Mixed Models Applied in Agricultural Sciences II. A Course in Mixed Models for use in Research in Animal Nutrition and Physiology

Transkript

1 Biometry Research Unit Internal Report Mixed Models Applied in Agricultural Sciences II Based on A Course in Mixed Models for use in Research in Animal Nutrition and Physiology Søren Højsgaard & Erik Jørgensen (editors) Danish Institute of Agricultural Sciences Research Centre Foulum

2 There are two publication series of Biometry Research Unit at the Danish Institute of Agricultural Science: Technical Reports and Internal Reports. Technical Reports: This series aims to cover the publication of pre-prints and research papers in an advanced stage of elaboration. The material published should have some original content, but reviews are also suitable. There are, in principle, no size limitations and extended versions with full details that are referenced later in the final publication are acceptable. The authors assume entirely the responsibility regarding the quality and validity of the published material. There are no editorial checks. The publication in the series does not disqualify the material for later presentation to a journal that requires originality. The preferred language in this series is English. The reports are distributed through a mailing list. Copies can be obtained from the editor. Internal Reports: This is an informal series intended to publish material of some interest that are not suitable for publishing in the technical report series. Typical articles are: documentation of useful programs or macros, pedagogic and divulgation articles in biostatistical methods, reports of interesting consultation cases, etc. The reports are distributed by the authors. An updated list of the reports and a complete collection of both series will be kept at the departments library and the central library at the Research Centre Foulum. Copies of the papers of both series can be obtained from the editor. The reports may also be downloaded in pdf-format from the webpage: Editor: Ulrich Halekoh Biometry Research Unit Danish Institute of Agricultural Sciences Research Centre Foulum

3 Internal Report Mixed Models Applied in Agricultural Sciences II Based on A Course in Mixed Models for use in Research in Animal Nutrition and Physiology Søren Højsgaard & Erik Jørgensen (editors) Ministry of Food, Agriculture and Fisheries Danish Institute of Agricultural Sciences Biometry Danish Institute Research of Unit Agricultural Sciences Research Centre Foulum Research Centre Foulum P.O. Box 50 DK-8830 Tjele Denmark

4 Mixed Models in Agricultural Science Preface The popularity of mixed models in agricultural (as well as in other) sciences has been steadily increasing over the last decade. This is due to several reasons: One is an increasing awareness among researches that measurements can often not be considered independent. Another reason is that software development in combination with cheap and powerful computers makes it possible to deal with non-independent data. The present report consists of project reports made by course participants in a course on mixed models given in the spring The participants were researchers and students from the Danish Institute of Agricultural Sciences (primarily from Department of Animal Nutrition and Physiology), Research Centre Foulum. A similar report exists from a previous aimed at researchers from Department of Animal Health and Welfare. The motivation behind making this compilation of the projects is to present to other researchers a series of examples of the use of mixed models in agricultural research. It is always important to be sceptical about (statistical) models. A famous saying among statisticians is that "all models are wrong, but some are usefull". This sentence also applies to what is presented in this report. Hence, when reading about a specific analysis, it is important to keep in mind that the analysis presented is just one of presumably many possible analyses of the given problem at hand. Another researcher may come up with a different analysis! Erik Jørgensen Søren Højsgaard Research Centre Foulum, /6/2002

5 Contents 1 Prædiktion af klinisk sygdom hos grise Niels Peter Baadsgård 7 2 Effect of feed structure and addition of formic acid to the diet on ph in the GIT of growing pigs at various times after feeding Nuria Canibe 19 3 Zink og kobber til fravænnede grise Mette S. Hedemann 35 4 Tilsætning af fedt og rapslecithin til smågrise: Effekt på fordøjeligheden Henry Jørgensen 43 5 NEOSPORA CANINUM - Variation i antistof respons afhængig af laktationsstadie og tidspunkt i drægtighed Anne Mette Kjeldsen, Dansk Kvæg 55 6 Ernæringens indflydelse på somælkens sammensætning Charlotte Lauritzen 65 7 Lactic acid to growing pigs Lene Lind Mikkelsen 89 8 Colour detection of colostrum Morten Damm Rasmussen 95 9 Søers varmeproduktion i relation til deres aktivitet Peter K. Theil 105 5

6 Mixed Models in Agricultural Science 10 Betydning af malkningsfrekvens og foderets energikoncentration på blodets indhold af glukose og insulin hos malkekøer i tidlig laktation Mogens Vestergaard /6/2002

7 Paper 1 Prædiktion af klinisk sygdom hos grise Niels Peter Baadsgård 7

8 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Niels Peter Baadsgaard 1/ Afd for sundhed og velfærd Prædiktion af klinisk sygdom hos grise Baggrund I forbindelse med den regelmæssige sundhedskontrol i svinebesætninger foretager den praktiserende dyrlæge en klinisk undersøgelse af besætningen. Formålet med den kliniske undersøgelse er at resultaterne herfra bidrager til diagnosticering (dvs afklaring) af sygdomsagens i besætningen ligesom antallet af grise med kliniske symptomer kan give et kvantitativt mål for niveauet af klinisk sygdom over tid i en besætning. Dette er nødvendigt ved vurdering af behandlingseffekt samt ved besætningsprognosen dvs. ved prædiktion af sygdomsudviklingen. Det er formålet med denne analyse at vise hvorledes gentagne målinger af klinisk sygdom over tid hos grise kan modelleres over tid med henblik på prædiktion af sygdomsniveauet i en svinebesætning. Data Der er foretaget regelmæssige kliniske undersøgelser i 15 svinebesætninger hos fravænningsgrise i vægtintervallet 7-30 kg. Antallet af målinger (dvs. besøg) i besætningerne svingede fra Dataopsamlingsperioden var Der blev anvendt en stratificeret sampling med henblik på at sikre at clustering af klinisk sygdom i visse stier/ staldafsnit ikke skulle påvirke målingen i den enkelte besætning. Observationsenheden var besætning, da der ikke var gentagne målinger på den enkelte gris. De kliniske målinger på den enkelte gris blev registreret som binære tilstande. Der blev foretaget en systematisk klinisk undersøgelse af den enkelte gris, dvs der blev registreret en lang række af forskellige symptomer. Der er her valgt kun at anvende registrering af grise med forstyrret almenbefindende i den endelige statistiske analyse. Statistisk model Fig.1 viser forløbet af den observerede sygdomsfrekvens i 5 besætninger. Figuren viser at der ses en betydelig variation både mellem besætninger og indenfor samme besætning. Figuren viser endvidere at nogle besætninger udviser et konstant lavt niveau mens der er større variation indenfor andre. Der er endvidere en tendens til at målinger som ligger tættere på hinanden er korrelerede indenfor den enkelte besætning. Fig. 2 viser fordelingen af de observerede frekvenser af grise med forstyrret almenbefindende i de 15 besætninger. Figuren viser at det ikke vil være rimeligt at antage normalfordeling af data som jo er en væsentlig antagelse ved anvendelse af proc mixed. Disse resultater giver anledning til at overveje en transformation af data. Lad Y it i være indeks for besætninger hvor i=1,2,3.,k; hvor k=15. Lad endvidere t angive tidspunktet for den kliniske undersøgelse. Lad endvidere y it være det observerede antal grise med klinisk sygdom i den i te besætning til tiden t. Observationerne y it er da realisationer af de uafhængige tilfældige variable Y it. Da den enkelte gris registreres som klinisk syg/ikke syg vil det være rimeligt at antage: Y binomial( p, n ) it ~ it it 8 27/6/2002 1

9 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise hvor n it er sample størrelsen, og hvor n=150. p it er en stokastisk variabel som angiver sandsynligheden for at observere sygdom. Ved analyse af denne type data anvendes ofte logit transformationen p it η it = log = αi + βxit p (1 it ) α ~ i P ( α µ, σ Parameteren β ~ P(β) angiver en gennemsnitlig respons for alle besætninger, mens α i modificerer niveauet for en specifik besætning Fordelingen af y it /n it ved at logittransformationen er vist på figur 3. På basis af denne vil vi i det følgende vil vi antage en normalfordeling for data. i 2 ) På basis af de observerede data vil det være rimeligt at tage som udgangspunkt: η = µ + λ + ω it i it 2 hvor µ angiver et fælles intercept, iid λi ~ N(0, σ s ) angiver tilfældig effekt af besætning med fælles varians σ 2 2 s,og hvor ω it = ρ * ηit 1 + ε it. ε it ~ N(0, σ ), ρ ~ unif ( 1,1 ). Der gælder at E(ω it ) =0 for alle t dvs ω it ~ N(0,θ); hvor θ = σ 2 /(1- ρ 2 ). σ 2 s antages uafhængig af σ 2. Vi antager altså at observationerne indenfor besætning følger en 1.ordens autoregressiv process. Denne model antager at korrelationen mellem besætninger et tidstrin tilbage er givet ved ρ. To tidstrin tilbage er korrelationen givet ved ρ 2 ; 3 tidstrin tilbage er den givet ved ρ 3 etc. Processen følger således en markov process som siger at givet viden om tilstanden t-1 vil vores observation i dag være uafhængig af hvad der blev observeret t-2, t-3 etc. Denne egenskab kan benyttes ved prædiktion af sygdomsniveauet ved η it+1. 27/6/

10 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Variansmatricen for η it for i=2 og for t=1,2,3 bliver derfor givet ved: V η = θ+ σ s 2 ρθ+ σ s 2 ρ 2 θ+ σ s 2 ρ θ+ σ s 2 θ+ σ s 2 ρ θ+ σ s 2 ρ 2 θ+ σ s 2 ρ θ+ σ s 2 θ+ σ s 2 0 θ+ σ s 2 ρ θ+ σ s 2 ρ 2 θ+ σ s 2 0 ρ θ+ σ s 2 θ+ σ s 2 ρθ+ σ s 2 ρ 2 θ+ σ s 2 ρ θ+ σ s 2 θ+ σ s 2 θ= σ 2 / (1- ρ 2 ) Ovennævnte model blev fittet i SAS version 8e med følgende syntaks proc mixed cl data=e ; class chrx visit ; model lpaltnew= /Outp=uddata1 solution cl ; random chrx/s; repeated visit / subject=chrx type=ar(1) r rcorr ; ods output FitStatistics=FS1 SolutionR=SR5; run; 10 27/6/2002 3

11 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Resultater Følgende resultater blev opnået ved at fitte ovennævnte model i SAS. Tabel 1 Covariance Parameter Estimates Cov Parm Subject Estimate Alpha Lower Upper CHR AR(1) CHR Residual σ s 2 blev estimeret til 1.05 med 95% konfidensintervalllet ρ blev estimeret til 0.48 med 95% konfidensintervallet θ blev estimeret til 0.85 med 95% konfidensintervallet Tabel 2 The Mixed Procedure Solution for Fixed Effects Standard Effect Estimate Error DF t Value Pr > t Alpha Lower Upper Intercept < Solution for Random Effects Std Err Effect CHR Estimate Pred DF t Value Pr > t CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR CHR /6/

12 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Intercept µ samt de individuelle estimater λ i for besætningsbidraget er angivet i Tabel 2. Fig 5 viser prædiktioner for modellen for en enkelt besætning. Prædiktionerne blev beregnet ved at successivt baglæns at slette observationerne fra en besætning. Sidste observation blev sat til missing, og det var derefter muligt at få SAS til at prædiktere denne observation. Diskussion og modelkontrol Under analysen blev flere forskellige variansstrukturer undersøgt, men det var ikke muligt at estimere mere komplekse variansstrukturer i dette datasæt. Det var heller ikke muligt at anvende random regression. Bartletts test for varianshomogenitet gav en p-værdi på <0.001 hvoraf det kan konkluderes at anatgelsen vedr. varianshomogenitet mellem besætninger ikke synes opfyldt. Resultat understreges af plotsene for de enkelte besætninger (Fig1). Akaikes informationscriterie var for ovennævnte model. En simpel model for data ville være at antage at observationerne lignede hinanden lige meget dvs ved anvende compound symmetry i modelformuleringen i SAS. Akaikes informationscriterie var for denne model hvorfor det kan konkluderes at autoregressive model giver et bedre fit til data. 2 Plot af den enkelte λ i viser at antagelsen vedr. iid λ i ~ N(0, σ s ) kan bevivles (Fig 6). Yderligere viser plots af residualer for de enkelte besætninger en uens fordeling af residualerne, hvilket er en understregning af de problemer der sås ved de individuelle plots af de observerede værdier (Fig 7). Da nogle besætninger erfaringsmæssigt ligger med et meget højt sygdomsniveau, vil det dog være betænkeligt blot at fjerne disse besætninger fra datasættet. Antagelse ρ ~ unif ( 1,1) kan ikke testes i mixed men ville kunne testes indenfor den bayesianske metodik ved at antage ρ ~ N(0.0,1000). Modellen vil naturligt overestimere niveauet ved faldende prævalens mens niveauet underestimeres ved stigende prævalens. Prædiktionen viser generelt den lidt forsinkede reaktion i modellen, da der jo betinges på den forudgående observation indenfor den enkelte besætning. Prædiktionerne vil dog være bedre end at antage den simple model med konstant korrelation. Da vores model kun husker et tidstrin tilbage vil der ikke kunne optages nogle systematiske trends i den enkelte besætning. Hertil er tidsrækkerne også for korte. Resultaterne fra vores prædiktion er er ikke meget bedre/dårligere end hvad der ville kunne opnås ved et simpelt rullende gennemsnit eller ved en simpel regression af Y it-1 samt Y it-2 på Y it /6/2002 5

13 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Data kan analyseres direkte som en ikke lineær mixed model i ved at fitte modellen i proc nlmixed i SAS med anvendelse af følgende syntaks: proc nlmixed data=e; parms mu=-1 b1=0 herdvar=2; eta=mu+b1*ralt+herd; p=1/(1+exp(-eta)); model favalt~binomial(total,p); random herd~normal(0,herdvar) subject=chr; predict eta out=bin; run; Her angiver Ralt Y it-1. Som det vil være klart indgår variablen i desigmatricen og vi har kun mulighed for at modellere den tidsmæssige afhængighed som compound symmetry. Dette er som tidligere vist ikke en relevant model ligesom den heller ikke vil have praktisk anvendelighed. Konvergens blev opnået men prædiktion vil kræve simulering af de enkelte observationer. Prædiktion vil blive tæt på besætningsgennemsnit medmindre der er meget stor effekt af regressions coefficienten i alle besætninger. En alternativ mulighed indenfor denne tilgang ville være random regression: proc nlmixed data=e; parms mu=-1 b1=1 s1=0.1 s12=0.1 s2=0.1; eta=mu+b1*ralt+herd; p=1/(1+exp(-eta)); model favalt~binomial(total,p); random mu herd ~normal([0,0],[s1,s12,s2])subject=chr; predict eta out=bin; run; Konvergens kunne ikke opnås. 27/6/

14 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Resultater til afleveringsopgave i mixed models Niels Peter Baadsgaard 0,7 0,6 0,5 Prævalens 0,4 0,3 0,2 0, Besøg nr Fig. 1. Observerede prævalens af grise med forstyrret almenbefindende i 8 besætninger. Fig, 2. Fordelingen af den observerede sygdomsprævalens i 15 svinebesætninger 14 27/6/2002

15 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Fig. 3 Logit transformation af observeret sygdomsprævalens. Fig. 4 Arcsin transformation af observeret sygdomsprævalens. 27/6/

16 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Prævalens 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Besøg nr. Fig. 5 Observerede og prædikterede værdier for sygdomsfrekvens i en besætning. = prædikterede værdier, =observerede værdier. Fig. 6 Fordelingen af de individuelle estimater af besætningsbidragene 16 27/6/2002

17 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise Fig. 7 Plot af residualer sorteret for de enkelte besætninger i analysen 27/6/

18 Niels Peter Baadsgård: Klinisk sygdom hos grise 18 27/6/2002

19 Paper 2 Effect of feed structure and addition of formic acid to the diet on ph in the GIT of growing pigs at various times after feeding Nuria Canibe 19

20 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT Mixed models course Nuria Canibe, Dept. of Animal Nutrition and Physiology Effect of feed structure and addition of formic acid to the diet on ph in the GIT of growing pigs at various times after feeding AIM A study was designed to investigate the effect of feed structure and addition of formic acid to the feed on ph of various segments of the gastrointestinal tract (GIT) of pigs at various times after feeding. MATERIALS AND METHODS A standard Danish pig diet was formulated and used to design the three experimental treatments: fine, heated and pelleted (A); course, non-heated and non-pelleted (B), fine, heated and pelleted added 1.8% formic acid (C). A total of 60 pigs (20 per diet) from 20 litters were used. Average initial body weight was ~30 kg. Three littermates of the same sex were allotted to each diet, with a total of three pens of five pigs each per series. There were four series. At a body weight of ~64 kg, the animals were sacrificed immediately after feeding, and at 2, 4, 6, and 8 hours after feeding. Animals from each pen were randomly slaughtered at the various times after feeding. The GIT was removed and divided in eight segments: stomach (1), three equally long segments of the small intestine (2-4), caecum (5), and three equally long segments of the colon including the rectum (6-8). ph was measured on digesta from all segments. Figure 1. Scheme of the experimental design for each of the four series. Pen 1 Pen 2 Pen 3 5 pigs 5 pigs 5 pigs * Time: Pigs from each pen are slaughtered at: 0, 2, 4, 6, 8 hours after feeding * Segment: From each pig eight segments are obtained 20 27/6/2002

21 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT VISUAL EXAMINATION OF THE DATA Some graphs used to examine the raw data are shown in Figures 2 to 4. Figure 2 (segment x ph) shows a much higher variation of the data measured in the stomach compared to the results from the other segments in all three diets. The graph showing the data as time x ph shows a clear effect of time on ph measured in the stomach, whereas the ph from the other segments is difficult to see due to the scale of the graphs when the results from the stomach are included. Figure 3 shows the same data as Figure 1, and, again the high variation of the ph measured in the stomach is evident. No conclusions from the results obtained from the other segments can be drawn at this stage. Figure 4, shows plots where the data from the stomach were excluded, and the data shows a more homogeneous variance. Figure 2. ph grouped by segment and by time for each diet.(examination of variance and outliers). ph 7 Diet=A ph 7 Diet=A segment Pig Time sti Diet=B Diet=B ph ph segment Pig Time sti ph Diet=C ph Diet=C segment Pig Time sti /6/

22 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT Figure 3. ph grouped by segment a), and by time b). (Examination of variance and outliers). a) ph A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 group b) ph A0 A2 A4 A6 A8 B0 B2 B4 B6 B8 C0 C2 C4 C6 C8 gr oup Figure 4. ph grouped by segment a), and by time b) without data from stomach. (Examination of variance and outliers). a) b) ph A0 A2 A4 A6 A8 B0 B2 B4 B6 B8 C0 C2 C4 C6 C8 gr oup 22 27/6/2002

23 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT VARIANCE HOMOGENEITY - BARTLETTS TEST A test for variance homogeneity was run with the groups represented in the plots of figures 2 to 4. The aim was to have an idea of the variance of the groups. The results were used only as an indication since these groups were not the smallest unit diet*segment*time, which should be used to be correct. These units were not used because there are only 4 observations in each, which is too small to draw any conclusion. Test of normality was not performed for the same reason, and that is also why the Bartletts test is an indication (normality is assumed to be able to perform a Bartlett test). Figure 5 shows the results of the test when groups are made by segment a) and by time b). The results show a clear variance heterogeneity when all data are included, which was expected after seeing Figures 2 and 3. Figure 5. Variance homogeneity - Bartlett test with all data. a) Macro "BARTLETT" Dataset: D Responsvariabel : PH Gruppevariabel : GROUP Beregningsskema: i ni Si USSi Si2/ni SSDi fi Var Mean A A A A A A A A B B B B B B B B C C C C C C C C Bartletts test: C -2logQ B p b) Macro "BARTLETT" Dataset: F Responsvariabel : PH Gruppevariabel : GROUP Beregningsskema: i ni Si USSi Si2/ni SSDi fi Var Mean A A A A A B B B B B C C C C C Bartletts test: C -2logQ B p /6/

24 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT A test where the stomach results were excluded was also performed (Figure 6). The results show that the variance is still different among groups when grouped by segment a), and it is smaller and almost homogeneous when grouped by time b). Figure 6. Variance homogeneity - Bartlett test without stomach data. a) Macro "BARTLETT" Dataset: D Responsvariabel : PH Gruppevariabel : GROUP Beregningsskema: i ni Si USSi Si2/ni SSDi fi Var Mean A A A A A A A B B B B B B B C C C C C C C Bartletts test: C -2logQ B p b) Macro "BARTLETT" Dataset: F Responsvariabel : PH Gruppevariabel : GROUP Beregningsskema: i ni Si USSi Si2/ni SSDi fi Var Mean A A A A A B B B B B C C C C C Bartletts test: C -2logQ B p /6/2002

25 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT MODEL SELECTION Model 1 proc mixed data=a; class time diet segment serie pen mother; model ph=time diet segment diet*segment time*diet time*segment diet*segment*time/ddfm=satterth OUTP=DATA1; random serie serie*mother serie*pen; repeated segment/subject=diet*serie*pen*mother*time type=un r rcorr; run; Log: G matrix not positive definite because variance of serie*sti is = 0. So, no correlation between observations from same pen. Model 2: without serie*pen proc mixed data=a; class time diet segment serie pen mother; model ph=time diet segment diet*segment time*diet time*segment diet*segment*time/ddfm=satterth OUTP=DATA1; random serie serie*mother /*serie*pen*/; repeated segment/subject=diet*serie*pen*mother*time type=un r rcorr; run;.. G matrix not positive definite because variance of series = 0. So, no correlation between observations from same series. Model 3: without serie*pen and serie proc mixed data=a; class time diet segment serie pen mother; model ph=time diet segment diet*segment time*diet time*segment diet*segment*time /ddfm=satterth OUTP=DATA1; random /*serie*/ serie*mother /*serie*pen*/; repeated segment/subject=diet*serie*pen*mother*time type=un r rcorr; run;.. No problems in log. 27/6/

26 Nuria Canibe: Feed structure and ph in GIT SELECTION OF COVARIANCE STRUCTURE Model 3: Unstructured The Mixed Procedure Estimated R Matrix for Subject 1 Row Col1 Col2 Col3 Col4 Col5 Col6 Col7 Col Estimated R Correlation Matrix for Subject 1 Row Col1 Col2 Col3 Col4 Col5 Col6 Col7 Col Comments: Variance: they are highest in stomach, decrease down to caecum and increase again. Correlation: different in the various segments, no clear profile. Negative between stomach and colon /6/2002