Mercodia Proinsulin ELISA

Transkript

1 Mercodia Proinsulin ELISA Brugsanvisning REAGENS TIL 96 BESTEMMELSER Til in vitro-diagnosticering Fremstillet af Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE Uppsala, Sverige

2 FORKLARING AF SYMBOLER ANVENDT PÅ ETIKETTER Reagens til 96 bestemmelser = 96 Udløbsdato Opbevar ved 2 8 C Partinr. Til in vitro-diagnosticering Mercodia

3 TILSIGTET ANVENDELSE Mercodia Proinsulin ELISA er en metode til kvantitativ bestemmelse af humant proinsulin i serum eller plasma. OVERSIGT OG FORKLARING AF ANALYSEN Proinsulin er den forløber for insulin, der er det primære hormon med ansvar for styring af glukosemetabolismen. Det syntetiseres i ß-cellerne i de langerhanske øer og behandles derefter for at danne C-peptid og insulin. Høje proinsulin-koncentrationer ses ofte ved patienter med benigne eller maligne ß-celle-svulster i bugspytkirtlen. De fleste patienter med ß-celle-svulster har forhøjede insulin-, C-peptid- og proinsulin-koncentrationer, men ofte er kun proinsulin-koncentrationen forhøjet. Trods den lave biologiske aktivitet kan proinsulin øges tilstrækkeligt til at give hypoglykæmi. Forhøjede proinsulin-koncentrationer ses også ved patienter med nyresvigt, cirrose eller hyperthyreose. PRINCIP FOR PROCEDUREN Mercodia Proinsulin ELISA er en tosidet solid phase-enzymimmunanalyse. Den er baseret på den direkte sandwich-teknik, hvor to monoklonale antistoffer rettes mod separate antigene determinanter på proinsulin-molekylet. Under inkubation reagerer proinsulin i prøven med antiproinsulin-antistofferne, der er bundet til mikrotitreringsbrønden. Efter skylning tilsættes de peroxidase-konjugerede anti-proinsulin-antistoffer, og efter den anden inkubation og en enkel skylning, der fjerner ubundet enzym-mærket antistof, registreres det bundne konjugat ved reaktion med 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (TMB). Reaktionen stoppes ved at tilsætte syre for at give et kolorimetrisk endepunkt, der aflæses spektrofotometrisk. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro-diagnosticering. Indholdet af dette kit samt rester deraf må ikke komme i kontakt med drøvtyggende dyr eller svin. Stop Solution i dette kit indeholder 0.5 M H 2 SO 4. Overhold almindelige forholdsregler for håndtering af farlige kemikalier. Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. Varje brunn kan bara användas en gång 3

4 NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Pipetter med passende volumen (repetitionspipetter foretrækkes til tilsætning af Assay Buffer enzyme conjugat 1X opløsning, Substrate TMB og Stop Solution) Rør, bægerglas og målebægre til klargøring af reagenser Redestilleret vand Magnetomrører Hvirvelblander Mikropladeaflæser (450 nm-filter) Rystebord ( omdrejninger per minute, orbital bevægelse) Skylleanordning til mikroplader med overflow funktion (anbefalet men ikke påkrævet) REAGENSER Hvert Mercodia Proinsulin ELISA kit indeholder reagenser til 96 brønde, nok til 43 prøver og en kalibreringskurve i dublet. Til større analyseserier skal der bruges puljereagenser fra pakker med samme partinummer. Udløbsdatoen for hele kittet er angivet på den yderste etiket. Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2 8 C. Coated Plate 1 plade 96 brønde Klar til brug Monoklonalt anti-proinsulin fra mus 8 brønde-strips Ved ubrugte mikrotiterpladebrønde skal posen genforsegles med klæbebånd. Opbevares ved 2 8 C og bruges inden for 2 måneder. Calibrators 1, 2, 3, 4 4 hætteglas 1000 μl Frystørret Rekombinant human proinsulin Tillsæt 1000 μl Farvekodet gul redestilleret Koncentration angivet på hætteglasets etiket vand pr. hætteglas Opbevaring efter rekonstituering: 2-8 C for 1 måned. Opbevaring af rekonstitueret Calibrator i mere end 1 måned bør ske ved 20 C. Calibrator 0 1 hætteglas 5 ml Klar til brug Farvekodet gul Assay Buffer 1 hætteglas 6 ml Klar til brug Farvekodet rød Enzyme Conjugate 21X 1 hætteglas 600 μl Klargøring, Peroxidas-konjugeret fra mus monoklonalt anti-proinsulin se nedenfor Enzyme Conjugate Buffer 1 hætteglas 12 ml Klar til brug Farvekodet blå Wash Buffer 21X 1 flaske 50 ml Fortynd med 1000 Opbevaring efter fortyndning: ml redestilleret vand 2-8 C for 2 måneder. for at lave wash buffer 1X opløsning. Substrate TMB 1 flaske 22 ml Klar til brug Farveløs opløsning Bemærk! Lysfølsom! Stop Solution 1 hætteglas 7 ml Klar til brug 0.5 M H 2 SO 4 4

5 Forberedelse af enzyme conjugate 1X opløsning Forbered den påkrævede mængde enzyme conjugate 1X opløsning ved at fortynde Enzyme Conjugate 21X i Enzyme Conjugate Buffer henhold til tabellen nedenfor. Hvis der forberedes enzyme conjugate1x opløsning till en hel plade, hæld hele indholdet af Enzyme Conjugate Buffer over i Enzyme Conjugate 21X røret. Bland forsigtigt før brug. Antal strimler 12 strimler 8 strimler 4 strimler Enzyme Conjugate 21X 1 hætteglas 350 μl 200 μl Enzyme Conjugate Buffer 1 hætteglas 7 ml 4 ml Opbevaring efter fortynding: 2-8 C i 2 måneder. UDTAGNING OG HÅNDTERING AF PRØVER Serum Tag blod ved venepunktur, lad det koagulere, og adskil serummet ved centrifugering. Prøver kan opbevares ved 2 8 C i op til 24 timer. Længere opbevaring skal ske ved 20 C. Undgå at nedfryse og optø af flere omgange. Plasma Tag blod ved venepunktur i rør med heparin eller EDTA som antikoagulant, og adskil plasmafraktionen ved centrifugering. Prøver kan opbevares ved 2 8 C i op til 24 timer. Længere opbevaring skal ske ved 20 C. Undgå at nedfryse og optø af flere omgange. Klargøring af prøver Fortynding er normalt ikke nødvendigt til plasma og serum prøver, men prøver med en koncentration på over Calibrator 4, skal fortyndes med Calibrator 0. 5

6 TESTPROCEDURE Alle reagenser og prøver bringes til stuetemperatur før brug. Lav en kalibratorkurve for hver analysekørsel. 1. Lav enzyme conjugate 1X opløsning og wash buffer 1X opløsning. 2. Klargør tilstrækkeligt med mikropladebrønde til Calibrators, kontroller og prøver i dublet. 3. Pipetter 50 μl af både Calibrators, kontroller og prøver i de relevante brønde. 4. Tilsæt 50 μl Assay Buffer i hver brønd. 5. Inkuber på et rystebord ( rpm) i 1 time ved stuetemperatur (18 25 C). 6. Vask 6 gange med 700 μl wash buffer 1X opløsning per brønd, anvend en automatisk pladevasker med overflow funktion. Efter sidste skylning vendes og bankes pladen mod absorberende papir. Benyt ikke soak funktion i vaske proceduren. Eller manuelt: Bortkast væsken i pladen ved at vende den på hovedet over en vask. Tilsæt 350 μl wash buffer 1X opløsning til hver brønd. Bortkast wash buffer 1x opløsningen, bank pladen flere gange mod absorberende papir for at fjerne overskydende væske. Gentag 5 gange. Undgå at forlænge perioden hvor brøndene står med væske i løbet af vaskeperioden. 7. Tilsæt 100 μl enzyme conjugate 1X opløsning i hver brønd. 8. Inkuber på et rystebord ( rpm) i 1 time ved stuetemperatur (18 25 C). 9. Vask som beskrevet i Tilsæt 200 μl Substrate TMB. 11. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur (18 25 C). 12. Tilsæt 50 μl Stop Solution hver brønd. Placer pladen på et rystebord i cirka 5 sekunder for at sikre blandingen. 13. Aflæs optisk densitet ved 450 nm, og beregn resultaterne. Aflæs inden for 30 minutter. Obs! For at forhindre kontermination mellem konjugatet og substratet, anbefales det at anvende særskilte pipetter. 6

7 INTERN KVALITETSKONTROL Kommercielle Kontroller som f.eks. Mercodia Diabetes Antigen Control (Kodenr / ) og/eller interne serumpuljer med lave, mellem og høje C-peptid-koncentrationer skal regelmæssigt analyseres som prøver, og resultaterne afbildes fra dag til dag. Det er god laboratoriepraksis at registrere følgende data for hver analyse: sættets partinummer; forberedelsedatoer for kittets komponenter; OD-værdier for blindprøver, Calibrators og kontrolprøver. Laboratoriet skal følge regeringens regulativer eller akkrediterings krav for frekvens af kavalitets kontrol. BEREGNING AF RESULTATER Computerberegning Computerstyret datareduktion af absorbansen for Calibrators, bortset fra Calibrator 0, i forhold til koncentration ved hjælp af cubic spline-regression skal udføres for at opnå koncentrationen af proinsulin Manuel beregning 1. Plot de absorbansværdier, der er opnået for Calibrators, bortset fra Calibrator 0, mod proinsulin-koncentrationen på dobbeltlogaritmisk papir, og tegn en kalibratorkurve. 2. Aflæs koncentrationen for de ukendte prøver fra kalibratorkurven. Eksempel på resultater Brønde Identitet A 450 konc. pmol/l Gennemsnit 1A B 1C D 1E F 1G H 2A B 2C D 2E F 2G H 3A B Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 *Koncentration angivet på hætteglassets etiket / / / / / / / / /

8 2G H Unknown / A B Unknown / *Concentration indicated on vial label. Eksempel på kalibratorkurve Example of calibrator curve Der vises en typisk kalibratorkurve. Brug ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyseresultater. A typical calibrator curve is shown here. Do not use this curve to determine actual assay results. 1,0 A450 0, Proinsulin (pmol/l) Proinsulin (pmol/l) PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Som ved alle diagnosticeringsanalyser må en definitiv klinisk diagnose ikke baseres på resultatet af en enkelt analyse, men skal foretages af lægen, efter at alle kliniske resultater er blevet bedømt. Anvendelsen af denne test på individer, der allerede er insulinbehandling, kompliceres af dannelse af anti-insulin-antistroffer, der kan forstyrre analysen. 9 Stærkt lipæmiske, ikteriske eller hæmolyserede prøver forstyrrer ikke analysen. Hæmolyse i serum- og plasmaprøver kan dog resultere i en degradering af insulin, som kan give falske lave værdier og bidrager til større inter-assay variation. Degraderingen afhænger af tid, temperatur og hæmoglobinkoncentration. Opbevar hæmolyserede prøver koldt eller på is for at forhindre insulindegraderingen. Separate pipetter skal anvendes ved pipettering af konjugatet og substratet. FORVENTEDE VÆRDIER God praksis foreskriver, at hvert laboratorium fastlægger sine egne intervaller for forventede værdier. Følgende resultater kan fungere som en vejledning, indtil laboratoriet selv har indsamlet tilstrækkelige data. Fasteniveauer for 112 testede, tilsyneladende sunde individer gav et gennemsnit på 10 pmol/l, en medianværdi på 7 pmol/l og et interval, der svarer til de midterste 95 % af observationerne på pmol/l. 8

9 YDEEVNE Registreringsgrænse Detektionsevnen skal betragtes som en del af metodevalideringen snarere end den laveste målbare koncentration. Detektionsgrænsen er 0.5 pmol/l bestemt ved hjælp af metodikken, der er beskrevet i ISO Part 4. Koncentrationen af prøver med en absorbans, der ligger under Calibrator 1, skal ikke beregnes, men istedet udtrykkes som mindre end eller lig med ( ) koncentrationen, der er angivet på hætteglas set med Calibrator 1. Genfinding Genfinding efter tilsætning er 97%. Hook-effekt Prøver med en koncentration på op til pmol/l kan måles uden at få falsk lave resultater. Nøjagtighed Hver prøve analyseres 4 gange ved 7 forskellige lejligheder. Variationskoefficient Prøve Gennemsnit pmol/l inden for analyse % mellem analyse % samlet analyse % Specificitet Der blev fundet følgende krydsreaktioner: Insulin < 0.03% C-peptide < 0.006% Proinsulin Des (64 65) 84% Proinsulin Split (65 66) 90% Proinsulin Des (31 32) 95% Proinsulin Split (32 33) 95% 9

10 KALIBRERING Mercodia Proinsulin ELISA sættet er kalibreret mod den International Reference Reagens for human proinsulin, IRR 84/611. KONVERTERINGSFAKTOR 1 μg/l svarer til 110 pmol/l GARANTI De angivne ydeevnedata blev opnået ved af den angivne fremgangsmåde. Alle ændringer af fremgangsmåden, der ikke anbefales af Mercodia AB, kan påvirke resultaterne, og i dette tilfælde ophæver Mercodia AB alle garantier, det være sig udtrykkelige, stiltiende eller lovbefalede, herunder den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt formål. I et sådant tilfælde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distributører ikke drages til ansvar for indirekte skader eller følgeskader. REFERENSER Gaines-Das, RE and Bristiw AF (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human insulin C-peptide. J Biol Stand 16: Garcia CA, Prabakar KR, Diez J, Cao ZA, Allende G, Zeller M, Dogra R, Mendez A, Rosenkranz E, Dahl U, Ricordi C, Hanahan D, Pugliese A (2005) Dendritic cells in human thymus and pe riphery display a proinsulin epitope in a transcription-dependent, capture-independent fashion. J Immunol 175: Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47: Yin H, Berg AK, Westman J, Hellerstrom C, Frisk G (2002) Complete nucleotide sequence of a Coxsackievirus B-4 strain capable of establishing persistent infection in human pancreatic islet cells: effects on insulin release, proinsulin synthesis, and cell morphology. J Med Virol 68: Yderligere oplysninger kan findes på vores hjemmeside: 10

11

12 OVERSIGTSPROTOKOLARK Mercodia Proinsulin ELISA Tilsæt Calibrators, kontroller* og prøver 50 μl Tilsæt Assay Buffer Inkuber Vask med wash buffer 1X opløsning 50 μl 1 time ved C på et rystebord rpm 700 µl, 6 gange Tilsæt enzyme conjugate 1X opløsning Inkuber Vask med wash buffer 1X opløsning 100 μl 1 time ved C på et rystebord rpm 700 µl, 6 gange Tilsæt Substrate-TMB 200 μl Inkuber Tilsæt Stop Solution Aflæs A minutter at C 50 μl Ryst i 5 sekunder for sikre blanding Evaluere resultaterne * ikke medsendt For alle detaljer se side version 12.0