Agenda. Livsbetingelser. Biofilm. Kontrol. Råvarekvalitet. Plaque er dannelse af biofilm på tænder. Eksempler

Transkript

1 Agenda Plaque er dannelse af biofilm på tænder. Livsbetingelser Biofilm Kontrol Formeringshastighed, næringskrav mm. Hvilke mikroorganismer Hvad er biofilm Dannelse af biofilm Anlæg Hvilke muligheder Råvarekvalitet Mellemrengøring Mikrofiltrering Landmand; tankvogn; mejeri Eksempler

2 Biofilm-problematikken, er det noget der skal tages alvorligt? Er det en ny problematik? Sikkert forværret med årene pga.: Større landbrug Større indsamlingsbiler & mellemtransport Større produktionssteder Fokus på besparelser / optimeringer/miljø Holdbarhed på produkter. Større forarbejdning af produkter.

3 Baggrund Hvad kan vokse ved en belastning (ved 45 C). ph-fald ved belastning: under ph 4,3 til ph 4,3 eller højere Sc. thermophilus er fundet bl.a. i regenerativ i pladeapparat, i centrifuge samt i rørstrenge og tanke. Luftproducerende Lactobacillus spp.; kan findes på / i ikke tilstrækkelig rengjort anlæg ( Teknikkerbogen ).

4 Spørgsmål; vi bør stilles os selv. Rengøringshyppighed CIP-optimering, er der ændret noget i anlægget. Tankvogns-undersøgelser uanmeldt besøg, hvordan udføres de i dag??? Renhed for tankvognene var meget bilafhængig for 15 år siden, hvordan ser det ud i dag. Ændringer i pode% i de sidste årtier, tendens til lavere pode%, hvorved mikroorganismer fra biofilm bedre kan konkurrere med starterkulturen.

5 Hvad er biofilm Opbygning af organisk materiale (fedt, protein), salte og mikroorganismer. Vækst; mikrokolonidannelse og dannelse af EPS. Mange forskellige mikroorganismer kan findes i en biofilm. Få dominerende arter i mejeribiofilm Sc. thermophilus, Leuconostoc spp., Lactobacillus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.

6 Problematik omkring bakterier fra biofilm. Mikroorganismer fra biofilm er mere resistente overfor forskellige stressfaktorer: Varme Rengøringsmidler / desinfektionsmidler Er beskyttet af fedt / protein og EPS. Efter fjernelse af opbygget biofilm (f.eks. ved anvendelse af Ancep CIP) skal der ændres i rengørings-proceduren, ellers opbygges biofilmen meget hurtigt igen. Er der lavet en Cip diagnose og hvis, hvordan anvendes den?

7 Exopolysaccharider; EPS. En række af mikroorganismer er i stand til at producere EPS. Negativt: Fastgøres til overflader. Positivt: Kan anvendes positivt i yoghurt (højere viskositet). Positivt: Kan anvendes positivt i ost (bedre binding af vand & forbedret tekstur). Homo- eller hetero-polysaccharider. Forskelle: hvilke enzymer skal anvendes til nedbrydningen. Bundet til celle eller frigives.

8 Dannelse af biofilm Opbygning: Adhæsion af proteiner og reversibel adhæsion af mikroorganismer (sekunder -timer). Irreversibel adhæsion af mikroorganismer og dannelse af netværk: bakterievækst & EPS; timer, oftest efter 8-12 timer Andre mikroorganismer kan nu fanges i EPSspindel (dage måneder) Selektion af hvilke mikroorganismer, der findes i lagene (inderst begyndende anaerobt; yderst aerobt) Mejeribiofilm er oftest bestående af få bakteriearter (Sc. thermophilus, Leuconostoc, Lactobacillus, Bacillus, Pseudomonas) Genopbygning af ny biofilm sker hurtigere, hvis der er en rest af gammel biofilm tilbage i anlægget

9 Lagvis opdeling af biofilmen. Lagdeling: Øverst: vækst af aerobe mikroorganismer. Midt: mikroaerofil område. Nederst: vækst af anaerobe mikroorganismer.

10 Biokorrosion

11 Hvor kan biofilm opbygges? Alle steder i procesanlægget (fra udmalkning til færdigt produkt). Rør Tanke pumper Ventiler Gulve; afløb Transportbånd Mest kritisk er dog: Dead ends Dårlig placeret ventiler Diverse samlinger Bøjninger Mest kritisk er de steder, der er svære at rengøre.

12 Ruhed af overfladen på rustfrit stål.

13 Forskellig tykkelse af biofilmen, afhængig af flow. Der opstår en ligevægt mellem tykkelsen af biofilm og flowet, hvor biofilmen bliver tykkere ved et lavere flow.

14 Væskestrømninger. Eksempel på hastighedsforskellen omkring en dødlomme konstruktion i et lukket procesudstyr. Vektorerne beskriver væskeretningen og gråtonen beskriver væskens hastighed. Middelhastigheden er 1,5 m/s.

15 Kontrol. Svært at lave kontrol: Hvor fast sidder biofilmen hvor meget ryger med? Mikroorganismer kan være i en speciel tilstand, hvor de er levedygtige i biofilm / mælk, men ikke på laboratorie substrat Biofilm sidder måske steder, hvor der mere sjældent kommer produkt (top i silotank - sprøjt, øvre del af rør - flow)

16 Muligheder for analyse af biofilm hvordan findes nålen i høstakken. Pladespredning / afsvabning. Belastning (kan måske ikke detektere mikroorganismer før efter en belastning): Belastning ved 20 C, evt. vækst af Leuconostoc Belastning ved 45 C, termoresistente kim ph følges - logning, eller måles før og efter belastning. Belastede prøver undersøges for mikroorganismer (stregpodning) eller evt. luftdannelse (MRS-b): Luftproducerende Lactobaciller el. Leuconostoc. Termoresistente kim. Skyllevandsprøver: Sterilfiltrering (200ml), anvende TSA / MRS, inkubering 30 C; 5 døgn. ATP-målinger (kan ikke isolere)

17 Måling af ATP. Princippet bag metoden er måling af ATP, som er energikilde i alt levende materiale. Dvs. at der findes ATP i alle mikroorganismer, samt i alt af animalsk eller vegetabilsk oprindelse. Hvis der er ATP på en overflade eller i skyllevandet, så er det tegn på, at overfladen / skyllevandet ikke er rent. I litteraturen er anført, at det ikke er muligt at detektere under 10 3 bakterier eller 10 gærceller. Derfor forsøges det at filtrere skyllevandet over et sterilt filter. Herved kommer detektionsgrænsen meget længere ned. Dvs. at et højt tal for ATP er ikke nødvendigvis helt samstemmende med et højt kimtal, da ATP også kan komme fra rester af mælkens bestanddele.

18 FISH ny metode Biofilm Metoden anvendes i den medicinske verden (Down s syndrom). Der er artsspecifikke baser i mikroorganismens rrna. Ved hybridisering kan specifikke prober (flourescerende) bindes. Anvende forskellige prober med hver sit flourescerende farvestof dermed få flere mikroorganismer frem. Kombination af to teknikker: FISH (Flourescent In Situ Hybridization) & CLMS (Confocal Laser Scanning Microscopy) Kan anvendes i f.eks. biofilm; kan se den rumlige fordeling af mikroorganismer i biofilmen.

19 Mellemrengøring gør det en forskel? Belastning af mælk udtaget hen over dagen (Mejeri D). ph 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 opstart Før mellemreng. Efter mellemreng. Afslutning timer Mellemrengøringen har gjort en forskel. Har anlægget været rent ved opstart, eller har det været noget mælk med et højt kimtal??

20 Mikrofiltrering Udtagning af mælk til belastning før og efter MF, pr.1. Udtagning af mælt til belastning før og efter MF, pr ph 6,5 6 5,5 5 4,5 Før MF, opstart Efter MF, opstart Før MF, afslut Efter MF, afslut ph 6,5 6 5,5 5 4,5 Før MF, opstart Efter MF, opstart Før MF, afslut Efter MF, afslut 4 ph før belast ph efter belast 4 ph før belast ph efter belast tid tid Med undtagelse af 1 prøve, er der nedsyrning af prøverne inden MF og ikke nedsyrning af prøver efter MF. Analyser foretaget i dec. 02 viser, at der kan være problemer med indholdet af termofile kim i mælk efter mikrofiltrerings-anlægget (stigning af antallet igennem anlægget). Årsagen til dette var en ikke rengjort skummesal (pasteur) oplysning fra mejeriet.

21 Resultater fra Sverige; Svensk Mjölk; Råvarekvalitet Värmeresistenta bakterier i skummjölk. Projektets mål var at sænke LP mælks indhold af termoresistente bakterier (til pulverfremstilling). I sammenfatningen: Det är tydligt att en flora värmeresistenta bakterier (överlever lågpastörisering) kommer in med helmjölken till mejeriet, ingen infektion eller större ökning sker i mejeriprocessen (Anna Arnadottir, ). Et litteraturstudium lavet v. Svensk Mjölk Forskning: Det tyder på att dårlig disk fråamjar förekomst av pastöriseringsöverlevande bakterier. Kort sammendrag af gårddiskens betydelse for forekomsten af past. overleverende bakterier i den rå mælk.

22 Hvorfor logninger af ph-forløb? ph 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 ph forløb, belastning af prøver. Hvor lang er nølefasen? minutter tankbil, råmælkstank buffertank Før past., Efter past., Der må være en stor betydning for ph-kurvens forløb: Til ph f.eks. 5: tiden svinger fra 380 minutter 640 minutter (begge pasteuriserede prøver).

23 Kimtal efter belastning af mælkeprøver. Kimtal efter belastning, cfu/ml 1,00E+10 1,00E+08 1,00E+06 1,00E+04 1,00E+02 1,00E+00 Tankbil, , kar 7 Råmælkssilo, kar 7 Balancetank , kar 7 prøve Buffertank, kar 7, Past. kar Past. kar Total, MPCA, B Total, MRS, B Termo, MPCA, B Termo, M-17, B Flow i mælkepladekøler er lige kommet op på det rigtige (kort tid før udtagning af prøver). Stigning i termoresistente kim fra tankbil til silotank: faktor 100 Stigning i kimtal ved indvejning Lavere kimtal: kan skyldes lavt ph i lang tid; celledød. Det kan også skyldes effekt af pasteurisering. Hvis det er past.effekt kontamineres mælken igen til ostekar (F100).

24 Kimtal efter belastning af mælkeprøver. Kim tal, efter belastning, ,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 cfu/ml 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 Tankbil Råmælkssilo totalkim, MPCA, B termores. MPCA, B balancetank past totalkim, MRS, B termores. M-17, B buffertank Stigning kun med en faktor 10, før ændring af flow i pladekøler; faktor 100. Stigning i termoresistente kim fra tankvogn til silotank: faktor 10; ændring i flow i pladekøler har hjulpet!!

25 Belastning af mælk; leverandør & tankvogn. ph, varmebehandlede prøver, 61,5 C/30 min. 7 leverandør 1 6,5 leverandør 2 6 leverandør 3 ph 5,5 5 4,5 start 24 timer tankvogn start tøm. tankvogn slut tøm. silotank Lev. 1 & lev. 2: syrner ikke. Lev. 3: syrner til 4,9. tid Tankvogn start & slut samt silotank: sammenfaldende kurve med Lev. 3. Mælken fra Lev. 3 (størst indvejet mængde) har altså stor indflydelse på nedsyrningen af den samlede mælk (tankvogn og silotank).

26 Belastning af mælk; leverandør & tankvogn - DK. ph, varmebehandlede prøver, 61,5 C/30min. ph 7,00 6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 ph ved modtagelse ph, 24 timer v. 45 C tid Vogn 2, lev. 1 Vogn 2, lev. 2 Vogn 2, lev. 3 Vogn 2, lev. 4 Vogn 2, lev. 5 Vogn 2, lev. 6 Tankvogn 2, start indvej. Råmælkstank Prøver fra leverandører nedsyrner ikke. tankvogn, start nedsyrner (til ph 5,92). Råmælkssilotank syrner til ph 4,43.

27 Kimtal inden belastning. En direkte kontaminering af mælken. cfu/ml 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 Tankvogn 1 Tankvogn 2 Råmælkssilo, Afgang past udtagningssted, mejeri totalkim, MPCA totalkim, MRS Termores., MPCA Termores., M-17 Prøver analyseret inden belastning. Højt indhold af totalkim allerede i tankvognsmælk. Dog ikke højere indhold af termoresistente kim end normalt set, men det kan skyldes den tilstand mikroorganismer fra biofilm, kan befinde sig i. Stor stigning i indholdet af termoresistente kim i råmælkssilo og afgang pasteur. Har hurtigere nedsyrning.

28 Logning af ph under belastning (til foregående tælling af kim i prøver) Belastning af mælkeprøver ved 45 C, ,8 Forstørret i næste OH ph 6,3 5,8 5,3 4,8 4,3 3, minutter Tankvogn 1 Tankvogn 2 Råmælks Silo Afgang past Hurtigere syrning og kurve flader ud ved ph 4,3. Har et højere indhold af kim Meget hurtigere syrning for Råmælkssilo og afgang past. end for prøver udtaget hos landmand. ph kurve for Råmælkssilo og afgang past. flader ud ved ph 4,3.

29 Forskelle i nølefasen. ph 7 6,8 6,6 6,4 6,2 6 5,8 5,6 5,4 5, minutter Tankvogn 1 Tankvogn 2 Råmælks Silo Afgang past Forskelle i nølefasen.

30 Nølefase. minutter Tankvogn 1 Tankvogn 2 Råmælkssilo, Afgang past Udtagningssted, mejeri Nølefase/min Definition: Nølefase: det antal minutter der går før ph er faldet 0,2 ph-enhed. Jo kortere nølefase, jo hurtigere kommer mikroorganismer i gang. Nølefase/min Tankvogn Tankvogn Råmælkssilo, Afgang past

31 Eksempler fra mejeribruget. Svært at eftervise, for det kan være svært at fange bakterien i det ødelagte produkt (død/enzymer; fortyndinger). Eksempler på undersøgelse af skyllevand Biofilm i koncentratpasteur; undersøgelse af skyllevand Pustet ost; isolater der er kraftig luftdannere; fundet i mælken ind i syrerum og i osten. Tendens til flækker i ost: isoleret Leuconostoc i osten, som ikke stammer fra syrevækker. Krystaldannelse; Lb. curvatus. Senpustning; indirekte årsag B. licheniformis. Bombering af emballage; Sc. thermophilus. Sødkoagulering; Bacillus spp. / Pseudomonas spp. Biofilm / virus (bakteriofager). UF- biofilm.

32 I just can t go with the flow anymore. I ve been thinking about joining a biofilm.

33 Husflora hvad er det i grunden??? En mulighed er, at det er biofilm fra forskellige mejerier / tankvogne / landmænd.

34 Spørgsmål?