UDVIKLING AF ELISA METODE TIL DETEKTION AF IP-10 PROTEIN I PLASMA

Transkript

1 UDVIKLING AF ELISA METODE TIL DETEKTION AF IP-10 PROTEIN I PLASMA Proffesionshøjskolen Metropol Bioanalytikeruddannelsen Udarbejdet af: Loren Esmael 7. Sem. Bachelor 2010 Projekt. Antal anslag: 38599

2 Forord Jeg takker klinisk forskningscenter afdeling på Hvidovre hospital fordi jeg har fået muligheden til at skrive min afsluttende bachelor projekt Jeg takker vejlederen på bioanalytiker uddannelsen Eigil Vejergang for tid og rådgivning. Jeg takker begge klinisk vejledere Morten Ruhwald og Jesper Eugen Olsen for opbakning, tid, enerig og rådgivning.

3 Indholdsfortegnelse: Resume... 1 Introduktion Problembaggrund Problemformulering Målformulering Begrebsdefinitioner Teori Adaptiv immunforsvaret og IP Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Metodevalg og afgrænsning Maxisorp mikrotiterplade Coating Begrundelse af blokering Antigen-antistof reaktion Enzym-substrat reaktion Begrundelse for valg af buffer Flowdiagram Fremgangsmåde Materialer og Metoder Apparaturer/materilaer Kemikalier og reagenser Prøvematerialer...15 Resultater...16 Diskussion...25 Konklusion...31 Referenceliste Vedlagte Appendix : 12

4 1. Resume: Tuberkulose skyldes infektion med bakterien (Mycobacterium tuberculosis). 1/3 del af verdens befolkning er inficeret med TB og omkring 2 millioner mennesker dør om åre. IGRA er nuværende test til diagnosering af TB men disse test har lav sensitivitet, specificitet og er omkostningsfulde både her og i ulandene. Videre udvikling af disse assay har forskere på Hvidovre Hospitalet arbejdet på. IP-10 protein bliver produceret i høje koncentrationer i blodet når man har LTBI, og kan dermed være en alternativ nye biomarkør til immun diagnostisk test. Derfor skal der valideres og udvikles en ELISA metode til detektion af IP-10 proteinet. ELISA metoden valideres ved at etablere en platform, hvor vi indstiller/optimerer ELISA parametrene. Vi beskriver range (måle område) med rekombinant IP-10 konc. Vi fastlægger en detektionsgrænse for assay'et vha. LOD og LOQ. Spike recovery har vi betsemt ved beregning af forskellige plasma koncentrationer for at se om der sker tab IP-10 konc. IP-10 er et stabilt molekyle som kan opbevares ved 23 Celsius, +5 Celsius og - 20 Celsius. 1

5 2. Introduktion: 2.1 Problembaggrund: Tuberkulose skyldes infektion med (Mycobacterium tuberculosis). Bakterien er et vigtigt globalt patogen som er en af de hyppigste smitsomme sygdomme. (1) Tuberkulose smitter ved dråbeinfektion. Dvs. hvis man er i nærheden af en hostende TB inficeret person i aktiv form, er man eksponeret og har risiko for at blive inficeret.(2) Når bakterierne kommer til lungen vil immunsystemet forsøge at bekæmpe infektionen. Lykkedes dette vil infektionen indkapsles og dermed etableres en latent infektion (LTBI). Lykkedes dette ikke spreder bakterien sig og den eksponeret bliver syg og kan smitte andre.(4). 1/3 del (2 milliarder) af verdens befolkning er inficeret med TB og omkring 2 millioner mennesker dør om året. 95% af alle nye tilfælde og 97% af alle dødsfald forekommer i Afrika, Asien, Syd- og Mellemamerika. Verdensunhedsorganisation (WHO) skønner at der er ca millioner nye inficeret tilfælde med TB om året. Kombination af TB med malaria eller HIV er en førende dødsårsag (1). Siden 1990'erne er HIV smitten steget voldsomt. Flere faktorer er med til tuberkulose epidemi stigningen. Sociale faktorer som fattigdom, utilstrækkelig sundhedssystem, underernæring og overbefolkning er med til at Tuberkulose rammer ulandene. Pga. HIV epidemien er Sydafrika hårdt af kombination af AIDS og Tuberkulose (5). Selvom TB i Danmark er et mindre problem end i de hårdt ramte lande, bruges tid på af screene og afkræfte LTBI. Det er estimeret at en halv million danskere der har LTBI. Autoimmune syge som f.eks leddegigt patienter, kan reaktivere LTBI såfremt de får TNF-alfa hæmmer som lægemiddel. Selve TNF- alfa er proteiner som signalstoffer og er en del af vores immunforsvaret. TNF-alfa har en anden rolle hos nogle leddegigt patienter, da der er opstået en fejl i immunforsvaret sådan at de får T celler til at angribe kroppens egne celler og medfører dermed betændelser. Derfor kan leddegigt patienter få TNF-alfa hæmmer som lægemiddel, hvilket hæmmer deres sygdom. Men konsekvensen af dette medfører også et svækket immunforsvaret hos disse patienter (6). Autoimmune patienter der skal starte TNF -alfa behandling skal derfor først screenes for LTBI. Forskellige assay til diagnosticering af LTBI har forskellige ulemper og fordele. Quantiferon TB 2

6 GOLD-in tube test og ELISA SPOT test er nuværende test (IGRA tests). Disse test er in Vitro assays der måler på produktion af interferon gamma efter stimulering med Mycobacterium tuberculosis specifikke antigener (ESAT-6, CFP10 og TB 7.7). Disse antigener er kodet inden for region forskel 1 (RD) segment af M. Tuberkulose genomet (9). QuantiFERON-TB Gold In-tube test måler på produktion og koncentration af IFN- gamma vha. ELISA efterfulgt inkubering af antigener med fuldblod. T-SPOT.TB test tæller antallet af T-celler, der producerer interferon gamma i en blodprøve. Tuberkulin testen (TST) er en billig test og har været anvendt mere end 100 år for diagnosticering af TB. TST er en hudtest, som er baseret på injektion af purified protein derivative (PPD) som er en slags afkog af Tuberkulose bakterier. Testen indeholder en blanding af forskellige mycobakterie antigener, inklusiv antigener der findes i vaccinestammen Mycobacterium bovis Bacillus Calmette- Guerin (BCG). Derfor har TST en lav specificitet da den ikke kun responderer på TB men og vaccinerede især hos immunsupprimerende patienter har TST en høj grad af falske-negative resultater (3). Sammenlignet med TST test er begge IGRA tester fundet til at have lave falskpositive resultater i forhold til TST (9). Men desværre er ingen af testene helt optimale da IGRA. IGRA er specifik men følsomheden ( ca. 50%) kan være lav pga. immun svækkelsen. Ydermere er IGRA en dyr test som ikke kan anvendes i ulandene, da der ikke er ressourcer, økonomi og rådighed til dette assay. Størst risiko for at få tuberkulose er verdens fattige folk som har den mindste chance til behandling. IP-10 eller CXCL10 er af CXC kemokin familien. IP-10 produceres af flere celletyper så som firbroblaster og monocytter. IP-10 kunne være en alternativ biomarkør til diagnosticering af TB i IGRA testene. Flere undersøgelse har vist at IP-10 bliver produceret i høje koncentrationer in virto hos patienter med TB infektion (10). Det er en mulighed for udvikling af en mere specifik, samt mere sensitiv test til diagnosticering af TB. En validering af ELISA sandwich metode til detektion af IP-10 er nødvendig før testen kan afprøves både her i Danmark og i ulandene. Målgruppen for projektet på Hvidovre Hospital er patienter med svækket immunforsvar patienter som skal starte biologisk behandling. Derfor er formålet med dette projekt er, at validere og udvikle en ELISA metode til detektion af kemokinet IP- 10 i plasma. Klinisk forskning center Hvidovre hospital af tidligere forsøg kommet frem til at IM2 antistof er et potentielt godt capture antistof i ELISA assay til detektion af IP-10 protein og IR1 et potentielt godt detection antistof. IM2 ( IP-10 mus monoklonalt antistof) og IR1 er produceret af en teknik der hedder hybridomteknik. IM2 antistof produceres i milten fra mus vha. denne teknik. IR1 3

7 antistof produceres fra rotter. 2.2 Problemformulering: Er det muligt, at udvikle og validere en ELISA metode ud fra nye antistoffer, IM2 og IR1, der reproducerbart måler kemokinet IP-10 i plasma? 2.3 Målformulering: Når vi er færdig med opgaven, forventer vi at: Udvikler og validerer en ELISA metode til måling af IP-10 i plasma. Indentificere den optimale af coating antistof (IM2) og detektion antistof (IR1). Vi laver standardkurve og kan beskrive ELISA range og lineært styk. Vi fastsætter kvalitativ detektionsgrænse ved beregning af LOD og fastsætter en kvantitaiv detektionsgrænse ved bregning af LOD. Vores assay vil være reproducerbart derfor ved intrassay variation skal CV% ligge under 10% som acceptabelt mens inter-assay variation skal CV% ligge under 20% som acceptablt. Ved spike recovery kan vi se om der sker IP-10 tab (interaktion) ved stigende plasma koncentrationer. Da assay skal bruges på mange forskellige måder for opbevaring, forventer vi at IP-10 er stabilt ved 23 Celsius, -20 Celsius og +5 Celsius. Derfor udføres forsøg til IP-10 stabilitet. 4

8 2.4 Begrebsdefinitioner: Forkortelse/begreber: Forklaring: LOD (Limit of Detektion) Metodens detektionsgrænse. Den laveste koncentration/måling man kan måle. Detektionsgrænse som angiver den laveste konc. af et givent komponent, der med statisktik sikkerhed detekteres. (15) LOQ (Limit of Quantification) Kvantificeringsgrænse: man kan med statistisk sikkerhed stole på den laveste koncentration som er målt i en prøve(15). Spike recovery: CV% SD Repeterbarhed Reproducerbarhed Spike recovery ser på nøjagtigheden af en immunoassay eller analysemetode. Fortyndig af en prøve kan forårsaget tab af en analysesand der fører til fejlagtige lave målte værdier. Til spike recovery bestemmes den procent af den tab og dermed at opdage interferende stoffer. Variationskoefficient, som fortæller variansen mellem målinger. CV%= SD/middel*100 Hvor stor er metodes analytiske spredning er. SD beregnes som kvartroden af den gennemsnitlige kvadrerede afstand fra gennemsnittet. Den præcision den enkelte person arbejde med. Den bestemmes f.eks. ved at lade personen gentage flere bestemmelser i samme mikrotiter plade samme dag(7). Den præcision den enkelte person arbejde med. Den bestemmes f.eks. ved at lade personen gentage flere bestemmelser i forskellige mikrotiter plade over flere (7). Diagnostisk sensitivitet: Diagnostisk specificitet: Matrix effekt In vitro Viser hvor god og følsom analysemetoden er, til at diagnosticere patienter med den pågældende sygdom dvs. hvor følsom er metoden til at fange de syge. Viser hvor god og følsom analysemetoden er, til at frigive de raske. At angive sand negativ resultat Interferende stoffer som kan konkurrere med IP-10 i plasma. Analyse/ biologiske forsøge af vævet udenfor levende oranisme kroppen. TMB Tetra methyl-benzidin, substrat reagens anvendes til ELISA assay (7). Skakbrætstitrering: PPD IP-10 Rek. IP-10 IM2 mab HRP-streptavidin: IR1: CFP10: 2 dimensional plan til coating antistof og detektion antistof på titerpladen. (Purified Protein Derivativ) er en blanding af mycobakterielle antigener. Interferon gamma inducerbare protein. Rekombinant IP-10 fra human IP-10 mus monoklonalt antistof ( produceres i milten fra mus) HRP-konjugeret Streptavidin består af streptavidin, såsom er et biotin-bindende protein fra Streptomyces avidinii. (7) Detektion antistof. Mycobacterium antigen ESAT6: (Mycobacterium antigen) Early secretory antigenic target 6 (3) 5

9 TB7.7 LPS IFN gamma HRP Stimuleret plasma Mycobacterium antigen Lipopolysakarid gram negativ bakterier. Under eksperimentel forskning kan anvendes til stimulation af fuldblod da det kan udløser immunrespons. nterferon gamma (IFN-γ) er en gruppe glykoproteiner, der kaldes for cytokiner. IFN-γ er signal stoffer og har betydning for regulering af immunforsvaret(10+3) (Horse radish Peroxidase) Det enzym peberrodsperoxidase (HRP) findes i peberrod Plasma hvor der er tilsat LPS i, som medfører at IP-10 kemokin bliver produceret. 6

10 2.5 Teori: Adaptive immunforsvaret og IP-10: Immunforsvaret angriber enhver mikroorganismer i form af parasitter, svampe, bakterier og virus. Immunforsvaret er inddelt i 2 overordnet systemmer. Den ene er den medfødte immunforsvar og den anden er den adaptive immunforsvaret. Den adaptive immunforsvaret er lymfocytter som inddeles i 2 hovedtyper, som har forskellige opgaver og egenskaber i kroppen. T lymfocytter og B lymfocytter. Lymfocytter stammer fra stamceller som dannes i knoglemarven. B lymfocytter dannes i knoglemarven og T lymfocytter dannes i thymus. Der findes utallige mange lymfocytter i blodet hver med sin specifikke receptor, som gør at den adaptive immunforsvaret kan bekæmpe ethvert fremmedstof. T lymfocytter inddeles yderligere til (TH) T hjælperceller og T dræbeceller.(tc). TH celler har T cellereceptor, men genkender ikke direkte antigenet. De har nemlig brug for antigen præcenterende MHCI og MHCII molekyler, som er et bestemte molekyle og findes på alle kroppens celler celler. TC cellen vil genkende MCHI vha. T cellereceptor (TCR recepotor) og derefter bliver reaktiveret. TH celler vil genkende MCHII vha T cellereceptor og derefter bliver reaktiveret. B lymfocytter producerer plasma celler (antistoffer) og hukommelsesceller. For at B lymfocytter kan danne antistoffer skal de aktiveres af antigener. Vha MHC II molekyler kan B lymfocyt, som antigenpræsenterende optage fremmedantigener på deres overflade. Yderligere kræves det en reaktivering af TH celler. TH celler kan reaktiverer B lymfocytter fordi de genkender antigen bundet til MCH komplekset (11). IP-10 kemokin som er en del af den adaptive immunforsvaret. Som nævnt i indledning IP-10 tilhører CXC kemokin familie (figur 1). Disse interferon proteiner bliver dannet ved konsekvens af immunsystem reaktion på infektion med både virus og bakterier. IP-10 produceres af monocytter. Monocytter/makrofager er antigenpræsenterende celler som fanger TB specifikke antigener (ESAT-6,TB 7,7 og CFP10) på overfladen. T-hjælperceller vil genkende det vha. Th1 (figur 1) IP-10 er CXC familie, ses op til højre på figuren 7

11 celler. T-hjælperceller bliver aktiveret og får monocytter til at producerer IP-10 (10). IP-10 er vejer 10 kda og består af 98 aminosyrer. Kemokiner er kemotaksiske cytokiner som er små molekyler/proteiner. Cytokiner er signalstoffer, der udskilles fra makrofager og neutrofile celler i immunsystemet. Kemokiner er klassificeret i 4 familier som : CC, C, CXC og CX3C. IP-1p er af CXC familie (12) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): ELISA er en immunkemisk metode, der anvendes til detektion af en antigen-antistof reaktion og bruges specielt til immunologi til at påvise og bestemme tilstedeværelse af et specifikt antistof eller antigen i en prøve. Der er flere forskellige varianter af ELISA, afhængig om man vil bestemme antigen, antistof. I den direkte sandwich ELISA sidder enzymet på det primære antistof (detektion antistof) mens ved indirekte metode er enzymet konjugeret på det sekundære antistof som er bundet til det primære antistof (7). Vi har lavet en sandwich ELISA for IP-10 og den er opbygget på følgende måde: Analyseprinccip for IP-10 ELISA er hvor antigen IP-10 indfanges af antistof (IM2) Detektionsantistof (IR1) som er bundet til enzymet (HRP) tilsættes. Farver reaktionen starter når subsratet (TMB) tilsættes og til sidst stoppes reaktion ved anvendelse af svovlsyre (H 2 SO 4 ) reagens. ELISA readeren måler på farveintensiteten (aborbans) ved 450 nm. Figur (2): Direkte sandwich ELISA analyseprincip til (figur 2). detektion af IP-10 8

12 2.6 Metodevalg og afgrænsning: Direkte sandwich ELISA består er flere trin (figur 3): Maxisorp mikrptiterplade: Maxisorp mikrotiterplade er lavet af polystyren materialet bestemt af 96 (8x12), der kan have volumen på 280 µl. Overfladen har høj hydrogen bindingskapacitet og hermed en høj bindingsevne (7+17) Coating: IM2 capture antistof tilsættes i coting buffer i karbonat buffer (ph 9,6, 0.05M). Vi coater 100 µl af coating buffer i hver brønd på Maxisorp mikrotitter plade. Karbonat buffer er basisk og medfører optimal adsorption til brøndoverfladen. Ionstyrken skal også være passende fordi for høj ionstyrke bevirker, at binding mellem de immobiliserende stoffer og polystyren bliver løsere. Coatingstiden har også betydning for bindingsevne Figur (3):Direkte sandwich ELISA mellem antistoffet og brøndoverfladen. passende tid til metode processen er visualiseret trin for trin Hvis tiden er for kort kan det medføre, at coating i brøndende bliver uensartet. Øget temperatur og for længe inkubationstid medfører denaturering af proteiner. Ved 4 Celcius anbefales coatingstid natten over mens når det er 37 Celcius anbefales coatingstid på 3-4 timer. Reagenser skal være sterile. Urenheder kan optage plads på overfladen i stedet for det ønskede molekyle. Efter caoting vaskes overskud af antistoffet væk og ustabile monolag. 9

13 2.6.3 Begrundelse for valg af Blokering: Den næste trin for ELISA Assay'et er at blokere ledige pladser på plastoverfladen med en inaktiv protein. Blokering med inaktivt protein forhindrer kydsreaktioner sådan at der ikke opstå falske positiv resultater. Der er forskellige blokerings buffer men vi vælger at anvende inaktiv Pierce StartingBlock og tilsætter 100 µl. For at blokering virker har temperaturen, tid og omrystning en betydning men de angives meget forskelligt(7+17). Vi vælger at omryste pladen i 10 min. ved stuetemperatur Antigen-antistof reaktion : Efter blokering af brøndene, tilsættes prøve (med antigen) plus detektion antistof. konjugeret antistof. Det er meget vigtigt at alle brønde får den samme inkubationstid i blande plade for at have den samme reaktionstid (17). Vi vælger 1 times inkubationstid på 37º C som mest passende,som tidligere har det vist sig at være den mest anvendte temperatur for inkubationen. Ikke alle antistoffer kan reagere hurtigere ved at øge temperaturen under inkubation. Det er bedst at undgå lang inkubationstider for at uspecifikke bindinger Enzym-substrat reaktion: Efter inkubation trin vaskes pladen 4 gang for at fjerne overskud af uspecifikke stoffer. Vi tilsætter substratet TMB som omdannes til farveprodukt vha. enzym HRP. Svovlsyre stopper reaktionen inden reaktionen er løbet til ende. Vi har anvendt 4-30 minutter som reaktionstid. Derefter er brøndene i titerpladen klarer til fotometrisk måling. Som nævnt før ELISA readeren måler på bølgelængden ved 450 nm og reference 630 nm Begrundelse for valg af Buffer: Buffer indgår som vigtige bestanddel i mange reagenser ved immunkemiske analyse. Reaktioner skal foregår under veldefineret ph. Som nævnt før anvendelsen af coatingsbuffer ved ph 9,6 er med til at få en bedre bindingsevne. Dilution buffer som vi anvender en del til at fortynde vores prøve med indeholder forskellige reagenser som f.eks. detergenter Tween 20. Tween 20 giver en god opløselighed af andre komponenter i fortynding/prøven. Tween 20 indgår 10

14 også i Wash Dilution buffer (vaske buffer) som også er med til at blokere brøndene efter caoting af pladen Flowdiagram Flowdiagrammet illustrer den praktisk del af projektets. Projektet består overordnet af 2 følgende forsøg: 1.Etablering af platform/ Optimering af parametrene. 2.Validering og beskrivelse af ELISA karakteristika. 1.a Bestemmelse af IM2 konc. 1. Etablering af platform Indstilling af parametre (skakbræt titrering) 1.b Bestemmelse af detektion mab (IR1) konc. 1.c Undersøgelse af den dynamiske range (måle område)/standard kurven 2. Udvikling og beskrivelse af ELISA karaktistika 2.a Etablering af plasma bank (indsamler prøver til forsøget) 2.b Beregning af LOD og LOQ 2.c Recovery i plasma 2.d Inter og intraassay variation 2.e IP-10 stabilitet -Stue. Temp (23Celsius ) -Frys og Tø (-20 Celsius) -Køleskab (+5 Celsius) 11

15 2.6.8 Fremgangsmåde: Flowdiagrammet beskrives yderligere herunder fremgangsmåde: 1.Etablering af platform/indstilling af parametrene. Som flowdiagrammet viser, er det skakbræt titrering vi starter med at udføre. Skakbræt titrering er en todimensional plan. Først coater vi med (IM2) mab på Maxisorp mikrotiter pladen og derefter detekterer vi med (IR1) på den samme plade. (figur 4) (figur 4) skakbræt titrering 1.a Bestemmelse af IM2 konc. : Vi bestemmer den optimale koncentration af mab IM2- antistof. IM2 fortyndes i karbonat buffer ved ph 9,6. Ved hjælp af 2-foldsfortynding varierer vi koncentration af IM2, hvor den højeste koncentration skulle være på 12 µg/ml og den mindste på 0. Udvalg af disse koncentrationer er baseret på tidligere studier. 1.b Bestemmesle af detektion mab (IR1) konc: Den samme mikrotiterplade, skal der bestemmes koncentration af IR1detektionantistof. Ved hjælp af 2-foldsfortynding varierer vi IR1og HRP koncentration mens IP-10 konc. er konstant. Den højeste koncentration på IR1 skulle være på 0,250 µg/ml og den mindste på 0. Udvalg af disse koncentrationer er baseret på tidligere studier. 1.c Undersøgelse af den dynamiske range Vi medtager en række standardfortyndinger af rekombinant IP-10 til at lave en lang standardkurve (S-kurve) den lineære del, angiver metodens detektionsområde som kan bruges til aflæsning af prøven. Vi vil undersøge og måle IP-10 koncentrationer, som er på de lave område, høje område og ret linje (figur 5) (figur 5) standardkurven 12

16 2. Udvikling og beskrivelse af ELISA karakteristika: 2.a Etablering af plasma bank (Appendix nr. 1) Indsamling af prøver til forsøget. Vi anvender (Lipopolysakarid) LPS til at stimulere fuldblød. Når blodet er stimuleret vil der produceres IP-10 kemokin som immunrespon. Vi laver foskellige stim:ustim forhold af plasma prøver. Stim og ustim plasma prøver bruger vi til en del af efterfølgende forsøg for at validere metoden. Vi afprøver vores donor prøver med (stim:ustim) og ser om LPS stimulering i fuldblod har medført IP-10 producering. Jo mere tilsætning af stimulans (LPS) jo højere konc. af IP-10 dannes. 2.b Bestemmelse af LOD og LOQ: Der bliver målt på 15 blanke prøver med dobbelt bestemmelse. Blanke prøver indeholder hverken rekombinant IP-10 eller plasma. 2.c Spike Recovery (interaktion men plasma): Praktisk forsøg måler vi på forskellige plasma donorer forhold i prøver med spike (+ rekombinant IP-10) og uden spike med (+BSA men rekombinant IP-10). Vi anvender ustimuleret plasma prøver 2.d Inter og intraassay variation: Ved intraassay udfører vi flere målinger af 5 forskellige donorer på samme dage. Ved beregning af CV% og SD kan vi se på reproducerbarhed mellem målinger. Ved inter-assay udfører vi flere målinger af 5 forskellige donorer over flere dage. Ved beregning af CV% og SD kan vi se på repeterbarhed mellem målinger. 2.e Forsøg til undersøgelseaf IP-10 stabilitet: Køleskab forsøg (+5 Celsius) Plasma prøver fra 5 forskellige donor i 5 forskellige forhold (stim:ustim) med LPS anvendes til køleskabforsøg. Alle donor prøver opholdes i køleskab i flere tidsintervaller. Disse prøver opbevares køleskab i 1 uge, 2 uger, 3 uger, 4 uger og 5 uger. Der medtages også referencen som 0 uge. Vi måler på disse prøver og afgør om der sker tab af IP-10 ved at opbevare plasma i køleskabet. Frys og tø (-20 Celsius): Plasma prøver fra 5 forskellige donor i 5 forskellige forhold (stim:ustim) med LPS anvendes. Alle donor fryses og tøes forskellige antal gang. Derefter måles på antal gange af frys og tø på disse prøver. Vi måler på disse prøver og afgør om der sker tab af IP-10 ved at fryse - tø flere gange.stue.temp. forsøg(23 Celsius): Plasma prøver fra 5 forskellige donor i 5 forskellige 13

17 forhold (stim:ustim) med LPS anvendes til stuetemperatur forsøg. Alle donor prøver opholdes i stuetemperatur i flere tidsintervaller. Disse prøver opbevares i 1 dag, 2 dage, 3 dage og 4 dage. Vi måler på disse prøver og afgør om der sker tab af IP-10 ved at opbevare plasma i stue.temp. 3. Materialer og metoder: 3.1 Apparaturer/materialer: Pipetter: Producent :Thermo Multikanal pipette: Lot. nr: Producent: BIOTH firma µl ELISA readeren. Apparat nr: Producent :ELX808 Ependorfrør: 1. Ependorf rør: Producent: MicroAmp TM tube strips 2. Ependorf rør : Producent: fra Nunc crytube 1,0 ml Sealing tape Coatingsplade Maxisorp plade: Producent: Nunc firma Blandingsplade Nunc plade. Vortex: apparat nr: Blandingsrør 50 ml 14

18 3.2 Kemikalier/ Reagenser: BSA( Bovin Serum Albumin) PBS (Phosphat buffer Salin): ph 7,4 V.nr: Prodocent: Hvidover Apotek Tween 20 0,1 % : Lot nr. S Producent: MERCK Shuchardt OHG Bovine IgG stock Producent: Nordic immunology BigG Batch nr: 5664 Dilution buffer: se (Appendix nr.2) Indeholder: BSA, Tween 20 0,01%, PBS IgG og steriltsaltvand. Coating buffer: 0,05 M sodium carbonate( Na 2 CO 3 ph 9,6) PSB (Pierce StartingBlock): lot. nr: KH HRP (streptavidin HRP) Prodocent: Becton Dickinson Wash Dilution: se (Appendix nr.3) TMB (Titra methyl benzin) : lot nr: Producent: Kem En Tee Diagnostics Svovlsyre ( H 2 SO 4 ) 1 mol/l :V nr: Millipore vand Sterilt vand 3.3 Prøvematerialer: LPS Stimulation Plasma Prøver ( 5 frivillige Donorer ) : se Appendix nr.1 15

19 Rekombinant IP-10 Peprotech ; Norge IM2 mab: Batch nr: 1609 Peprotech; Norge Detektionsantistof (IR1) 4. Resultater: For overskuelighedsskyld følger jeg processen beskrevet i flowdiagrammet (side 10): Som nævnt før består projektet betsår af 2 overordnet forsøg: Etablering af platform/optimering af parametrene og validering og beskrivelse af ELISA karakteristika. 1.Etablering af platform/indstilling af parametrene: 1. a Coating antistof og 1.b Detektionsantistof. Graf 1.a til venstre vises at detektion mab (IR1) konc. bliver mættet ved 0,125 ug/ml på x-aksen og aflæste OD på y-aksen Graf 1.b til højre bestemmes coating mab (IM2) konc. som bliver mættet allerede ved 2 ug/ml på x-aksen og aflæste OD på y-aksen. 16

20 1.c Grafer/ undersøgelse af den dynamiske range: (graf 1.c.1) illustrerer lange standardkurven Sammenligne af vores lange standard graf med de udleverede standardrække. (graf 1.c. 2) standardkurve illusterer udelverede standardrække Udleverede standardrækken er aflæst. Til forsøget anvender vi en standardrække af tidligere studier, som vi har fået udleveret. Der er angivet følgende IP-10 koncentrationer: 1500, 1000, 500, 250, 17

21 100, 25, 5, 0 pg/ml er illustreret på x-aksen og aflæste OD'er på y-aksen. Som ses på begge grafer at standardlinien knækker ved ca pg/ml. 2.Validering og beskrivelse af ELISA karakteristika: 2.a graf Graf: 2. a Her viser grafen at IP-10 konc. stiger jo mere stimuleret plasma konc. hos alle 5 donor. X-aksen præcenter stim:ustim plasma forhold mens y-aksen præcenter ufortyndet IP-10 koncentration. Afprøvning af vores plasma prøver som vi har fremstillet i ustim:stim forhold. Ved yderligere beregning ses (Appendix nr.12) 18

22 2.b Beregning af LOD og LOQ LOD og LOQ beregnes som følgende formler: LOD= værdi af (blanke)+3*sd LOQ= værdi af (blanke)+10*sd Konc 1 pg/m L Konc 2 pg/m L ,9 1,9-1,9-3,8-1 -3,8-1,9-2,9-1 -1,9-2,9-1,9-2,9 0-3,8-1,9-1,9-2,9-3,8 0-2,9-1,9-1,9-2,9-4,8-3,9-2,9-1,9 værdi = -2,08 SD = 1,14 LOD = 1,35 LOQ = 9,33 Vi måler på 15 blanke prøver med dobbelt bestemmelser. Ved aflæste OD'er omregner vi til koncenrationer. Der er beregnet forskel på konc.1 og konc.2 (dobbeltbestemmelse). Som ses på tabellen er LOD og LOQ beregnet vha. af SD og middelværdien. 19

23 2.c Spike Recovery: Nedenstående Graffer for donor 2 og 5 viser spike recovery konc. og spike recovery i (%). Eksempel for beregning af spike recovery i (%) for donorer (Appendix nr. 4) Grafer 2.c for donorer 2 20

24 Grafen til højre præsenterer Recovery i (%) for donorer 2 Der vises ustim plasma forhold i (%) på x-aksen mens recovery i (%) er på y-aksen Recovery i (%) = Spike plasma / Spike 0 *100 Formlen er anvendt til at beregne recovery i (%) på y-aksen Grafen til venstre præsenterer Spike recovery for donorer 2 Der vises ustim plasma forhold i (%) på x-aksen mens IP-10 konc. i pg/ml på y-aksen. IP-10 konc. pg/ml er beregnet udefra dobbelt bestemmelsen af spike plasma 2. d Intra- og interassay variation (Appendix nr.5): Intra-assay variaton: Nedenstående tabel viser flere målinger af hver donor på samme dag (5 donorer). Ved beregning af CV% og SD kan vi se på repeterbarhed mellem målinger (18). CV % = SD/middel*100 21

25 Table 1. Donor 1 flere målinger på samme dag Ustim: stim SD CV% forhold i % 1. måling 2. måling 3. måling 4. måling 5. måling målinger , , ,4 714, ,5 1194,6 3, ,6 1407,5 1, ,4 1813,2 2,7 26,8 2,7 Ved beregning af SD og CV% sammenlignes gentagne målinger på den samme donor (1) CV% viser variation mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. Inter-assay variation: Nedenstående tabel viser flere målinger af hver donorer over flere dage ( 5 donorer). Ved beregning af CV% og SD kan vi se på reproducerbarhed mellem målinger. Tabel 2: Donor 1 flere målinger over 5 dage: Ustim: stim SD CV% forhold i % Måling Måling Måling Måling Måling målinger Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag ,87 241,71 154,19 160,74 145,93 180, , , ,93 582,28 500,93 604,33 115,37 19, , ,96 753, ,22 801, ,44 248,07 24, , , , , , ,74 339,23 23, , , , , ,7 1752,3 435,7 24,86 Ved beregning af SD og CV% sammenlignes gentagne målinger over 5 dage på den samme donor (1) CV% viser variation mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. 2.e Forsøg til undersøgelseaf IP-10 stabilitet: Graf 2.e.1 ved Stuetemp. forsøg (23º Celsius) graf: Dette er en repræsentativ graf udefra 5 stue.temp. forsøg grafer. Resten af grafer ses ved Appendix nr. 6 22

26 Grafen præsenterer IP-10 stabilitet i plasma opbevaret op til 4 dage. på y- aksen vises (%) af referencen, IP-10 i prøven sammenlignet med en reference prøve der ikke har stået ved (23º Celsius). Et eksempel på beregning af ref. i (%) Ved 4:0 ( pg/ml) Dobbelt bestemmelse af referencen Konc. ref 1 Konc. ref ,7 pg/ml 1066 pg/ml (1118,7+1066)/2= 1092,8 pg/mlmiddel ref. Referencen er IP-10 konc. målt ved 0 dage i stue.temp. Derefter beregner vi i (%) målte konc. /middel ref. *100 yderligere beregninger se ved (Appendix nr. 7) Graf 2.e.2 ved frys og tø forsøg (-20 Celsius) Dette er en repræsentativ graf udefra 5 frys og tø grafer. Resten af grafer. Ses ved (Appendix nr. 8) 23

27 Grafen præsenterer IP-10 stabilitet i plasma ved op til 5 gang frys og tø. På y- aksen vises (%) af referencen, IP-10 i prøven sammenlignet med en reference prøve der ikke har været optøet før. Et eksempel på beregning af ref. i (%) Ved (ref. 1107pg/mL) Dobbelt bestemmelse af reference. Konc. ref 1 Konc. ref ,0 pg/ml 1110,6 pg/ml (1104, ,6)/2=1107,3pg/mLmiddelref. Referencen er IP-10 konc. målt ved 0 antal frys og tø Derefter beregner vi i (%) målte konc. /middel ref. *100 yderligere beregninger ses ved (Appendix nr. 9) - Graf 2.e.3 for Køleskab (+5 Celsius) forsøg Dette er en repræsentativ graf udefra 5 grafer af køleskab forsøg. Resten af grafer ses ved (Appendix nr. 10) 24

28 Grafen præsenterer IP-10 stabilitet i plasma ved opbevaring op til 5 uger. På y- aksen vises (%) af referencen. IP-10 i prøven sammenlignet med en reference der ikke har stået ved (+5 Celsius) Et eksempel på beregning af ref. i (%) ved ( ref pg/ml) Dobbelt bestemmelse af reference. Konc. ref 1 Konc. ref ,9 pg/ml 1291,9 pg/ml (1170,9+1291,9)/2=1231,4pg/mLmi ddelref. Referencen er IP-10 konc. målt ved 0 antal gang i køleskab. Derefter beregner vi i (%) målte konc. /middel ref. *100 yderligere beregninger ses ved (Appendix nr. 11) 5. Diskussion: 25

29 1.a coatingantistof, 1.b detektion antistof Udefra graf 1.a. Kan det vurderes at detektion mab (IR1) bliver mættet allerede ved ca µg/ml Af tidligere studier har afdeling vurderet IM2 optimale koncentration på 3 µg/ml men det interessant er at fra vores egen forsøg er mab (IM2) optimale koncentration på 2 µg/ml (graf1.b) Materialebrug som IM2 er dyre. Udefra forsøget kan man vurdere at der kan spares lidt på reagenset. Det er en fordel at der kan spares 1 µg/ml IM2 hver gang den anvendes til coating af pladen. 1.c standard grafer: 1.c.1 graf Vi varierer IP-10 koncentration hvor den højeste konc. er på 5,93 ng/ml vha. 19 fortyndinger. Efter flere forsøg kom vi frem til at den højeste IP-10 konc. skulle være på 5,93 pg/ml vha. 2- foldsfortynding. Vi laver standardkurven for at kunne sammenligne med den udleverede, da vi skal anvender den til praktisk forsøg. 1.c.2 graf Udleverede standardrækken er aflæst. Til forsøget anvender vi en standardrække af tidligere studie som vi har fået udleveret. Der er angivet følgende IP-10 koncentrationer: 1500, 1000, 500, Ved sammenligning af vores standardakurve og de udleverede standardkurve, kan det ses, at begge kurve knækker ved 1500 pg/ml. Som grafer (1.c.1 og 1.c.2) viser, ses at begge standardkurve knækkes ved ca pg/ml. Senere hen i det praktisk forløb har vi fundet ud af, at udleverede standardrække knækker allerede ved 1000 pg/ml og ikke 1500 og pg/ml. På baggrund af dette har vi ekskluderet den øverste målte koncentration. Det betyder at i vores assay er den lineære del af standardkurven er mindre end den første. 26

30 2.c Spike Recovery (interaktion men plasma): Der er målt på flere donorer ustimuleret plasma forhold recovery i (%) for at se generelt hvordan spike recovery ser ud. Generelt ved alle donorer falder spike recovery grafen ved 20% plasma forhold (Appendix nr.4) Ydermere generelt begynder grafer med at stige lidt fra 0% til 10% og det kan have noget med blokering effekt at gøre. Blokering af prøver med en inaktiv protein måske foregår ikke optimalt. Antigener i prøven kan binder sig til både antistoffer IM2 og de ''inaktive'' proteiner. Under resultat afsnit vises spike recovery studier ved forskellige koncentrationer af plasma. Ved stigende mængde plasma ses mindre recovery.. Dette kan ske for plasma indeholder proteiner og salte. Jo mere plasma mængde jo flere salte og proteiner, hvilket medfører mindre recovery. Matrix effekten kan have en betydning. IP-10 kan risikere at binde sig til andre proteiner end vores IM2 antistof. Derfor på den måde kan der ske tab af IP-10 protein. Vi ser på (graf 2.c til venstre) spike recovery falder lidt ved ca. 20% ustimuleret plasma forhold. Det betyder allerede ved 20% plasma er der andre proteiner der konkurrer med IP-10 til at blive detekteret. Men det ses ved (graf 2.c til højre ) recovery i (%), at recovery falder fra 100% til 80%. dvs. der er forskel kun på 20% recovery, som alligevel er ikke så ringe. Det er mindre en halvdelen. 2. d Intra- og interassay variation resultater/tabeller: Intra-assay variation: Intra-assay variation flere målinger af hver donorprøver på samme dag. CV% viser variansen 27

31 mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. Ved beregning af CV% og SD kan vi se på repeterbarhed mellem målinger for hver donor/prøve. Som nævnt før at der er blevet målt på 5 donorer ved intra-assay variation. Vi har valgt at måle på alle donor. Vi ser generelt på hvordan ser repeterbarhed ved intra-assay 5 gang. Det viser igen at CV% overstiger ikke 10. For donorer 1, 2, 3, 4 og 5 er CV% 2.7, 9.6, 2.9, 4.9 og 3.5 i rækkefølge. Se (Appendix nr. 5) Tabel 1 for donor 1 flere målinger på samme dag under resultat afsnit, ses at CV% ser acceptable ud. Acceptable på den måde at CV% ikke overstiger 10. Generelt for donor 1 ligger CV% på 2,7 som betyder at variation mellem målinger er ikke stor. Det betyder at vi har en god repeterbarhed når vi gentager flere målinger samme dag. Inter-assay variation: Inter-assay variation viser flere målinger af hver donorprøve over flere dage. Donorer prøver er plasma indeholdende IP-10 i forskellige forhold. Ved beregning af CV% og SD kan vi se på reproducerbarhed mellem målinger over flere dage. Tabel 2 for donor 1 flere målinger over flere dage sammenlignes ved beregning af SD og CV%. Normalt er CV% ved reproducerbarhed større end repeterbarhed, da flere usikkerheder angiver højere CV%. Nøjagtigheden af resultater har afhængig af prøvematerialet, analyseudstyret, analytikkeren. Ved repeterbarhed har vi anvendt den samme materiale, titerplade, udstyr, analytikker som angiver mindre usikkerhed på anlyseresultater end reproducerbarhed. Reproducerbarhed måles af standardafvigelse. Som intra-assay er udført af forskellige personer, forskellige udstyr (f.eks mikrotiterplade) og materialer. Det giver større usikkerhed for fejlkilder kan opstå. Ved vores tilfælde er CV% ved inter-assay højere end normalt. Dette kan skyldes en systematisk fejl. Som vi kan se på tabellen at CV% er høje da de fleste overstiger 20% som acceptabelt. CV% er også højt ved lave og høje koncentrationer som gælder både inter-assay variation og intraassay variation. 2.e Forsøg til undersøgelse af IP-10 stabilitet: 28

32 At undersøge om IP-10 er holdbart ved forskellige opbevarings former, vil være en stor fordel især i ulandene. Der findes får laboratorier med manglende ressourcer i ulandene. Derfor bliver der transporteret prøver fra landsbyer til de steder hvor der findes laboratorier. At transportere prøver kan det tage tid. Vi vil med vores stabilitet forsøg se om IP-10 er et stabilt protein den er udenfor køleskab (hvis det skulle transporteres i ulandene) hvis assayet anvendes. Opbevaring af IP-10 i plasma ved stue.temp. over flere dage lykkedes viser forsøgsresultater. Der vises (graf 2.e.1) for donor 5 at IP-10 er stabilt. Der sker ikke tab af IP-10 proteinet i plasma ved stue.temp. opbevaring over flere dage. Referencen er medtaget i forsøget, hvor vi sammenligne IP-10 i prøven med referencen som ikke har stået ved 23 Celsius. Frys og tø forsøg viser også at IP-10 protein er stabilt. Der ses på graf (2.e.2) for donor 3 viser at der ikke sker tab af IP-10 proteinet. IP-10 proteinet i plasma kan fryses og tøes flere gang over flere dage. Endnu en måde til IP-10 plasma opbevaring. Graf (2.e.3) viser IP-10 stabilitet er i orden. Det er køleskab forsøg hvor der vises at IP-10 proteinet er stabilt over flere uger ved opbevaring i køleskabet. Generelt har jeg forventet at IP-10 ville være stabilt eller måske lidt faldende ved disse forskellige opbevaring metoder. IP-10 har vist sig at være stabilt som forventet men overraskende ved nogle donor er IP-10 konc. steget som ikke forventet se (Appendix numre 6, 8 og 10). Det kunne tænkes at IP-10 molekyle har evnen til at binde sig med andre proteiner men pga. denaturering af proteiner kan disse bindinger går i stykker og IP-10 frigivet mere i plasma. Sensitivitet, specificitet og IP-10: 29

33 Da IP-10 produceres i høje koncentrationer og dermed giver mulighed for at vælge detektion grænse lavt eller højt. Dette er ikke muligt for IFN-gamma da niveauerne er meget lave. Hvis man vælger detektion grænse lavt, har man valgt en mere sensitiv assay men specificitet vil være lav. Høj sensitivitet angiver sand positive resultater (her detektere alle de syge) men samtidig øges risikoen for falsk positive resultater ( raske som betragtes som syge) Hvis man vælger detektions grænse højt, har man valgt et assay med høj specificitet men følsomheden vil være lav. Høj specificitet angiver sand negative resultater ( frigiver alle de raske) men angiver samtidig falsk negativ resultater ( syge betragtes som raske) Afhængig af hvilke risikogruppe det er og hvor hen i verden drejer det sig om, er sensitivitet og specificitet prioriteret forskelligt. For eksempel: For risiko gruppe af patienter med autoimmune sygdomme i Danmark der skal i TNF-a bloker behandling, prioriteres en assay med høj sensitivitet til diagnosticering af LTBI, da patienter har svækket immunforsvar. Opstående fejlkilder under forsøget: Under forsøgets fremgang er der sket en del fejlkilder som selvfølgelige har påvirket analyseresultat. Ved de fleste tilfælde har vi gentaget om da fejlkilden havde em stor indflydelse på 30

34 analyseresultatet. Selvom vi bioanalytikere studerende er oplært til at afpipettere og laver fortyndinger under studiet har rutinen en stor betydning. Eksempler på fejlkilder: 1. Jeg har glemt at resuspendere grunding mellem hver fortynding da jeg skulle lave en række fortyndinger for detektion antistof. Dette medført stort variation mellem målinger. 2. Vi har gentaget stue.temp. forsøg da vi kom til at blande standardfortyndinger med dilution buffer i maxisorp plade og ikke i blandingsplade. Det er sådan at maxisorp titerplade har stærkt bindingsevne som nævnt før. Dette har resulteret store afvigelser op dobbelt bestemmelser. Vi ikke bruge forsøgsresultater til vurdering af IP-10 stabilitet derfor gentog vi forsøget. Denne fejl illustrerer og bekræfter at MaxiSorp har har en god bindingsevne. 3. Inter-assay variation forsøg gik ikke helt som det skulle. Der er alt for stor variationer mellem målinger. Da vi har fremstillet vores plasma prøver se (Appendix nr. 5) har vi afpipetteret 25 µl i epedorfrør tubes men også 225 µl afpipetteret i ependorfrør. I plasma kan der dannes fibrin, som er et protein der er involveret i blodets størkningsproces. Fibrin klumper sig sammen i tråde i plasma. Desværre fibrin opstået i mange af de 25 µl mikrotubes plasma. Det besværliggjorde afpipetterings proces. Vi burde have afpipetteret fra 225 µl plasma i ependorfrør. Usikkerheden ville have været mindre. 31

35 6. Konklusion: Det lykkedes at udvikle og validere en ELISA metode ud fra nye antistoffer, IM2 og IR1, der reproducerbart måler kemokinet IP-10 i plasma. Etablering af platform ved skakbrætstitrering opnåede vi optimale koncentrationer på detektionsantistof (IR1) og coatingsatnigstof (IM2) derefter beskriver vi range med rekombinant IP-10 konc. Vi har bestemt vores detektion grænse vha. beregning af LOD og LOQ. Ved beregning af spike recovery til vores immunoaasay, kan vi konkludere vi at der sker lidt tab af IP-10 konc. i 20% plasma konc. Spike recovery i % viser at faldet af grafen er ikke stor. IP-10 stabilitet ved forskellige opbevaring metoder lykkedes. Jeg kan konkludere at IP-10 i plasma er et stabilt molekyle i 23 Celsius, +5 Celsius og -20 Celsius opbevaring i flere dage flere dage, uger og flere gang. 32

36 Referenceliste: 1. fra: ( Internet hjemmeside (internet hjemmeside fra Madariaga MG, Jalali Z, Swindells S: Clinical Utility of Interferon Gamma Assay in the Diagnosis of Tuberculosis. J Am Board Fam Med Nov-Dec;20(6): Ponce de Leon D, Acevedo-Vasquez E, Alvizuri S, Gutierrez C, Cucho M, Alfaro J, Perich R, Sanchez-Torres A, Pastor C, Sanchez-Schwartz C, Medina M, Gamboa R, Ugarte M:Comparison of an interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for detection of tuberculosis (TB) infection in patients with rheumatoid arthritis in a TB-endemic population: J Rheumatol May;35(5): Epub 2008 Apr 1. Mortensen LM, Hansen A: Tuberkulose - den glemte trussel. Aktuel Naturvidenskab 2005; 2: internet hjemmeside ( Leddegigt portalen) Andersen H, Sørensen U, Thomsen E. Immunkemiske metoder-teori og praksis. 1. udgave 5. oplag Dufour JH, Dziejman M, Liu MT, Leung JH, Lane TE, Luster AD: IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking. J Immunol Apr 1;168(7): Ruhwald M, Bodmer T, Maier C, Jepsen M, Haaland MB, Eugen-Olsen J, Ravn P; TBNET: Evaluating the potential of IP-10 and MCP-2 as biomarkers for the diagnosis of tuberculosis.eur Respir J Dec;32(6): Epub 2008 Aug 6. Ruhwald M, Bjerregaard-Andersen M, Rabna P, Eugen-Olsen J, Ravn P: IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, and IL-1RA hold promise as biomarkers for infection with M. tuberculosis in a whole blood based T-cell assay. BMC Res Notes Feb 4;2:19. orsvaret.aspx (

37 Kuan WP, Tam LS, Wong CK, Ko FW, Li T, Zhu T, Li EK : CXCL 9 and CXCL 10 as Sensitive Markers of Disease Activity in Patients with Rheumatoid Arthritis. Rheumatol Feb;37(2): Epub 2009 Dec 23. Nørgaard J. Medicinske Fagudtryk - en klinisk ordbog med kommentarer. 2. udgave. Danmark: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck, ( Lee JW, Devanarayan V, Barrett YC, Weiner R, Allinson J, Fountain S, Keller S, Weinryb I, Green M, Duan L, Rogers JA, Millham R, O'Brien PJ, Sailstad J, Khan M, Ray C, Wagner JA.Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm Res Feb;23(2): Epub 2006 Jan spx (figuren) Rowell V. Nunc Guide to solid phase. 3. udgave oktober ( noter i statistik) Referencer til figuer: Figur 1: Figur 2: Figur 3 Referencer til figur på forsiden: medicom.blogdetik.com/2009/03/18/uji-tuberkulin/ commons.wikimedia.org/wiki/File:ChtxChemokine

38 Appendix nr 1: Fremstilling af plasma prøver Formålet: formålet med forsøget er fremstilling af prøvematerialer som stimuleret plasma med LPS og ustimuleret plasma uden LPS. Reagenser: Materialer: Proceduren: Fuldblod af 5 frivillige donor LPS (Lipopolysakkarid) heparin glas 10 ml Finpipetter. 1. Der er blevet tappet ca. 100 ml fuldblod pr. donor, hvor 30 ml af det stimuleres med LPS mens resten forbliver ustimuleret. 30 ml fuldblod 70 ml stimuleres + fuldblod ustimuleret 60 µl/ml LPS LPS 2. Derefter resuspenderes den stimulerede glas med LPS grundigt. 3. Hele fuldblod for hver donor stimuleret og ustimuleret inkuberes ved 37º C i 24 timer. 4. Efter 24 timers inkubation, skulle stimuleret og ustimuleret fuldblod centrifugeres. 5. Efter centrifugering er afpipetteret stimuleret og ustimuleret plasma er klar til at lave forskellige (stim:ustim) forhold.

39 For hver donor er der udført følgende 5 forskellige (stim:ustim) forhold i blandingsrør. Fra blandingsrøre afpipetteres 25 µl plasma af de foskellige (stim:ustim) forhold til mikro tubes eppendorfsrør for hver donor. Desuden er der også afpipetteret 225 µl plasma af de foskellige (stim:ustim) forhold til mikro eppendorf tubes for hver donor. Følgende figur viser processen yderligere: Blandingsrør: (1 : 0) (3 : 1) ( 1 : 1) (1 : 3 ) (0 : 1) (Ustim:stim) (Ustim:stim) (Ustim:stim) (Ustim:stim) (Ustim:stim) plasma plasma plasma plasma plasma A B C D E eppendorfsrør (mikrotubes) µl µl µl µl µl A B C D E Der er også blevet fremstillet eppendorfsrør (mikrotubes) med 225 µl (stim:ustim) plasma forhold i for hver donor.

40 Appendix nr 2 : Fremstilling af Dilution Buffer: Formålet: Fremstilling af Dilution Buffer Reagenser: BSA (bovin serum albumin) PBS (Phosphate buffer salin) ph 7.4 Tween 20 0,1 % Sterilt saltvand. Bovine IgG stock 2,5 mg/ml Fremstilling af 1 Liter Dilution buffer: 10 g BSA 100 ml PBS 900 ml sterilt saltvand 1 ml Tween 20 0,1 % 0.5 ml IgG

41 Appendix nr 3. Fremstilling af Wash Dilution Vi fortynder PBS (Phosphat buffer Salin) buffer 1:9 9 L millipore vand 1 L PBS buffer 10 ml Tween 20 0,1 % Efter fremstilling skal anvendelse Wash Dilution ventes ca min.

42 Appendix nr 4: 2.c Spike Recovery: Nedenstående Graffer for donorer 1, 2, 3 og 4 viser spike recovery konc. og spike recovery i (%). Grafer 2.c for donorer 1 & 4 Grafen til højre præsenterer Recovery i (%) for donorer 1 & 4. Der vises ustim plasma forhold i (%) på x-aksen mens recovery i (%) er på y-aksen. Grafen til venstre præsenterer Spike recovery for donorer 1 & 4. Der vises plasma forhold i (%) på x-aksen mens IP-10 konc. i pg/ml på y-aksen. Grafer 2.c for donorer 2 & 3

43 Grafen til højre præsenterer Recovery i (%) for donorer 2 & 3. Der vises ustim plasma forhold i (%) på x-aksen mens recovery i (%) er på y-aksen. Grafen til venstre præsenterer Spike recovery for donorer 2 & 3. Der vises ustim plasma forhold i (%) på x-aksen mens IP-10 konc. i pg/ml på y-aksen.

44 Appendix nr 5: Interassay og Intraassay tabbeller Intraassay tabeller Tabel 2: Donor 2 flere målinger på samme dag. Ustim: stim SD CV% forhold i % 1. måling 2. måling 3. måling 4. måling 5. måling målinger ,5 60,6 7, ,2 445,5 22, ,6 4, ,5 1091,5 6, ,5 6,3 60 9,6 Ved beregning af SD og CV% sammenlignes gentagne målinger på den samme donor (2) CV% viser variansen mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. Tabel 3: Donor 3 flere målinger på samme dag. Ustim: stim SD CV% forhold i % 1. måling 2. måling 3. måling 4. måling 5. måling målinger ,9 139,4 2, ,4 676,9 1, ,3 1227,2 2, ,3 1575,6 3, ,4 1888,4 3,9 34,9 2,9 Ved beregning af SD og CV% sammenlignes gentagne målinger på den samme donor (3) CV% viser variansen mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. Tabel 4: Donor 4 flere målinger på samme dag. Ustim: stim SD CV% forhold i % 1. måling 2. måling 3. måling 4. måling 5. måling målinger ,7 75,3 7,6

45 ,4 516, , , ,7 1152,4 2, , ,8 28,5 4,5 Ved beregning af SD og CV% sammenlignes gentagne målinger på den samme donor (4) CV% viser variansen mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. Tabel 5: Donor 5 flere målinger på samme dag. Ustim: stim SD CV% forhold i % 1. måling 2. måling 3. måling 4. måling 5. måling målinger , ,9 421,5 0, ,6 622,2 2, ,8 844,4 3, ,2 963,9 4 20,5 3,5 Ved beregning af SD og CV% sammenlignes gentagne målinger på den samme donor (4) CV% viser variansen mellem målinger mens SD viser spredning af målinger fra middelværdien. Interassay tabeller: Tabel 2: Donor 2 flere målinger over 5 dage: Ustim: stim SD CV% forhold i % Måling Måling Måling Måling Måling målinger Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 Dag ,49 83,69 53,7 45,93 45,66 58,29 15,78 27, ,67 578,13 328,73 385,45 359,27 420,45 98,94 23, , ,45 687,25 534,64 689,15 175,72 25,5