1. modulprojekt ROS og diabetes 2004/2005

Transkript

1 Abstract I denne rapport beskrives, hvordan hyperglykæmi inducerer øget oxidativt stress. Dette sker gennem de fem signalveje, elektrontransportkæden, polyol-signalvejen, hexosamin-signalvejen, protein kinase C og AGE-dannelsen. Da pancreas har et nedsat niveau af forsvarsenzymer mod ROS, kan et forøget oxidativt stress medføre en destruktion af β-celler i de Langerhanske øer. Ved destruktionen af β-celler fremkommer tilstanden hyperglykæmi, som følge af blandt andet nedsat insulinsekretion eller reduceret glucoseoptag. ROS kan aktivere af en række signalveje, der kan føre til mikro- og makrovaskulære skader, herunder retinopati, neuropati, nephropapati. Der forskes intensivt i at afdække de molekylærbiologiske mekanismer for at forbedre forebyggelse og behandling af udviklingen af diabetiske komplikationer. Denne rapport behandler, hvordan komplikationer kan undgås ved brugen af forskellige medikamenter, som blandt andet reducerer niveauet af oxidativt stress. Om disse medikamenter kan anvendes på patienter, kræver kliniske forsøg som dokumentation for effekten af disse. 1

2 Abstract...1 Forkortelser Introduktion Komplikationer Projektets fokus Diabetes mellitus Hyperglykæmi Glucosetransport Langerhanske øer Insulin Metabolisme af glucose Dannelse af ROS ROS og diabetes Dannelse af øget oxidativt stress Øget ROS-dannelse gennem elektrontransportkæden Hexosamin-signalvejen Polyol-signalvejen Protein Kinase C AGE Interaktioner mellem ROS-inducerende signalveje Signalveje medieret af ROS og hyperglykæmi Cytokiner Aktivering af monocytter Transskriptionsfaktoren NF-κB Hyperglykæmi aktiverer NF-κB Aldose-reductase aktiverer NF-κB gennem PKC Adhæsionsmolekyler Cyclooxygenase Pro- og antiapoptose aktiveret af NF-κB Signalveje induceret af nitrogenoxid NO medierer ekspressionen af COX VEGF Diskussion Effekten af hyperglykæmi Defekt glucosetransport Defekt glucose-6-phosphatase Udvikling af diabetes ROS-dannelse - via RAGE Forebyggelse af komplikationer Inhibering af elektrontransportkæden Inhibering af AGE-dannelse og AGE-RAGE binding Inhibering af Protein Kinase C Inhibering af hexosamin-signalvejen Inhibering af polyol-signalvejen Forebyggelse med antioxidanter ROS-dannelse gennem hexosamin-signalvejen NO påvirkes af forøget ROS-dannelse NF-κB COX Sammenfaldene signalveje for diabetes og cancer VEGF Fas og FasL Konklusion...45 Litteraturliste

3 Forkortelser AGE camp CML COX CRE CREB DAG enos FasL GLUT IDDM inos ICAM IFN NIDDM NF-κB nnos PKC RAGE ROS SOD STZ TGF TNF VCAM VEGF Advanced glycation endproduct Cyclic AMP Carboxymethyllysine Cyclooxygenase Cyclic AMP Response Element Cyclic AMP Response Element binding protein Diacylglycerol Endothelial NO synthase Fas ligand Glucose transporter Insulin dependent diabetes mellitus Inducing NO synthase Intracellular adhesion molecule Interferon Non insulin dependent diabetes mellitus Nuclear factor-κb Neuronal NO synthase Protein kinase C Receptor AGE Reactive oxygen species Superoxid dismutase Streptozotocin Transforming growth factor Tumor necrosis factor Vascular cell adhesion molecule Vascular endothelial growth factor, vækst faktor 3

4 1 Introduktion Det skønnes, at der i Danmark i dag er ca personer med insulinkrævende diabetes, og mellem og personer med ikke-insulinkrævende diabetes. Antallet af personer med ikkeinsulinkrævende diabetes skønnes at stige med og om året [Sundhedsstyrelsen, 2004]. Stigningen i antallet af ikke-insulinkrævende diabetes skyldes blandt andet, at antallet af overvægtige personer samt en større ældrebefolkning øges. En stor del af det danske sundhedsbudget går til behandling af diabetes herunder de komplikationer, der opstår som følge af forhøjet glucosekoncntration. Omkring til indlæggelser årligt er relateret til diabetes, hvilket svarer til ca. 1,4 % af årlige indlæggelser i Danmark [Danmark Statistik, 2004]. I Danmark er ca. 2 % af alle årlige dødsfald relateret til diabetes (tabel 1.1) [Danmark Statistik, 2004]. Behandlingen af diabetiske komplikationer udgør en stor samfundsøkonomisk belastning. Endvidere giver komplikationerne anledning til forringet livskvalitet hos diabetikere. Der forskes derfor intensivt i at finde medikamenter, der kan forbedre behandlingen samt forebygge diabetes og de medfølgende komplikationer. Dødsfald årsag diabetes mellitus Mænd Kvinder Samlet antal Tabel 1.1: Antallet af årlige dødsfald i årene , hvor årsagen er diabetes mellitus [Kilde: Danmark Statistik]. 1.1 Komplikationer Diabetes kan medføre mikro- og makrovaskulære skader, der kan føre til udvikling af retinopati, neuropati og nephropati. Retinopati skyldes, at de små blodkar i nethinden brister samt udvikling af nye blodkar i retina, hvilket kan medføre blindhed. Neuropati medfører nedsat følelsessans, smerter, samt nedsat muskelfunktion i primært arme og ben. Diabetes kan ligeledes medføre nephropati, hvor de små blodkar i nyrerne brister, og der lækkes protein til urinen. Endvidere ses en forøget risiko for gigt. Diabetes fører til ændringer i metabolismen, hvilket kan medføre indsnævringer af blodårer, da kolesterol og fedtstoffer aflejres i karvæggen. Hvordan komplikationerne opstår, er endnu ikke helt klarlagt, men flere forklaringer er givet herpå. Dette vil blive beskrevet i projektet. 1.2 Projektets fokus Hyperglykæmi medfører en øget produktion af reactive oxygen species (ROS), hvilket medfører udvikling af ovennævnte komplikationer. Pancreas er specielt udsat for skader forårsaget af ROS, da niveauet af enzymer, som deltager i forsvarsmekanismer mod ROS, er lavt heri. I denne rapport vil sammenhængen mellem ROS og hyperglykæmi samt aktiveringen af forskellige signalveje, der fører til komplikationer, blive behandlet. I øjeblikket forskes intensivt i forskellige former for behandling, der kan forbedre diabetikeres livskvalitet. Beskrivelser af stoffer, som har indflydelse på dannelsen af ROS samt inhibitorer af signalvejene, der medieres af ROS vil indgå i rapporten. 4

5 2 Diabetes mellitus Insulinkrævende diabetes mellitus, IDDM (insulin dependent diabetes mellitus), opstår ved nedsat insulinsekretion. IDDM kan være en følge af nedsat følsomhed eller reducering i antallet af β-celler i de Langerhanske øer gennem en eller flere af β-cellestimulerende faktorer. Destruktionen af β-cellerne kan blandt andet skyldes immunologiske processer og pancreatitis, som er en kronisk betændelsestilstand i pancreas. Personer med nedsat insulinsekretion har lav eller ingen insulinkoncentrationen i blodplasmaet. NIDDM (non insulin dependent diabetes mellitus) er en ikke-insulinkrævende form for diabetes. Personer med NIDDM har øget insulinresistens, men kan producere insulin. Årsagen til NIDDM kan være et nedsat antal af insulin receptorer i de insulinfølsomme væv eller en nedsat affinitet mellem receptorer og insulin. Flere faktorer kan forøge insulinresistens, såsom fedme, lav fysisk aktivitet, forhøjet koncentration af hormoner som glucagon og væksthormon. I denne rapport er det IDDM og NIDDM, der relateres til. Det er imidlertid ikke alle omtalte eksperimenter, der differentierer mellem de to typer af diabetes. Til forsøg anvender mange forskere celler udsat for hyperglykæmi, der kan forekomme under begge typer af diabetes. 2.1 Hyperglykæmi I forbindelse med ukontrolleret eller ubehandlet diabetes, kan glucosekoncentrationen ikke reguleres tilstrækkeligt, hvorved tilstanden hyperglykæmi kan opstå. Raske personer samt velregulerede diabetikere har normalt en glucosekoncentration på 5-7 mm. Ikke velregulerede diabetikere ved hyperglykæmi har en koncentration på over 10 mm glucose. Hyperglykæmi opstår enten ved nedsat insulinsekretion eller øget insulinresistens. Følgende afsnit vil beskrive importen af glucose i cellerne, samt reguleringen af insulinsekretionen Glucosetransport Glucose transporteres over cellemembranen ved faciliteret diffusion. Denne transport katalyseres af transportproteiner, da glucose er et hydrophilt molekyle og derfor ikke kan trænge gennem cellemembranen [Anderson et al., 2001 (1); reviewed in Bouché et al., 2004; reviewed in Hemachandra & Cowett, 1999]. Om glucose transporteres ind eller ud af cellerne er afhængig af forholdet mellem den intracellulære og ekstracellulære glucosekoncentration. Normalt er koncentrationen af glucose større i blodet end i cytoplasmaet. Denne koncentrationsforskel giver anledning til en gradient, som skyldes, at den importerede glucose omdannes til glucose-6-phosphat via hexokinaser (figur 1.1). Det er ikke muligt for transportproteiner at transportere glucose-6-phosphat ud af cellen. Transporten af glucose sker via en række forskellige og vævsspecifikke proteiner, som katalyserer transporten af glucose og andre hexoser over plasmamembranen; herunder blandt andet faciliteret glucose transportør (GLUTs) (afsnit ). Glucoseoptagelsen i væv, som optager og forbruger glucose såsom muskler og fedtvæv stimuleres af insulin, idet insulin forøger antallet af transportproteiner i vævets plasmamembran [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Der findes fire forskellige typer hexokinaser i dyrevæv, som nummeres I-IV. De fire hexokinaser har forskellige placeringer, regulering og distribuering. Hexokinaserne I-III har en lav K m -værdi for glucose, 10-6 og 10-1 mm, hvor hexokinase IV har en høj K m -værdi, mellem 6 og 11 mm. K m er en værdi for et enzym, der henfører til enzymets bindingsaffinitet for substratet, i dette tilfælde glucose. En høj K m -værdi henfører til en lav affinitet [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Glucose-6-phosphatase nedsætter glucosekoncentrationen i cytoplasmaet, hvorved gradienten bibeholdes. Glucosetransporten reguleres via hormoner, som for eksempel insulin. I forbindelse med transporten af glucose, skal der skelnes mellem væv, der forbruger glucose og væv, som afgiver glucose [Reviewed in Bouché et al., 2004]. 5

6 Glucose GLUT Glucose Glucose-6-phosphatase (hæmmes af insulin og glucose) Hexokinase (I-IV) (stimuleres af insulin) Glucose-6-phosphat Figur 2.1: Skematisk oversigt over glucosens indgang i cellen. Hexokinase IV benævnes glucokinase og er medvirkende til katalyseringen af phosphoryleringen af glucose primært i leverceller men også i nyre- og β-celler. Aktiviteten af glucokinase stimuleres af insulin og hæmmes af glucagon og cortisol. Hexokinasernes K m -værdi er ofte lavere i væv, som forbruger glucose såsom muskler og fedtvæv (tabel 2.1) [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Ved metabolismen af glucose er glucokinase den begrænsende faktor i β-celler, da den er ansvarlig for den glucosemedierede stimulering af insulinsekretion. Glucokinase i leveren stimuleres af insulin og inhiberes af cyklisk adenosin monophosphat (camp). Aktiviteten af β-cellernes glucokinase opreguleres af glucosekoncentrationen. Ved manglende funktion af glucokinase ses en nedregulering af insulinsekretionen [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Hexokinas K m værdier Affinitet Placering I, II, III Lav (10-6 og 10-1 mm) Høj Muskler, fedtvæv IV Høj (6-11 mm) Lav Lever, nyre, β-celler Tabel 2.1: Oversigt over hexokinasermes typiske K m -værdier, affinitet og placering. Aktiviteten af glucose-6-phosphatase kan inhiberes af insulin og glucose, hvorved omdannelsen af glucose-6-phosphat til glucose falder efter et måltid i blandt andet leveren. I personer med NIDDM er niveauet af glucose-6-phosphatase opreguleret. Det giver anledning til, at niveauet af glucose-6-phosphat falder (figur 2.1). Disse personer behandles ofte med stoffet Metformin, der nedregulerer omdannelsen af glucose-6-phosphat til glucose i celler. Desuden stimulerer Metformin glucoseoptaget sammen med aktivering af AMP-aktiveret proteinkinase (afsnit ). Det er endnu uvidst, hvordan denne nedregulering foregår, men det er sandsynligvis ved inhibering af glucose-6-phosphat. Hvordan denne nedregulering sker, er endnu uvis, men det sker sandsynligvis ved at hæmme glucose-6-phosphatase [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Ved en forøget mængde af glucose-6-phosphatase i lever eller pancreas, udvikles insulinresistens i transgene mus, da glucosekoncentrationen stiger intracellulært og gradienten herved udlignes, hvilket nedsætter insulinsekretionen Transportproteiner. GLUT er en familie af faciliterede glucosetransportører og opdeles i klasserne I, II og III afhængig af affinitet (tabel 2.2) [Reviewed in Bouché et al., 2004]. 6

7 GLUT K m -værdi Affinitet Klasse 1, 3, 4 2 Lav Mellem Høj Mellem 5, 7, 9, 11 Høj Lav II 6, 8, 10, 12 Ukendt Ukendt. III I Tabel 2.2: Oversigt over K m -værdier, affinitet og klasse for glucosetransportsproteiner - GLUT1-12. GLUT1 til 4 benyttes i de forsøg omtalt i dette projekt, og derfor beskrives de i dette afsnit (tabel 2.3). GLUT1, 3 og 4 har en høj affinitet for glucose (tabel 2.2). De er derfor effektive ved små glucosekoncentrationer. Ekspressionen af GLUT2 og GLUT3 er styret af det metaboliske niveau af central nervesystemet og er ikke påvirket af insulin. Nedreguleringen af GLUT4, som findes i insulinfølsomt væv - primært i skelet- og hjertemuskulatur samt fedtvæv - kan være en årsag til insulinresistens [Reviewed in Hemachandra & Cowett, 1999]. GLUT Primære virkested Kilde 1 Nyrer, celler fra blod-vævs barriere. Primær GLUT i fostre. Anderson et al., 2001(2). Reviewed in Bouché et al., Hepatocytter og β-celler fra pancreas samt i væv udsat for store glucosekoncentrationer såsom lever og nyrer. Anderson et al., 2001(2). Reviewed in Bouché et al., Hjernen i det neuronal væv, makrofager og moderkagen. Anderson et al., 2001(1). Reviewed in Bouché et al., Insulinresponderende væv, såsom i hjertet, skelet muskulaturen. Koncentrationen af GLUT4 er lavere hos voksne end fostre. Tabel 2.3: Oversigt over GLUT 1-4 og deres virkested i kroppen. Reviewed in Hemachandra & Cowett., 1999 Anderson et al., 2001(2) Ændret glucosetransport ved diabetes Anderson et al. (2) [2001] har undersøgt effekten på GLUT1 og GLUT4 i embryonale muskelceller fra får ved hyperglykæmi og forhøjet insulinkoncentration. Ved hyperglykæmi ses en 4-gangs opregulering af niveauet af GLUT1, og 3-gangs opregulering af GLUT4. Ved forhøjet insulinkoncentration ses en 2-gangs opregulering af GLUT4, men der observeres ingen ændring i GLUT1. Hyperglykæmi og forhøjet insulinkoncentration har uafhængige effekter på mængden af GLUT1 og GLUT4 [Anderson et al., 2001(2)]. Forsøg udført på mesangial celler ved normal glucosekoncentration, men forhøjet niveau af proteinet GLUT1, ført til patogene træk. Ligeledes har celler, udsat for hyperglykæmi, forøget niveau af kollagen og fibronectin. Det er endnu uvidst, hvorvidt den forøgede ekspression af GLUT1 eller den høje glucosekoncentration er årsag til diabetiske komplikationer [Heilig et al., 1995]. I personer med NIDDM kan ekspressionen af GLUT4 både være opreguleret og nedreguleret. I nogle tilfælde af NIDDM kan ekspression af GLUT4 være normal, men med ændret affinitet. I andre tilfælde af NIDDM ses en nedreguleret ekspression af GLUT4. Forsøg udført på diabetiske mus har vist, at forhøjet muskelspecifik ekspression af GLUT4 kan forbedre insulinoptaget og sænke glucoseniveauet. Dette skyldes, at antallet af transportproteiner forøges, hvorved importen af glucose forøges [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Forsøg udført af Christ-Roberts et al. [2004] har vist samme resultat på personer med NIDDM. 8 ugers motion har vist en opregulering i ekspressionen af GLUT4 uden et forøget niveauet af 7

8 insulin. Herved forøges insulinsensitiviteten. Opreguleringen af GLUT4 forøger importen af glucose og omdannelse via glycogen syntasen, hvilket reducerer koncentrationen af glucose i blodet [Christ-Roberts et al., 2004]. Størstedelen af de udførte forsøg, har vist forbedret insulin-sensitivitet ved forøget ekspression af primært GLUT1 og GLUT4 [Reviewed in Bouché et al., 2004, Anderson et al., 2001 (2)]. In vitro forsøg med stoffet Thiazolidinedion har vist forøget ekspression af både GLUT1 og GLUT4 i muskelceller, hvorved importen af glucose forbedres [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Hos personer med NIDDM hvor der er et forøget niveau af glucose-6-phosphatase. Ved behandling med stoffet Metformin nedreguleres niveauet af glucose i cellen. Denne nedregulering sker, sandsynligvis via inhibering af glucose-6-phosphatase. Samme effekt er observeret ved stoffet Thiazolidinedion [Reviewed in Bouché et al., 2004]. Ved nedreguleret niveau af GLUT4 forhindres importen af glucose fra blodet, hvorved ATP-dannelsen udfra glucose nedsættes [Hemachandra & Cowett, 1999]. Reduceret koncentration af glucose medfører nedsat niveau af GLUT4, hvorved koncentrationen af insulin også nedreguleres. Glucosekoncentrationen er højest i insulinfølsomt væv, hvor antallet af glucosetransportører er højest. Ved at opregulere ekspressionen af glucosetransportørerne, kan effekten af hyperglykæmi nedsættes. Som i mus, er ekspressionen af GLUT4 nedsat i personer med NIDDM. Behandling med stoffer, der forøger ekspressionen GLUT4, kan dermed være gavnlig [Reviewed in Holmes & Dohm, 2004]. Forsøg udført af Itani et al. [2003], har vist et reduceret optag af glucose ved hyperglykæmi i skeletmuskulatur på rotter, men et forøget optag ved lav glucosekoncentration. Denne effekt skyldes sandsynligvis aktivering af enzymet AMP-aktiveret protein kinase. Dette enzym aktiveres når celler udsættes for blandt andet oxidativt stress og mangel på ATP. AMP-aktiveret protein kinase forøger, uafhængigt af insulin, importen af glucose i skeletmuskulaturen ved ekspempelvis motion. Aktiviteten af AMP-aktiveret protein kinase var størst i celler præinkuberet uden glucose og mindst ved glucosekoncentration ved 25 mm. For at måle importen af glucose samt forbruget, måles koncentrationen af malonyl-coa spektrofotometrisk. Ved hyperglykæmi ses et forøgede niveau af malonyl-coa og et reduceret niveau af acetyl-coa. Dannelsen af lactat er størst ved hyperglykæmi, som er et udtrykt for niveauet af metabolisme via glycolysen. Hvorvidt niveauet af AMP-aktiveret protein kinase kan regulere glycolysen er endnu uvis [Itani et al., 2003]. 2.2 Langerhanske øer Insulinproduktionen foregår i de Langerhanske øer, som er en del af pancreas. De Langerhanske øer består primært af α-, β- og γ-celler, der alle producerer peptidhormoner. α-celler danner og syntetiserer glucagon, hvor β-celler danner og syntetisere insulin og γ-celler danner somatostatin, som medvirker i reguleringen af insulin og glucagon. Insulin frigøres ligesom glucagon i sekretionsvesikler til blodet via exocytose. Glucagon sikrer, at vævene er forsynet med energigivende substanser ved faldende koncentrationer af disse. Ved hyperglykæmi stimuleres insulinsekretionen og glucagonsekretionen hæmmes Insulin Insulin er et lille anabolisk hormon, der indeholder to polypeptidkæder som er forbundet med to disulfidbroer, A og B-kæden (figur 2.2). Insulin syntetiseres med et hydrofobt N-terminalsignalpeptid, der gennemtrænger det ru endoplasmatiske reticulums membraner og fører hele translationsproduktet ind i det ru endoplasmatiske reticulum. Først syntetiseres præproinsulin, som siden omdannes til proinsulin, ved at signalpeptidet hydrolyseres fra i endoplasmatiske reticulums (figur 2.2). Proinsulin transporteres til golgiapparatet, hvorfra sekretionsgranulae dannes, som frigøres til cytosolen. Ved denne transport fraspaltes C-peptidet ved hydrolyse af amidbindingen ved B-kædens og A-kædens N-terminale aminosyre. 8

9 A-kæde A-kæde A-kæde COO - 21 C-peptid 35 COO - 21 S S S S C-peptid 35 COO - 21 S S S S NH Signalpeptid 30 B-kæde NH B-kæde NH B-kæde Præproinsulin Proinsulin Insulin Figur 2.2: Skitse af præproinsulin, proinsulin og insulin (Modificeret figur efter Nielsen og Krukow, 2001). Insulin fremmer deponeringen af glycogen og triacylglycerol og stimulerer proteinsyntesen. Koncentrationen af glucose, fedtsyrer og aminosyrer i blodbanen mindskes via insulin. Ved høje koncentrationer af oxiderbare, energigivende substanser, stimuleres insulinsekretionen, hvorved deponerede energireserver ikke nedbrydes. Ved faste vil koncentrationen af fedtsyrer og ketonstoffer i blodet stige via øget lipolyse i fedtvævet og øget syntese i leveren. Dette stimulerer insulinsekretionen og dæmper herved lipolysen og ketogenesen. Et intracellulært receptorprotein phosphorylerer insulinreceptorsubstrat, når insulin bindes til en insulinreceptor. Insulinreceptorerne er placeret i membranen og er opbygget af to α- og to β-subunits, som er forbundet med covalente disulfidbindinger. Antallet af en celles receptorer varierer mellem Når insulinreceptoren er aktiveret, stimuleres blandt andet optaget af glucose og opbygningen af glycogen. Transporten af glucosetransportører sker via intracellulære vesikler, som har transportørerne i membranen. Vesiklerne kan fusionere med cellemembranen, hvorved antallet af glucosetransportører øges. Når stimuleringen forsvinder, fjernes glucosetransportørerne fra cellemembranen ved endocytose og forekommer atter i intracellulære vesikler Metabolisme af glucose I forbindelse med hyperglykæmi, er de relevante metaboliske signalveje for glucose elektrontransportkæden, hexosamin- og polyol-signalveje (afsnit 3.4 og 3.5). Glucose GLUTs Glucose Glucose-6-phosphatase Hexokinaser P Glucose-6-phosphat ETC Hexosamin signalvej Polyol signalvej ROS Figur 2.3: Udnyttelsen af glucose i forbindelse med hyperglykæmi (modificeret figur efter Bouché et al., 2004). 9

10 3 Dannelse af ROS Reactive oxygen species (ROS) er en betegnelse for en række reaktive forbindelser, som dannes under normale fysiologiske omstændigheder i kroppen. ROS dannes gennem elektrontransportkæden, ved NADH-dehydrogenase i kompleks I og mellem ubiquinon og kompleks III. Som nævnt i introduktionen, har forsøg vist, at hyperglykæmi kan opregulere koncentrationen af ROS [Reviewed in Kajimoto & Kaneto, 2004]. Årsagen til den reaktive virkning af ROS er, at de er radikaler, og dermed har en uparret elektron. ROS kan reagere med alle makromolekyler, herunder DNA, hvilket kan føre til mutationer der medfører uhæmmet cellevækst samt nedsat apoptose, hvilket kan medføre cancer. Celler har et veludviklet forsvarssystem imod ROS. Forsvarssystemet består af en række enzymer, der omdanner ROS. I elektrontransportkæden dannes superoxid, som af superoxid dismutase (SOD) omdannes til hydrogenperoxid og oxygen. På denne måde reduceres skaderne, der er forårsaget af ROS. Omdannelse af superoxid til hydrogenperoxid og oxygen: SOD O 2 + 2H O 2 H 2O2 O + SOD er et CuZnenzym. Kobber indgår i dismutationsprocessen, mens zink stabiliserer foldningen af enzymet. SOD forekommer i flere typer udover CuZnSOD, blandt andet også som MnSOD. Hydrogenperoxid er en meget giftig og reaktiv forbindelse og kan omdannes til vand og oxygen af catalase (CAT), som er et andet forsvarsenzym. Herved forhindres skader af hydrogenperoxid. Omdannelse af hydrogenperoxid til vand og oxygen: CAT 2O 2 2H 2O O 2 2H + Hydrogenperoxid kan også omdannes til vand af enzymet gluthationperoxidase. I denne reaktion reducerer gluthationperoxidase hydrogenperoxid til vand ved oxidation af gluthation. Omdannelse af hydrogenperoxid til vand og oxygen af glutathionperoxidase (GSH-Px): GSH Px 2 + 2GSH + H O 2 2H 2O GSSG Gluthation (GSH) fungerer som et coenzym og medvirker i reduktionen af hydrogenperoxid. Ud fra denne raktion dannes vand og oxideret glutathion (GSSG). De ovennævnte reaktioner sker meget hurtigt, alligevel er det ikke altid nok til at forhindre skader, forårsaget af ROS. 3.1 ROS og diabetes Det er vist, at personer med hyperglykæmi lider af forhøjet oxidativt stress [Rösen et al., 2001] samt et hæmmet antioxidant forsvarssystem [Parthiban et al., 1995]. Dette medvirker til udviklingen af diabetiske komplikationer. Et forhøjet niveau af oxidativt stress er en betegnelse for en øget mængde af ROS, som er en følge af hyperglykæmi [Reviewed in Piconi et al., 2003]. I pancreas er der forøget risiko for skader, forårsaget af ROS. Dette skyldes, at niveauet af en række enzymer, der medvirker i forsvaret mod ROS, er lavt i pancreas i forhold til andre væv. Der er for eksempel vist en langt mindre koncentration af SOD og CAT i pancreas i forhold til i leveren [Lenzen et al, 1996]. Det lave niveau af SOD og CAT medfører, at β-cellerne i pancreas er specielt udsatte for skader fra ROS og andre radikaler, hvilket kan medføre destruktionen af β-cellerne [Lenzen et al., 1996; reviewed in Ho & Bray, 1999]. Færre β-celler vil medføre en forringelse af insulinsekretionen, hvilket kan føre til hyperglykæmi og IDDM [Reviewed in Ho & Bray, 1999]. Den forøgede mængde af radikaler og et forringet forsvarssystem mod ROS kan endvidere føre til skader på cellulære organeller og enzymer. Herudover forøges lipid peroxidation og udvikling af insulinresistens [Reviewed in Maritim et al., 2003]. 10

11 I flere forsøg er det vist at forsvarsenzymerne er nedreguleret i personer med diabetes. Atli et al. [2004] har udført forsøg på personer over 65 år, hvor de blandt andet studerede det antioxidante forsvarssystem. De antioxidante enzymer, CAT og glutathionperoxidase, var signifikant forøget i en gruppe med nedsat glucosetolerance i forhold til en gruppe raske forsøgspersoner [Atli et al, 2004]. Andre forsøg har vist, at aktiviteten af SOD og CAT er signifikant lavere i både personer med NIDDM og IDDM i forhold til raske personer [Abou-Seif & Youssef, 2004]. Endvidere har forsøg på PBMC (peripheral blood mononuclear cells) med og uden diabetes ved hyperglykæmi vist, at niveauet af forsvarssystemerne er nedreguleret i personer med diabetes [Hodgkinson et al., 2003]. 3.2 Dannelse af øget oxidativt stress Under hyperglykæmi øges dannelsen af oxidativt stress gennem fem nedenstående signalveje. Elektrontransportkæden Hexosamin-signalvejen Polyol-signalvejen Protein kinase C Dannelsen af AGE 3.3 Øget ROS-dannelse gennem elektrontransportkæden Om der er øget dannelse af ROS gennem elektrontransportkæden under hyperglykæmi, undersøges af Sakai et al [2003]. Målingerne af den intracellulære ROS-dannelsen blev udført på β-cellelinien, MIN6 og humane Langerhanske øer. En glucosekoncentration på 50 mm blev benyttet til forsøgene, som forløb over 96 timer. Den høje glucosekoncentration resulterede i øget intracellulær ROS-produktion i både MIN6-cellerne og i de humane Langerhanske øer. Den forhøjede ROS-produktion blev observeret 15 minutter efter udsættelsen for den høje glucosekoncentration. Sakai et al. [2003] skriver, at de ikke har kendskab til andre tidligere undersøgelser, der viser, at der er øget mitochondriel ROS-produktion i de Langerhanske øger (figur 3.1) [Sakai et al., 2003]. 15 min Glucose 30 mm ETC ROS Figur 3.1: Figuren viser den signalvej Sakai et al. [2003] beskriver i deres artikel. Glucose øger via elektrontransportkæden (ETC) dannelsen af ROS. For at bekræfte, at ROS-dannelsen stammede fra elektrontransportkæden, udførtes forsøg med inhibitorer af elektrontransportkæden samt forsøg med en efterligner af det intracellulære antioxidante forsvarssystem, der betegnes som et mimicked forsvarsenzym. I MIN6 cellerm medførte tre timers udsættelse for 30mM glucose, at intracellulært ROS blev forøget. Denne ROS-produktion forsvandt fuldstændigt med tilsætning af inhibitorene (figur 3.2) [Sakai et al., 2003]. Inhibitorer af ETC Glucose 30 mm ETC ROS Figur 3.2: Illustration af forsøg udført af Sakai et al., [2003]. En inhibitor af elektrontransportkæden (ETC) nedregulerer ROS-produktionen fra ETC. 11

12 I isolerede humane Langerhanske øer, øgede 30 mm glucose ligeledes intracellulært ROS. Ved tilsætning af mimicked MnSOD, blev det forøgede niveau af ROS nedreguleret. Disse resultater tyder på, at høj glucose koncentration forøgede ROS-produktion som følge af en øget dannelse af NADH og FADH 2, da disse forøger superoxidproduktionen gennem elektrontransportkæden i β-celler fra pancres (figur 3.3) [Sakai et al., 2003]. Mimicked MnSOD Glucose 30 mm ETC ROS Figur 3.3: Illustration af forsøg udført af Sakai et al., [2003]. Et mimicked forsvarsenzym, MnSOD, nedregulerer ROSproduktionen fra elektrontransportkæden (ETC). Sakai et al. [2003] udførte et andet forsøg for at undersøge, hvorvidt ROS hæmmede den glucoseinducerde insulinsekretionen. Der blev foretaget målinger af insulinsekretionen på MIN6-celler og celler fra de Langerhanske øer fra mus. Cellerne blev udsat for glucosekoncentrationer på 2,8 mm eller 25 mm glucose og som repræsentant for ROS tilsattes H 2 O 2 til cellerne i forskellige koncentrationer kombineret med de to glucosekoncentrationer [Sakai et al., 2003]. Indvirkningen af ROS på den glucoseinducerede insulinsekretion blev vurderet til værende betydelig. Sakai et al. [2003] fandt, at selv små koncentrationer af H 2 O 2 fra mitochondrier kunne nedsætte den glucoseinducerede insulinsekretion, og at det skete koncentrationsafhængigt. Endda hæmmede en koncentration på µm H 2 O 2 den glucoseinducerede insulinsekretion MIN6-celler. Den blev ikke påvirket af H 2 O 2 i MIN6-celler med en glucosekoncentration på 2,8 mm glucose. I de Langerhanske øer fra mus fik Sakai et al. lignende resultater. Den glucoseinducerede insulinsekretion blev hæmmet koncentrationsafhængigt. Inhiberingen var signifikant ved en koncentration på 50 µm. Den glucoseinducerede insulinsekretion, blev ikke hæmmet af H 2 O 2 med en glucosekoncentration på 2,8 mm. I begge celletyper, blev der observeret en hæmning ved µm H 2 O 2. Forsøg har vist, at H 2 O 2 forårsager inaktivering af GADPH i isolerede rottehjerter [Chatham et al., 1989]. Sakai et al. [2003] foreslår derfor, at GADPH kunne være et potentiel target molekyle for H 2 O 2, og at dette kunne hæmme den første fase af den glucoseinducerede insulinsekretion [Sakai et al., 2003]. 3.4 Hexosamin-signalvejen Hexosamin-signalvejen, er ifølge flere forfattere, involveret i udviklingen af insulinresistens og diabetiske vaskulære komplikationer [Reviewed in Schleicher & Weigert, 2000; Pouwels et al., 2002]. Det er derfor af betydning at få klarlagt, hvordan denne signalvej fungerer, og dermed er involveret i udviklingen af diabetiske komplikationer. Hexosamin-signalvejen menes at deltage i dannelsen af det øgede oxidative stress under hyperglykæmi [Kajimoto & Kaneto, 2004] Forsøg på β-celler fra rotter har vist, at glucosamin øgede H 2 O 2 -produktionen koncentrationsafhængigt [Kaneto et al., 2001]. Det omtales i litteraturen, at hexosamin-signalvejen kan have en opregulerende effekt på PKC [Filippis et al., 1997]. Ved at udføre forsøg på adipocytter fra rotter, har Filippis et al. [1997] vist, at PKC stimuleres via hexosamin-signalvejen, ved både 3 mm glucosamin og 30 mm glucose. En inhibitor af GFAT blev tilsat til adipocytter, der var behandlet med henholdsvis 30 mm rglucose og 3 mm glucosamin. Inhibitoren af GFAT var i dette forsøg indikator for, hvorvidt hexosamin-signalvejen var involveret i PKC aktiviteten, da GFAT er det regulerende enzym i hexosamin-signalvejen. PKC-aktiviteten faldt drastisk ved tilsætning af GFAT i celler, der var behandlet med 30 mm glucose, hvorimod der ingen effekt var i de celler, der var 12

13 behandlet med glucosamin. Dette indikerer, ifølge Filippis et al. [1997], at hexosamin-signalvejen er involveret i PKC-aktivering medieret af glucose. Hexosamin-signalvejen kan hermed indirekte via PKC stimulere ROS dannelsen. Hexosamin-signalvejen kan stimuleres af både glucose og glucosamin. Enzymet, glutamin-fructose-6- phosphat-amidotransferase (GFAT), er det enzym, der regulerer gennemstrøminingen af glucose gennem hexosamin-signalvejen. Glucose importeres ind i cellen via glucose transportører. Glucose metaboliseres via hexokinase til glucose-6-phosphat, hvoraf størstedelen føres videre gennem glycolysen, hvor det metaboliseres til pyruvat. I glycolysen bliver 2-3 % af det metaboliserede glucose ført videre gennem hexosamin-signalvejen. Dette sker ved, at glucosamin-6-phosphat dannes ud fra en lille del af fructose-6- phosphat og aminosyren, glutamin. Denne proces katalyseres af GFAT [Filippis et al., 1997]. Glucosamin transporteres, som glucose, ind i celler via glucosetransportører. Inde i cellen phosphoryleres glucosamin hurtigt af hexokinase til glucosamin-6-phosphat, hvormed det når hexosamin-signalvejen direkte og springer GFAT over (figur 3.4) [Marshall et al., 2004; reviewed in Pouwels et al., 2004; reviewed in Schleicher & Weigert, 2000]. De enzymatiske trin i hexosamin-signalvejen er irreversible og kræver hverken ATP eller cofaktorer for at forløbe [Reviewed in Bouché et al., 2004]. GFAT er udtrykt i adskillelige humane væv såsom muskler, fedt, lever, vaskulære glatte muskelceller og i de Langerhanske øer i pancreas [Monauni et al., 2000]. Når glucosamin-6-phosphat er dannet, gennemgår det en hurtig omdannelse til UDP-N-acetylglucosamin, UDP-N-acetylglucose og andre nucleotide hexosaminer [Marshall et al., 2004]. De dannede hexosaminer i hexosamin-signalvejen er vigtige substrater for O-bundet glycosylering af transkriptionsfaktorer, RNApolymerase og kerneporeproteiner, hvis aktivitet ændres ved glycosylering [Emilsson et al, 2001]. Glycosylering resulterer i, at vækstfaktorer og cytokine gener transskriberes. Leptin er et af de cytokine genprodukter, der dannes ud fra glycosylering. Leptin fremmer nogle af de negative metaboliske effekter ved hyperglykæmi og hyperlipidæmi [Emilsson et al, 2001]. Flere transskriptionsfaktorer glycosyleres ved at få tilføjet et molekyle O-koblet β-n-acetylglucosamin til enten deres serin- eller threonin-rest. Denne hurtige omdannelse medfører ændringer i transskriptionsfaktorernes aktivitet og stabilitet. Hexosaminsignalvejen kan herved formidle effekten af glucose på flere genprodukter, og dermed deltage i glucotoxicitet [Reviewed in Bouché et al., 2004]. 13

14 ATP ADP Glucose Hexokinase Glu-6-p Fru-6-p Glykolyse Pyruvat Glucosamin Glutamin Hexokinase Glucosamin-6- p Glutamat Cellemembran N-acetyl glucosamin-6-p N-acetyl glucosamin-1-p UDP-N-acetyl glucosamin Glycoproteiner Glycolipider Figur 3.4: Glucose og glucosamin transporteres via glucose-transportører ind i cellen. I cellen bliver glucose phosphoryleret til glucose-6-phosphat (glu-6-p) af hexokinasen. Glutamin-fructose-6-phosphat-amidotransferase (GFAT) stimulerer dannelsen af glucosamin-6-phosphat (glucosamin-6-p) udfra Fru-6-p og glutamin. Glucosamin phosphoryleres hurtigt af hexokinasen til glucosamin-6-p, hvormed glucosamin indgår i hexosamin-signalvejen uafhængigt af GFAT. Efter dannelse af glucosamin-6-phosphat omdannes dette hurtigt til UDP-N-hexosaminer. Hexosamin-signalvejen er muligvis den mekanisme, der fungerer som cellulær sensor for niveauet af glucose i insulin-sensitive celler. Når insulin-sensitive celler udsættes for substrater, som for eksempel glucose, fede frie syrer eller glucosamin, opstår insulin-resistens, hvorved cellen forebygges mod overekspression af oxidative forbindelser [Reviewed in Bouché et al., 2004; Monauni et al., 2000]. Pouwels et al. [2002] har undersøgt, hvorvidt forøget dannelse af UDP-hexosaminer, UDP-Nacetylglucosamin og UDP-N-acetylgalactosamin, ved forhøjet aktivitet af hexosamin-signalvejen, er afgørende for insulinresistens forårsaget af hyperglykæmi. Forsøget blev udført på insulinresistente, overvægtige NIDDM-personer ved at måle hexosamin-signalvejens metabolitter. Metabolitterne blev målt fra muskelvæv før og efter intensiv behandling med intravenøs insulin. Behandlingen med insulin skulle medføre et stabilt, normalt glucoseniveau. Insulinmængden blev indstillet efter hver enkelt forsøgsperson. UDP-hexosaminerne blev målt ved brug af et HPLC-baseret assay, med hvilken det er muligt, at analysere små prøver af humant muskelvæv. Målinger af UDP-hexosaminer viste, at niveauet af disse var højere efter behandling med insulin end før behandlingen. Dette overraskede Pouwels et al. [2004], da forsøget hermed viser, at forøget aktivitet af hexosamin-signalvejen ikke har en afgørende rolle i hyperglykæmis påvirkning på insulinresistens i mennesker [Pouwels et al., 2002]. 3.5 Polyol-signalvejen Under normoglykemiske forhold phosphoryleres størstedelen af cellulært glucose til glucose-6-phosphat af hexokinasen. En lille del af det ikke phosphorylerede glucose føres under normoglykæmi gennem polyol- 14

15 signalvejen. Ved hyperglykæmi øges glycolysen og dermed stiger niveauet af NADH. Hexokinaseerne mættes med glucose, og mængden af glucose, der omdannes via polyol-signalvejen, øges, hvormed omkring en trediedel af den totale glucose-omdannelse vil gå gennem denne metabolske signalvej [Reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. Ved den øgede mængde NADH hæmmes glycolysen i det trin, hvor 1,3- biphosphoglycerat dannes ud fra glyceraldehyd-3-phosphat [Lee & Chung, 1999]. Der er flere eksempler på, at forøget aktivitet af polyol-signalvejen medfører diabetiske komplikationer [Amano et al., 2002; Coltons & Down, 2004; Hodgkinson et al., 2003]. Der er to enzymer i polyolsignalvejen (figur 3.5). Det første enzym er det regulerende, cytosoliske monomer enzym aldose-reductase [Amano et al., 2002; Reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. Aldose-reductase har et β/α motif-struktur, hvor der er et stort, aktivt hydrofobisk site. Det hydrofobiske site er placeret centralt i strukturen, og cofaktoren, NADPH, bindes hertil. Aldose-reductase katalyserer reduktionen af glucose til sorbitol med NADPH som cofaktor. Aldose-reductase har lav affinitet for glucose og ved normal glucosekoncentration, er det derfor omkring 3 % af det totale glucoseforbrug, der omdannes via polyolsignalvejen. Ved hyperglykemiske forhold øges reduktionen af glucose til sorbitol, hvormed NADPHkoncentrationen i cellen falder [Reviewed in Brownlee, 2001; Nashikawa et al., 2002]. Aldose-reductase findes i størstedelen af mammalie celler, men fordelingen af aldose-reductase i forskellige typer mammale væv er ikke ensartet [Reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. Der er fundet flere aldose reductase inhibitorer, heriblandt Fidarest [Amano et al., 2002], Zopolrestat [Wilson et al., 1993] og Sobinil [Urzhumtsev, 1997]. Det er vist, at Zopolrestat bindes på toppen af NADPHs aktive site. Bindingen af Zopolrestat forstyrrer positionen af to loops, der findes i strukturen, hvilke bevirker en konformationsændring i det aktive site [Wilson et al., 1993]. Sobinil bindes til det aktive site i aldose-reductasen uden konformationsændring af denne [Urzhumtsev, 1997]. Det andet enzym i polyol-signalvejen er sorbitol dehydrogenase (SDH). Dette enzym oxiderer sorbitol til fructose med NAD + som cofaktor, som reduceres til NADH, hvormed NADH-niveauet i cellen stiger [Amano et al., 2002; reviewed in Brownlee, 2001]. Oxidation af sorbitol til fructose er en langsom proces, hvilket medfører akkumulation af sorbitol i celler [Lee et al, 1995]. Under normoglykemiske forhold anvendes fructose blandt andet som energikilde til sæd i sædblæren [Reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. Koncentrationen af fructose stiger, fordi glucose gennemstrømningen i polyol-signalvejen accelererer. Det forhøjede niveau af fructose medvirker til akkumulation af glycationsprodukter i diabetiske væv. Dette skyldes, at fructose glycosyleres før glucose [Reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. I diabetiske retina er glycosylering blandt andet medvirkende til ændring af stukturen og funktionen af makromolekyler i væv, membranfortykkelse og et forhøjet niveau af frie radikaler i diabetiske retina [Lee og Chung, 1999; reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. Glucose AR Sorbitol SDH Fructose NADPH NADP + NAD + NADH Figur 3.5: Polyol-signalvejen. Glucose reduceres til sorbitol af enzymet aldose-reductase (AR) ved brug af cofaktoren NADPH, der oxideres til NADP +. Sorbitol oxideres af sorbitol dehydroganse (SDH) til fructose. SDH anvender NAD + som cofaktor, der reduceres til NADH. Forøget gennemstrømning af glucose gennem polyol-signalvejen under hyperglykæmi, påvirker aktiviteten af glutathion-reductasen og NO-syntasen, da cofaktoren, NADPH, forbruges af aldose-reductase (figur 3.6). Glutathion-reductase er et antioxidativt enzym, der varetager glutathion-koncentrationen i væv. Ved mangel på NADPH vil glutathion-reductasens aktivitet falde, hvormed glutathion-koncentrationen falder. Faldet i glutathion-koncentrationen vil medføre oxidativt stress under diabetiske forhold (afsnit 3.1). Ligeledes vil NO-produktionen fra NO-syntasen hæmmes, grundet mangel på NADPH. Hæmmet 15

16 produktion af NO vil medføre mikrovasculære forstyrrelser, og nerveimpulsers hastighed vil blive langsommere [Reviewed in Brownlee, 2001; reviewed in Yabe-Nishimura, 1998]. NAD+ NADH Normoglykæmi Glucose-6- phosphat CO2 Glucose Hyperglykæmi AR Sorbitol SDH Fructose L-Angenin NADPH NAD + NADP + NADH Glutation reduktase NO GSSG GSH Figur 3.6: Nedbrydning af glucose under hyperglykæmi via polyol-signalvejen og normoglykæmi. Under hyperglykæmi reduceres glucose af aldrose-reductase (AR) til sorbitol. Sorbitol oxideres til fructose af enzymet sorbitol dehydrogenase (SDH). AR benytter NADPH som cofaktor. Glutathion-reduktasen (GSSH-reductase) benytter ligeledes NADPH som cofaktor. Ved opregulering af polyol-signalvejen opstår konkurrence mellem AR og glutathion (GSSH), hvormed koncentrationen af reduceret glutathion (GSH) falder. Samme konkurrencetilstand opstår mellem AR og L-Angenin, hvilket medfører fald i NO-koncentrationen. Amano et al. [2002] har udført forsøg, hvor de har undersøgt enzymet sorbitol dehydrogenases funktionelle rolle i dannelsen af ROS og dermed udviklingen af diabetisk grå stær. Amano et al. [2002] udsatte bovine pericytter for henholdsvis 5 mm og 30 mm glucose. Pericytter er celler, der ligger uden på kapillærernes endotel og har muligvis en kontraktil effekt. Ved den høje glucose koncentration var sorbitolindholdet i pericytterne signifikant højere end ved de 5 mm glucose, hvilket viser, at hyperglykæmi stimulerer reduktion af glucose til sorbitol. Herefter undersøgte Amano et al. [2002], hvorvidt et højt glucoseniveau kunne stimulere dannelsen af intracellulært ROS i pericytter. I dette forsøg blev pericytter behandlet både med og uden sorbitol dehydrogenase, i henholdsvis 5 mm og 30 mm glucose, samt med og uden 0,3 µm af aldose-reductase inhibitoren Fidarestat (tabel 3.1) [Amano et al., 2002]. Fidarest var tilsat for at undersøge, hvorvidt blokering af første trin i polyol-signalvejen kan inhibere dannelsen af ROS, stimuleret af højt niveau af sorbitol dehydrogenase i pericytter udsat for høj glucosekoncentration 16

17 0,3 mm Fidarest + SDH i 5 mm glucose Ingen ROS dannelse + SDH i 30 mm glucose Ingen ROS dannelse - SDH i 5 mm glucose Ingen ROS dannelse - SDH i 30 mm glucose Ingen ROS dannelse Intet Fidarest ROS dannelsen stimuleres ikke ROS dannelsen stimuleres signifikant ROS dannelsen stimuleres ikke ROS dannelsen stimuleres moderat Tabel 3.1: Sobitol-dehydrogenase (SDH) behandlede pericytter med og uden behandling med SDH, udsat for henholdsvis 5 mm og 30 mm glucose. Der tilsattes henholdsvis 0,3 µm af inhibitoren af aldose-reductase, Fidarestat og intet Fidarestat. Ud fra resultaterne i tabel 3.1 ses, at ROS-dannelsen inhiberes ved tilsætning af Fidarest. Udfra denne inhibering, og at der ikke dannes ROS ved 5 mm glucose, konkluderer Amano et al. [2002], at dannelsen af ROS stimuleres ved akkumulation af sorbitoldehydrogenase i bovine pericytter under hyperglykæmi. Lee et al. [1995] har vist, at polyol-signalvejen har stor betydning for udviklingen af diabetisk grå stær. Da sorbitol har svært ved at diffundere ud af cellen, og oxidationen af sorbitol til fructose foregår langsomt, ophobes sorbitol under hyperglykæmi. Ved akkumulation af sorbitol opstår et osmostisk tryk, som kan medføre forøgelse af cellevolumen og ødelæggelse af fiberceller fra retina. Mus har normalt ikke særlig høje koncentrationer af aldose-reductase i retina. Derfor udvikler de sjældent diabetisk grå stær. Dette fik Lee et al. [1995] til at udvikle transgene mus med høj koncentration af aldose-reductase i retina. Mutationen i de transgene mus medførte blokering af oxidationen af sorbitol til fructose, hvorved sorbitol blev akkumuleret. Dette gjorde det muligt at se, om musene ville udvikle diabetisk grå stær. Forsøget viste, at jo højere indholdet af aldose-reductase i retina var, desto hurtigere forekom udviklingen af grå stær. Dette indikerer, at polyol-signalvejen inducerer udviklingen af grå stær gennem aldose-reductase [Lee et al., 1995]. Lee og Chung [1999] har i et forsøg brugt samme transgene mus som Lee et al. [1995]. Lee og Chung [1999] brugte musene til at undersøge forholdet mellem polyol-signalvejen og oxidativt stress. For at se, om aldose-reductase er involveret i produktionen af oxidativt stress i forhold til diabetes, målte Lee og Chung [1999] niveauet af reduceret glutathion. Niveauet af glutathion blev målt i retina på diabetiske transgene mus og diabetiske ikke-transgene kontrolmus. Musene blev delt op i to grupper, hvoraf den ene blev behandlet med Streptozotocin, og den anden fungerede som kontrol og blev behandlet med Streptozotocin. Ved normale glucoseforhold var glutathionsniveauet højt i begge gruppers retina. Ved hyperglykæmi faldt glutathionsniveauet brat i retina fra transgene mus, hvilket, ifølge Lee og Chung [1999] viser, at faldet af glutathion medfører oxidativt stress. I de diabetiske ikke-transgene mus, var der ingen videre ændring i niveauet af glutathion og malondialdehyd i retina [Lee & Chung, 1999]. Akkumulation af sorbitol i retina, kan ifølge Lee et al. [1995] medføre osmotisk stress i retina, hvilket muligvis kan medføre lækage eller svækkelse af importen af aminosyrer. En sådan svækkelse ville medføre reduceret glutathion-reduktion i retina og dermed yderligere øget oxidativt stress [Lee et al., 1995; Lee & Chung; 1999]. Den reducerede glutathion-reductase kunne, ifølge Lee et al. [1995] også skyldes, at den øgede gennemstrømning af glucose i polyol-signalvejen medfører konkurrence mellem glutathion og aldose-reductase om cofaktoren NADPH. For bedre at forstå årsagen til den reducerede aktivitet af glutathion-reductase, opstillede Lee et al. [1995] et forsøg, hvor retina fra transgene mus blev inkuberet i et medie, indeholdende glyceraldehyd. Glyceraldehyd har større affinitet for aldose-reductase end sorbitol har. Ved glyceraldehyd blev produktet glycerol dannet. Glycerol har samme effekt som sorbitol, men akkumuleres ikke i cellen. Dette vil sige, at en gennemstrømning af glyceraldehyd gennem polyolsignalvejen ikke danner osmotisk stress i celler fra retina. Lee et al. [1995] viste, ved at udsætte retina for glyceraldehyd i fem dage, at det ikke er osmotisk stress, der forårsager faldet af glutathion i celler fra retina. [Lee et al., 1995]. 17

18 3.6 Protein Kinase C Protein kinase C (PKC) er opkaldt efter calcium, da flere af de mindst 11 isoformer er Ca 2+ -sensitive, mens andre er diacylglycerol (DAG)-sensitive. DAG, som findes i membranen, har to potentielle signalroller; Det kan blive spaltet og frigive arachidonsyre, som kan fungere som signalmolekyle eller indgå i syntesen af prostaglandiner. Diacylglycerols anden rolle er at aktivere PKC. Når PKC er aktiveret, phosphorylerer det targetproteiner, som er forskellige afhængig af celletypen (figur 3.7). Hyperglykæmi kan aktivere PKC, hvilket kan have en indvirkning på udviklingen af komplikationer [Cosentino et al., 2003; Ramana et al., 2004]. Gennem PKC-signalvejen kan der under hyperglykæmi, dannes ROS i forøgede mængder [Reviewed in Couture & Girolami, 2004]. Endvidere kan superoxid aktivere PKC. [reviewed in Koya & King, 1998]. ROS kan herved virke både opstrøms- og nedstrømssignalerende på PKC [Lee et al, 2004]. Ligeledes viste Koya et al. i deres artikel fra 1998, at DAG-PKC-signalvejen er aktiveret i glomeruli i levende rotter med diabetes. Forsøgene udførtes med vitamin E, d-α-tocopherol, og de viste, at aktiviteten af DAG-PKC-signalvejen var nedsat i forhold til ubehandlet rotter. I glomeruli hos diabetiske rotter forhindrede behandling med d-α-tocopherol et forhøjet niveau af albumin [Koya et al., 1998]. Hyperglykæmi De novo DAG syntese Aktivering af PKC Aktivering af NAD(P)H oxidase ROS Figur 3.7: PKC kan inducere øget produktion af ROS, gennem aktivering af NADPH-oxidase, som PKC aktiverer. PKC aktiveres af hyperglykæmi via DAG-syntesen. Sammenhængen mellem PKC og hyperglykæmi er vist i forsøg udført på mesangial-celler fra både rotter og mennesker, hvor glucosekoncentrationer på 22 mm øgede aktiviteten af PKC. Sammenhængen blev kontrolleret ved at behandle cellerne med stoffet LY333531, der inhiberer PKC [Koya et al., 1997]. DAGaktivering af PKC har betydning for udviklingen af flere komplikationer, der opstår i forbindelse med diabetes. Blandt andet er DAG og PKC medvirkende til filtrationer i glomeruli, der kan medføre et forhøjet niveau af albumin i urinen. Forbedringerne skyldes ifølge Koya et al., [1998] at d-α-tocopherol påvirker DAG-kinasen, som omdanner DAG til phosphatsyre, der ikke kan aktivere PKC [Koya et al., 1998]. Lee et al [2004] har undersøgt, hvordan ROS-produktionen forøges under hyperglykæmi. Forsøgene blev udført med inhibitorer af NADPH-oxidase og af elektrontransportkæden på humane epitelceller fra bughinden (HPMC-celler). Forsøgene viste, at ved 50 mm glucose, blev en øget produktion af cellulært ROS induceret Induktionen fandt sted efter 15 minutter. Efter en time, var stigningen signifikant og efter 18

19 48 timer, var der fortsat den samme signifikante forskel i forhold til kontrollen. Ud fra forsøgene ses det, at H 2 O 2 er det dominerende ROS-molekyle, der dannes [Lee et al., 2004]. I 1996 blev det af Shostak et al. vist, at H 2 O 2 dannes i rotte-epitelceller fra bughinden samt at denne produktion signifikant øges af 1,5 % glucose i mediet [Shostak et al., 2004]. I samme forsøg af Lee et al. [2004] blev det vist, at sammenhængen mellem høj glucosekoncentration, der inducerer ROS, er dosis-respons-afhængig [Lee et al., 2004]. Endvidere er det vist, at dannelsen af cellulært ROS i HPMC, sker gennem aktivering af PKC, NADPHoxidase samt mitochondriel metabolisme [Lee et al., 2004]. Dette konkluderer Lee et al. af deres forsøg, som udførtes med diphenyleneiodinium chlorid og Apomycin, der begge er inhibitorer af NADPHoxidase samt Rotenon, der er en inhibitor af elektrontransportkæden. Forsøgene viste, at de tre inhibitorer alle hæmmede dannelsen af ROS, der var induceret af forhøjet glucosekoncentration (figur 3.7) [Lee et al., 2004]. Lee et al. [2004] undersøgte, hvorvidt ROS spiller en rolle på ekspressionen af fibronectin under hyperglykæmi. Ha et al. [2001] har vist, at høj glucosekoncentration inducerer opregulering af ekspressionen af fibronectin i HPMC og at denne inducering skyldes aktivering af PKC [Ha et al., 2001; Chan et al., 2003]. Lee et al. (2004) tilslutter, at høj glucosekoncentration, har stor betydning for syntesen af fibronectin i HPMC-celler. Denne dannelse af fibronectin kan hæmmes af antioxidanter [Lee et al., 2004]. I eksperimenter med glomeruli fra diabetiske rotter er der et forhøjet niveau af fibronectin og α1(iv) kollagen i forhold til kontrolgruppen. Det forhøjede niveau af de to komponenter reduceres ved behandling med LY Det er givetvis transformerings vækstfaktor-β1 (TGF-β1), der øger ekspressionen af fibronectin og α1 (IV) kollagen, da cellerne viste en øget ekspression af TGF-β1 mrnaniveauet, der kunne inhiberes med LY [Koya et al., 1997]. Fibronectin er et glycoprotein, der findes på overfladen af mammale celler og kollagen er et bindevævsprotein. Begge proteiner er medvirkende til, at blodkar kan forsnævres og ilttilførelsen svækkes. Et reduceret oxygenniveau kan aktivere hypoxia inducible factor-1 og vascular endothelial growth factor (VEGF), der øger angiogenesen, som er medvirkende til retinopati hos diabetikere (afsnit 4.5) [Reviewed in Conti; 2002, reviewed in Papetti & Herman, 2002]. 3.7 AGE Ved forhøjet niveau af glucose i blodet, vil der dannes glycolipider og glycoproteiner ved glycosylering. Dette sker uden enzymaktivitet. Der er blandt andet fundet glycosylering af hæmoglobin og albumin [Reviwed in Kajimoto & Kaneto, 2004]. De dannede glycoproteiner og glycolipider vil føre til dannelsen af en række reaktive produkter, som har fællesbetegnelsen; advanced glycation end products (AGE). Den ikke enzymkrævende glycosylering af proteiner og lipider samt den følgende irreversible dannelse og deponering af AGE menes, at være den vigtigste signalvej i patogenesen af gigt i forbindelse med diabetes [Reviewed in Basta et al., 2004]. Dannelsen af AGE udfra glycolipider og glycoproteiner sker under øget ROS-dannelse [Reviewed in Basta et al., 2004].. Cellek et al. [2003] mener derimod ikke, at der dannes ROS direkte ud fra AGE-dannelsen, men at ROS-dannelsen sker via AGE-receptoren, RAGE [Cellek et al., 2003]. Glycosylering af proteiner sker ved, at der spontant dannes en kovalent binding mellem aldehyd- eller keton-gruppen i den reducerende sukker og den frie aminogruppe i proteinet. Denne forbindelse kaldes en Schiff base (figur 3.8). Schiff basen vil spontant blive omdannet til Amadoris produkt, som er en ketoamin, der er mere stabil end Schiff basen [Reviwed in Basta et al., 2004]. 19

20 Protein Aldehyd H 2 N O Schiff s base N CH CH OH 4 Amadori s produkt HN H 2 C C O CH H 2 C OH CH OH 3 CH OH 4 H 2 C OH H 2 C Glucose OH CML Pentosidine m.fl. HC HC Glyoxal O O HC C H 2 C CH O H 3 C O C O O HC M ethyl-glyoxal OH 2 AGE s H 2 C OH 3-deoxy-glucosone Figur 3.8: Oversigt over mulige signalveje i dannelsen af AGE. Det ses, at proteinet kan reagere med aldehydgruppen i glucose og danne en Schiff base og derefter spontant videre blive omdannet til Amadoris produkt. Ud fra Amadoris produkt kan dannes en række forskellige AGE, blandt andet CML og pentosidin, der er medvirkende i udviklingen af diabetisk nephropati. Forhøjet niveau af CML og pentosidin betegnes carbonyl stress. CML benyttes som markør for intracellulært oxidativt stress. I cirklen ses intermidiaterne, glyoxal, 3-deoxy-glucosone og methyl-glyoxal, som kan blive dannet ud fra glucose, Schiff basen eller outooxidation af Amadori svprodukt. Disse kan reagere med frie aminogrupper og danne AGE fra [modificeret fra Basta et al, 2004]. Der findes en fri reaktiv carbonylgruppe på Amadoris produkt, som er medvirkende i konsekvenserne, som glycosylering er årsag til. Amadoris produkt kan omdannes til andre carbonylforbindelser, som ligeledes er vældig reaktive (figur 3.8). Disse carbonylforbindelser kan reagere med frie aminogrupper og på denne måde øge glycosyleringen. På figur 3.8 ses, at carbonylforbindelsen 3-deoxy-glucosone kan reagere med en fri aminogruppe og danne et glycoprotein [Reiewed in Basta et al., 2004]. Det er for nylig foreslået at intermediater, som fører til dannelse af AGE, også inkluderer dicarbonylintermidiater, som for eksempel 3-deoxy-glucosone, glyoxal og methylglyoxal. De to sidstnævnte kan endvidere dannes ved glucoseautooxidation og af produkter fra glycolipider. Disse glycosylationsprodukter vil blive omdannet til Amadoris produkt, og videre til AGE, som kan interagere med specifikke overfladestrukturer. Ved denne omdannelse ses en tilbøjelighed til at frigive ROS [Reviewed in Basta et al., 2004]. Dannelsen af AGE er forøget under hyperglykæmi og derfor er ROS-produktionen via AGE, ligeledes øget. Især dannes en øget mængde af AGE en methylglyoxal [Reviewed in Bonnefont-Rousselot et al., 2002]. Det er sandsynligt at produktionen af ROS under AGE dannelsen, sker via aktivering af NADPH-oxidase [Wautier et al., 2001]. NADPH-oxidase i hjertekar er et membranbundet enzym, som katalyserer dannelsen af superoxid, hvilket ses i følgende reaktion: NAD(P)H + 2O 2 NAD(P) + H O 2 - I reaktionen kan benyttes enten NADH eller NADPH som elektrondonor. Forsøg, udført med inhibitorer af NADPH-oxidase, tyder på en sammenhæng mellem NADPH-oxidase og produktionen af ROS ud fra AGE-dannelsen. Dette skyldtes, at produktionen af ROS blev hæmmet, når NADPH-oxidasen blev hæmmet [Wautier et al., 2001]. 20