RUC Roskilde Universitet. Inducerede pluripotente stamceller og Parkinsons Sygdom. Den Naturvidenskabelige Bacheloruddannelse (Nat-Bach)

Transkript

1 RUC Roskilde Universitet Den Naturvidenskabelige Bacheloruddannelse (Nat-Bach) 1. semesterprojekt Mandag d. 21 december 2015 Hus: 14.1 Inducerede pluripotente stamceller og Parkinsons Sygdom Forfattere Gruppe 5 Helen Halskov Lambert (57360) Mads Teglhus Henriksen (58549) Nadia Ahrensborg Bülow Sleiman (57376) Natacha Marie Skotte Hansen (57356) Rasmus Troner Hansen (57332) Zilas Kjær Mikkelsen (57364) Vejleder: Johanne Davidsen Vejleder: Johanne Davidsen

2 English Abstract: Parkinson s disease is one of the most common neurodegenerative diseases. The disease is known to affect approximately 1 out of 500 people worldwide. Scientists across the world have tried attempted to discover a cure without success. Levodopa was the first effective treatment option for patients with Parkinson s disease, but the lack of consistency made the drug ineffective over time. Therefore, scientists searched for a new treatment and they discovered embryonic stem cells (ESC). Unfortunately, the ethical concerns caused scientist to search for an even better solution. Based on the research found in the field of embryonic stem cells, Takahashi & Yamanaka discovered induced pluripotent stem cells (ipsc). With ipsc many of the ethical issues are not present due to the fact that ipsc is produced from human somatic cells. Stem cells and also their efficiency in cell therapy for patients suffering from PS are the main focus of this paper. We will disclose the process from which a human somatic cell is reprogrammed into an ipsc, from ipsc to dopamine producing neurons and how far along scientists are in the attempt of finding a cure. As insight for this topic, we used scientific papers, books and articles. Based on the knowledge and information from these sources did we conclude that: ipsc is capable of increasing the dopamine producing neurons that causes Parkinson s disease and will therefore have the potential to enhance life quality of individuals suffering from Parkinson s disease. Dansk Parkinsons sygdommen er en af de mest almindelige neurodegenerative sygdom. Sygdommen er estimeret rammer 1 ud af 500 personer. Forskere fra hele verden har prøvet at finde en kur, men uden held. Levodopa var det første effektive medicin præparat til behandling af Parkinsons sygdommen, dog er dets virkning ikke permanent og reduceres over tid. Grundet dette søgte forskerene efter en ny behandlingsmetode, det var her de opdaget embryoniske stamceller. De etiske problemer omkring embryonale stamceller gjorde, at forskere søgte efter en bedre behandlingsmetode. Takahashi & Yamanaka 2006 opdagede induceret pluripotente stamceller (ipsc) baseret på data fra embryonale stamceller. Ved ipsc er de fleste etiske problemstillinger ikke længere en realitet, da ipsc kan produceres fra somatiske celler. Det er disse celler som der Side 1 af 49

3 vil blive fokuseret på i dette projekt og hertil hvordan disse stamceller kan bruges til behandling af Parkinsons sygdom. Derudover vil processen der benyttes fra omprogrameringen af fibroblast til ipsc, samt fra ipsc til dopaminproducerende neuroner bliver forklaret. Der vil blive redegjort for hvor langt foskere er nået med, at finde en kur for Parkinsons sygdom. For at få viden til dette projekt har vi benyttede os af videnskabelige papirer, bøger samt artikler. Ud fra den viden vi har fået fra vores kilder er vi kommet frem til følgende konklusion: ipsc er i stand til, at øge dopaminproducerende neuroner, som er årsagen til Parkinsons sygdom, og kan derfor have potentiale til, at øge livskvaliteten hos personer der lider af Parkinsons sygdommen. Side 2 af 49

4 Indholdsfortegnelse Forord... 5 Indledning... 6 Problemformulering... 8 Problemafgrænsning... 8 Metodevalg... 9 Semesterbindingen... 9 Afsnit 1: Hjernens Funktion Centralnervesystemet Kommunikation og signalering Dopamin Basal Ganglierne Afsnit 2: Parkinsons sygdom Hvad er Parkinsons sygdom Årsager til Parkinsons sygdom Behandling af Parkinsons sygdom i dag Afsnit 3: Stamceller Karakteristika Deling og differentiering Typer af stamceller Embryonal udvikling Afsnit 4: Transskriptionsfaktorer til omprogrammering af fibroblaster Yamanaka Factors Afsnit 5: Metode til reprogrammering Gensplejsning med virale vektorer Gensplejsning uden brug af virale vektorer Afsnit 6: Fra ipsc til DA producerende nervecelle ipsc til midt hjerne DA producerende neuroner Afsnit 7: ipsc-terapi og Parkinsons sygdom Transplantation Efter Transplantation Lovgivning Diskussion Konklusion Side 3 af 49

5 Perspektivering Side 4 af 49

6 Forord Vi vil gerne takke vores vejleder, Johanne Davidsen, for hendes rettidige kommentarer og styring i forbindelse med formalia, teori, samt gruppedynamikken. Vi vil også gerne takke Professor Poul Hyttel, Institut for Klinisk Veterinær og Husdursvidenskab ved Københavns Universitet, for hans tid, samt ekspertise til at besvare vores spørgsmål angående ipsc. Vi vil gerne takke Cathy Mitchelmore, lektor ved RUC Eukaryot Cellebiologi & Molekylærbiologi På Institut for Natursystemer og Modeller", for hendes vejledning angående processen bag DA producerende neuroner. Vi vil gerne takke vores opponentgruppe for deres konstruktive kritik, som var til gavn for projektet, samt deres interesse for emnet. Derudover vil vi gerne takke vores opponentgruppes vejleder for engagement og idéer angående vores projekt under henholdsvis midt- og slutevaluering. Side 5 af 49

7 Indledning Der bliver hver dag verden over, forsket i nye metoder til helbredelse af sygdomme. I flere tilfælde bliver der fundet en kur, hvorimod andre sygdomme er mere komplekse at bekæmpe, herunder Parkinsons sygdom. Man har endnu ikke været i stand til at forklare hvorledes sygdommen opstår, og til dags dato eksisterer der ikke en fuldendt kur. 2 Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ sygdom, som forårsager tab af dopaminproducerende nerveceller i hjernen. Dopamin er et vigtigt signalstof for hjernen, og mangel på dette kan have konsekvenser såsom motoriske- og kognitive lidelser. Symptomer som gangbesvær og tremor, kan i takt med stigende mangel på dopamin, blive en del af patientens hverdag og fremprovokere depressiv tilstand hos patienten til stor gene for patienten, samt pårørende. 3 Der er stor efterspørgsel for en kur imod Parkinsons sygdom, hvilket har fået forskere til at se stamcelleterapi som en mulig behandlingsmetode. Stamcellers potentiale til at kunne differentiere sig, kan vise sig at have afgørende betydning for erstatning af dopaminproducerende neuroner i hjernen hos patienter med Parkinsons sygdom. Det er vigtigt at påpege at der findes forskellige typer stamceller, som hver især har forskellige formål. 4 En interessant type stamceller er embryonale stamceller, som hører under kategorien pluripotente stamceller, hvilke har potentiale til, at differentiere sig til alle celler i kroppen. 5 Disse typer stamceller optræder i embryoet og udtagningen af disse, skal ske i et fosters tidlige stadie, i en alder af 4-6 dage gammelt, hvilket skaber etiske problematikker. En anden problemstilling er, at brugen af embryonale stamceller er omkostningsfuldt, både økonomisk og arbejdsmæssigt. Udover dette kræver terapi med denne type stamceller ofte flere end et foster. 6 Med henblik på disse problematikker i behandlingen med embryonale stamceller, er en alternativ type stamceller, inducerede pluripotente stamceller (ipsc) i forskeres søgelys. Disse stamceller har, teoretisk set, samme potentiale som embryonale stamceller, men disse voksne celler kan omprogrammeres til at optræde som en pluripotent stamcelle, nemlig en ipsc. Ved brugen af denne type stamceller til terapi, vil man kunne undgå de etiske problemer, som forekommer ved arbejdet med embryonale stamceller. 7 En af fordelene ved brug af ipsc i behandlingssammenhænge er, at de omprogrammerede voksne celler kommer fra patienten selv og derfor indeholder samme DNA som patienten. Side 6 af 49

8 Undersøgelser har vist, at behandling med ipsc kan give anlæg for tumordannelse. Denne problematik forekommer i udviklingsfasen af denne type stamceller. Dette ligger til baggrund for at der forskes i metoder hvorpå, at omprogrammering af voksne celler til ipsc, kan lade sig gøre uden risiko for tumordannelse. 8 (NB: på billede 1 i appendiks ses en illustration af de væsentligste processer ved omprogrammering, som kan overblik over processen fra fibroblaster inducerede pluripotente stamceller dopaminproducerende neuroner) Side 7 af 49

9 Problemformulering Hvilket potentiale har dopaminproducerende neuroner afledt af inducerede pluripotente stamceller til at behandle Parkinsons sygdom? Problemafgrænsning I dette projekt vil der tages udgangspunkt i ipsc til dannelse af dopaminproducerende neuroner, da denne type stamceller, i vores projekt har vist sig at have størst potentiale. Der vil ikke blive beskrevet, hvordan embryonale stamceller- og direkte omprogrammering af fibroblaster til DA producerende neuroner, finder sted. Fokus vil dermed være på hvordan fibroblaster omdannes til ipsc og dernæst videreudvikles til DA producerende neuroner. Til omprogrammeringen af ipsc fra fibroblaster findes mange metoder, hvoraf Yamanaka Factors vil benyttes i dette projekt. Der vil ikke tages udgangspunkt i andre metoder. Der vil blive redegjort for selve dannelsen af DA neuroner, samt hvilke faktorer som benyttes i denne proces. Dog vil der ikke forekomme dybdegående beskrivelse af de enkelte faktorer. Ved omprogrammering af fibroblaster til ipsc vil der tages udgangspunkt i tre forskellige metoder til indsættelse af transskriptionsfaktorer til udtryk af bestemte gener; plasmider, retrovirus, herunder lentivirus, og adenovirus. Disse metoder hører under de mest anvendte metoder til omprogrammering. Der vil blive taget udgangspunkt i betydningsfulde transskriptionsfaktorer, som er vurderet til at have størst indflydelse ved udtryk af nødvendige gener i opretholdelsen af ipsc. Der vil blive lagt vægt på de væsentligste dele af hjernen, som har en relevans i forhold til Parkinsons sygdom. Dette gøres for at skabe forståelse for hvad denne sygdom indebærer, samt give et indblik i de betydningsfulde områder i hjernen, som bliver påvirket hos patienter med Parkinsons sygdom. Dette betyder, at der ikke vil blive beskrevet hvorledes andre dele af hjernen fungerer. Side 8 af 49

10 Metodevalg Vi har gennem litteraturstudie tilegnet os viden ved brug af diverse rapporter, journaler, artikler og bøger. Vi har ud fra denne viden udarbejdet dette projekt. Vi har taget kontakt til følgende forskere: Professor Poul Hyttel, Ved Institut for Klinisk Veterinær og Husdyrvidenskab ved Københavns universitet og Lektor ved RUC Cathy Mitchelmore, Eukaryot Cellebiologi (CELLBIOL) / Natur, Systemer og Modeller (NSM) / Molekylærbiologi. Kontaktpersonerne har vi benyttet som hjælp til vores projekt. Vi har især benyttet os af Professor Poul Hyttel, som har forsket og skrevet meget om stamceller, med særligt fokus på ipsc. Vi har, i forhold til vores egen forståelse og formidling af opgaven, benyttet repræsentationsformer, som indebærer statistik, figurer og empiri fra eksperter på området, stamceller. I udarbejdelsen af dette projekt har vi benyttet en hypotese opstillet af Takahashi & Yamanaka : ( ) that the factors that play important roles in the maintenance of ES cell identity also play pivotal roles in the induction of pluripotency in somatic cells. 10 Denne hypotese danner grundlag for teknologien bag ipsc. Semesterbindingen Dette 1. semesterprojekt omhandler hvordan naturvidenskab kan belyse et samfundsmæssigt problem. Denne gruppe har valgt at fokusere på Parkinsons sygdom, da denne sygdom har stor samfundsrelevans. Dette bunder i at Parkinsons sygdom er en af de mest almindelige neurodegenerative lidelser. Ifølge statistiske undersøgelser estimerer man, at 1 ud 500 mennesker på verdensplan lider af Parkinsons sygdom. 11 Hvis forskere kan finde en kur/behandling som kan hjælpe den syge, kan det have stor betydning for patienten, men også stor betydning ud fra et samfundsmæssigt perspektiv, da det er omkostningsfuldt at behandle patienter. Følelsesmæssigt, kan Parkinsons sygdom, udover at have indflydelse på den ramte, også have stor indflydelse på familie og pårørende. 12 Side 9 af 49

11 Afsnit 1: Hjernens Funktion I dette afsnit gennemgås centralnervesystemet og dettes opbygning, da det er den primære del af vores nervesystem, som bliver påvirket af Parkinsons sygdom. Der vil blive forklaret om aktionspotentialet og forbindelsen mellem de to hjernehalvdele (se billede 2 i appendiks for hjernens opbygning). 1.1 Centralnervesystemet Centralnervesystemet (CNS) består af to overordnede bestanddele; hjernen og rygmarven. Hjernen fungerer- og optræder som et opsamlingspunkt for informationer, hvor rygmarven agerer, som en direkte rute for signaler til/fra hjernen. CNS er opbygget af to typer væv; det grå- og hvide væv. Det hvide væv består primært af axoner og oligodendrytter, hvor det grå væv primært består af neuroner. 13 Begge typer af væv består af en stor mængde gliaceller. Gliacellerne kan optræde som støtteceller til neuronerne. Gliaceller optræder i forskellige former til specifikke opgaver. 14 Rygmarven er vores informationsvej fra hud, muskler, hår og nerver. Rygmarvens primære funktion i forbindelse med CNS, er at transportere stimuli og sende disse op mod hjernebakken og thalamus. Hvis det er en stimuli der påfører smerte, eller på anden måde ubehag, stoppes signalet i thalamus, hvortil det ikke sendes videre til cortex Kommunikation og signalering Midthjernen er kædet sammen med begge hjernehalvdele og samtidigt også med basalganglierne. Både den visuelle- og auditive respons er centreret i midthjernen. En måde hvorpå kroppen sender informationer videre på er via neuroner, som udnytter det aktionspotentiale der opstår ved hjælp af natrium/kalium-pumpen. Pumpen fungerer ved, at der bliver flyttet ioner fra den indre side af cellen til den ydre, hvorved der opstår en ændring i den potentielle energi hen over membranen. 16 Aktionspotentialet fungerer således, at neuronet kan sende et signal videre når potentialet overstiger et minimumskrav. 17 Neuroner står for kommunikation i CNS. Neuroner styrer forskellige typer adfærd, både indirekte og direkte i hele kroppen. Neuroner kommunikerer ved hjælp af to metoder, den ene kaldet; localized graded potential og aktionspotentialet. Den mest centrale forskel ved de to nævnte kommunikationsmetoder er afstanden hvorover de kommunikerer. Localized graded Side 10 af 49

12 potential bruges i forbindelse med kommunikation over små afstande, og aktionspotentialet i forbindelse med større afstande. Neuroner kommunikerer via elektriske impulser og kemiske stoffer kaldet transmitterstoffer. 18 Figur 1 På denne figur ses hvordan præ- og postsynaptikse neuroner kommunikerer med hinanden via transmitterstoffter. Endvidere ses det hvordan et neuron består af en cellekrop med tilhørende cellekerne. Neuronet består ydermere af et axon der sørger for, at sende signaler videre til andre neuroner. Neuronets dendritter modtager signaler fra andre neuroner. 19 Et neuron er opbygget af en cellekrop (se figur 1), hvor cellens DNA og organeller er lokaliseret. Ud fra cellekroppen udspringer dendritter og aksonet. Dendritter er små grene som andre neuroner kan danne synapser imellem. Synapser betegnes som det område, hvorpå neuroner mødes og kommunikerer. Aksonet er en forlængelse fra cellekroppen, som er specialiseret i den kommunikationsmetode kaldet aktionspotentialet. Aksonet munder ud i en masse små forgreninger, hvilket kaldes aksonsterminaler. Aksonsterminalerne danner synapser med den næste celles dendritter, cellekrop eller akson. En synapsekløft er til stede imellem det præsynaptiske neuron og dendritterne på den postsynaptiske celle. 20 Aktionspotentialet betegner neuroners kommunikationsmetode over længere distancer, som foregår ved elektriske impulser, der genererer en forstyrrelse over cellemembranens spænding. Efter initiering af aktionspotentiale, vandrer det elektriske impuls ned til aksonsterminalen, hvor det stopper. Det er ikke muligt for den elektriske impuls at krydse synapsekløften, men derimod aktiveres de transmitterstoffer som den præsynaptiske celle har synteseret, og pakket i små blærer, kaldet vesikler. Transmitterstofferne krydser herefter synapsekløften og binder sig til receptorer på den postsynaptiske celle. Hermed er signalet/informationen blevet videregivet fra én celle til en anden. Alle transmitterstoffer Side 11 af 49

13 binder sig til en specifik gruppe receptorer. Et af disse transmitterstoffer er dopamin, som spiller en stor rolle i Parkinsons sygdom Dopamin Da Parkinsons sygdom skyldes et tab af dopaminproducerende neuroner i CNS, mellem substantia nigra og striatum, også kaldet nigrostriatal rute, er det vigtigt med en detaljeret forståelse af dopamin og transmitterstoffets rolle i den raske hjerne, for forståelsen af Parkinsons sygdom. Dopamin er et transmitterstof og spiller en rolle i CNS ved eksempelvis, at regulere menneskets motorik, søvncyklus, kognitive processer og belønningssystemet. Figur 2 - Her ses et billede af synteseringen af dopamin. 1. trin: ses hvordan tyrosin bliver omdannet til dihydroxyphenylalanin (DOPA) via enzymet tyrosin hydroxylase. 2. trin: ses det hvordan DOPA bliver omdannet til dopamin via enzymet dopadecarboxylase.. 22 Dopamin syntetiseres i hjernen fra aminosyren tyrosin, hvilket kan ses på figur 2. Tyrosin konverteres via enzymet tyrosin hydroxylase til dihydroxyphenylalanin, hvorefter dette omdannes til intracellulær dopamin via enzymet dopadecarboxylase. Efter frigørelsen af dopamin i synapsekløften, binder dopamin sig enten til D1- eller D2 receptoren, som regulerer basalganglierne og efterfølgende musklerne i form af bevægelse, hvilket vil blive redegjort for i det efterfølgende afsnit Basal Ganglierne Basal ganglierne (BG) er betegnelse for en samling neuroner i CNS. Disse områder i hjernen er cerebral cortex, striatum, globus pallidus, thalamus, substantia nigra og subthalamic nucleus. Disse seks nævnte områder i BG spiller væsentlige roller i forståelsen af Parkinsons sygdom. BG s funktion består i at regulere vores muskelbevægelse. BG fungerer via to forskellige ruter; enten den direkte- eller den indirekte rute. Disse to ruter påvirker enten vores muskler fremmende eller hæmmende. De seks nævnte komponenter i BG spiller væsentlige rolle i hver rute. 24 Side 12 af 49

14 Når vi eksempelvis vil sætte gang i vores muskler, og løbe i stedet for at gå, er det den direkte rute der aktiveres. Cerebral cortex (cortex), som er den del af hjernen der kommunikerer med vores muskler via neuroner, starter processen ved at sende stimulerende signaler ved brug af transmitterstoffet glutamate til striatum. I striatum er putamen lokaliseret. Striatum har til funktion, at sende hæmmende signaler via transmitterstoffet, GABA, til globus pallidus internal (GPI). GPI modtager hæmmende signaler fra striatum hvilket betyder, at GPIs aktivitet reduceres og medfører at GPIs effekt på thalamus reduceres. Thalamus er en komponent i BG hvis funktion er at sende stimulerende signaler til cortex. Thalamus vil være aktiv og sende stimulerende signaler til cortex, og på denne måde aktivere vores muskler. Dette gør, at thalamus aktivitet holdes nede af GPI. Dette betyder, at hvis GPIs aktivitet nedsættes via GABA fra striatum bliver thalamus aktivitet effektiviseret. Hertil modtages signalet til cortex, som startede processen, og cortex kan dermed sende flere stimulerende signaler til vores muskler. Substantia nigras rolle i denne proces er essentiel. På de neuroner der sender hæmmende signaler fra striatum til GPI i den direkte rute, sidder der dopamin Figur 3 Viser hvorledes Den Direkte Rute og Den Indirekte Rute fungerer ved at sende signaler rundt i de forskellige komponenter i BG. Den gule skrift GLU står for Glutamate og er de fremmende signaler i BG. Den røde skrift GABA er de hæmmende signaler i BG. De grønne streger er nigrostriatal pathway, altså ruten hvor dopamin bliver sendt fra Substantia Nigra til Striatum. 139 receptorer kaldet D1. Substantia nigra sender dopamin til striatum via nigrostriatal rute. Dopamin binder sig til D1-receptorerne, hvilket resulterer i, at de hæmmende signaler fra striatum til GPI bliver forstærket. Dette betyder at GPI i større grad bliver hæmmet og de efterfølgende hæmmende signaler til thalamus bliver svagere. Thalamus aktivitet øges og derved øges de stimulerende signaler til cortex og videre til vores muskler. Den sidste komponent i den direkte rute er subthalamic nucleus (STN). STN sender stimulerende signaler til substantia nigra (SN), som herefter sender mere dopamin til striatum via nigrostriatal rute. SN kan sende hæmmende signaler tilbage til STN og stoppe de stimulerende signaler fra STN Side 13 af 49

15 til SN. Konsekvensen af manglende dopamin er altafgørende for de motoriske færdigheder og vil blive redegjort for i afsnit 2. Den indirekte rute indeholder de samme komponenter som i den direkte rute, dog findes der udover GPI også globus pallidus external (GPE). Den indirekte rute består i, at forhindre uønsket muskelbevægelse. Processen påbegyndes ved at cortex sender stimulerende signaler til striatum. Striatum sender hæmmende signaler til GPE i stedet for til GPI. GPE sender sine hæmmende signaler til STN, som sender hæmmende signaler videre til GPI. Da GPEs rolle er at reducere aktiviteten af STN, bliver STN nu mere aktiv idet striatum sender hæmmende signaler til GPE. GPE kan derfor ikke kan sende ligeså mange hæmmende signaler til STN. STN vil dermed have en øget aktivitet. STN kan nu sende flere fremmende signaler til GPI. Dette medfører at GPI bliver mere aktiv og kan sende flere hæmmende signaler til thalamus altså det modsatte af den direkte rute. Thalamus aktivitet hæmmes og thalamus kommunikation med cortex reduceres. Dermed reduceres kommunikationen mellem cortex og vores muskler Dopamins rolle er ligesom i den direkte rute, essentiel. Dopamin påvirker den indirekte rute ved at øge aktiviteten af thalamus og dermed regulere den indirekte rute. Dette foregår ved at STN sender stimulerende signaler til SN. SN kan herved sende dopamin til striatum via nigrostriatal rute. Dopamin binder sig efterfølgende til D2-receptorer på stimulerende neuroner i striatum. Disse neuroner fremmer det hæmmende signal fra striatum til GPE. Dopamin hæmmer de stimulerende neuroner og reducerer derfor det hæmmende signal fra striatum til GPE. De hæmmende signaler fra striatum til GPE er nu derfor, ikke så aktive som før og GPE kan nu hæmme STN mere. Dette resulterer i, at STN s aktivitet reduceres og derfor også, de stimulerende signaler til GPI. I sidste ende medfører dette, at GPIs reducerende effekt på thalamus aktivitet reduceres og thalamus får en øget kommunikation med cortex og dermed vores muskler Side 14 af 49

16 Afsnit 2: Parkinsons sygdom I dette afsnit bliver der gennemgået hvad Parkinsons sygdom indebærer, samt nogle af de teorier bag hvorfor man udvikler Parkinsons sygdom. Der vil blive redegjort for hvilke typer af behandlingsformer der i dag bliver brugt imod Parkinsons sygdom. 2.1 Hvad er Parkinsons sygdom Parkinsons sygdom (PS) er en progressiv neurodegenerativ sygdom. Dette betyder, at sygdommen intensiveres og forværres med tiden, og at der er et konstant tab af neuroner i hjernen. Årsagen til PS er et tab af dopaminproducerende neuroner i substantia nigra. Som det ses på figur 4, er der en væsentlig forskel på substantia nigra hos patienten med PS, sammenlignet med patienten uden PS. I hjernen til højre, ses patienten med PS, hvor dopaminproducerende neuroner, er blevet reduceret. 29 Hos patienten uden PS (til venstre) ses de dopaminproducerende neuroner, hvilket er det sorte område, som er indikeret med gule pile på figuren. PS kan karakteriseres ved blandt andet træge- og fravær af bevægelser hos patienten. Dette ses i form af rystelser, stivhed i kroppen og kan medføre at patientens bevægelser ikke forekommer lige så flydende sammenlignet med en rask patient. Symptomerne er et resultat, som en af følgerne ved tabet af DA-producerende neuroner i substantia nigra. 30 Figur 4 På denne figur ses substantia nigra. Til venstre ses hvordan substantia nigra ser ud hvor en rask person. Til højre ses substantia nigra hos en patient med parkinon. På denne illustration ses de DA producerende neuroner (sort område) hos en rask person, det ses endvidere hvordan de er forsvundet hos en med PS. 140 Det nævnes i (afsnit 1.4) at DA producerende neuroner i substantia nigra sender deres axoner til striatum, hvorved den direkte- og indirekte signaleringsrute aktiveres. Dopaminreceptorerne i substantia nigra, fremmer den direkte- og hæmmer den indirekte rute. Mangel på DA-producerende neuroner i substantia nigra gør således, at den direkte- og indirekte signaleringsrute ikke fungerer optimalt. Hos patienter med PS er de frivillige motoriske bevægelsesmønstre reduceret ved motor cortex, som er en væsentlig faktor for Side 15 af 49

17 frivillig bevægelse. Motor cortex er hos patienter med PS hæmmet af den indirekte signaleringsrute og stimuleringen er ikke kraftig nok til, at den direkte signaleringsrute kan aktiveres. Tabet af DA-producerende neuroner i substantia nigra, forstyrrer den balance der forekommer mellem stimuleringen og hæmningen af den direkte signaleringsrute og indirekte rute Årsager til Parkinsons sygdom Det fremstår til dags dato stadig uklart for forskere, hvorfor man udvikler PS. Der findes forskellige teorier om, at specifikke genmutationer kan være en medvirkende årsag som gør, at man udvikler enten sporadisk eller arvelig PS. 32 Mutation i genet leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) kan tilknyttes til sporadisk og arvelig PS. Det menes, at en mutation i dette gen er ansvarlig for 5-13% af arvelig PS, hvorimod sporadisk PS menes at være 1-5%. 33 LRRK2 koder for proteinet dardarin. Leucine-rich er en region i dardarin proteinet. Leucine-rich indeholder store mængder af aminosyre kaldet leucine. Mutationerne foregår således, at en enkelt aminosyre bliver udskiftet i dardarin. Disse mutationer påvirker, at proteinet ændrer struktur og derudover funktion. Det forekommer dog stadig uklart, hvordan mutationer i LRRK2 kan sættes i forbindelse med de nævnte motoriske problemer hos patienter med PS. 34 Lewy bodies (LB) ses ofte hos patienter med PS. LB optræder i døende- eller døde DAproducerende neuroner. 35 Proteinet -synuclein er en vigtig del af LB som er det patologiske kendetegn ved PS. 36 LB er kendetegnet ved de skader der forekommer i de degenerative neuroner i hjernen hos patienter med PS. En mutation i genet der koder for proteinet - synuclein er blevet koblet til en arvelig form for PS. Forsøg med lys og elektron mikroskoper udført med antistoffer viste, at -synuclein også spiller en rolle i sporadisk PS. 37 En af LBs store bestanddele er misfoldede -synuclein, som SNCA koder for. Det er stadig usikkert hvad - synucleins rolle er i den raske hjerne. Proteinet kan have indflydelse på både frigørelsen- og reguleringen af dopamin. Rollen af SNCA i PS er ikke helt kortlagt, men en eventuel sammenklumpning af proteinet, -synuclein, som den koder for, kan være en faktor, som er med til at forstyrre de signaler der bruges under frigivelsen af dopamin, hvilket kan lede til død af DA producerende neuroner. Forskere mener, at misfoldninger af -synuclein, kan lukke for de funktioner i cellen som har til opgave at fjerne uønskede proteiner, hvilket kan have indflydelse på DA producerende neuroner, da uønskede proteiner kan tilstoppe og gøre Side 16 af 49

18 neuroner ineffektive eller dræbe dem. Det vides dog ikke, om LB er en faktor der er skyld i tabet af de dopaminproducerende neuroner, eller om det er et resultat af at cellerne prøver at bekæmpe sygdommen Behandling af Parkinsons sygdom i dag Den mest almindelig behandlingsform dags dato af PS er med medicinpræparatet levodopa (Ldopa), hvilket skyldes effektiviteten. L-dopa giver den bedste dæmpende effekt på symptomerne både i det tidlige og sene stadie af PS. L-dopa bliver ved hjælp af en hæmmer for chol-o-methyltransferase (COMT) transporteret ind i hjernen og udskiller dopamin. Hæmmeren er en betydningsfuld faktor, da den forøger mængden af L-dopa, som kan krydse blod-hjerne-barrieren (BHB). BHB er en begrænsning for dopamin, da det i sig selv ikke kan krydse denne barriere. Hvis dopamin optages i kroppen, før det trænger igennem BHB, vil dette give bivirkninger hos patienten med PS, såsom kvalme og hukommelsestab. L-dopa kan gives i en kombination med carbidopa og entacapone. Cardidopa fungerer som hæmmer for L-dopa. Den øger effektiviteten og undgår at L-dopa nedbrydes i blodet, før det har trængt igennem BHB, hvor det optages af neuroner i substantia nigra og omdannes til dopamin. Entacapone er en hæmmer, som sørger for at L-dopa forlænger sin effekt i substantia nigra og gør, at patienten er symptomfri i længere tid. Denne tilførsel af dopamin ved brug af præparater, kan afhjælpe patienter med PS med de motoriske problemer, som sygdommen er skyld i. 39 Effekten af L-dopa er ikke permanent. Derimod vil præparatet med tiden have ringere effekt på patienten, hvilket vil sige, at symptomerne efter forholdsvis få år vil vende tilbage. 40 En anden behandlingsmetode er deep brain stimulation (DBS). Denne behandlingsform er en operation, som patienten får foretaget. Der bliver indopereret elektroder i enten subthalamic nucleus eller globus pallidus. Disse er begge vigtige dele af basal ganglia, som er det sted i hjernen, hvor den degenerative ændring i PS forekommer. 41 Side 17 af 49

19 Under operationen bores der et hul i kraniet hvor en eller flere elektroder implanteres i udvalgte steder i hjernen. Hertil er ledninger forbundet med elektroderne, som forsyner disse med elektricitet. Elektroderne i hjernen er tilsluttet en impulsgenerator der er placeret under brystet. Impulsgeneratoren sender elektriske impulser gennem ledningerne op til nævnte elektroder (se figur 5). Disse elektriske impulser benyttes til at aktivere eller hæmme de signaler som neuronerne i subthalamic nucleus eller globus pallidus udsender. Elektroderne kan tilsluttes til både højre- og venstre hjernehalvdel eller blot til en af dem. De mest almindelige steder i hjernen, hvor DBS benyttes er subthalamic nucleus eller globus pallidus, som begge tilhører basal ganglierne. DBS kan reducere rystelser, stivhed og langsomhed ved stimulation af de nævnte steder. DBS har ikke vist sig at forbedre de kognitive problemer såsom tale, demens, angst og depression, men kan derimod være med til at svække disse faktorer. Meget af den viden som forskere har omkring DBS, er primært underbygget af empiri, da man endnu ikke har været i stand til at forklare, hvilket faktorer som har indflydelse på PS. Man ved dog, at DBS kan lindre motoriske problemer hos patienter med PS. 42 Figur 5 - Her ses et billede af hvordan DBS er indopereret i hjernen hos en med PS. Derudover ses det hvordan impulsgeneratoren er placeret under brystet og er forbundet med ledninger som går op gennem nakken og under hovedbunden hvor elektroden er placeret i subthalamic nucleus. 141 Side 18 af 49

20 Afsnit 3: Stamceller Da vores formål med denne rapport er at udnytte stamcellers pluripotens som behandlingsform af Parkinsons sygdom, er det nødvendigt, at have en forforståelse vedrørende stamceller og deres egenskaber. I dette afsnit vil vi redegøre for de karakteristika, som stamceller indebærer, samt deres deling og differentiering. Derudover vil vi opstille en hierarkisk opdeling af stamcellers potens. Der vil blive redegjort for den embryonale udvikling, hvilket delvist danner grundlag bag teorien om ipsc. 3.1 Karakteristika Stamceller er defineret ved deres unikke evne til at kunne forny sig selv i uendelighed, og deres evne til at kunne specialisere sig til en eller flere af kroppens forskellige celletyper. Cellerne gentager mitose celledelinger i uendelighed, fordi stamceller har et højt indhold af enzymet telomerase. Telomerase beskytter telomererne (kromosomenderne). Modsat celler som ikke udtrykker enzymet telomerase, kan celledeling kun finde sted et bestemt antal gange. Hver celles DNA bliver forkortet for hver gang en celledeling finder sted, hvilket på et tidspunkt leder til, at der ikke kan opstå flere delinger. 43 Denne grænse af baseret på Hayflick s grænse. 44 De udifferentierede stamceller har endvidere nogle karakteristika der adskiller dem fra de andre typer af celler i kroppen. De har få organeller i deres cytoplasma, men mange mitokondrier der kan opretholde energien ved de mange celledelinger som stamceller udfører. Ydermere, har udifferentierede stamceller brug for at kunne opretholde en mere aktiv proteinsyntese. Derfor har de en større nucleolus, som kan producere rigeligt med ribosomer, der kan producere de nødvenlige proteiner. 45 Side 19 af 49

21 3.2 Deling og differentiering Når udifferentierede stamceller skal dele sig, kan de gøre dette på to forskellige måder; ved symmetrisk deling eller ved asymmetrisk deling. Ved asymmetrisk deling producerer en stamcelle en kopi af sig selv og en differentieret celle (se figur 6). Denne delingsmetode er med til at holde niveauet af stamceller stabilt. Stamceller er i stand til at lave to forskellige former for symmetrisk deling; proliferation og differentiation. Ved en proliferation deling bliver en stamcelle til to identiske kopier, og ved en differentiation deling bliver en stamelle til to identiske differentierede celler (se figur 6). Den symmetriske deling udfører stamcellerne i tilfælde af skader på eksempelvis hudceller, hvor stamcelleniveauet skal forhøjes. 46 Figur 6 - På overstående figur ses de to overordnede måder hvorpå udifferentierede stamceller kan dele sig; symmetrisk og asymmetrisk dellig. Ved den asymmetriske deling kan det ses hvordan en stamcelle kan dele sig til en idendisk kopi af sig selv samt en diffentieret celle. Ved symmetrisk deling kan det ses hvordan en stamcelle kan blive til to idendiske kopier, dette kaldes proliferation. Den anden form for symmetrisk delling er differentiation, her bliver en stamcelle til to differentierede celler Typer af stamceller Det er vigtigt at påpege, at alle stamceller ikke har samme formål. Stamceller opdeles i fire forskellige grupper; uni-, multi-, pluri- og totipotente. De stamceller som kun kan differentiere sig til én enkel celletype kaldes unipotente stamceller. Disse ses eksempelvis ved hudceller, da de opretholder mængden og den løbende udskiftning af vævet. 47 Multipotente stamceller kan kun differentiere sig til et bestemt udsnit af kroppens celler. 48 De pluripotente stamceller har potentiale til, at kunne differentiere sig til alle kroppens celler. De totipotente stamceller kan ikke blot differentieres til alle typer af kroppens celler, men også til moderkagen og fosterhinden, derved en komplet organisme. Disse findes kun i zygoten og i de meget tidlige stadier af embryonet Embryonal udvikling Et befrugtet æg (zygot), er en stamcelle, samt de første celler som deler sig efterfølgende. 50 Det er ved fosterudviklingen der dannes embryonale stamceller. Side 20 af 49

22 Når et æg befrugtes (se figur 7) deler dette sig gentagende gange ved mitose. Efter at de første faser er overstået (2-4-stadium) vil cellerne i næste fase (8-16- cellestadium) fordele sig i forskellige bestanddele, nemlig et cellelag lokaliseret ved yderste fosterhinde og indre cellemasse. Cellelaget, trophectodermen, sørger for, at cellemassen er lokaliseret ved en pol, hvilket den formår ved produktion af en transporterende væske. I de følgende dage vil stamcellerne forsætte denne dannelse og derved optræde som en blastocyst efter en deling på omtrent 100 celler. 51 Embryoet er blevet en kugleformet masse af celler, med et væskefyldt hulrum i midten. 52 Denne består af 2 forskellige slags celler; en indre cellemasse og en ydre. Den indre cellemasse er de embryonale stamceller, som tilhører gruppen pluripotente. Den ydre cellemasse udvikles til moderkagen og kaldes trophoblast. 53 Den har ikke en direkte indvirkning på udviklingen af embryoet, men danner en forbindelse til livmoderen. Det er fra blastocysten, at embryonale stamceller kan isoleres. 54 Figur 7 Dette billede viser udviklingen af et befrugtet æg i de trin, som forekommer i den første uge efter befrugtningen. Processen fra zygoten til blastocysten. 143 Side 21 af 49

23 Afsnit 4: Transskriptionsfaktorer til omprogrammering af fibroblaster Dette afsnit vil redegøre for de betydningsfulde transskriptionsfaktorer, som ligger til baggrund for meget af den forskning der har været på området for ipsc. Der vil derudover opsættes, samt redegøres for transskriptionsfaktorernes hierarkiske orden Yamanaka Factors Takahashi & Yamanaka opdagede, at man ved hjælp af somatiske celler kunne danne pluripotente stamceller ved at overudtrykke gener, som kommer til udtryk i en embryonale stamcelle (ESc). Forskerholdet arbejdede ud fra en hypotese om, at de faktorer som havde en afgørende betydning for opretholdensen af ESc, havde en tilsvarende betydningsfuld rolle i inducerede pluripotente somatiske celler. 56 Det lykkedes dem ud fra i alt 24 kandidater, at udvælge 4 (Oct3/4, Sox2, Klf4 og c-myc), som i høj grad viste sig at aktivere de gener der bliver udtrykt i ESc. 57 Disse kandidater er transskriptionsfaktorer, som er proteiner der kan beslutte hvilke gener der skal hæmmes og aktiveres. I undersøgelsen benyttede forskerne sig af fibroblaster fra mus, men ved et forsøg af samme forskere i 2007, lykkedes det, at danne ipsc baseret på fibroblaster fra mennesker, ved at inducere de 4 transskriptionsfaktorer (Yamanaka Factors 58 ) i cellen. 59 På figuren 8 vises hierarkiet over transskriptionsfaktorerne i en ESc. I undersøgelsen af Takahashi & Yamanaka redegøres der for, at Oct4 og Sox2 fungerer som de centrale faktorer i hierarkiet, som der binder til Nanog. 61 Hertil fungerer Klf4 som en master regulator, som styrer de andre transskriptionfaktors udtryk (Oct4, Sox2, Klf4, c-myc og Nanog), hvilket kan ses på figur 8. Oct4 blev som det første af de fire transskriptionsfaktorer fundet til at være Figur 8 På denne figur vises hierakiet over afgørende transskriptionsfaktorer til omprogrammering af fibroblaster til ipsc. Dette består af Kruppel-like factor 4 (KLF4), octamer-binding transcription factor 4 (Oct4), SRY (sex determining region Y)-box 2 (Sox2), Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog (c-myc) og Homeobox protein (Nanog). Klf4, Oct4 og Sox2 er master regulatorer, som har stor indflydelse på udtrykket af de resterende transskriptionsfaktorer. 144 det grundlæggende bag pluripotens i ESc. 62 Side 22 af 49

24 I et forsøg lod man et embryo med manglende Oct4 udvikle sig til blastocyststadiet, hvor man kunne observere, at den indre cellemasse ikke længere opretholdte sin pluripotens. 63 I en undersøgelse 64 foretaget i 2007, har forskere undersøgt omprogrammering af fibroblaster til ipsc fra mus uden brug af c-myc, da c-myc i flere tilfælde på grund af reaktivering af retrovirus, har udviklet kræft. 65 Undersøgelsen viste, at uden tilstedeværelsen af c-myc bliver processen mindre effektiv, da transskriptionsfaktoren er med til at stimulere proliferation, hvilket kan ses på figur De forskellige transskriptionsfaktorer er i flere undersøgelser blevet undersøgt med henblik på, hvilken betydning de har for differentiation og pluripotens hos ESc. Oct4 har i en undersøgelse vist, at en vis mængde af transskriptionsfaktoren er nødvendig for at undgå, at stamcellen differentierer sig, og er betydningsfuld for reguleringen af stamcellens pluripotens. Desuden har denne transskriptionsfaktor også en indflydelse på selvfornyelse. 67 Klf4 har en vigtig rolle hvad angår reguleringen af celledeling og pluripotens. 68 Denne transskriptionsfaktor har i en undersøgelse vist sig, at koncentrationen af denne i udifferentierede celler forsvinder drastisk i løbet af de første dage under differentiering. 69 Klf4s selvfornyelse kan blive påvirket af Nanog. Det har vist, at sig hvis Klf4 bliver slået ud, kan et forstærket udtryk af Nanog være med til at redde ESc fra at differentiere sig. Dette tyder på, at Klf4 fungerer som en upstream regulator for Nanog og Nanog som en downstream regulator for Klf4. 70 Klf4 har, som vist på figur 8 interagerer med Sox2 og Oct4 og derved binde sig til Nanog promoter og regulere denne transskriptionsfaktor. 71 I figur 9 redegøres der for transskriptionsfaktorerne Oct4, FoxD3 og Nanog. FoxD3 og Nanog har en produktstimulerende effekt, hvorimod Oct4 har en hæmmende effekt på sig selv. FoxD3 kan opregulere Nanog, hvorimod Oct4 kan Figur 9 Denne figur viser betydningsfulde transskriptionsfaktorer, som har betydning for transskriptionsfaktorer til omprogrammering af fibroblaster til ipsc. Figuren viser betydningen af disse transskriptionsfaktorer ifht. Selvfornyelse og pluripotens for ipsc. Figuren består af Forkhead box D3 (FoxD3), Homeobox protein (Nanog) og octamerbinding transcription factor 4 (Oct4). 145 Side 23 af 49

25 undertrykke aktiviteten af Nanog. 72 FoxD3 har en effekt på selvfornyelse af stamceller, ved at være en promotor for de to andre transskriptionsfaktorer, vist på figur 9. Det skønnes at denne cyklus blot er en lille del af et større billede, hvor der er usikkerhed vedrørende transskriptionsfaktorene og deres hierarkiske opdeling. 73 Side 24 af 49

26 Afsnit 5: Metode til reprogrammering For at omdanne en fibroblast til ipsc, skal den udtrykke de gener der kommer til udtryk i embryonale stamceller (se afsnit 4). Det er derfor nødvendigt, at indsætte de nødvendige transskriptionsfaktorer i fibroblasten. I dette afsnit bliver metoden for indsættelse af transskriptionsfaktorene med retrovirus, herunder lentivirus, og adenoviris, samt plasmider gennemgået. Disse metoder er udbredte og anvendes i flere undersøgelser, hvilket ligger til baggrund for, at der redegøres for netop disse metoder. Der vil blive redegjort for de forskellige metoders komplikationer og fordele med henblik på indsættelse af transskriptionsfaktorene i fibroblaster og dermed dannelsen af ipsc. 5.1 Gensplejsning med virale vektorer Vira er en inficerende partikel og fungerer som en parasit, da den ikke kan reproducere sig selv eller har et stofskifte, og derfor må udnytte andre organismer som vært. Vira består ikke af celler og kan ikke klassificeres som en levende organisme. 74 De vira som bruges til genmodificering af fibroblaster er oftest af klassen retrovirus, samt underklassen kaldet lentivirus. Lentivirus har den unikke evne til at også at kunne inficere ikke- delende celler, hvilket ikke er muligt for retrovirus generelt. Retrovirus adskiller sig især ved enzymet reverse transskriptase (RT), som kan transskribere RNA til DNA, da dets genom består af RNA. Virussen fungerer således, at arvematerialet, RNA, indsættes permanent i cellens genom ved infektion, og kan Figur 10 - På figuren ses opbygningen af en retrovirus. Virussens genom bestående af to identiske RNA-strenge og dets enzym reverse transkriptase er omringet af virussens capsidproteiner. Virussen er derudover omgivet af en kappe (viral envelope) med glycoproteiner, som binder sig til receptormolekyler på værtsceller. 146 efterfølgende replikeres. 75 Side 25 af 49

27 Glycoproteinerne på virussens kappe (envelope) binder sig til specifikke receptormolekyler på værtscellens overflade. Efter at retrovirussen optages i værtscellen, fjernes capsidproteinerne og RT og virussens RNA frigøres i værtscellens cytoplasma. RT katalyserer herefter syntesen af RNA til en dobbeltstrenget DNA. Den nye virale DNA-sekvens indtræder herefter i værtscellens nucleus og integrerer sig i dets genom. Det integrerede virale DNA, kaldet provirus, forbliver i værtscellen. Derefter kan provirus transskriberes til RNA igen. Virussens RNA og RT enzymer indkapsles af capsidproteinerne, og den nysyntetiserede viruspartikel forlader værtscellen gennem knopskydning, se Figur Ved gensplejsning med virus benyttes virussens egen biologiske proces, til indsættelse af transskriptionsfaktorer i værtscellen. Virussen bliver derfor en viral vektor og er et nyttigt redskab, til brug af gensplejsning. Omprogrammeringen af fibroblaster til ipsc kan gøres ved brug af retrovirus, hvilket har god effektivitet i form af udbyttet af stamceller. 77 Første gang man udviklede ipsc, benyttede man retrovirus. 78 Figur 11 - Denne figur viser replikationen af en virus. Det ses hvordan virus inficere en værtscelle hvorefter enzymet RT og det virale RNA bliver frigivet. Derefter bliver det virale RNA omdannet til DNA, som derefter kan få adgang til værtcellens kerne. Herefter bliver det integreret i værtscellens genom og bliver herefter kaldet provirus. Værtcellen kan derefter udtrykke de gener provirus koder for og dermed danne nye virus. Når de nye virus forlader værtcellen medtager de dermed glycoproteinerne fra værtcellens membran. Dermed kan virus forsætte ud i kroppen og inficere andre celler, ved at binde sig til specifikke receptorer på overfladen af værtscellerne. 147 Den største forhindring ved brugen af lentivirus og retrovirus er, at omprogrammere fibroblaster til ipsc, da deres genom permanent bliver integreret i værtscellens DNA. Det betyder at transskriptionsfaktorerne har potentialet til at blive genaktiveret, selv efter ipsc er blevet differentieret til andre celletyper. Det er især transskriptionsfaktoren c-myc der er problematisk hvis den genaktiveres efter indsættelse i fibroblasten, da den er associeret med tumordannelse 79. Tumordannelsen forekommer på grund af manglende kontrol for vækst og Side 26 af 49

28 deling. 80 Da nerveceller ikke deler sig, er det problematisk, hvis c-myc, der er associeret med proliferation, bliver genaktiveret og får nervecellerne til at dele sig. 81 Grundet problemstillingerne med benyttelse af retrovirus, herunder lentivirus, er der blevet lavet forsøg med andre vira b.la. adenovirus. Fordelen ved brugen af adenovirus er, at virussen ikke bliver integreret i værtscellens DNA, og dermed mindskes risikoen for genaktivering af c- Myc. 82 Dette er dog også en ulempe, da det er meget svært, at kontrollere transskriptionsfaktorernes udtryk af gener. Dette kan resultere i, at generne ikke bliver udtrykt i tilstrækkelige mængder og kan vanskeliggøre dannelsen af ipsc. Dermed er effektiviteten af adenovirus meget lav, og ikke velegnet til udvikling ipsc Gensplejsning uden brug af virale vektorer Grundet de forskellige problemstillinger ved bruge af virale vektorer til genereringen af ipsc, er der blevet lavet flere forsøg med formålet, at genere ipsc uden brugen af virale vektorer. Der er derfor mange forskellige metoder hvorpå dette kan lade sig gøre, men den metode vi vil gå i dybden med er brugen af plasmider. Dette afsnit er baseret på et forskerinterview med Professor Poul Hyttel. 84 Prokayoters kromosomer adskiller sig fra eukaryoters, ved at være cirkulære, i forhold til at være lineære hos eukaryoter. 85 En typisk prokaryot celle har derudover også plasmider. Disse findes i bakterier og nogle svampe, og kan variere i størrelse, fra 0,1-5% af bakteriens samlede DNA. 86 Plasmider er selvstændigt replikerende ringformet DNA, der kun består af få gener. 87 Bakterien kan replikere pladsmiden og derefter videregives ved deling, eller overføres til andre bakterier. Plasmider bruges ofte i forskning til at klone, overføre og manipulere gener, og når plasmiderne anvendes eksperimentelt til disse formål kaldes de vektorer. Forskere kan indsætte gener i en plasmidvektor, som derefter kan indsættes i en værtscelle, ved transformation. Værtscellen vil derefter udtrykke de gener plasmidvektoren indeholder. 88 Omprogrammeringen fra fibroblast til ipsc ved hjælp af plasmidvektorer foregår således: startes ved, at der udtages fibroblaster fra patienten, som derefter bliver dyrket i en dyrkningsskål. Dernæst indsættes transskriptionsfaktorerne i fibroblasterne, hvor gener efterfølgende bliver udtrykt og omprogrammerer fibroblasterne til ipsc. Disse transskriptionsfaktorer er pakket sammen i tre plasmider. Plasmiderne overføres til cellerne Side 27 af 49

29 ved elektroporation, hvor fibroblasternes membran kortvarigt permeabiliseres 1, så plasmiderne kan trænge ind i fibroblasten. Efter dette elektrochok, er plasmiderne indsat i fibroblasterne og udvikles til ipsc. Fordelen ved brugen af plasmider er, at de ikke integrere deres DNA i fibroblasternes genom, og dermed undgås risikoen for genaktiveringen af generne. Transskriptionsfaktorerne der indsættes i plasmiderne, er som udgangspunkt de fire transskriptionsfaktorer (Sox2, Oct4, c-myc og Klf4). Effektiviteten er forholdsvis lav med en effektivitetsprocent på 0,016%, hvilket betyder, at det kun er 0,016% af de dyrkede kolonier som fungerer med henblik på udvikling af DA producerende neuroner. 89 Endvidere kan der bruges forskellige molekyler og transskriptionsfaktorer, hvilket der ikke vil blive redegjort for. 1 Fibroblasternes cellemembran åbnes kortvarigt og gøres gennemtrængelig for plasmiderne Side 28 af 49

30 Afsnit 6: Fra ipsc til DA producerende nervecelle Efter omprogrameringen af fibroblaster til ipsc, skal ipsc nu differentieres til DA producerende neuroner. I dette afsnit vil der i forsøget udført af Kriks et al blive gennemgået med henblik på differentiering af ipsc til DA producerende neuroner. Her forklares hvert enkelte trin, samt de forskellige hæmmere og aktivatorer, som bruges. Dette er for at skabe forståelse for processen af differentieringen af ipsc, samt give indblik i fremgangsmåden in vitro. Figur 12 Denne figur viser dannelsen fra ipsc til DA producerende neuroner. Trin 1: Består af ipsc-kolonie, hvor tilsætningen af; purmorphamine (Pur) til aktivering af Sonic Hedgehog (SHH); CHIR til aktivering af canonical WNT signalering; SB til inhibitering af - transformerende vækstfatkor beta (TGFβ); lav dose naltrexone (LDN) til inhibitering af knoglemorfogenetisk protein (-BMP). 2. Trin 2: Her optræder samme karakteristiske egenskaber, som der gør i midt hjerne floor plate. Tilsætning af; Blodpladeafledt vækst faktor (PDGF-AA); Neuron-afledt neurotrofisk faktor (BDNF); Gliacelleafledt neurotrofisk faktor (GDNF); Catabolit aktivatorprotein (camp); Transformerende vækstfaktor 3 (TGFβ). Trin 3: Er de færdigudviklede DA producerende neuroner blevet dannet ipsc til midt hjerne DA producerende neuroner I en undersøgelse af Kriks et al har forskere dannet DA producerende neuroner ud fra ipsc, som i denne undersøgelse har vist, at være effektiv in vivo hos dyr, beskadiget med 6- hydroxydopamine, som simulerer Parkinsons sygdom. 93 I undersøgelsen eksponeres ipsc for bestemte molekyler i et bestemt antal dage, i udviklingen af DA producerende neuroner, hvilket kan ses på figur 12. Ved det første trin (dag 0-13) eksponeres stamcellerne for følgende faktorer: Pur (SHH), CHIR (WNT), SB (-TGFβ) og LDN (-BMP), hvor stamcellerne i vækstmediet begynder differentiation. Allerede fra dag 11 kunne forskerne se forstadiet til DA producerende neuroner. På dag 13 kunne forskerne se markører for DA producerende neuroner, som er karakteristiske for midthjerne floor plate væv. Midthjerne floor plate fungerer som signalcenter og signalerer til cellerne i vækstmediet, hvorledes de skal differentiere sig under udviklingen til DA producerende neuroner. 94 Pur og CHIR er aktivatorer, som aktiverer signalveje for SHH og WNT. SB og LDN hæmmer bestemte signalveje for -TGFβ og -BMP, hvilket minusset repræsenterer og kan ses på figuren i fra dag I andet trin (dag 13-25) indsættes fem forskellige vækstfaktorer kaldet PDGF-AA, BDNF, GDNF, camp og TGFβ3, som kan ses på figur Disse vækstfaktorer udvikler cellerne til DA producerende neuroner (trin 3), hvilket i den nævnte undersøgelse af Kriks et. al. 2011, redegøres for, da samme karakteristiske faktorer optræder i midthjerne DA producerende Side 29 af 49