeholder 1 <5% octoxinol; og Flaske 6, vaskebuffer (20x), indeholder 1 <20% trometamol. Disse stoffer kræver ingen faremærkater ved de pågældende koncentrationer. Sikkerhedsdatablade (MSDS er) til professionelle brugere kan rekvireres. 4. Flaske 2, Pepsin, indeholder pepsin A, som kan medføre en allergisk reaktion. 5. Flaske 3, HER2/CEN 17 probemix indeholder 45% formamid og er mærket: Giftigt. R61 Kan give fosterskader. S45 Ved uheld eller ved ildebefindende skal der straks søges lægehjælp (vis etiketten, hvis det er muligt). S53 Undgå enhver kontakt indhent særlige anvisninger inden brug. S60 Dette materiale og emballagen skal bortskaffes som farligt affald. Som en generel regel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Material Safety Data Sheet (MSDS)) for yderligere oplysninger. 6. Dækglasforseglingsmidlet indeholder % naphtha (petroleum), let hydrobehandlet, og er mærket: Yderst brandfarligt. Miljøfarligt. R11 Meget brandfarlig. R51/53 Giftig for organismer, der lever i vand; kan forårsage uønskede langtidsvirkninger i vandmiljøet. S9 Emballagen skal opbevares på et godt ventileret sted. S16 Holdes væk fra antændelseskilder Rygning forbudt. S35 Materialet og dets beholder skal bortskaffes på en sikker måde. S57 Skal indesluttes forsvarligt for at undgå miljøforurening. S 61 Undgå udledning til miljøet. Se særlig vejledning/sikkerhedsdatablad. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Material Safety Data Sheet (MSDS)) for yderligere oplysninger. ( ) K /DK/ULH/ s. 7/50

8 Brystcancer 7. Prøver, før og efter fiksering, og alle materialer, der har været eksponeret mod disse, skal håndteres som smittefarlige og skal bortskaffes under iagttagelse af passende forholdsregler (13). Pipetter aldrig med munden, og undgå at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenserne kommer i kontakt med følsomme områder, skylles der med rigeligt vand. 8. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlagtige resultater. 9. Andre inkubationstider og temperaturer eller metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 10. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på prøverne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. 11. Undgå fordampning af HER2/CEN 17 probemix under hybridiseringen ved at sikre tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 12. Reagensernes fortynding er optimeret. Yderligere fortynding kan medføre manglende effektivitet. 13. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Material Safety Data Sheet (MSDS)) for yderligere oplysninger. Opbevaring Bryst Opbevares mørkt ved 2 8 C. Alle reagenser tåler opbevaring i fryser. Frysning og optøning af reagenserne inden hver analyse påvirker ikke resultaterne. Pepsin, HER2/CEN 17 probemix og Fluorescensmonteringsmedium (Flaske 2, 3 og 5) kan påvirkes alvorligt hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse reagenser ved stuetemperatur. HER2/CEN 17 probemix og Fluorescensmonteringsmedium (Flaske 3 og 5) kan påvirkes alvorligt hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. Anvend ikke kittet efter udløbsdatoen angivet på kittets beholder. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er specificeret på indlægssedlen, skal brugeren verificere reagensernes ydeevne (14). Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HER2 FISH pharmdx kittet. Klargøring af prøver Bryst Prøver fra biopsier, excisioner eller resektioner skal håndteres, så vævet bevares til FISH analyse. Der bør anvende standardmetoder til behandling af væv til immuncytokemisk farvning for alle prøver (15). Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er paraffinindstøbte og konserveret i neutral bufferet formalin, egner sig. Prøverne bør f.eks. udskæres til en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i neutral, bufferjusteret formalin. Derefter dehydreres vævet i en serie af gradvist stigende % ethanol og xylen efterfulgt af infiltrering af smeltet paraffin, der ikke er mere end 60 C varmt. Korrekt fikser et og indstøbt væv vil holde sig uendeligt inden sektionering og montering på objektglas, hvis det opbevares koldt (15 25 C) (15 16). Andre fiksative r er ikke egnede. Vævssnit skal skæres i en tykkelse på 4 6 µm. Objektglassene nødvendige til analyse for HER2 genamplifikation og bekræftelse på tilstedeværelse af tumor bør klargøres samtidigt. Det anbefales at anvende mindst 2 serielle snit, 1 snit til bekræftelse af tilstedeværelse af tumor farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E stain) og 1 snit til analyse for HER2 genamplifikation. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas. Prøverne bør analyseres inden for 4 6 måneder efter sektionering hvis opbevaret ved stuetemperatur (20 25 C). ( ) K /DK/ULH/ s. 8/50

9 BRUGSVEJLEDNING Bryst Brystcancer A. Klargøring af reagens Bryst Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Forbehandlingsopløsning Der kan være krystaller i flaske 1, men de opløses ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 1 (forbehandlingsopløsning 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér opløsningen, hvis den er uklar. A.2 Stringent vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 4 (stringent vaskebuffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér fortyndet buffer, hvis de n er uklar. A.3 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 6 (vaskebuffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Ethanolserie Ud fra en opløsning af 96% ethanol fremstilles 3 kar med henholdsvis 70%, 85% og 96% ethanol. Opbevar de lukkede kar ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kassér opløsningerne, hvis de er uklare. B. Farvningsprocedure Bryst B.1 Procedurebemærkninger Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og blive fortrolig med alle komponenterne inden brug (se Forholdsregler). Hvis kittets komponenter opbevares i fryser, anbefales det, at reagenserne sættes i køleskab (2 8 C) dagen inden udførelsen af analyse for at m uliggøre korrekt temperaturudligning. Alle reagenser skal ækvilibreres til den relevante temperatur inden brug som følger: Flaske 1: Den fortyndede forbehandlingsopløsning bør ækvilibreres til C, hvis forbehandlingen udføres ved hjælp af et vandbad (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode A). Hvis der anvendes en mikrobølgeovn med mulighed for registrering til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode B), skal den fortyndede forbehandlingsopløsning ækvilibreres til stuetemperatur C. Flaske 2: Pepsin skal anvendes ved 2 8 C og holdes koldt konstant. Flaske 3: HER2/CEN 17 probemix kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 til 25 C. Flaske 4: Den fortynder stringente vaskebuffer; ét kar skal ækvilibreres til stuetemperatur, et andet kar til 65 C inden brug. Flaske 5: Fluorescensmonteringsmedium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 til 25 C. Flaske 6: Den fortyndede vaskebuffer bør ækvilibreres til stuetemperatur C. Dækglasforseglingsmidlet kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 til 25 C. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren indbefatter et antal dehydreringer efterfulgt af tørring af vævssnittene. Sørg for, at vævssnittene er helt tørre inden der fortsættes til næste trin. Vævssnittene må ikke tørre ud under de øvrige trin i proceduren. ( ) K /DK/ULH/ s. 9/50

10 Brystcancer Hvis farvningsproceduren skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i vaskebuffer efter afparaffineringstrinnet i op til 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at dette påvirker resultaterne. B.2 Behandling af væv inden farvning Afparaffinering og rehydrering: Inden udførelse af analysen skal vævsobjektglassene afparaffineres for at fjerne indstøbningsmedium og rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i 96% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i 70% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit B.3, trin 1, Forbehandling. Xylen og alkoholopløsninger bør udskiftes efter 200 objektglas eller tidligere. Xylenerstatninger kan anvendes. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturer kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. B.3 Farvningsprotokol DAG 1 Trin 1: Forbehandling Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A) eller alternativt ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B). Metode A) Forbehandling ved hjælp af vandbad: Fyld farveskåle, f.eks. Coplin skåle, med den fortyndede forbehandlingsopløsning (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.1). Anbring farvningskarrene med Pre Treatment Solution i vandbad. Opvarm vandbadet og forbehandlingsopløsningen til C. Mål temperaturen inde i skålen med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Sæt låg på karrene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede Pre Treatment Solution i farvningskarrene. Kontroller temperaturen igen og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. Fjern hele skålen med objektglas fra vandbadet. Fjern låget og giv objektglassene lov til at køle af i forbehandlingsopløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. ( ) K /DK/ULH/ s. 10/50

11 Brystcancer Metode B) Forbehandling med mikrobølgeovn med mulighed for registrering: Fyld en plastskål med fortyndet forbehandlingsopløsning ved stuetemperatur (20 25 C). Nedsænk de afparaffinerede snit i forbehandlingsopløsning, dæk skålen med et låg med ventilationshuller, og placer den i mikrobølgeovnen. Aktivér kogepunktssensoren, og vælg et program, der kører i 10 minutter efter at temperaturen er nået op på kogepunktet*. Efter de 10 minutters inkubation tages skålen med objektglas ud af ovnen, låget fjernes og skålen lades henstå til afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Flyt objektglassene over i en skål med fortyndet vaskebuffer, og lad dem ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. * Kravet om brug af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering betyder, at ovnen skal have en sensor og programmer, som indledningsvis opvarmer forbehandlingsopløsningen til kogepunktet og derefter opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC), mens den forudindstillede tid tæller ned (10 (±1) minutter). På visse mikrobølgeovne med mulighed for registrering er det ikke muligt at indstille en valgfri nedtællingstid. Hvis ovnen kun har forudindstillede programmer, skal der vælges et program, som opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC) i mindst 10 (±1) minutter, og programmet skal stoppes manuelt efter 10 (±1) minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Trin 2: Pepsin, brugsklar Pepsin inkubering kan udføres enten ved stuetemperatur (20 25 C) som beskrevet under metode A), eller alternativt ved 37 C som beskreve t under metode B). Tap overskydende buffer af med lette slag. Tør med en fnugfri klud (såsom en absorberende serviet eller et stykke gaze) omhyggeligt af rundt om prøven for at fjerne overskydende væske og holde reagenserne inden for det foreskrevne område. Påfør 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) Pepsin (fla ske 2), så præparatet er dækket. Opbevar altid pepsin ved 2 8 o C. Metode A) Inkubation ved stuetemperatur Inkuber i 5 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 10 minutter vil være tilstrækkeligt for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og bør bestemmes af brugeren. Tap pepsinet af og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Metode B) Inkubation ved 37 C Placer prøven med pepsin på en varmeblok ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 3 minutter. En inkubationstid på 3 minutter vil være tilpas for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og skal bestemmes af brugeren. Tap Pepsinet af, og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Trin 3: HER2/CEN 17 probemix, brugsklar Følgende trin skal udføres i et stinkskab. Tilsæt 10 µl HER2/CEN 17 probemix (Flaske 3) til midten af vævssnittet. Læg straks et 22 mm x 22 mm dækglas over probemixen og lad det spredes jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, fjernes de ved at slå forsigtigt på dækglasset med en pincet. Forsegl dækglasset med dækglasforseglingsmidlet ved at presse dette ud i en fuge langs kanten af dækglasset. Lad Coverslip Sealant overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at dækglasforseglingsmidlet dækker hele dækglassets kant. ( ) K /DK/ULH/ s. 11/50

12 Brystcancer Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er mættede og optimale for brug. Start Hybridizer en, og vælg et program, som vil denaturere ved 82 C i 5 minutter og hybridiser natten over (14 20 timer) ved 45 C (se brugervejledningen til Dako Hybridizer ve drørende yderligere oplysninger). Placer objektglassene i Hybridizer en, sørg for, at låget er korrekt lukket, og start programmet. * Instrumenter, der gør det muligt at opnå betingelser, der svarer til de ovenfor beskrevne, kan også anvendes til denaturering og hybridisering: Placer objektglassene på en jævn overflade af metal eller sten (varmeblok eller på en blok i en hybridiseringsovn) forvarmet til 82 (±2) C. Denatu rer i 5 minutter så det sikres, at temperaturen af blokken ikke på noget tidspunkt falder til under 80 C. Anbring objektglassene i et forvarmet, hybridiseringsfugtkammer. Læg låg over kammeret og inkuber natten over (14 20 timer) ved 45 (±2) C. Bemærk, at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke er tilstrækkelig til brug med proberne i ndeholdt i dette kit. DAG 2 Trin 4: Stringensvask Fyld farveskåle, f.eks. Coplin skåle, med den fortyndede stringente vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Det anbefales at bruge mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hver skål. Placer en af farveskålene indeholdende fortyndet stringent vaskebuffer ved stuetemperatur i et stinkskab og den anden i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede stringente vaskebuffer til 65 C. Sørg for, at temperaturen er blevet stabil. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Den stringente vaskebuffer indeholder detergent og kan blive turbid ved 65 C. Dette vil ikke påvirke resultatet. Ved brug af en pincet eller handsker tages objektglassene ud af hybridiseringskammeret, dækglasforseglingsmidlet og dækglassene fjernes, og objektglassene placeres i forvaskeskålen, der har stuetemperatur, et ad gangen. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskeskålen ved stuetemperatur til skålen i vandbadet ved 65 C. Udfør stringent v ask i nøjagtig 10 minutter ved 65 C. Fjern objektglassene fra den fortyndede stringente vaskebuffer og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene tørre fuldstændigt. Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl Fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI (Flaske 5) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglas opbevares mørkt ved 2 8 C. ( ) K /DK/ULH/ s. 12/50

13 Kvalitetskontrol Bryst 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Brystcancer Normale celler bør indeholde 1 2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN 17 PNA proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler bør ligeledes indeholde 1 2 klart synlige røde signaler, der indikerer, at HER2 DNA proben har hybridiseret godt til HER2 amplikonet. På grund af vævssektionering vil nogle af de normale celler indeholde færre end de forventede 2 signaler af hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en fejlagtig analyse, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI filter. Talrige spøgelsesagtige celler og en generelt dårlig nukleær morfologi indikerer overdigestion af prøven, hvilket medfører tab eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Forskelle i vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning Bryst Evaluerbart væv: Kun prøver fra patienter med invasivt carcinom bør testes. I tilfælde hvor der findes carcinoma in situ og invasivt carcinom i samme præparat, skal kun det invasive område bedømmes. Undgå områder med nekrose og områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Spring kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund over. Tælling af signal: Lokaliser tumoren på det H&E farvede objektglas og evaluer det samme område på det FISH farvede objektglas. Scan adskillige områder af tumorceller for at tage højde for mulig heterogenesitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område idet der scannes fra venstre mod højre. Tæl antallet af signaler inden for kerneafgrænsningen af hver evaluerede kerne ifølge retningslinjerne nedenfor (se også appendiks 3). Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. Tæl to signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, som kun ét signal. I kerner med høje niveauer af HER2 genamplifikation kan HER2 signalerne være placeret meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I disse tilfælde kan antallet af HER2 signaler ikke tælles, men må i stedet estimeres. Vær særlig opmærksom på de grønne signaler, da klynger af HER2 signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved anvendelse af et specifikt FITC filter. Tæl ikke kerner uden signaler, eller med signaler af kun en farve, med. Tæl kun de kerner, der indeholder et eller flere FISH signaler af hver farve, med. ( ) K /DK/ULH/ s. 13/50

14 Tællevejledning Brystcancer 1 Skal ikke tælles. Kernerne lapper over hinanden, ikke alle kernernes områder er synlige 2 To grønne signaler. Tæl ikke kerner med kun en signalfarve med 3 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 4 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 5 Tælles ikke med (under eller overfordøjede kerner). eller Manglende signaler i centrum af kernerne (donut formede kerner). 6 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 7 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler 8 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 9 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC filter, eller tæl ikke kernen med Optegn tallene i en tabel som vist i appendiks 2. Tæl 20 kerner pr. vævsprøve, når muligt fra distinkte tumorområder (17). Beregn HER2/CEN 17 forholdet ved at dividere det totale antal røde HER2 signaler med det totale antal grønne CEN 17 signaler. Prøver med et HER2/CEN 17 forhold større end eller lig med 2 bør betragtes som HER2 genamplificerede (5, 17 19). Resultater ved eller tæt på cut off (1,8 2,2) skal fortolkes med forsigtighed. Hvis forholdet er på grænsen (1,8 2,2) tælles yderligere 20 kerner, og forholdet beregnes igen ud fra de 40 kerner. I tvivlstilfælde skal prøven tælles igen. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskeligt. ( ) K /DK/ULH/ s. 14/50

15 Brystcancer Begrænsninger Bryst 1. FISH er en diagnostisk proces omfattende mange trin, der kræver specialiseret uddannelse vedrørende valg af passende reagenser såvel som vævsselektion, fiksering, behandling og fremstilling af FISH objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Resultater af FISH er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For optimale og reproducerbare resultater skal objektglassene med vævsprøverne afparaffineres fuldstændigt. Fjernelsen af paraffin skal være fuldført ved begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSVEJLEDNING, afsnit B.2). 4. Der bør kun benyttes temperaturkalibreret vandbad, varmeblok og hybridiseringsovn. Brug af andre typer udstyr kan resultere i fordampning af HER2/CEN 17 probemix under hybridisering og skal valideres af brugeren. Præstationskarakteristika Bryst Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten af HER2 FISH pharmdx Kittet blev undersøgt i et patologisk rutinelaboratorium. 126 formalinfikserede paraffinindstøbte vævssnit blev testet ved anvendelse af den anbefalede procedure. Ud af de 126 prøver kunne 124 scores ifølge produktets vejledning, mens 2 prøver ikke kunne scores af tekniske grunde. Således var hybridiseringseffektiviteten 124/126 = 98% (20). Analytisk sensitivitet Sensitiviteten af HER2/CEN 17 probemixen blev undersøgt ved anvendelse af 1 cellelinje med og 2 cellelinjer uden amplifikation af HER2 genet. Forholdet mellem antallet af HER2 signaler og CEN 17 signaler blev beregnet baseret på tælling af 60 kerner pr. cellelinje. Den amplificerede cellelinje blev scoret som amplificeret med et gennemsnitligt forhold på 3,21, mens de 2 uamplificerede cellelinjer blev scoret som uamplificerede med et gennemsnitligt forhold på 0,96 og 1,17. Endvidere blev HER2/CEN 17 forhold for 5 vævssnit med uamplificeret HER2 gen bestemt med HER2 FISH pharmdx kittet. Hvert vævssnit blev scoret af 3 uafhængige laboratorieteknikere. Resultaterne er vist i Tabel 1. Tabel 1. HER2/CEN 17 forhold for 5 uamplificerede væv scoret af 3 uafhængige laboratorieteknikere Væv 1 Væv 2 Væv 3 Væv 4 Væv 5 Tekniker 1 0,95 1,01 1,04 1,21 1,15 Tekniker 2 1,05 1,00 0,99 1,11 1,09 Tekniker 3 1,05 1,00 0,92 1,14 1,06 Middelforhold 1,02 1,00 0,98 1,15 1,10 VK% VK: Variationskoefficient Studiet bekræftede, at alle 5 vævssnit var uamplificerede med et gennemsnitligt HER2/CEN 17 forhold tæt på 1,0. ( ) K /DK/ULH/ s. 15/50

16 Brystcancer Analytisk specificitet HER2 DNA proberne i HER2/CEN 17 probemixen er blevet ende sekvenseret og kortlagt for at bekræfte en total dækning af 218 kb inklusive HER2 genet. CEN 17 PNA proberne i HER2/CEN 17 probemixen er blevet testet hver for sig og i kombination for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. For at udelukke krydshybridisering til andre kromosomer end kromosom 17 blev der udført studier på metafasespredninger ifølge standard Dako QC procedurer. I alt 250 metafasespredninger blev evalueret for specifik hybridisering af HER2 DNA og CEN 17 PNA probemixerne. I alle 250 tilfælde var hybridiseringen specifik for kromosom 17. Der observeredes ingen krydshybridisering til andre kromosomer i nogen af de 250 tilfælde. Studier af robusthed Robustheden af HER2 FISH pharmdx analysen blev testet ved variation af forbehandlingstid og temperatur, inkubationstid med pepsin, denatureringstemperatur, hybridiseringstid og temperatur og tid og temperatur for stringent vask. Der observeredes ingen betydende forskelle i resultater ved følgende eksperimentbetingelser: Forbehandling i 7, 10 og 13 minutter kombineret med hver af temperaturerne 89, 92 og C. Pepsininkubationstider på 2, 5, 10, 15 og 18 minutter. Denatureringstemperaturer på 72, 77, 82, 87 og 92 C. Hybridiseringstider på 17 timer kombineret med temperaturerne 40, 45 og 50 C. Hybridiseringstider på 10, 12 og 14 timer ved en temperatur på 45 C. Den stringente vask blev testet i 10 minutter ved 60, 65 og 70 C. Yderligere blev den stringente vask testet i 5, 10 og 15 minutter ved 65 C. Strin gent vask i 10 minutter ved 70 C og stringent vask i 15 minutter ved 65 C resulterede i tab af s ignal, mens der ikke observeredes nogen betydende forskel i resultater ved de øvrige kombinationer af tid og temperatur. Gentagelsesnøjagtighed Gentagelsesnøjagtigheden af HER2/CEN 17 forholdet blev undersøgt med HER2 FISH pharmdx Kittet ved anvendelse af efter hinanden følgende vævssnit af normalt brystvæv og brystcarcinom. Variationskoefficienten for normalt brystvæv fandtes at være 6% og 4% for brystcarcinom. I alt 10 efter hinanden følgende vævssnit af brystcancervæv af forskellig tykkelse (duplikater af 3, 4, 5, 6 og 7 µl) blev testet med HER2 FISH pharmdx kittet. Variationskoefficienten af HER2/CEN 17 forholdet i dette studie blev fundet at være 12%, dvs. højere end for vævssnit af ens tykkelse. Reproducerbarhed HER2 FISH pharmdx kittet blev testet for lot til lot, dag til dag og observatør til observatør reproducerbarhed ved anvendelse af 3 forskellige formalinfikserede og paraffinindstøbte cellelinjer (de uamplificerede MDA 231 og MDA 175 og den HER2 genamplificerede SKBR3). Dens største variation af HER2/CEN 17 forholdet (8%) blev fundet i observatør til observatør studiet af den amplificerede cellelinje. Dette kan være forventeligt og afspejler muligvis en hvis subjektivitet i signalfortolkning og tælling. Resultaterne er udtrykt som middelforhold, standardafvigelse og variationskoefficient vist i Tabel 2 4. ( ) K /DK/ULH/ s. 16/50

17 Brystcancer Tabel 2. Lot til lot reproducerbarhed. HER2/CEN 17 forhold målt for 3 forskellige lot af HER2 FISH pharmdx kittet Cellelinje HER2/CEN 17 forhold Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 I alt MDA 231 Middel 1,06 1,04 1,07 1,06 SD 0,04 0,04 0,05 0,04 VK% N MDA 175 Middel 1,23 1,20 1,16 1,20 SD 0,02 0,05 0,07 0,06 VK% N SKBR3 Middel 3,99 3,77 3,82 3,86 SD 0,18 0,19 0,29 0,23 VK% N SD: Standardafvigelse VK: Variationskoefficient N: Antal objektglas Tabel 3. Dag til dag reproducerbarhed. HER2/CEN 17 forhold målt på 4 forskellige dage Cellelinje HER2/CEN 17 forhold Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 I alt MDA 231 Middel 1,04 1,03 1,05 0,99 1,03 SD 0,05 0,02 0,03 0,01 0,04 VK% N MDA 175 Middel 1,26 1,17 1,25 1,16 1,21 SD 0,06 0,04 0,07 0,04 0,07 VK% N SKBR3 Middel 4,30 4,59 4,56 4,09 4,39 SD 0,39 0,32 0,15 0,08 0,32 VK% N SD: Standardafvigelse VK: Variationskoefficient N: Antal objektglas Tabel 4. Observatør til observatør reproducerbarhed. HER2/CEN 17 forhold målt af 3 forskellige observatører Cellelinje HER2/CEN 17 forhold Obs. 1 Obs. 2 Obs. 3 I alt MDA 231 Middel 1,03 1,03 1,09 1,05 SD 0,02 0,08 0,05 0,06 VK% N MDA 175 Middel 1,17 1,15 1,11 1,14 SD 0,02 0,05 0,11 0,07 VK% N SKBR3 Middel 4,03 3,57 3,63 3,74 SD 0,18 0,19 0,24 0,29 CV N SD: Standardafvigelse VK: Variationskoefficient N. Antal objektglas ( ) K /DK/ULH/ s. 17/50

18 Brystcancer Analyseportabilitet For at vurdere reproducerbarheden mellem forskellige laboratorier (analyseportabilitet) udførtes et blindt, randomiseret, sammenlignende studie af HER2/CEN 17 forhold målt i 4 formalinfikserede, paraffinindstøbte brystcancerprøver involverende 5 forskellige studiesteder. De 4 prøver inkluderet i studiet repræsenterede forskellige niveauer af HER2 genamplifikation og blev udvalgt med henblik på at afspejle et naturligt område af amplifikationsforhold inklusive en uamplificeret (målt forhold 0,9 1,2), en ændret, men uamplificeret (målt forhold 1,4 1,7), en lavt amplificeret (målt forhold 3,0 4,0) og en kraftigt amplificeret (målt forhold 5,0 8,0). Hvert laboratorium farvede og fortolkede de 4 prøver i 3 separate kørsler (i alt 12 objektglas). Der blev ligeledes inkluderet en udleveret kontrol i hver kørsel. Ved stratificering af resultaterne som enten positiv eller negativ for HER2 genamplifikation (cut off forhold = 2,0) var der fuldstændig overensstemmelse mellem de 5 laboratorier, se tabel 5. Tabel 5. Sammenfatning af portabilitetsresultater Prøve HER2 negativ HER2 positiv Uamplificeret 15 0 Ændret, men uamplificeret 15 0 Lav amplifikation 0 15 Høj amplifikation 0 15 En dag til dag variation på 10% blev fundet i de 5 laboratorier for HER2/CEN 17 forholdet. En sted til sted variation for HER2/CEN 17 forholdet på cirka 10 15% blev observeret i de uamplificerede tilfælde med forhold tæt på cut off. Dette tal er i overensstemmelse med fund rapporteret i litteraturen. Der blev observeret en højere variation (25%) for den kraftigt amplificerede prøve. Dette er ligeledes i overensstemmelse med litteraturen, og denne variation betragtes ikke som værende klinisk relevant (17). Da scoringen af kraftigt amplificerede tilfælde, hvor signalerne findes i klynger, ikke kan baseres på tælling, men må baseres på en estimering af antallet af signaler, kan der forventes en høj variation i sådanne tilfælde. Klinisk anvendelighed Den kliniske anvendelighed af Dako HER2 FISH pharmdx kittet blev undersøgt i et komparativt studie med Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe kittet. Studiet inkluderede 150 arkiverede prøver fra patienter, der havde enten noduspositiv eller nodusnegativ, grad II III brystcancer. Det primære formål med studiet var at undersøge graden af konkordans mellem forholdet HER2/kromosom 17 centromer for de 150 prøver, som testet med Dako og Vysis kittene både med hensyn til den generelle overensstemmelse mellem forholdene og overensstemmelsen med de dikotomiserede FISH resultater (+/ grupper). I alt 145 prøver blev vellykket hybridiseret og scoret og var dermed egnede til statistisk analyse. En 2 x 2 krydstabulering af resultaterne er vist i Tabel 6. ( ) K /DK/ULH/ s. 18/50

19 Brystcancer Tabel 6. Dikotomiserede resultater fra 145 brystcancerprøver testet med Dako HER2 FISH pharmdx kittet og Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe kittet. 60 kerner i hver prøve blev scoret med hvert af de to kit. Dako kit ( ) amplificeret Dako kit (+) amplificeret Sum Vysis kit ( ) amplificeret Vysis kit (+) amplificeret Sum Konkordansen mellem Dako og Vysis tests var 95% med et konfidensinterval på 92 99%. Kappaværdien var 0,89. McNemars test for systematisk bias mellem de to tests var ikke signifikant (p=0,22). Figur 1 viser et scatterplot af de parrede observationer for de 145 prøver. Figur brystcancerprøver testet med for HER2 genamplifikation med Dako HER2 FISH pharmdx kittet og Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe kittet. Resultaterne er udtrykt som forholdet mellem HER2 og kromosom 17 centromer. 60 kerner i hver prøve blev scoret med hvert af de to kit. 12,00 Scatter Scatterplot of af paired parrede observations observationer DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit g Dako HER2 FISH pharmdx Kit 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit Den generelle overensstemmelse mellem Dako HER2 FISH pharmdx og Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe testene blev undersøgt ved analyse af forskellen mellem parrede observationer af logaritmen (forhold) og en lineær regressionsanalyse af logaritmen (forhold) af de to tests. Det blev konkluderet, at forskellen mellem parrede observationer af logaritmen ( ) K /DK/ULH/ s. 19/50

20 Brystcancer (forhold) systematisk øges med summen af HER2/kromosom 17 centromer forholdene, og at det målte forhold for højere forhold er højere i Dako testen end i Vysis testen. Det højere HER2/kromosom 17 centromerforhold observeret med Dako HER2 FISH pharmdx kittet kan relateres til en virkelig forskel mellem de to tests, f.eks., at en større opløsning for Dako HER2 FISH pharmdx kittet resulterer i højere forhold i tilfælde med kraftig HER2 genamplifikation. Imidlertid blev testningen af kittene udført 2 forskellige steder, og variation mellem laboratorier er forventeligt. Ydermere er der i litteraturen rapporteret om en højere variation for kraftigt amplificerede tilfælde, men dette betragtes ikke at være klinisk relevant (17). Nærværende studie tillader ikke undersøgelse for en systematisk forskel de to tests udført på mange laboratorier. Det bør tilføjes, at den observerede variation mellem de to tests er af samme størrelse som variationen mellem teststederne i portabilitetsstudiet. HER2 FISH metoden er relativt tidskrævende, hvilket hovedsageligt skyldes den konventionelle tælling af signaler i et betragteligt antal tumorceller i hver prøve. Imidlertid støtter undersætanalyse af data genereret i det komparative studie af Dako HER2 pharmdx kittet og Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe kittet anvendelse af simplificerede tællemetoder. Tabel 7 viser testresultater opnået ved analyse af 145 brystcancerprøver ved anvendelse af Dako HER2 pharmdx kittet og tælling af op til 10, 20, 30 og 60 hændelser (signaler) i mindst 6 celler i hver prøve. Endvidere viser Tabel 7 resultater af statistiske analyser af disse metoder til tælling af et fast antal hændelser sammenlignet med Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe testen og tælling af signaler i 60 celler. Det skal bemærkes, at tællingen af et fast antal antal hændelser indebærer, at der vil blive talt et relativt større antal kerner i prøver med HER2/kromosom 17 centromerforhold omkring cut off end ved kraftigt HER2 genamplificerede og dermed utvivlsomt positive prøver. Tabel 7. Konkordans og kappaværdier ved tælling af et fast antal hændelser (signaler). Sammenligning mellem tælling af 10, 20, 30 og 60 hændelser i Dako HER2 FISH pharmdx testen og tælling af signaler i 60 kerner i Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe testen. Alle 145 brystcancerprøver blev testet for HER2 genamplifikation med alle 5 metoder. Dako kit ( ) amp. Tælling af op til 10 hændelser Tælling af op til 20 hændelser Tælling af op til 30 hændelser Tælling af op til 60 hændelser Vysis kit ( ) amplificeret (N=97) (+) amp. KI: konfidensinterval N: Antal prøver Vysis kit (+) amplificeret (N=48) ( ) amp. (+) amp. Konkordans 95% KI Kappa værdi McNemars test (p værdi) ,94 0,90 0,98 0,87 0, ,94 0,90 0,98 0,87 0, ,96 0,92 0,99 0,91 0, ,97 0,93 0,99 0,92 0,19 Sammenlignet med tælling af signaler i 60 kerner forblev konkordansen og kappaværdierne uændrede, dvs. med overlappende KI for alle 4 undersøgte metoder til tælling af et fast antal hændelser. Antallet af kerner talt ved hver metode til tælling af et fast antal hændelser blev undersøgt. En sammenfatning af resultaterne er vist i Tabel 8. ( ) K /DK/ULH/ s. 20/50

21 Tabel 8. Antallet kerner talt i de 4 metoder til tælling af et fast antal hændelser. Tællemetode Median antal kerner Område antal kerner Brystcancer 90% fraktil antal kerner Tælling af op til 10 hændelser Tælling af op til 20 hændelser Tælling af op til 30 hændelser Tælling af op til 60 hændelser Muligheden for at tælle signaler i mindre end 60 kerner blev ligeledes undersøgt. Resultatet af denne analyse er vist i tabel 9. Tabel 9. Konkordans og kappaværdier ved tælling af et fast antal antal celler. Sammenligning mellem tælling af 10, 20 og 30 kerner i Dako HER2 FISH pharmdx testen og tælling af signaler i 60 kerner i Vysis PathVysion HER 2 DNA Probe testen. Alle 145 brystcancerprøver blev testet for HER2 genamplifikation med alle 4 metoder. Dako kit ( ) amp. Vysis kit ( ) amplificeret (N=97) (+) amp. Vysis kit (+) amplificeret (N=48) ( ) amp. (+) amp. Konkordans 95% KI Kappa værdi McNemars test (p værdi) Tælling af 10 kerner Tælling af 20 kerner Tælling af 30 kerner ,96 0,93 0,99 0,91 0, ,96 0,93 0,99 0,91 0, ,96 0,93 0,99 0,91 0,34 KI: konfidensinterval N: Antal prøver Sammenlignet med tælling af signaler i 60 kerner forblev konkordansen og kappaværdierne uændrede, dvs. med overlappende KI for alle 3 undersøgte metoder til tælling af 10, 20 og 30 kerner. Således støtter den statistiske analyse scoring af prøver baseret på tælling af signaler i 10 kerner. ( ) K /DK/ULH/ s. 21/50

22 Fejlfinding Bryst Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler 2. Ingen grønne signaler. 3. Ingen røde signaler. 4. Områder uden signal 1a. Kittet er blevet udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1c. Falmede signaler 1d. Forkerte forbehandlings betingelser 1e. Fordampning af probemix under hybridisering 2a. Forkerte betingelser under stringent vask 3a. Forkerte forbehandlings betingelser 4a. For lille probevolumen 4b. Luftbobler fanget under tilsætning af probemix eller montering Brystcancer 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Kontroller, om der stadig var tøris i pakken ved modtagelsen. Kontroller, at flaske 2, 3 og 5 er blevet opbevaret ved højst 2 8 C og at flaske 3 og 5 er blevet opbevaret mørkt. 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til anvendelse sammen med kittets fluorokromer og at kviksølvlampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt ud over den forventede levetid. (Se appendiks 3). I tvivlstilfælde bedes du kontakte din mikroskopleverandør. 1c. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen mod kraftigt lys. 1d. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og tid 1e. Sørg for tilstrækkelig luftfugtighed i hybridiseringskammeret 2a. Sørg for at anvende den anbefalede vasketemperatur og tid for stringent vask og at fjerne dækglas inden udførelse af stringent vask 3a. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og tid 4a. Sørg for, at probevolumenet er stort nok til at dække området under dækglasset 4b. Undgå luftbobler. Hvis sådanne observeres, bankes de forsigtigt væk med en pincet ( ) K /DK/ULH/ s. 22/50

23 Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 5. Stor baggrundsfarvning 6. Dårlig vævsmorfologi 5a. Forkert vævsfiksering 5b. Paraffinen er ikke helt fjernet 5c. For lav temperatur for stringent vask 5d. For lang tids eksponering af hybridiseret vævssnit mod for kraftigt lys 6a. Forkert behandling med pepsin 6b. Forkerte forbehandlingsbetingelser kan føre til et uklart og grumset udseende 6c. Pepsin behandling i for lang tid eller en meget tynd snittykkelse kan medføre, at der kommer spøgelsesceller eller donut celler. Brystcancer 5a Sørg for kun at anvende formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 5b. Følg de afparaffinerings og rehydreringsprocedurer, som er beskrevet i afsnit B.2 5c. Sørg for, at temperaturen for stringent vask er 65 (±2) C 5d. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen mod kraftigt lys. 6a. Følg de anbefalede Pepsin inkubationstider. Se afsnit B.3, trin 2. Sørg for at håndtere Pepsin ved den korrekte temperatur. (Se afsnit B.1) 6b. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og tid 6c. Forkort Pepsin inkubationstiden. Se afsnit B.3, trin 2. Sørg for, at vævstykkelsen er 4 6 µm. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, bedes du kontakte vores tekniske serviceafdeling for at få yderligere hjælp. ( ) K /DK/ULH/ s. 23/50

24 Brystcancer Appendiks 1 Bryst HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Protokolcheckliste Dato (Dag 1) for kørslen: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Lot: Prøve ID: Udstyrs ID: Farvekørsels log ID: Dato for fortynding/udløb af 1 x vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20): / Vævet fikseret i neutral, bufferjusteret formalin Ja Nej DAG 1 Trin 1: Forbehandling Dato for fortynding/udløb af forbehandlingsopløsning (Flaske 1 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af forbehandlingsopløsning (95 99 C) hvis der anvendes et vandbad til opvarmning. Forbehandling (10 minutter) og afkøling (15 minutter) Vask i vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Trin 2: Pepsin Varighed af behandling med pepsin (Flaske 2) ved 37 C eller Varighed af behandling med pepsin (Flaske 2) ved stuetemperatur Vask i vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i gradvist stigende ethanol og lufttør Trin 3: HER2/CEN 17 probemix Tilsæt probemix (Flaske 3), læg dækglas på og forsegl med Coverslip Sealant C Minutter Minutter Målt denatureringstemperatur (82 ± 2 C) C Denaturer i 5 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 ± 2 C) C Hybridisering natten over (beskyt mod lys) DAG 2 Trin 4: Stringensvask Dato for fortynding/udløb af stringent vaskebuffer (Flaske 4 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af stringent vaskebuffer (65 C) C Stringent vask (10 minutter) efter fjernelse af dækglas Vask i vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i gradvist stigende ethanol og lufttør Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl Fluorescensmonteringsmedium (Flaske 5) og læg dækglas på Kommentarer: Dato og underskrift, tekniker: ( ) K /DK/ULH/ s. 24/50

25 Brystcancer Appendiks 2 Bryst HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Scoringsskema Dato (Dag 1) for kørslen: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Lot: Farvekørsels log ID: Prøve ID: Kerne nr. HER2 score (rød) Tæl signaler i 20 kerner CEN 17 score (grøn) Kerne nr I alt (1 10) I alt (11 20) HER2 score (rød) CEN 17 score (grøn) Til bestemmelse af HER2/CEN 17 forholdet tælles antallet af HER2 signaler og antallet af CEN 17 signaler i de samme 20 kerner, og det totale antal HER2 signaler divideres med det totale antal CEN 17 signaler. Hvis HER2/CEN 17 forholdet er på grænsen (1,8 2,2) tælles yderligere 20 kerner, og forholdet beregnes igen. Resultater ved eller tæt på cut off (1,8 2,2) skal fortolkes med forsigtighed (se tællevejledningen). Samlet score (1 20) HER2 CEN 17 HER2/CEN 17 forhold Forholdet < 2: Der blev ikke observeret HER2 genamplifikation Forholdet 2: Der blev observeret HER2 genamplifikation Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning ( ) K /DK/ULH/ s. 25/50

26 Brystcancer Appendiks 3 Bryst HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til anvendelse sammen med HER2 FISH pharmdx Kit, K5331: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden). 3. Objektiver Til screening af vævene kan der anvendes fluorescens tør 10x eller fluorescens olieimmersion 16x objektiver. Til højeffektsforstørrelse og bedømmelse af signaler kan der kun anbefales fluorescens olieimmersion objektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtre udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler anvendelse af et specifikt DAPI filter i kombination med et højkvalitets Texas Red/FITC dobbeltfilter. DAPI filter, f.eks. Chroma filter # Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma filter # Texas Red og FITC enkelte filtre kan anvendes til bekræftelse. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt Deres mikroskopleverandør eller Deres Dako repræsentant, hvis De ønsker detaljeret information. 5. Olie Ikke fluorescerende olie. Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke. Rhodaminfiltre kan ikke anvendes. Tripelfiltre anbefales ikke. Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt rettet ind og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Man skal bestræbe sig på at udsætte prøven for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Vi anbefaler, at De diskuterer opsætningen af Deres mikroskop med producenten, eller læser litteraturen, inden De påbegynder in situ fluorescenshybridiseringen. ( ) K /DK/ULH/ s. 26/50

27 Gastrisk cancer Resumé og forklaring Gastrisk Det humane HER2 gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) er lokaliseret på kromosom 17 og koder for HER2 proteinet eller p185 HER2. HER2 proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1 2). HER2 genet er til stede i 2 kopier i alle normale diploide celler. Overekspression af HER2-proteinet og amplifikation af HER2-genet i gastrisk cancer er påvist i et stort antal undersøgelser (gennemgås i (21)). HER2 positivitet kan detekteres hos ca. 20% af patienterne ved enten IHC eller FISH (21). Prækliniske in vitro- og in vivo-undersøgelser har vist, at trastuzumab (Herceptin ) er effektivt i forskellige gastriske cancermodeller, hvilket har ført til initiering af adskillige kliniske undersøgelser (21-25). I en fase III undersøgelse BO18255, ToGA forsøget, blev HER2 positive patienter med uopererbart, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk eller gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom randomiseret til at modtage 5 FU eller capecitabin og cisplatin enten alene eller i kombination med trastuzumab. Der blev konstateret en statistisk signifikant stigning i den generelle overlevelsesfaktor (OS) hos patienter, der modtog den kombinerede behandling med trastuzumab og kemoterapi (26). Trastuzumab er et humant, monoklonalt antistof, der med høj affinitet binder sig til HER2 proteinet. Det er påvist, at det hæmmer profilerationen af humane tumorceller med overekspression af HER2 protein in vitro og in vivo (22-25). Procedureprincip Gastrisk HER2 FISH pharmdx Kit indeholder alle nødvendige reagenser til udførelse af en FISH procedure på prøver af formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i Pre Treatment Solution i 10 minutter. Det næste trin involverer proteolytisk fordøjelse ved anvendelse af brugsklart pepsin enten ved stuetemperatur eller ved en temperatur på 37 C. De n optimale pepsin inkubationstid afhænger af vævets fiksering og skal fastsættes af brugeren, men 10 minutter ved stuetemperatur eller 3 minutter ved 37 C vil være passende for de flest e prøver. Efter opvarmningen og det proteolytiske forbehandlingstrin anvender dette kit en brugsklar FISH probemix baseret på en kombination af PNA (peptidnukleinsyre) (12) og DNA teknologi. Denne probemix består af en blanding af Texas Red mærkede DNA prober, der dækker en 218 kb stor region inklusive HER2 genet på kromosom 17 og en blanding af fluoresceinmærkede PNA prober, der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17 (CEN 17). Specifik hybridisering til de to målområder resulterer i frembringelse af et distinkt rødt fluorescenssignal i hvert HER2 genlocus og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver kromosom 17 centromer. For at nedsætte baggrundsfarvning indeholder probemixen også umærkede, blokerende PNA prober. Efter en stringent vask monteres prøverne med Fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI, hvorefter de dækkes med dækglas. Ved brug af et fluorescensmikroskop udstyret med passende filtre (se appendiks 3) lokaliseres tumorcellerne, og der udføres tælling af de røde (HER2) og grønne (CEN 17) signaler. Derefter beregnes forholdet HER2/CEN 17. Normale celler i det analyserede vævssnit vil tjene som intern positiv kontrol for forbehandlings og hybridiseringseffektivitet. For detaljer, se afsnittet Fortolkning af farvning. Der henvises til det interaktive e learning program HER2 FISH pharmdx, der er udviklet med det formål, at give bioanalytikere, patologer og forskere nem adgang til akkurat og hurtig information om, hvordan der opnås optimale resultater med HER2 FISH pharmdx Kit: ( ) K /DK/ULH/ s. 27/50

28 Reagenser Gastrisk Gastrisk cancer Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet af tests er baseret på anvendelse af 5 8 dråber (250 µl pr. objektglas af Flaske 2, 10 µl pr. objektglas af Flaske 3 og 15 µl pr. objektglas af Flaske 5). Sættet indeholder materialer til 10 individuelle farvningskørsler. HER2 FISH pharmdx Kit forsendes på tøris. Som en kontrol af at sættets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af kittets komponenter kan være ufrosne. Dette vil ikke påvirke resultaterne opnået med HER2 FISH pharmdx kittet. Flaske 1 Flaske 2 Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Flaske 6 Forbehandlingsopløsning (20x) 150 ml, koncentreret 20x MES (2 [N morpholin] ethansulfonsyre) buffer. Pepsin 7,5 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0; indeholder stabilisator og et antimikrobielt stof. HER2/CEN 17 probemix 0,2 ml, brugsklar Blanding af Texas Red mærkede HER2 DNA prober og fluoresceinmærkede CEN 17 PNA prober; leveret i hybridiseringsbuffer med 45% formamid, stabilisator og umærkede, blokerende PNA prober. Stringent vaskebuffer (20x) 150 ml, koncentreret 20x SSC (saltvandsopløsning natriumcitrat) buffer med detergent. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, brugsklar Fluorescensmonteringsmedium med 100 µg/l DAPI (4,6 diamidin 2 phenylindol). Vaskebuffer (20x) 500 ml, koncentreret 20x Tris/HCl buffer. Coverslip Sealant 1 tube, brugsklar Opløsning af aftageligt forseglingsmiddel til dækglas. BEMÆRK: Alle reagenser, inklusive forbehandlingsopløsningen, den stringente vaskebuffer og Fluorescensmonteringsmedium, er formuleret specifikt til brug med dette kit. ( ) K /DK/ULH/ s. 28/50

29 Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96% Xylen eller xylenerstatninger Gastrisk cancer Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område: C) Kalibreret overfladetermometer (område: C) Dækglas (22 mm x 22 mm) Pincet Stinkskab Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* Objektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas (se Klargøring af prøve) Farveskåle eller bade Timer (i stand til 2 15 minutters intervaller) Vandbad med låg (der kan holde 65 C til 99 C) Mikrobølgeovn med mulighed for registrering, hvis der udføres forbehandling ved hjælp af en mikrobølgeovn (se B3. Farvningsprotokol. Trin 1: Forbehandling, Metode B) * Varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (82 (±2) C) og hybridisering (45 (±2) C) sammen med et fugtighedskammer til hybridisering kan anvendes som alternativ til Dako Hybridizer. Mikroskopudstyr og tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbeltfilter eller FITC og Texas Red monofiltre se appendiks 3 for detaljer Fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvlampe anbefales Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende) Forholdsregler Gastrisk 1. Anvendes til in vitro diagnostik 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, forbehandlingsopløsning (20x), indeholder 1 <20% 2 morpholinoethansulfonsyre; Flaske 2, pepsin, indeholder 5 10% propan 2 ol; Flaske 4, stringent vaskebuffer (20x), indeholder 1 <5% octoxinol; og Flaske 6, vaskebuffer (20x), indeholder 1 <20% trometamol. Disse stoffer kræver ingen faremærkater ved de pågældende koncentrationer. Sikkerhedsdatablade (MSDS er) til professionelle brugere kan rekvireres. 4. Flaske 2, Pepsin, indeholder pepsin A, som kan medføre en allergisk reaktion. 5. Flaske 3, HER2/CEN 17 probemix indeholder 45% formamid og er mærket: Giftigt. R61 Kan give fosterskader. S45 Ved uheld eller ved ildebefindende skal der straks søges lægehjælp (vis etiketten, hvis det er muligt). S53 Undgå enhver kontakt indhent særlige anvisninger inden brug. S60 Dette materiale og emballagen skal bortskaffes som farligt affald. Som en generel regel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Material Safety Data Sheet (MSDS)) for yderligere oplysninger. ( ) K /DK/ULH/ s. 29/50

30 Gastrisk cancer 6. Dækglasforseglingsmidlet indeholder % naphtha (petroleum), let hydrobehandlet, og er mærket: Yderst brandfarligt. Miljøfarligt. R11 Meget brandfarlig. R51/53 Giftig for organismer, der lever i vand; kan forårsage uønskede langtidsvirkninger i vandmiljøet. S9 Emballagen skal opbevares på et godt ventileret sted. S16 Holdes væk fra antændelseskilder Rygning forbudt. S35 Materialet og dets beholder skal bortskaffes på en sikker måde. S57 Skal indesluttes forsvarligt for at undgå miljøforurening. S 61 Undgå udledning til miljøet. Se særlig vejledning/sikkerhedsdatablad. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Material Safety Data Sheet (MSDS)) for yderligere oplysninger. 7. Prøver, før og efter fiksering, og alle materialer, der har været eksponeret mod disse, skal håndteres som smittefarlige og skal bortskaffes under iagttagelse af passende forholdsregler (16). Pipetter aldrig med munden, og undgå at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenserne kommer i kontakt med følsomme områder, skylles der med rigeligt vand. 8. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlagtige resultater. 9. Andre inkubationstider og temperaturer eller metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 10. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på prøverne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. 11. Undgå fordampning af HER2/CEN 17 probemix under hybridiseringen ved at sikre tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 12. Reagensernes fortynding er optimeret. Yderligere fortynding kan medføre manglende effektivitet. 13. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Material Safety Data Sheet (MSDS)) for yderligere oplysninger. 14. Det er på grund af de gastriske cancerpræparaters heterogene natur vigtigt at foretage en grundig scanning af hele præparatet for at evaluere signalfordelingen, inden området for signaltælling vælges. 15. Evaluering af meget små præparater anbefales ikke (dvs. at præparaterne skal have intakt morfologi og tilstrækkelige kerner til tælling). 16. Hvis der udføres en HER2 FISH-analyse på et biopsipræparat, skal der analyseres flere (7-8) vurderbare biopsier fra forskellige regioner af tumoren for at sikre, at HER2-status bestemmes korrekt. 17. Det er vigtigt at inspicere det H&E-farvede objektglas mhp. identifikation af alle vævskerner i et biopsipræparat. Opbevaring Gastrisk Opbevares mørkt ved 2 8 C. Alle reagenser tåler opbevaring i fryser. Frysning og optøning af reagenserne inden hver analyse påvirker ikke resultaterne. Pepsin, HER2/CEN 17 probemix og Fluorescensmonteringsmedium (Flaske 2, 3 og 5) kan påvirkes alvorligt hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse reagenser ved stuetemperatur. HER2/CEN 17 probemix og Fluorescensmonteringsmedium (Flaske 3 og 5) kan påvirkes alvorligt hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. Anvend ikke kittet efter udløbsdatoen angivet på kittets beholder. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er specificeret på indlægssedlen, skal brugeren verificere reagensernes ydeevne (13). ( ) K /DK/ULH/ s. 30/50

31 Gastrisk cancer Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HER2 FISH pharmdx kittet. Klargøring af prøver Gastrisk Præparater fra gastrisk eller gastro-esofageal overgangs-adenocarcinom fra biopsier, excisioner eller resektioner skal håndteres for at bevare vævet til FISH-analyse. Der bør anvendes standardmetoder til behandling af væv til immuncytokemisk farvning for alle prøver (14). Ved test af små biopsipræparater fastslås intakt tumormorfologi og tilstedeværelsen af tilstrækkelige tumorceller for signaltælling. Hvis der udføres en HER2 FISH-analyse på et biopsipræparat, skal der analyseres flere (7-8) biopsier fra forskellige regioner af tumoren for at sikre, at HER2-status bestemmes korrekt. Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er paraffinindstøbte og konserveret i neutral bufferet formalin, egner sig. Præparater skal for eksempel skæres ud i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i neutral bufferet formalin. Biopsipræparaterne blev fikseret i 6-8 timer under ToGAforsøget (forsøgsreferencen findes under (26)). Derefter dehydreres vævet i en serie af gradvist stigende % ethanol og xylen efterfulgt af infiltrering af smeltet paraffin, der ikke er mere end 60 C varmt. Korrekt fikseret og indstøbt væv vil holde sig uendeligt inden sektionering og montering på objektglas, hvis det opbevares koldt (15 25 C) (14, 15). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævssnit skal skæres i en tykkelse på 3 6 µm. Objektglassene nødvendige til analyse for HER2 genamplifikation og bekræftelse på tilstedeværelse af tumor bør klargøres samtidigt. Det anbefales at anvende mindst 2 serielle snit, 1 snit til bekræftelse af tilstedeværelse af tumor farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E stain) og 1 snit til analyse for HER2 genamplifikation. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas. Prøverne bør analyseres inden for 4 6 måneder efter sektionering hvis opbevaret ved stuetemperatur (20 25 C). BRUGSVEJLEDNING Gastrisk A. Klargøring af reagens Gastrisk Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Forbehandlingsopløsning Der kan være krystaller i flaske 1, men de opløses ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 1 (forbehandlingsopløsning 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér opløsningen, hvis den er uklar. A.2 Stringent vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 4 (stringent vaskebuffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér fortyndet buffer, hvis de n er uklar. A.3 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 6 (vaskebuffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Ethanolserie Ud fra en opløsning af 96% ethanol fremstilles 3 kar med henholdsvis 70%, 85% og 96% ethanol. Opbevar de lukkede kar ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kassér opløsningerne, hvis de er uklare. ( ) K /DK/ULH/ s. 31/50

32 B. Farvningsprocedure Gastrisk Gastrisk cancer B.1 Procedurebemærkninger Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og blive fortrolig med alle komponenterne inden brug (se Forholdsregler). Hvis kittets komponenter opbevares i fryser, anbefales det, at reagenserne sættes i køleskab (2 8 C) dagen inden udførelsen af analyse for at m uliggøre korrekt temperaturudligning. Alle reagenser skal ækvilibreres til den relevante temperatur inden brug som følger: Flaske 1: Den fortyndede forbehandlingsopløsning bør ækvilibreres til C, hvis forbehandlingen udføres ved hjælp af et vandbad (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode A). Hvis der anvendes en mikrobølgeovn med mulighed for registrering til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode B), skal den fortyndede forbehandlingsopløsning ækvilibreres til stuetemperatur C. Flaske 2: Pepsin skal anvendes ved 2 8 C og holdes koldt konstant. Flaske 3: HER2/CEN 17 probemix kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 til 25 C. Flaske 4: Den fortynder stringente vaskebuffer; ét kar skal ækvilibreres til stuetemperatur, et andet kar til 65 C inden brug. Flaske 5: Fluorescensmonteringsmedium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 til 25 C. Flaske 6: Den fortyndede vaskebuffer bør ækvilibreres til stuetemperatur C. Dækglasforseglingsmidlet kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 til 25 C. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren indbefatter et antal dehydreringer efterfulgt af tørring af vævssnittene. Sørg for, at vævssnittene er helt tørre inden der fortsættes til næste trin. Vævssnittene må ikke tørre ud under de øvrige trin i proceduren. Hvis farvningsproceduren skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i vaskebuffer efter afparaffineringstrinnet i op til 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at dette påvirker resultaterne. B.2 Behandling af væv inden farvning Afparaffinering og rehydrering: Inden udførelse af analysen skal vævsobjektglassene afparaffineres for at fjerne indstøbningsmedium og rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i 96% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i 70% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit B.3, trin 1, Forbehandling. Xylen og alkoholopløsninger bør udskiftes efter 200 objektglas eller tidligere. Xylenerstatninger kan anvendes. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturer kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. ( ) K /DK/ULH/ s. 32/50

33 B.3 Farvningsprotokol Gastrisk cancer DAG 1 Trin 1: Forbehandling Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A) eller alternativt ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B). Metode A) Forbehandling ved hjælp af vandbad: Fyld farveskåle, f.eks. Coplin skåle, med den fortyndede forbehandlingsopløsning (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.1). Anbring farvningskarrene med Pre Treatment Solution i vandbad. Opvarm vandbadet og forbehandlingsopløsningen til C. Mål temperaturen inde i skålen med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Sæt låg på karrene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede Pre Treatment Solution i farvningskarrene. Kontroller temperaturen igen og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. Fjern hele skålen med objektglas fra vandbadet. Fjern låget og giv objektglassene lov til at køle af i forbehandlingsopløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Metode B) Forbehandling med mikrobølgeovn med mulighed for registrering: Fyld en plastskål med fortyndet forbehandlingsopløsning ved stuetemperatur (20 25 C). Nedsænk de afparaffinerede snit i forbehandlingsopløsning, dæk skålen med et låg med ventilationshuller, og placer den i mikrobølgeovnen. Aktivér kogepunktssensoren, og vælg et program, der kører i 10 minutter efter at temperaturen er nået op på kogepunktet*. Efter de 10 minutters inkubation tages skålen med objektglas ud af ovnen, låget fjernes og skålen lades henstå til afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Flyt objektglassene over i en skål med fortyndet vaskebuffer, og lad dem ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. * Kravet om brug af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering betyder, at ovnen skal have en sensor og programmer, som indledningsvis opvarmer forbehandlingsopløsningen til kogepunktet og derefter opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC), mens den forudindstillede tid tæller ned (10 (±1) minutter). På visse mikrobølgeovne med mulighed for registrering er det ikke muligt at indstille en valgfri nedtællingstid. Hvis ovnen kun har forudindstillede programmer, skal der vælges et program, som opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC) i mindst 10 (±1) minutter, og programmet skal stoppes manuelt efter 10 (±1) minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Trin 2: Pepsin, brugsklar Pepsin inkubering kan udføres enten ved stuetemperatur (20 25 C) som beskrevet under metode A), eller alternativt ved 37 C som beskreve t under metode B). Tap overskydende buffer af med lette slag. Tør med en fnugfri klud (såsom en absorberende serviet eller et stykke gaze) omhyggeligt af rundt om prøven for at fjerne overskydende væske og holde reagenserne inden for det foreskrevne område. Påfør 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) Pepsin (fla ske 2), så præparatet er dækket. Opbevar altid pepsin ved 2 8 C. Metode A) Inkubation ved stuetemperatur Inkuber i 5 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 10 minutter vil være tilstrækkeligt for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og bør bestemmes af brugeren. Tap pepsinet af og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. ( ) K /DK/ULH/ s. 33/50

34 Gastrisk cancer Metode B) Inkubation ved 37 C Placer prøven med pepsin på en varmeblok ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 3 minutter. En inkubationstid på 3 minutter vil være tilstrækkeligt for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og bør bestemmes af brugeren. Tap Pepsinet af, og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Trin 3: HER2/CEN 17 probemix, brugsklar Følgende trin skal udføres i et stinkskab. Tilsæt 10 µl HER2/CEN 17 probemix (Flaske 3) til midten af vævssnittet. Læg straks et 22 mm x 22 mm dækglas over probemixen og lad det spredes jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, fjernes de ved at slå forsigtigt på dækglasset med en pincet. Forsegl dækglasset med dækglasforseglingsmidlet ved at presse dette ud i en fuge langs kanten af dækglasset. Lad Coverslip Sealant overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at dækglasforseglingsmidlet dækker hele dækglassets kant. Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er mættede og optimale for brug. Start Hybridizer en, og vælg et program, som vil denaturere ved 82 C i 5 minutter og hybridiser natten over (14 20 timer) ved 45 C (se brugervejledningen til Dako Hybridizer ve drørende yderligere oplysninger). Placer objektglassene i Hybridizer en, sørg for, at låget er korrekt lukket, og start programmet. * Instrumenter, der gør det muligt at opnå betingelser, der svarer til de ovenfor beskrevne, kan også anvendes til denaturering og hybridisering: Placer objektglassene på en jævn overflade af metal eller sten (varmeblok eller på en blok i en hybridiseringsovn) forvarmet til 82 (±2) C. Denatu rer i 5 minutter så det sikres, at temperaturen af blokken ikke på noget tidspunkt falder til under 80 C. Anbring objektglassene i et forvarmet, hybridiseringsfugtkammer. Læg låg over kammeret og inkuber natten over (14 20 timer) ved 45 (±2) C. Bemærk, at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke er tilstrækkelig til brug med proberne i ndeholdt i dette kit. DAG 2 Trin 4: Stringensvask Fyld farveskåle, f.eks. Coplin skåle, med den fortyndede stringente vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Det anbefales at bruge mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hver skål. Placer en af farveskålene indeholdende fortyndet stringent vaskebuffer ved stuetemperatur i et stinkskab og den anden i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede stringente vaskebuffer til 65 C. Sørg for, at temperaturen er blevet stabil. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Den stringente vaskebuffer indeholder detergent og kan blive turbid ved 65 C. Dette vil ikke påvirke resultatet. Ved brug af en pincet eller handsker tages objektglassene ud af hybridiseringskammeret, dækglasforseglingsmidlet og dækglassene fjernes, og objektglassene placeres i forvaskeskålen, der har stuetemperatur, et ad gangen. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskeskålen ved stuetemperatur til skålen i vandbadet ved 65 C. Udfør stringent v ask i nøjagtig 10 minutter ved 65 C. ( ) K /DK/ULH/ s. 34/50

35 Gastrisk cancer Fjern objektglassene fra den fortyndede stringente vaskebuffer og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene tørre fuldstændigt. Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl Fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI (Flaske 5) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglas opbevares mørkt ved 2 8 C. Kvalitetskontrol Gastrisk 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Normale celler bør indeholde 1 2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN 17 PNA proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler bør ligeledes indeholde 1 2 klart synlige røde signaler, der indikerer, at HER2 DNA proben har hybridiseret godt til HER2 amplikonet. På grund af vævssektionering vil nogle af de normale celler indeholde færre end de forventede 2 signaler af hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en fejlagtig analyse, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI filter. Talrige spøgelsesagtige celler og en generelt dårlig nukleær morfologi indikerer overdigestion af prøven, hvilket medfører tab eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Det mindste antal evaluerbare tumorceller er Forskelle i vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning Gastrisk Evaluerbart væv: Lokaliser tumoren på det HE farvede objektglas og evaluer det samme område på det FISH farvede objektglas (i DAPI filteret). Kun præparater fra patienter med gastrisk eller gastroesofageal overgangs-adenocarcinom bør analyseres. I tilfælde med intestinal metaplasi og adenocarcinom i samme præparat skal kun carcinomkomponenten bedømmes. Undgå områder med kraftig inflammation, nekrose og områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Medtag ikke kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund. Begynd med mikroskopisk evaluering af det komplette FISH-farvede snit og det tildelte område på H&E-snittet, henholdsvist. Inden optælling af det FISH-farvede objektglas noteres den generelle signalfordeling (homogen eller heterogen) på arket til signaltælling. I tilfælde af heterogen fordeling noteres det, hvorvidt der forekommer fokal amplifikation eller enkeltcelleamplifikation (mosaik). 1) Homogen signalfordeling Såfremt signalfordelingen er homogen, tælles henholdsvis antallet af kromosomcentromerer (grønne signaler) og antallet af HER2 gener (røde signaler) fra 20 celler i 1 2 repræsentative tumorområder. ( ) K /DK/ULH/ s. 35/50

36 Gastrisk cancer 2) Heterogen signalfordeling I tilfælde, hvor signaltællingen er heterogen, optælles i alt 20 celler fra udvalgte områder, som anført nedenfor: A) Hvis der er fokal amplifikation, skal der udvælges områder med amplificerede celler. B) I tilfælde af mosaikfordeling eller forekomst af amplificerede, polysomale og disomale celler tælles der i områder med amplificerede celler. Inden for disse områder skal ikke kun amplificerede celler men også de tilstødende uamplificerede celler tælles til et samlet antal på 20 celler. Undgå om muligt at udvælge overlappende områder. Ignorer farvning af bakterielt DNA Et antal specialiserede celler (mastceller og makrofager) spredt i det gastriske væv udviser et højt farvningsniveau ved HER2 proben på grund af forekomsten af bakterielt DNA. Dette resulterer i røde fluorescente celler, der tydeligt adskiller sig fra tumorceller med høj HER2 genamplifikation. Signaltælling Når et område er blevet udvalgt til signalevaluering, skal analysen startes i én af de 20 tilstødende valgte kerner, og derefter skal tælling foretages celle for celle, hvor der kun ses bort fra kerner, der ikke opfylder kvalitetskriteriet. Tæl antallet af signaler inden for den nukleære grænse for hver evalueret kerne i henhold til nedenstående vejledning (se ligeledes Appendiks 7). - Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. - Tæl to signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand (lig med eller) mindre end diameteren af signalet, som kun ét signal. Afstanden skal mindst være lig med diameteren af ét signal af normal størrelse for at tælle to individuelle signaler. Når afstanden mellem to signaler er mindre end diameteren af et signal, skal det tælles som ét. - I kerner med høje niveauer af HER2 genamplifikation kan HER2 signalerne være placeret meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I disse tilfælde kan antallet af HER2 signaler ikke tælles, men må i stedet estimeres. Vær særlig opmærksom på de grønne signaler, da klynger af røde HER2 signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved anvendelse af et specifikt FITC filter. Tæl ikke kerner uden signaler, eller med signaler af kun én farve, med. Tæl kun de kerner, der indeholder ét eller flere FISH signaler af hver farve, med. Tællevejledning 1 Skal ikke tælles. Kernerne lapper over hinanden, ikke alle kernernes områder er synlige 2 To grønne signaler. Tæl ikke kerner med kun en signalfarve med 3 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 4 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 5 Tælles ikke med (under eller overfordøjede kerner). eller Manglende signaler i centrum af kernerne (donut formede kerner). ( ) K /DK/ULH/ s. 36/50

37 Gastrisk cancer 6 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 7 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler 8 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 9 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC filter, eller tæl ikke kernen med Optegn tallene i en tabel som vist i Appendiks 5 og 6. Tæl 20 kerner pr. vævsprøve, når det er muligt, fra distinkte tumorområder. Beregn HER2/CEN 17 forholdet ved at dividere det totale antal røde HER2 signaler med det totale antal grønne CEN 17 signaler. Prøver med et HER2/CEN 17 forhold større end eller lig med 2 bør betragtes som HER2 genamplificerede (27). Resultater ved eller tæt på cut off (1,8 2,2) skal fortolkes med forsigtighed. Hvis forholdet er på grænsen (1,8 2,2) tælles yderligere 40 kerner, og forholdet beregnes igen ud fra de 40 kerner. Hvis tællingen stadig er på grænsen, er resultatet af den anden evaluering gyldigt. En immunhistokemisk farvning af HER2 skal i givet fald indbefattes for bedre orientering under den anden tælling. I tvivlstilfælde skal prøven tælles igen. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskeligt. Begrænsninger Gastrisk 1. FISH er en diagnostisk proces omfattende mange trin, der kræver specialiseret uddannelse vedrørende valg af passende reagenser såvel som vævsselektion, fiksering, behandling og fremstilling af FISH objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Resultater af FISH er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For optimale og reproducerbare resultater skal objektglassene med vævsprøverne afparaffineres fuldstændigt. Fjernelsen af paraffin skal være fuldført ved begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSVEJLEDNING, afsnit B.2). 4. Der bør kun benyttes temperaturkalibreret vandbad, varmeblok og hybridiseringsovn. Brug af andre typer udstyr kan resultere i fordampning af HER2/CEN 17 probemix under hybridisering og skal valideres af brugeren. ( ) K /DK/ULH/ s. 37/50

38 Præstationskarakteristika Gastrisk Baggrund Gastrisk cancer Sikkerheden og effektiviteten ved trastuzumab (Herceptin ) er blevet påvist i en klinisk undersøgelse (ToGA forsøget) (26). Undersøgelsen blev udformet som en open labeled, randomiseret, multicenter fase III undersøgelse af HER2 positive patienter med med uopererbart, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk eller gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom. I ToGA forsøget var HER2 positivitet defineret som enten værende IHC positiv (3+) (HercepTest, Dako) og/eller positiv ved HER2 FISH (HER2/CEN-17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Patienterne blev efter inklusion i undersøgelsen randomiseret til at modtage kemoterapi (5 FU eller capecitabin og cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Det primære endepunkt i undersøgelsen var generel overlevelse (OS). Der blev i alt randomiseret 594 patienter i undersøgelsen, og 584 patienter modtog undersøgelsens medicin og blev inkluderet i hele analysens sæt (FAS). For det primære endepunkt viste kombinationen af kemoterapi plus trastuzumab sig at være statistisk bedre end kemoterapi alene. Den mediane OS steg fra 11,1 til 13,8 måneder (p=0,0046) med en hazard ratio på 0,74 (95% CI: 0,60 0,91). Kaplan Meier kurverne for OS vises i Figur 2. Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 Logrank-test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (måneder) Antal overlevende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 2. Kaplan Meier kurve for OS (n=584). Der blev udført præspecificerede eksploratoriske undergruppeanalyser af HER2 status, efter dataene var tilgængelige, og derudover blev to nye HER2 undergrupper defineret post-hoc, baseret på IHC scoring: Gruppe 1 ( gruppe med lav HER2 ekspression ): Gruppe 2 ( gruppe med høj HER2 ekspression ): IHC 0/FISH+ og IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ og IHC 3+ (FISH+ eller FISH - eller FISH intet resultat) (n=446) ( ) K /DK/ULH/ s. 38/50

39 Gastrisk cancer Når den primære analyse af OS blev gentaget post-hoc for gruppen med høj HER2 ekspression (n=446), var fordelene for den kombinerede behandling endnu større. Den mediane OS for gruppen af patienter, der havde modtaget kemoterapi plus trastuzumab, steg til 16,0 måneder sammenlignet med 11,8 måneder for patienterne på kemoterapi alene. Hazard ratio for denne analyse faldt til 0,65 (95% CI: 0,51 0,83). Kaplan Meier kurverne for OS for gruppen med høj HER2 ekspression vises i Figur 3. Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (måneder) Antal overlevende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 3. Kaplan Meier kurve for OS for gruppen med høj HER2 ekspression (n=446). BO18255-forsøget demonstrerede den kliniske anvendelse af både HercepTest og HER2 FISH pharmdx Kit til vurdering af HER2-status hos patienter med med uopererbart, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk eller gastroøsofagealt overgangsadenokarcinom. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet for HER2/CEN 17 probemixen blev undersøgt ved anvendelse af 18 gastrisk cancer adenocarcinompræparater. Forholdet mellem antallet af HER2 signaler og CEN 17 signaler blev beregnet baseret på en tælling af 20 kerner fra normale celler omkring tumoren. HER2/CEN-17-forholdet blev bedømt til mellem 0,1 og 1,09, hvilket var inden for de prædefinerede godkendelseskriterier. Analytisk specificitet HER2 DNA proberne i HER2/CEN 17 probemixen er blevet ende sekvenseret og kortlagt for at bekræfte en total dækning af 218 kb inklusive HER2 genet. CEN 17 PNA proberne i HER2/CEN 17 probemixen er blevet testet hver for sig og i kombination for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. Der blev for at udelukke krydshybridisering til andre kromosomer end kromoson 17 udført undersøgelser på metafasespredninger. I alt 250 metafasespredninger blev evalueret for specifik hybridisering af HER2 DNA og CEN 17 PNA probemixerne. I alle 250 tilfælde var hybridiseringen specifik for kromosom 17. Der observeredes ingen krydshybridisering til andre kromosomer i nogen af de 250 tilfælde. ( ) K /DK/ULH/ s. 39/50

40 Gastrisk cancer Studier af robusthed Robustheden af HER2 FISH pharmdx analysen blev testet ved variation af forbehandlingstid og temperatur, inkubationstid med pepsin, denatureringstemperatur, hybridiseringstid og temperatur og tid og temperatur for stringent vask og bufferkoncentration. Der observeredes ingen betydende forskelle i resultater ved følgende eksperimentbetingelser: Forbehandling i 7, 9, 10, 11 og 13 minutter ved ºC. Forbehandling ved 89, 92 og ºC i 10 minutter. Pepsin inkubationstider på 2, 2½, 3 og 4 minutter ved 37 ºC. Denatureringstemperaturer på 72, 77, 82, 87 og 92 ºC i 5 minutter. Hybridiseringstider på 10, 12 og 14 timer. Hybridiseringstemperaturer på 40, 45 og 50 ºC. Stringent vask i 5, 10 og 15 minutter ved 65 ºC. Stringent vask i 60, 65 og 70 ºC i 10 minutter. Bufferkoncentration for stringent vask på 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 og 1:40. Bemærk: For robusthedstests blev kun ét parameter i farvningen ændret ad gangen, mens de andre parametre forblev konstante. Det anbefales, at tid og temperaturer, der er indikeret i farvningsproceduren, følges. Gentagelsesnøjagtighed Gentagelsesnøjagtigheden af HER2/CEN 17 forholdet blev undersøgt med HER2 FISH pharmdx kittet ved anvendelse af 3 konsekutive vævssnit fra 9 forskellige gastrisk cancer adenocarcinompræparater. Variationskoefficienten blev fundet at være 1 5% indenfor de prædefinerede godkendelseskriterier. Gentagelsesnøjagtigheden på konsekutive snit af gastriske adenocarcinompræparater (IHC HER2 2+) af forskellig tykkelse (2-7 µm) blev testet med HER2 FISH pharmdx kittet. Variationskoefficienten af HER2/CEN-17-forholdet i denne undersøgelse blev fundet at være 2 6%, dvs. i samme område som for vævssnit af lignende tykkelse og inden for de prædefinerede godkendelseskriterier. Reproducerbarhed Reproducerbarheden dag-til-dag, sted-til-sted og observatør-til-observatør blev testet ved brug af HER2 FISH pharmdx Kit. Snit fra 24 forskellige gastriske cancerpræparater taget fra mave (75%) eller gastro-esofageal overgang (25%) blev farvet og analyseret på fem ikke på hinanden følgende dage af to observatører på tre steder. Dette resulterede i et samlet antal på 720 signaltællinger af HER2/CEN-17-forholdet (se tabel 10). Præparaterne repræsenterede kirurgiske resektioner (70%) og biopsier (30%) med ens antal af uamplificerede, IHC 2+ (bestemt af HercepTest ) og amplificerede præparater. Tabel 10. HER2/CEN-17-forholdbestemmelser fra 720 signaltællinger Sted Et Observatører Sted To Observatører Sted Tre Observatører A B C D E F I alt Dag Dag Dag Dag Dag I alt ( ) K /DK/ULH/ s. 40/50

41 Gastrisk cancer Den gennemsnitlige CV (standardafvigelse / middelværdi x 100) for HER2/CEN-17-forholdet bestemt for hver observatør fra de otte præparater i hver kategori (fem observationer pr. blok) ses i tabel 11. De samlede gennemsnitlige CV'er for hver observatør var henholdsvist 5,4%, 3,8%, 12,0%, 11,9%, 4,7% og 24,4% (tabel 11). De gennemsnitlige CV'er bestemt i hver kategori for alle kombinerede observationer (dage, steder, observatører) var henholdsvist 22,8%, 16,5% og 25,2% i den uamplificerede, IHC 2+ og den amplificerede kategori. Tabel 11. Den gennemsnitlige dag-til-dag CV (%) for hver observatør og den gennemsnitlige CV (%) for alle optællinger i de tre kategorier. Gennemsnitlige CV'er (%) Sted Et Observatører Sted To Observatører Sted Tre Observatører A B C D E F Alle steder Alle observatører Uamplificeret 5,4 4,7 8,1 16,3 3,1 20,6 22,8 IHC 2+ 6,2 3,9 8,9 7,5 4,5 17,2 16,5 Amplificeret 4,7 2,9 19,1 11,9 6,6 35,3 25,2 Alle kategorier 5,4 3,8 12,0 11,9 4,7 24,4 21,5 Tabel 11 viser den gennemsnitlige CV (%) for hver observatør på de tre steder (dag-til-dag variation) for bestemmelser af HER2/CEN-17-forhold. I den sidste kolonne angives den gennemsnitlige CV (%) for alle bestemmelser foretaget for hvert præparat i de tre kategorier. Ved brug af komponentmodeller for statistisk varians blev det fundet, at variationen tilknyttet selve præparatet bidrog til langt størstedelen af dag-til-dag-, sted-til-sted- og observatør-til-observatør-variationen. Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten for HER2 FISH pharmdx Kit blev undersøgt som en del af reproducerbarhedsundersøgelsen. Af de i alt 360 formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit, der blev testet på de tre undersøgelsessteder, kunne 358 optælles i henhold til produktets retningslinjer. Hybridiseringseffektiviteten var således 99,4%. ( ) K /DK/ULH/ s. 41/50

42 Fejlfinding Gastrisk Gastrisk cancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler 2. Ingen grønne signaler. 3. Ingen røde signaler. 4. Områder uden signal 1a. Kittet er blevet udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1c. Falmede signaler 1d. Forkerte forbehandlings betingelser 1e. Fordampning af probemix under hybridisering 2a. Forkerte betingelser under stringent vask 3a. Forkerte forbehandlings betingelser 4a. For lille probevolumen 4b. Luftbobler fanget under tilsætning af probemix eller montering 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Kontroller, om der stadig var tøris i pakken ved modtagelsen. Kontroller, at flaske 2, 3 og 5 er blevet opbevaret ved højst 2 8 C og at flaske 3 og 5 er blevet opbevaret mørkt. 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til anvendelse sammen med kittets fluorokromer og at kviksølvlampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt ud over den forventede levetid. (Se appendiks 7). I tvivlstilfælde bedes du kontakte din mikroskopleverandør. 1c. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen mod kraftigt lys. 1d. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og tid 1e. Sørg for tilstrækkelig luftfugtighed i hybridiseringskammeret 2a. Sørg for at anvende den anbefalede vasketemperatur og tid for stringent vask og at fjerne dækglas inden udførelse af stringent vask 3a. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og tid 4a. Sørg for, at probevolumenet er stort nok til at dække området under dækglasset 4b. Undgå luftbobler. Hvis sådanne observeres, bankes de forsigtigt væk med en pincet ( ) K /DK/ULH/ s. 42/50

43 5. Stor baggrundsfarvning 6. Dårlig vævsmorfologi 5a. Forkert vævsfiksering 5b. Paraffinen er ikke helt fjernet 5c. For lav temperatur for stringent vask 5d. For lang tids eksponering af hybridiseret vævssnit mod for kraftigt lys 6a. Forkert behandling med pepsin 6b. Forkerte forbehandlingsbetingelser kan føre til et uklart og grumset udseende 6c. Pepsin behandling i for lang tid eller en meget tynd snittykkelse kan medføre, at der kommer spøgelsesceller eller donut celler. Gastrisk cancer 5a Sørg for kun at anvende formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 5b. Følg de afparaffinerings og rehydreringsprocedurer, som er beskrevet i afsnit B.2 5c. Sørg for, at temperaturen for stringent vask er 65 (±2) C 5d. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen mod kraftigt lys. 6a. Følg de anbefalede Pepsin inkubationstider. Se afsnit B.3, trin 2. Sørg for at håndtere Pepsin ved den korrekte temperatur. (Se afsnit B.1) 6b. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og tid 6c. Forkort Pepsin inkubationstiden. Se afsnit B.3, trin 2. Sørg for, at vævstykkelsen er 3 6 µm. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, bedes du kontakte vores tekniske serviceafdeling for at få yderligere hjælp. ( ) K /DK/ULH/ s. 43/50

44 Gastrisk cancer Appendiks 4 Gastrisk HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Protokolcheckliste Dato (Dag 1) for kørslen: HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Lot: Prøve ID: Udstyrs ID: Farvekørsels log ID: Dato for fortynding/udløb af 1 x vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20): / Vævet fikseret i neutral, bufferjusteret formalin Ja Nej DAG 1 Trin 1: Forbehandling Dato for fortynding/udløb af forbehandlingsopløsning (Flaske 1 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af forbehandlingsopløsning (95 99 C) hvis der anvendes et vandbad til opvarmning. Forbehandling (10 minutter) og afkøling (15 minutter) Vask i vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Trin 2: Pepsin Varighed af behandling med pepsin (Flaske 2) ved 37 C eller Varighed af behandling med pepsin (Flaske 2) ved stuetemperatur Vask i vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i gradvist stigende ethanol og lufttør Trin 3: HER2/CEN 17 probemix Tilsæt probemix (Flaske 3), læg dækglas på og forsegl med Coverslip Sealant C Minutter Minutter Målt denatureringstemperatur (82 ± 2 C) C Denaturer i 5 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 ± 2 C) C Hybridisering natten over (beskyt mod lys) DAG 2 Trin 4: Stringensvask Dato for fortynding/udløb af stringent vaskebuffer (Flaske 4 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af stringent vaskebuffer (65 C) C Stringent vask (10 minutter) efter fjernelse af dækglas Vask i vaskebuffer (Flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i gradvist stigende ethanol og lufttør Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl Fluorescensmonteringsmedium (Flaske 5) og læg dækglas på Kommentarer: Hours Dato og underskrift, tekniker: ( ) K /DK/ULH/ s. 44/50

45 Gastrisk cancer Appendiks 5 Gastrisk HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Scoringsskema HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 lot: Dato (Dag 1) for kørslen: Farvekørsels log ID: Prøve ID: Karakterisering af signalfordeling i væv: Homogen: Heterogen fokal: eller Heterogen mosaik: Tæl signaler i 20 kerner Kerne nr. Rød (HER2) Grøn (CEN 17) Kerne nr. Rød (HER2) Grøn (CEN 17) I alt 1 10 I alt Til bestemmelse af HER2/CEN 17 forholdet tælles antallet af HER2 signaler og antallet af CEN 17 signaler i de samme 20 kerner, og det totale antal HER2 signaler divideres med det totale antal CEN 17 signaler. Hvis HER2/CEN 17 forholdet er på grænsen (1,8 2,2) tælles yderligere 40 kerner, og forholdet beregnes igen (der henvises til scoringsskemaet for ny tælling). HER2 FISH HER2 CEN 17 HER2/CEN 17 forhold SAMLET SCORE (1 20) Forholdet < 2: Der blev ikke observeret HER2 genamplifikation Forholdet 2: Der blev observeret HER2 genamplifikation Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning ( ) K /DK/ULH/ s. 45/50

46 Appendiks 6 Gastrisk Gastrisk cancer HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Scoringsskema til ny tælling HER2 FISH pharmdx Kit, K5331 Lot: Dato (Dag 1) for kørslen: Farvekørsels log ID: Prøve ID: Signaler i 40 ekstra kerner (1 40) Kerne Rød Grøn Rød Grøn Rød Grøn nr. HER2 CEN 17 nr. HER2 CEN 17 nr. HER2 CEN 17 nr Rød HER2 Grøn CEN 17 I alt I alt I alt I alt Til bestemmelse af HER2/CEN 17 forholdet tælles antallet af HER2 signaler og antallet af CEN 17 signaler i de samme 40 kerner, og det totale antal HER2 signaler divideres med det totale antal CEN 17 signaler. Anfør samlet score fra de 1 40 kerner i nedenstående skema. HER2 FISH HER2 CEN 17 HER2/CEN 17 forhold SAMLET SCORE (1 40) Forholdet < 2: Der blev ikke observeret HER2 genamplifikation Forholdet 2: Der blev observeret HER2 genamplifikation Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning ( ) K /DK/ULH/ s. 46/50

47 Gastrisk cancer Appendiks 7 Gastrisk HER2 FISH pharmdx Kit, kode K5331 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til anvendelse sammen med HER2 FISH pharmdx Kit, K5331: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden). 3. Objektiver Til screening af vævene kan der anvendes fluorescens tør 10x eller fluorescens olieimmersion 16x objektiver. Til højeffektsforstørrelse og bedømmelse af signaler kan der kun anbefales fluorescens olieimmersion objektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtre udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler anvendelse af et specifikt DAPI filter i kombination med et højkvalitets Texas Red/FITC dobbeltfilter. DAPI filter, f.eks. Chroma filter # Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma filter # Texas Red og FITC enkelte filtre kan anvendes til bekræftelse. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt Deres mikroskopleverandør eller Deres Dako repræsentant, hvis De ønsker detaljeret information. 5. Olie Ikke fluorescerende olie. Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke. Rhodaminfiltre kan ikke anvendes. Tripelfiltre anbefales ikke. Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt rettet ind og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Man skal bestræbe sig på at udsætte prøven for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Vi anbefaler, at De diskuterer opsætningen af Deres mikroskop med producenten, eller læser litteraturen, inden De påbegynder in situ fluorescenshybridiseringen. ( ) K /DK/ULH/ s. 47/50

48 Referencer 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v erb b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76: Coussens L, Yang Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v erbb related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9: Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89: Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER 2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30: Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER 2/neu oncogene. Science 1987;235: Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61: Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER 2/neu amplification predicts poor survival in node positive breast cancer. Cancer Res 1990;50: Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29 A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA: NCCLS Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER 2/neu (c erb B 2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER 2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53: ( ) K /DK/ULH/ s. 48/50

49 19. Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Jørgensen J. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;In press. 22. Fujimoto Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti HER2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27: Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER 2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Van Cutsem E, Kang KY, Chung H et al. Efficacy results from the ToGA trial: A phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first line human epidermal growth factor receptor 2 positive advanced gastric cancer.j Clin Oncol 2009;27(Suppl; abstr LBA2409. (http://media.asco.org/silver)). 27. Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim YM, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti HER2 antibody (Herceptin) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JB, Henner D, Wong WL, et al. Humanization of an anti p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185her2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti p185her2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Bang Y, Chung J, Xu J, et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trail. J Clin Oncol 2009;27:15s (suppl; abstr 4556). 32. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: A phase III study of trastuzumab added to standrad chemotherapy in first line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positive advanced gastric cancer (Presentation ASCO 2009). ( ) K /DK/ULH/ s. 49/50

50 Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsniger Lotnummer Giftigt Medicinsk anordning til in vitro diagnostik Beskyttes mod direkte sollys (se afsnittet om opbevaring) Anvendes senest Meget brandfarligt Se brugsvejledningen Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests Producent Farligt for miljøet Producent: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK 2600 Glostrup Danmark Tlf Fax ( ) K /DK/ULH/ s. 50/50

TOP2A FISH pharmdx kit Kode K5333

TOP2A FISH pharmdx kit Kode K5333 101752-001 / 20-01-03 TOP2A FISH pharmdx kit Kode K5333 3. udgave Til in vitro-diagnostisk brug Kittet indeholder reagenser til 20 analyser. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 1/35 Indhold Side Tilsigtet

Læs mere

Cytology FISH Accessory Kit Kode nr. K 5499

Cytology FISH Accessory Kit Kode nr. K 5499 Cytology FISH Accessory Kit Kode nr. K 5499 2. udgave Til in situ fluorescenshybridisering (FISH) på cytologiprøver. Kittet indeholder reagens tilstrækkeligt til 20 tests. Indhold Side Tilsigtet anvendelse...3

Læs mere

EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Kode K8010 5. udgave Sættet indeholder reagenser til 400 600 analyser. Til Dako Autostainer/Autostainer Plus. Valgfri reagenser: Kode Produktnavn

Læs mere

Histology FISH Accessory Kit Kode K5799

Histology FISH Accessory Kit Kode K5799 Histology FISH Accessory Kit Kode K5799 6. udgave Til fluorescens in situ hybridisering (FISH) på formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Sættet indeholder reagenser til 20 analyser. (128916-002)

Læs mere

HER2 IQFISH pharmdx Kode K udgave

HER2 IQFISH pharmdx Kode K udgave HER2 IQFISH pharmdx Kode K5731 3. udgave HER2 IQFISH pharmdx er en direkte in situ fluorescenshybridiseringsanalyse (FISH) til kvantitativ bestemmelse af HER2 genamplifikation i formalinfikserede, paraffinindstøbte

Læs mere

Tissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP

Tissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP August 2015 QIAsymphony SPprotokolark Tissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP Dette dokument er Tissue_LC_200_V7_DSP og Tissue_HC_200_V7_DSP QIAsymphony SPprotokolark, R2, til kitversion 1. QIAsymphony

Læs mere

HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)

HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Kode GM333 2. udgave HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) er en analyse af direkte fluorescens in situ-hybridisering (FISH), som er designet til kvantitativ fastlæggelse af

Læs mere

ScanGel Monoclonal ABO/RH1/K 86495 48 kort 86485 288 kort

ScanGel Monoclonal ABO/RH1/K 86495 48 kort 86485 288 kort ScanGel Monoclonal ABO/RH1/K 86495 48 kort 86485 288 kort GELER INDEHOLDENDE MONOKLONALE REAGENSER AF MURIN ELLER HUMAN OPRINDELSE ABO1, ABO2, RH1, KEL1 Ag BESTEMMELSE IVD Alle de af Bio-Rad producerede

Læs mere

PNA ISH Detection Kit Kodenr. K5201

PNA ISH Detection Kit Kodenr. K5201 PNA ISH Detection Kit Kodenr. K5201 9. udgave Til in situ hybridisering ved brug af fluoresceinkonjugerede PNA-prober. Sættet indeholder reagenser til mindst 40 tests*. * Antallet af tests er baseret på

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD. NU-CIDEX, færdigblandet opløsning, flaske A og flaske B. Dampe/aerosoler kan irritere luftvejene. Kan irritere øjnene og huden.

SIKKERHEDSDATABLAD. NU-CIDEX, færdigblandet opløsning, flaske A og flaske B. Dampe/aerosoler kan irritere luftvejene. Kan irritere øjnene og huden. 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG LEVERANDØREN 1/6 NU-CIDEX, færdigblandet opløsning, flaske A og flaske B PR-nr. Endnu ikke tildelt Anvendelse: Desinfektionsmiddel Emballage: 5000 ml Leverandør:

Læs mere

Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse

Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Kode K5007 3. udgave Til brug sammen med automatiske Dako instrumenter til immunfarvning. Sættet indeholder reagenser til 500 analyser.

Læs mere

Find enzymer til miljøvenligt vaskepulver

Find enzymer til miljøvenligt vaskepulver Find enzymer til miljøvenligt vaskepulver Enzymer, der er aktive under kolde forhold, har adskillige bioteknologiske anvendelsesmuligheder. Nye smarte og bæredygtige produkter kan nemlig blive udviklet

Læs mere

Bøgeskovvej 7 3490 Kvistgård

Bøgeskovvej 7 3490 Kvistgård SIKKERHEDSDATABLAD 4514 Enviro Sulfaminsyre 1. Identifikation af stoffet/ materialet og leverandøren. Leverandør: SAMSON-ENVIRO ApS Bøgeskovvej 7 3490 Kvistgård CVR.Nr: 31327164 Telefon: 49 13 97 00 Fax.:

Læs mere

Sporbarhed: Alle sterile poser er mærket med lot. nummer, så sterilcertifikater kan bestilles.

Sporbarhed: Alle sterile poser er mærket med lot. nummer, så sterilcertifikater kan bestilles. Laboratorieudstyr -fordi det er enkelt! Messeavis Scanlab 28-30 sept. 2010 Besøg vores stand på scanlab messen stand nr C3-165 og se alle de spændende nyheder! Optimale vækstbetingelser FLERBRØNDSPLADER

Læs mere

ScanGel ReverScan A1, B 86790 2 x 5 ml ReverScan A1, A2, B, O 86795 4 x 5 ml

ScanGel ReverScan A1, B 86790 2 x 5 ml ReverScan A1, A2, B, O 86795 4 x 5 ml ScanGel ReverScan A1, B 86790 2 x 5 ml ReverScan A1, A2, B, O 86795 4 x 5 ml HUMANE TESTERYTHROCYTER TIL ABO-SERUMKONTROL IVD Alle de af Bio-Rad producerede og markedsførte produkter gennemgår fra modtagelse

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD EDDIKESYRE 32% Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien.

SIKKERHEDSDATABLAD EDDIKESYRE 32% Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien. da 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN: Produktnavn: Leverandør: ITW ApS Platinvej 21 6000 Kolding Telefon: +45 76 34 84 00 Telefax: +45 75 50 43 70 Ansvarlig for sikkerhedsdatablad:

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD SPRIT 93 VOL.- % ethanol F R11 1. Generelt: Medbring dette sikkerhedsdatablad ved henvendelse til læge/skadestue.

SIKKERHEDSDATABLAD SPRIT 93 VOL.- % ethanol F R11 1. Generelt: Medbring dette sikkerhedsdatablad ved henvendelse til læge/skadestue. da 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN: Produktnavn: Leverandør: ITW ApS Platinvej 21 6000 Kolding Telefon: +45 76 34 84 00 Telefax: +45 75 50 43 70 Ansvarlig for sikkerhedsdatablad:

Læs mere

Spm. 1.: Hvis den totale koncentration af monomer betegnes med CT hvad er så sammenhængen mellem CT, [D] og [M]?

Spm. 1.: Hvis den totale koncentration af monomer betegnes med CT hvad er så sammenhængen mellem CT, [D] og [M]? DNA-smeltetemperaturbestemmelse KemiF2-2008 DNA-smeltetemperaturbestemmelse Introduktion Oligonucleotider er ofte benyttet til at holde nanopartikler sammen med hinanden. Den ene enkeltstreng er kovalent

Læs mere

ARBEJDSPLADSBRUGSANVISNING

ARBEJDSPLADSBRUGSANVISNING VBG Mekanisme Olie 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG LEVERANDØREN: Leverandør: VBG Produkter A/S Industribuen 20-22 5592 Ejby Danmark Telefon: 6446 1919 Anvendelsesområde: Side 1/5 PR-nr.: 497636

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD MALKE DES. Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien.

SIKKERHEDSDATABLAD MALKE DES. Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien. da 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN: Produktnavn: Leverandør: ApS Platinvej 21 6000 Kolding Telefon: +45 76 34 84 00 Telefax: +45 75 50 43 70 Ansvarlig for sikkerhedsdatablad:

Læs mere

LEVERANDØRBRUGSANVISNING

LEVERANDØRBRUGSANVISNING 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/PRÆPARATET OG AF VIRKSOMHEDEN Godkendt for brug Godk. for lab. brug Modificeret af Bostik AB HANDELSNAVN ANVENDELSESOMRÅDE Forbehandling af mineralflader som f.eks. tegl, beton

Læs mere

Kemiøvelse 3 C3.1. Na-ISE. Øvelsens pædagogiske rammer

Kemiøvelse 3 C3.1. Na-ISE. Øvelsens pædagogiske rammer Kemiøvelse 3 C3.1 Na-ISE Øvelsens pædagogiske rammer Sammenhæng Denne øvelse er tilpasset kemiundervisningen på modul 7 ved bioanalytikeruddannelsen. Kemiundervisningen i dette modul indeholder blandt

Læs mere

EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (Link)

EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (Link) EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (Link) Kode K8002 5. udgave Sættet indeholder reagenser til 400 600 analyser. Til Autostainer Link-instrumenter. Valgfri reagenser Kode Produktnavn Analyser K8004 EnVision

Læs mere

En intro til radiologisk statistik

En intro til radiologisk statistik En intro til radiologisk statistik Erik Morre Pedersen Hypoteser og testning Statistisk signifikans 2 x 2 tabellen og lidt om ROC Inter- og intraobserver statistik Styrkeberegning Konklusion Litteratur

Læs mere

INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail

INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail 800-4422 05899826001 Indholdsfortegnelse TILSIGTET ANVENDELSE...2 SAMMENDRAG OG REDEGØRELSE...2 PROCEDURENS PRINCIP...2 MATERIALER...3 Leverede reagenser...3 Rekonstitution,

Læs mere

BRUGSANVISNING SIDE 1

BRUGSANVISNING SIDE 1 BRUGSANVISNING SIDE 1 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET OG LEVERANDØREN 1.1 IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET: PR-nr.: 769435 Handelsnavn: KONTAKT PRF 6-68 1.2 IDENTIFIKATION AF LEVERANDØREN: Dato: 11-12-2008

Læs mere

Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse

Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Kode K5001 6. udgave Til brug sammen med automatiske Dako instrumenter til immunfarvning. Sættet indeholder reagenser til 500 analyser. (129655-001)

Læs mere

BRUGSANVISNING SIDE 1

BRUGSANVISNING SIDE 1 BRUGSANVISNING SIDE 1 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET OG LEVERANDØREN 1.1 IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET: Handelsnavn: TURBO OIL PRF 290 PR-nr.: 777435 1.2 IDENTIFIKATION AF LEVERANDØREN: Dato: 11-12-2008

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD. Kræves ikke Anvendelse: 310 ml Leverandør:

SIKKERHEDSDATABLAD. Kræves ikke Anvendelse: 310 ml Leverandør: 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG LEVERANDØREN 1/5 PR-nr. Kræves ikke Anvendelse: Tætningsmasse til karrosseri Emballage: 310 ml Leverandør: Henkel Norden AB, Copenhagen Division Loctite Hørskætten

Læs mere

VÆG OG FACADERENS. S-sætninger: 2- Opbevares utilgængeligt for børn 26- Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes

VÆG OG FACADERENS. S-sætninger: 2- Opbevares utilgængeligt for børn 26- Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes Udstedelsesdato: 29.08.2007 Revisionsdato: 29.04.2012 1. Identifikation af stoffet/blandingen og selskabet/virksomheden: Produktidentifikator: Væg og facaderens PR-nr.: Under anmeldelse Relevante identificerede

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Olie til Gulvafslibning

Sikkerhedsdatablad. Olie til Gulvafslibning Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren PR-nummer: Revideret den: 02-06-2003 / JR Anvendelse: Anvendes som "kølemiddel" ved gulvafslibning. Leverandør: Borup Kemi I/S

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Fugerens

Sikkerhedsdatablad. Fugerens Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/ materialet og leverandøren. Leverandør: Cab-Dan ApS Mådevej 80 6705 Esbjerg Ø. Telefon: 7545 4828 Fax.: 7611 5080 E-mail: info@cabdan.com Produktnavn: Fugerens

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD GRAM STAIN KIT, R40080

SIKKERHEDSDATABLAD GRAM STAIN KIT, R40080 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren. Produktets navn og/eller nummer. PR-nr.: Ikke anmeldepligtig Udstedelsesdato: 31.01.2010 Firmanavn, adresse og telefonnummer: Importør: Udenlandsk

Læs mere

EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus)

EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) EnVision FLEX+, Mouse, High ph, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Kode K8012 6. udgave Sættet indeholder reagenser til 400 600 analyser. Til Dako Autostainer/Autostainer Plus. Valgfri reagenser: Kode

Læs mere

Tidl. Concresive 1366. Erst. PCI Apogel F Marts. 2015 erst. feb. 2014

Tidl. Concresive 1366. Erst. PCI Apogel F Marts. 2015 erst. feb. 2014 PRODUKTBESKRIVELSE MasterInject 1360 er en 2-komponent, epoxybaseret injektionsharpiks med lav viskositet. Den bruges til injektion med lavt/højt tryk og tyngdekraftbaseret indføring i revner i beton for

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Palisanderolie Varenr. 6/3006

Sikkerhedsdatablad. Palisanderolie Varenr. 6/3006 Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: 1052460 Revision: 15-07-2010 / LBN Anvendelse: Renser og giver såvel olieret som matlakeret palisandertræ

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD ifølge 1907/2006/EF, Artikel 31

SIKKERHEDSDATABLAD ifølge 1907/2006/EF, Artikel 31 SIKKERHEDSDATABLAD ifølge 197/26/EF, Artikel 31 PUNKT 1: Identifikation af stoffet/blandingen og af selskabet/virksomheden 1.1. Produktidentifikator Produktnavn 1.2. Relevante identificerede anvendelser

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning af/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 201-116-6 202-859-9 229-962-1

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning af/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 201-116-6 202-859-9 229-962-1 Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: Under anmeldelse Udarbejdet den: 12-05-2009 / LFJ Anvendelse: Hærder. Anvendes sammen med Flexovoss

Læs mere

1 Identifikation af produktet og af producent og leverandør

1 Identifikation af produktet og af producent og leverandør 1 Identifikation af produktet og af producent og leverandør Produktnavn: Vindues- og glasrens Anvendelse: Til rengøring af spejle og vinduesglas mm. Vare nr. 1952 Leverandør: Sodasan Wash- und Reinigungsmittel

Læs mere

Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia.

Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia. Transformation af E.coli K 12 Version 3. marts 2009 (C) Claudia Girnth-Diamba og Bjørn Fahnøe Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages

Læs mere

: KPS BIOETHANOL 96% / DUNK 4 L

: KPS BIOETHANOL 96% / DUNK 4 L 1.IDENTIFIKATION AF STOFFET/DET KEMISKE PRODUKT OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN Produkt information Handelsnavn : Produkt kode : 2199376 Leverandør : Brenntag Nordic A/S Strandvejen 104 A DK 2900 Hellerup

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD 91/155/EG

SIKKERHEDSDATABLAD 91/155/EG 1. Identifikation af produktet og virksomheden HANDELSNAVN: ZINKOTOM FL, 5kg spand vare nr. 35006 Anvendelse: Effektiv koldforzinkning og forsegling Leverandør: METALINAS A/S, Sintrupvej 11 B, 8220 Brabrand,

Læs mere

LEVERANDØRBRUGSANVISNING

LEVERANDØRBRUGSANVISNING 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/PRÆPARATET OG AF VIRKSOMHEDEN Godkendt for brug Godk. for lab. brug Modificeret af Aerosol Scandinavia AB HANDELSNAVN Varenummer 161040 National producent/importør Virksomhed

Læs mere

LEVERANDØRBRUGSANVISNING

LEVERANDØRBRUGSANVISNING 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/PRÆPARATET OG AF VIRKSOMHEDEN HANDELSNAVN ANVENDELSESOMRÅD E BIKE ATTITUDE KÆDESPRAY Smøremiddel Se særligt eksponeringsscenarie Internt vare-nr. Betegnelse 0232,5258 Kædespray

Læs mere

EnVision FLEX, High ph (Dako Omnis)

EnVision FLEX, High ph (Dako Omnis) EnVision FLEX, High ph (Dako Omnis) Code GV800 2. udgave Sættet indeholder reagenser til 600 analyser. Til Dako Omnis-instrumenter. Valgfri reagenser: Kode Produktnavn Analyser GV804 GV805 EnVision FLEX

Læs mere

Tekniske Data Epoxy Yacht HB

Tekniske Data Epoxy Yacht HB Tekniske Data Epoxy Yacht HB Produktbeskrivelse Epoxy Yacht HB er en to-komponent overfladetolerant, rusthindrende, mastiks epoxymaling med et højt tørstofindhold, der kan påføres i høje filmtykkelser.

Læs mere

Betydning af erstatning af DS metoder med EN metoder - Farvetal

Betydning af erstatning af DS metoder med EN metoder - Farvetal Betydning af erstatning af DS metoder med EN metoder - Farvetal Miljøstyrelsens Referencelaboratorium Miljøstyrelsen Rapport December 2004 Betydning af erstatning af DS metoder med EN metoder - Farvetal

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Lubcon Turmosynth VG 2,10,15,32,46,68,100,150,220,460,680,1000,1500

Sikkerhedsdatablad. Lubcon Turmosynth VG 2,10,15,32,46,68,100,150,220,460,680,1000,1500 Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: Ikke anmeldelsespligtig Udarbejdelsesdato: 14-05-2009 Revision: 14-05-2009 / HBN Erstatter den:

Læs mere

Herlev og Gentofte Hospital. The influence of different fixatives and preparation methods on morphology, immunohistochemistry and molecular analyses

Herlev og Gentofte Hospital. The influence of different fixatives and preparation methods on morphology, immunohistochemistry and molecular analyses Herlev og Gentofte Hospital The influence of different fixatives and preparation methods on morphology, immunohistochemistry and molecular analyses Problem Rutinemæssigt bruges 10% neutralbuffet formalin

Læs mere

KØLESKAB MED ENKELT DØR MODEL NR.:K73

KØLESKAB MED ENKELT DØR MODEL NR.:K73 KØLESKAB MED ENKELT DØR MODEL NR.:K73 INDHOLDSFORTEGNELSE Generel beskrivelse ------------------------------------------------------------------------------------------ 1 Transport og håndtering ------------------------------------------------------------------------------------

Læs mere

1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF FREMSTILLER, LEVERANDØR ELLER IMPORTØR

1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF FREMSTILLER, LEVERANDØR ELLER IMPORTØR (overholder 2001/58/EF) Trykkedato: 2004-06-23 Side 1 af 5 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF FREMSTILLER, LEVERANDØR ELLER IMPORTØR Produktnavn : Anvendelsesområde Leverandør Nødtelefon : Øvelsesbane

Læs mere

LÆS OG GEM DISSE ANVISNINGER

LÆS OG GEM DISSE ANVISNINGER Instruktioner til brug og vedligeholdelse af SousVide Supreme -vakuumforsegler LÆS OG GEM DISSE ANVISNINGER For yderligere oplysninger bedes du besøge vores hjemmeside på SousVideSupreme.com Dette apparat

Læs mere

ZappBug Oven 2. Brugermanual. Vigtigt! Læs Advarsler før ovnen tages i brug SIKKER, GENNEMPRØVET BEKÆMPELSE

ZappBug Oven 2. Brugermanual. Vigtigt! Læs Advarsler før ovnen tages i brug SIKKER, GENNEMPRØVET BEKÆMPELSE ZappBug Oven 2 Brugermanual Vigtigt! Læs Advarsler før ovnen tages i brug SIKKER, GENNEMPRØVET BEKÆMPELSE 1 ! Vigtige oplysninger om sikkerhed Information Alle sikkerhedsoplysninger skal overholdes, når

Læs mere

Skumforvask gul (Yellow Foam Conditioner +) TW042-DK Beregned anvendelse Bilplejeprodukter

Skumforvask gul (Yellow Foam Conditioner +) TW042-DK Beregned anvendelse Bilplejeprodukter SIKKERHEDSDATABLAD 1. NAVN PÅ PRODUKT OG FIRMA Produktblad nr 34 Ed: 2003-09-02 Team Wash Produktnavn Skumforvask gul (Yellow Foam Conditioner +) Producentens varenummer: TW042-DK Beregned anvendelse Bilplejeprodukter

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD. Glasrens

SIKKERHEDSDATABLAD. Glasrens 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN: Produktnavn: Leverandør: Clean Supply A/S Fabriksparken 10 A 2600 Glostrup Telefon: 43 43 44 55 Ansvarlig for sikkerhedsdatablad: E-mail:

Læs mere

Leucosep rør LTK.615 INDLÆGSSEDDEL. Til diagnostisk anvendelse in vitro PI-LT.615-DK-V3

Leucosep rør LTK.615 INDLÆGSSEDDEL. Til diagnostisk anvendelse in vitro PI-LT.615-DK-V3 Leucosep rør LTK.615 INDLÆGSSEDDEL Til diagnostisk anvendelse in vitro PI-LT.615-DK-V3 Vejledende information Tilsigtet anvendelse Leucosep rørene er beregnet til anvendelse i forbindelse med indsamling

Læs mere

Stofklassificering. Ingen R10 T, R23C,R34. 1) Giftig og miljøfarlig stof/ C+R34 ætsende / R50 Meget giftig for vandlevende organismer.

Stofklassificering. Ingen R10 T, R23C,R34. 1) Giftig og miljøfarlig stof/ C+R34 ætsende / R50 Meget giftig for vandlevende organismer. Revultex MR - Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/materiale Revultex LR Kemisk beskrivelse: Centrifugeret natur-cis 1,4 polyisoprenlatex konserveret VIB.nr. RE 00 EU-mærkning (EU-nr.): 1. 232-689-0

Læs mere

LCK 319 LCK 319. Cyanid som let frigøres. Analyseprocedure. Gældende for alle fotometertyper. Udgave 05/08

LCK 319 LCK 319. Cyanid som let frigøres. Analyseprocedure. Gældende for alle fotometertyper. Udgave 05/08 Analyseprocedure Gældende for alle fotometertyper Udgave 05/08 Se venligst vejledningen under punktet Vær særlig opmærksom på. Spildevandsprøver, som har været underkastet en behandling med dithionit,

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 231-096-4 231-105-1 231-107-2 231-111-4

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 231-096-4 231-105-1 231-107-2 231-111-4 Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/produktet og af selskabet/virksomheden PRnummer: Revideret den: 07062007 / ABB Anvendelse: Metallegering til fabrikation 2. Fareidentifikation Leverandør:

Læs mere

MANUAL TIL IS MASKINE

MANUAL TIL IS MASKINE MANUAL TIL IS MASKINE VIGTIGE SIKKERHEDSANVISNINGER Læs hele vejledningen grundigt før brug. Tag stikket ud af stikkontankten før montering, adskillelse, eller rengørelse af dele. Børn bør ikke bruge denne

Læs mere

SAFTPRESSER. Model Nr.: 1925 BETJENINGSVEJLEDNING

SAFTPRESSER. Model Nr.: 1925 BETJENINGSVEJLEDNING SAFTPRESSER Model Nr.: 1925 BETJENINGSVEJLEDNING VIGTIGE SIKKERHEDSANVISNINGER LÆS SIKKERHEDSANVISNINGERNE OMHYGGELIGT, OG GEM DEM TIL FREMTIDIG BRUG 1 Læs denne vejledning omhyggeligt, inden du bruger

Læs mere

LEVERANDØRBRUGSANVISNING

LEVERANDØRBRUGSANVISNING 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/PRÆPARATET OG AF VIRKSOMHEDEN Godkendt for brug Godk. for lab. brug Modificeret af IKL Produkter HANDELSNAVN ANVENDELSESOMRÅDE MiterAktivator Aktivator kan anvendes til læder,

Læs mere

KEELER HÅNDTAG C-STØRRELSE

KEELER HÅNDTAG C-STØRRELSE KEELER HÅNDTAG C-STØRRELSE 13A 13B LÆS OG FØLG DENNE VEJLEDNING OMHYGGELIGT Keeler håndtag C-størrelse Læs dette instruktionsafsnit omhyggeligt inden Keeler-produktet tages i brug. For egen og kundernes

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD. Natronlud. Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien. natriumhydroxid C R35 1

SIKKERHEDSDATABLAD. Natronlud. Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien. natriumhydroxid C R35 1 Natronlud 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN: da Produktnavn: Varetype: Natronlud 27,65% Leverandør: Clean Care A/S Indkildevej 2C 9210 Aalborg SØ Telefon: Telefax: Ansvarlig

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD. Varenummer: 03-924 005. Produktregistreringsnummer: 1507445. Rensemiddel til sæder, tæpper o.lign.

SIKKERHEDSDATABLAD. Varenummer: 03-924 005. Produktregistreringsnummer: 1507445. Rensemiddel til sæder, tæpper o.lign. SIKKERHEDSDATABLAD Produktnavn: Tekstil Rens. Varenummer: 03-924 005. Produktregistreringsnummer: 1507445. Anvendelse: Rensemiddel til sæder, tæpper o.lign. Dato: 29. 05. 2002. Rev. dato: 14. 10. 2002.

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD (Baseret på EØF direktiv 91/155/ff.)

SIKKERHEDSDATABLAD (Baseret på EØF direktiv 91/155/ff.) 1. OPLYSNINGER OM STOFFET/MATERIALET OG VIRKSOMHEDEN Produktnavn: Tilsigtet brug Katalognumre LIFECODES LifeScreen Deluxe (LMX) Perlebaseret immunoanalyse til kvalitativ påvisning af IgGantistoffer mod

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD. i henhold til Arbejdsministeriets bkg. nr. 540/485 og direktiv 91/155/EØF og 93/112/EF. 1270919 Anvendelse:

SIKKERHEDSDATABLAD. i henhold til Arbejdsministeriets bkg. nr. 540/485 og direktiv 91/155/EØF og 93/112/EF. 1270919 Anvendelse: 1. SIKKERHEDSDATABLAD i henhold til Arbejdsministeriets bkg. nr. 540/485 og direktiv IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG LEVERANDØREN 1/7 PR-nr. 1270919 Anvendelse: Rengøringsmiddel til PUR skum Emballage:

Læs mere

PUNKT 3: SAMMENSÆTNING AF/OPLYSNING OM INDHOLDSSTOFFER

PUNKT 3: SAMMENSÆTNING AF/OPLYSNING OM INDHOLDSSTOFFER SYNTHV 0W30 Udarbejdet: 02022015 PUNKT 1: IDENTIFIKATION AF STOFFET/BLANDINGEN OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN 1.1 Produktidentifikator Produktnavn: Varenummer: SYNTHV 0W30 ARD010044 1.2 Relevante identificerede

Læs mere

Miljøstyrelsens Referencelaboratorium Undersøgelse af konserveringsmetoder for kviksølv i spildevand

Miljøstyrelsens Referencelaboratorium Undersøgelse af konserveringsmetoder for kviksølv i spildevand Miljøstyrelsens Referencelaboratorium Undersøgelse af konserveringsmetoder for kviksølv i spildevand Miljøstyrelsen Rapport September 2005 Miljøstyrelsens Referencelaboratorium Undersøgelse af konserveringsmetoder

Læs mere

AFKALKER TIL KAFFEMASKINER

AFKALKER TIL KAFFEMASKINER da LEVERANDØRBRUGSANVISNING FLYDENDE Revisionsdato: 30. Nov. 2005 erstatter: 5. Dec. 2002 Databladsnr.: 1504 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG LEVERANDØREN: Produktnavn: Varetype: FLYDENDE Leverandør:

Læs mere

Sundhedsstyrelsen anbefaler, at børn bliver ammet eller får modermælkserstatning, indtil de er 1 år. Fra børnene er 1 år, må de få letmælk.

Sundhedsstyrelsen anbefaler, at børn bliver ammet eller får modermælkserstatning, indtil de er 1 år. Fra børnene er 1 år, må de få letmælk. September 2015. Sundhedsstyrelsen anbefaler, at børn bliver ammet eller får modermælkserstatning, indtil de er 1 år. Fra børnene er 1 år, må de få letmælk. Modermælkserstatning fremstilling og opbevaring:

Læs mere

Blodprøvetagning - Venepunktur

Blodprøvetagning - Venepunktur Blodprøvetagning - Venepunktur Klargøring til venepunktur Følgende genstande skal være tilgængelige inden prøvetagning: Prøvetagningsblanket (PTB) (Manuel rekvisitionsblanket benyttes kun ved nedbrud af

Læs mere

SIKKERHEDS-DATABLAD - CARTECHNIC Bremse-rens

SIKKERHEDS-DATABLAD - CARTECHNIC Bremse-rens SIKKERHEDS-DATABLAD - CARTECHNIC Bremse-rens 1. Identifikation af materialet og leverandør Produkt: CARTECHNIC Bremse-rens (Spray) Varenummer: MA 5540026 STA 2735005 WM 596.35.41 2. Sammensætning/oplysning

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD SALPETERSYRE 62% Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien. salpetersyre O, C R8, R35 1 + 2

SIKKERHEDSDATABLAD SALPETERSYRE 62% Udledning af større mængder til vandmiljøet kan forårsage ændringer i ph-værdien. salpetersyre O, C R8, R35 1 + 2 da SIKKERHEDSDATABLAD Oprettet: 7. maj 2003 Revisionsdato: 2. nov. 2010 erstatter: 29. apr. 2008 da 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN: Produktnavn: Leverandør: Aps Platinvej

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Lubcon Turmofluid ED 91. 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden. 2. Fareidentifikation

Sikkerhedsdatablad. Lubcon Turmofluid ED 91. 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden. 2. Fareidentifikation Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: Udarbejdelsesdato: 30-11-2007 Revision: 30-11-2007 / HBN Erstatter den: Anvendelse: Syntetisk

Læs mere

Mivita. Forhandles af: Læs denne brugsanvisning omhyggeligt, før du bruger din espresso-kaffemaskine

Mivita. Forhandles af: Læs denne brugsanvisning omhyggeligt, før du bruger din espresso-kaffemaskine Forhandles af: Mivita Læs denne brugsanvisning omhyggeligt, før du bruger din espresso-kaffemaskine VIGTIGT: Opbevar nedenstående serienummer på din kaffemaskine til eventuel senere brug. Kun til husholdningsbrug.

Læs mere

Leverandørbrugsanvisning (Sikkerhedsdatablad)

Leverandørbrugsanvisning (Sikkerhedsdatablad) Leverandørbrugsanvisning (Sikkerhedsdatablad) 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren PR-nummer: Ikke anmeldelsespligtig Udarbejdelsesdato: 17-10-2006 Udarbejdet den: 17-10-2006 / HBN Anvendelse:

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Olie til Skifer & Klinker

Sikkerhedsdatablad. Olie til Skifer & Klinker Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: 1691860 Revideret den: 22-06-2007 / JST Anvendelse: Anvendes til behandling af klinker, teglfliser

Læs mere

Revision: 22 Oktober 2015 SIKKERHEDSDATABLAD

Revision: 22 Oktober 2015 SIKKERHEDSDATABLAD Revision: 22 Oktober 2015 SIKKERHEDSDATABLAD PUNKT 1 Identifikation af stoffet/blandingen og af selskabet/virksomheden 1.1 Produktidentifikator - Produktnavn: Vibe Textilfarve Sort - PR-nummer: 1152322

Læs mere

Kuvettetest LCK 319 Cyanid som let frigøres

Kuvettetest LCK 319 Cyanid som let frigøres Kuvettetest Princip Ved reaktionen bliver cyanider, som let frigøres, til gasformigt HCN (cyanbrinte og overføres gennem en membran til indikatorkuvetten. Farveændringen i indikatoren evalueres fotometrisk.

Læs mere

TW050-DK Beregned anvendelse Bilplejeprodukter

TW050-DK Beregned anvendelse Bilplejeprodukter SIKKERHEDSDATABLAD 1. NAVN PÅ PRODUKT OG FIRMA Produktblad nr 22 Ed: 2003-07-19 Team Wash Produktnavn Skum Shampoo (Shampoo +) Producentens varenummer: TW050-DK Beregned anvendelse Bilplejeprodukter Leverandør

Læs mere

Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik

Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik Bilag 2 Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik ved forsker Mogens Nicolaisen, Danmarks JordbrugsForskning,

Læs mere

SIKKERHEDSDATABLAD NR UL-247-GB DANSK

SIKKERHEDSDATABLAD NR UL-247-GB DANSK NR UL-247-GB DANSK 1 IDENTIFIKATION AF PRODUKTET OG VIRKSOMHEDEN Produktets navn: Leverandør: HD SURFACE WIPES HELVEMED SA CH - 1227 Geneve Helvemed: + 41 22 718 7500 2 - KOMPOSITION Præparat: Kemisk natur:

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Petroleum, lugtfri

Sikkerhedsdatablad. Petroleum, lugtfri Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: 1691852 Revideret den: 22-06-2007 / JST Anvendelse: Anvendes som lampeolie og tændvæske til grill

Læs mere

Leverandørbrugsanvisning (Sikkerhedsdatablad)

Leverandørbrugsanvisning (Sikkerhedsdatablad) 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren PR-nummer: Ikke anmeldelsespligtig Revideret den: 17-06-2005 / LW Anvendelse: Kobber og messing pudsemiddel. 2. Sammensætning/ oplysning om indholdsstoffer

Læs mere

AgroN. Safety Data Sheet. Fare. Rød

AgroN. Safety Data Sheet. Fare. Rød 09122012 Safety Data Sheet 1. IDENTIFICATION OF THE SUBSTANCE/PREPARATION AND OF THE COMPANY/UNDERTAKING 1.1. Produktidentifikator Rød Agron 1.2 Relevante identificerede anvendelser for stoffet eller blandingen

Læs mere

Eddikesyre 20 % Til afkalkning af kaffemaskiner og maskiner m.m. Effektiv afkalkning af kaffemaskiner og maskiner.

Eddikesyre 20 % Til afkalkning af kaffemaskiner og maskiner m.m. Effektiv afkalkning af kaffemaskiner og maskiner. Type:. Anvendelse: Til afkalkning af kaffemaskiner og maskiner m.m. Egenskaber: Effektiv afkalkning af kaffemaskiner og maskiner. Dosering: Anvendes fortyndet. 1 dl. til 4 dl. vand. Hæld produktet i kedlen

Læs mere

INDLÆGSSEDDEL: INFORMATION TIL BRUGEREN. EVICEL vævsklæber, opløsninger Humant fibrinogen, humant trombin

INDLÆGSSEDDEL: INFORMATION TIL BRUGEREN. EVICEL vævsklæber, opløsninger Humant fibrinogen, humant trombin INDLÆGSSEDDEL: INFORMATION TIL BRUGEREN EVICEL vævsklæber, opløsninger Humant fibrinogen, humant trombin Læs denne indlægsseddel grundigt, inden du begynder at bruge medicinen. - Gem indlægssedlen. Du

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning af/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 238-878-4 270-659-9 238-878-4

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning af/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 238-878-4 270-659-9 238-878-4 Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: 609925 Udarbejdelsesdato: 12-03-2003 Udarbejdet den: 03-04-2008 / HSV Anvendelse: Spartelmasse

Læs mere

Sikkerhedsdatablad KC 50/50/700 Referencemørtel 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren Anvendelse: Kontaktperson/nødtelefon:

Sikkerhedsdatablad KC 50/50/700 Referencemørtel 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren Anvendelse: Kontaktperson/nødtelefon: Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren PR-nummer: 1741004 Udarbejdet den: 27-03-2008 Anvendelse: Anvendes til reparation og opmuring af murværk Leverandør: Gjerlev a/s

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning af/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 200-543-5

Sikkerhedsdatablad. 3. Sammensætning af/oplysning om indholdsstoffer Einecs nr. Stoffer Klassificering w/w% Note 200-543-5 Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/det kemiske produkt og af selskabet/virksomheden PR-nummer: 1065464 Udarbejdelsesdato: 31-10-2005 Udarbejdet den: 15-07-2010 / LBN Anvendelse: Renser sølv

Læs mere

Brugsanvisning til REAL serien RE-CIC/RE-CIC-TR

Brugsanvisning til REAL serien RE-CIC/RE-CIC-TR Brugsanvisning til REAL serien RE-CIC/RE-CIC-TR I denne brugsanvisning kan høreapparat, renseudstyr og lignende se anderledes ud end det, du har. Ret til ændringer forbeholdes. Høreapparater, tilbehør

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Hud Fjern straks forurenet tøj. Vask huden med vand og sæbe. Søg læge ved vedvarende ubehag og vis dette sikkerhedsdatablad.

Sikkerhedsdatablad. Hud Fjern straks forurenet tøj. Vask huden med vand og sæbe. Søg læge ved vedvarende ubehag og vis dette sikkerhedsdatablad. Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/materialet og leverandøren PR-nummer: Revideret den: 02-06-2003 / JR Anvendelse: Bindemiddel til fremstilling af mørtel, puds og beton. Leverandør: Borup

Læs mere

Vanskelige opgaver: 2 ltr. til 10 ltr. vand

Vanskelige opgaver: 2 ltr. til 10 ltr. vand Produktinfoblad Højalkalisk grundrengøringsmiddel Anvendelse: Til rengøring af alle vaskbare gulve. Kan med fordel anvendes i værksteder, motorer, lastbiler, restauranter, storkøkkener, levnedsmiddelindustrien,

Læs mere

PUNKT 3: SAMMENSÆTNING AF/OPLYSNING OM INDHOLDSSTOFFER

PUNKT 3: SAMMENSÆTNING AF/OPLYSNING OM INDHOLDSSTOFFER Udarbejdet: 12012015 PUNKT 1: IDENTIFIKATION AF STOFFET/BLANDINGEN OG AF SELSKABET/VIRKSOMHEDEN 1.1 Produktidentifikator Produktnavn: 1.2 Relevante identificerede anvendelser for stoffet eller blandingen

Læs mere

Tlf.: +49 30 19240. CAS-nr. EINECS Indholdsstof Konc. % Symboler R-sætninger

Tlf.: +49 30 19240. CAS-nr. EINECS Indholdsstof Konc. % Symboler R-sætninger 1. Identifikation af stoffet/produktet og af virksomheden Varenr.: 4170 Produktnavn: LYRA markeringsspray Anvendelse: Mærkning. Producent: Lyra Bleistift-Fabrik GmbH & Co.KG Willstaetterstrasse 54-56 90449

Læs mere

Kuvettetest LCK 319 Cyanid som let frigøres

Kuvettetest LCK 319 Cyanid som let frigøres VIGTIGT NYT! Det aktuelle udgavenummer er nu angivet ved analyseproceduren eller aflæsning. Se venligst punktet Bemærk (se nedenfor. Kuvettetest Princip Ved reaktionen bliver cyanider, som let frigøres,

Læs mere

Hvid Vægtfylde (kg/l): 1,07

Hvid Vægtfylde (kg/l): 1,07 Sikkerhedsdatablad Revisionsdato: 23-11-2007 Erstatter: 15-08-2007 1. IDENTIFIKATION AF STOFFET/MATERIALET OG AF FREMSTILLER, LEVERANDØR ELLER IMPORTØR Produktets navn og nummer Junckers Nåletræslud, hvid

Læs mere

Sikkerhedsdatablad. Tæpperens

Sikkerhedsdatablad. Tæpperens Sikkerhedsdatablad 1. Identifikation af stoffet/ materialet og leverandøren. Leverandør: Cab-Dan ApS Mådevej 80 6705 Esbjerg Ø Telefon: 75 45 48 28 Fax.: 76 11 50 80 E-mail: info@cabdan.com Produktnavn:

Læs mere

Sikkerhedsdatablad Sid. 1(7) REACH. (EF) nr. 1907/2006 og nr. 453/2010 CLP, (EF) nr. 1272/2008

Sikkerhedsdatablad Sid. 1(7) REACH. (EF) nr. 1907/2006 og nr. 453/2010 CLP, (EF) nr. 1272/2008 Sikkerhedsdatablad Sid. 1(7) 1: Sikkerhedsdatablad... Udstedt dato: 2015 07 14 Revideret den: 1.1 Produktidentifikation Produktnavn: REACH reg nr:: CAS nr:. Artikelnr: 304, 305. 1.2 Relevante identificerede

Læs mere