ØVELSE 3 ENZYMMÅLINGER OG ENZYMKINETISKE UNDERSØGELSER

Transkript

1 27023, Forår 2013 ØVELSE 3 ENZYMMÅLINGER OG ENZYMKINETISKE UNDERSØGELSER Lærer: Maher Abou Hachem, maha@bio.dtu.dk, Tlf , Bygning 224, 122

2 Indholdsfortegnelse: INTRODUKTION Enzymer - definition og virkemåde Enzymkinetisk analyse Inhibering af enzymaktivitet Kompetitiv inhibering Non-kompetitiv inhibering Faktorer af betydning for enzymaktivitet Enzymanalyse Introduktion til phosphataser... 9 EKSPERIMENTELT Kort beskrivelse af de forskellige deløvelser A: Absorptionsmaksimum B: Standardkurve for p-nitrophenol C: Sammenhæng mellem reaktionshastighed og tid D: ph-optimum E: Temperaturoptimum F1-F3: Enzymkinetiske undersøgelser Fremgangsmåde Plan for udførelse af metode Deløvelse B. Standardkurve for p-nitrophenol (anjon) Deløvelse C: Sammenhæng mellem reaktionshastighed og tid Deløvelse D: ph optimum Deløvelse F1- F3. Enzymkinetiske undersøgelser RAPPORTERING Aflevering: Indhold og form Rapportering 1: Deløvelse B Rapportering 2: Deløvelse C Rapportering 3: Deløvelse D Rapportering 4: Deløvelse F Rapportering 5: Supplerende spørgsmål APPENDIKS Appendiks 1: Guide til Epoch mikrotiterbakke-læser Appendiks 2: Skabelon til påsætning i mikrotiterbakker Appendiks 3: Beskrivelse af anvendte kemikalier Side 2/27

3 INTRODUKTION 1. Enzymer definition og virkemåde Enzymer er proteiner, der katalyserer biologiske reaktioner. Som andre katalysatorer påvirker enzymer hastigheden, hvormed ligevægt opnås, uden at influere på reaktionens ligevægtsbetingelser. Dette sker, ved at tilstedeværelse af enzym tilbyder en reaktionsvej med lavere aktiveringsenergi end den ikke-katalyserede reaktion. 2. Enzymkinetisk analyse Hovedfaktorer der bestemmer reaktionshastigheden er: 1. Enzymkoncentrationen 2. Substratkoncentration 3. ph og temperatur 4. Eventuelle enzyminhibitorer Figur 1 viser ændringen i produktkoncentrationen som funktion af tiden. Hastigheden, V, hvormed produktet dannes eller substratet bruges, kan udtrykkes ved V = dp dt ds = dt Når reaktionen starter, er V lineær, men efter en periode aftager den langsomt. Ved kinetiske undersøgelser af enzymkatalyserede reaktioner anvendes derfor ofte den initiale hastighed V 0 Figur 1 Den initiale reaktionshastighed, V 0, for en enzymkatalyseret reaktion vokser med forøget substratkoncentration, indtil et vist niveau er nået, hvor yderligere tilsætning af substrat ikke forøger V 0 yderligere. Dette fænomen kaldes substratmætning, og den maksimale initiale reaktionshastighed benævnes V max. Side 3/27

4 Figur 2 Den afbildede sammenhæng mellem initiale hastighed og substrat Figur 2, side 4 er forsøgt forklaret ved følgende reaktionsskema, hvor E er enzym, S er substrat og P er produkt: (1) k 1 E + S ES E + P k -1 k 2 Som det fremgår, involveres kun et enkelt substrat, og reaktionen forløber over et intermediært enzym-substrat kompleks (ES) under dannelse af et produkt. Michaelis og Menten har ud fra ovenstående reaktionsskema udledt et matematisk udtryk, der beskriver sammenhængen mellem initial reaktionshastighed og substratkoncentration: (2) V o = V max [S] K m + [S] K m og V max er karakteristiske størrelser for det undersøgte enzym/substrat system. V max er den maksimalt opnåelige reaktionshastighed for en given enzymkoncentration og er således et udtryk for enzymets katalytiske kapacitet. K M har koncentrationsenhed e.g. mol/liter (M) eller mg/ml og angiver den substratkoncentration, hvor reaktionshastigheden er V max /2. K M = (k -1 + k 2 )/k 1 er et mål for stabiliteten af enzym/substrat-komplekset. Om k -1 >> k 2, er K M ( k -1 /k 1 ) et udtryk for enzymets affinitet for substratet. Den trinvise udledning af (2) er beskrevet i biokemi lærebogen og bør studeres, da de anvendte forudsætninger er af betydning. Side 4/27

5 K M og V max kan bestemmes ved at lave en non-lineær regression som tilpasser Mikaelis- Menten udtrykket til afbildningen, repræsenteret ved Figur 2, side 4. En alternativ bestemmelse kan foretages ved en retlinet afbildning. I den foreliggende øvelse anvendes Hanes plot med afbildning af [S]/V 0 mod [S], idet (2) kan omskrives til (3) Hanes plot er vist i Figur 3, side 5 [] S V 0 [ S] V 0 1 = V max [] S K + V M max K V m max α = 1 V max -K M [S] Figur 3: Hanes plot. Bestemmelse af K M og V max. initiale reaktionshastigheder er blevet bestemt for forskellige koncentrationer. Linjens hældningskoefficient er 1/Vmax, Skæring med y-aksen er K M /V max og med x-aksen er -K M. Mange enzymer reagerer med to eller flere substrater i samme reaktion. En korrekt kinetisk analyse for sådanne reaktioner kan derfor ikke foretages ved hjælp af den skitserede model. Imidlertid kan de samme generelle retningslinjer også i disse tilfælde danne grundlag for udledning af de relevante sammenhænge. I praksis foretages en kinetisk analyse af fler-substratsreaktioner oftest ved at variere koncentrationen af et substrat, medens de øvrige substrater fastholdes overmætningskoncentrationen. 3. Inhibering af enzymaktivitet Inhibering (hæmning) af enzymaktivitet ved specifikke interaktioner mellem enzymer og små molekyler (evt. ioner) udgør vigtige kontrol- og reguleringsmekanismer for biologiske systemer. Således beror mange lægemidlers og toxiske stoffers virkning på inhiberende effekt overfor enzymkatalyserede reaktioner. Inhiberingen kan være reversibel eller irreversibel. Information om mekanismen bag reversibel inhibering kan ofte opnås ved en kinetisk analyse af inhiberingenseffekt. I den aktuelle sammenhæng begrænses fremstillingen til kun at omfatte to typer af reversibel inhibering af enzym/substrat-systemer med reaktionskinetik, der kan beskrives ved den omtalte Michaelis-Menten model. 3.1 Kompetitiv inhibering Side 5/27

6 En kompetitiv inhibitor typisk har strukturel lighed med enzymets substrat. Den reversible enzym-inhibitor-binding er lokaliseret til enzymets substrat bindings site, uden at dette dog medfører en katalytisk betinget reaktion overfor inhibitoren. Binding af inhibitor (I) udelukker således binding af substrat (S) (og omvendt). Reaktionsskemaet har følgende udseende: (4) E + S + I ES EI E + P Ingen reaktion hvor K i = [E] [I]/[EI]. Dvs. K i er dissociationskonstanten (K d ) af enzym-inhibitor komplexet, og altså et udtryk for affiniteten mellem enzym og inhibitor. Den omskrevne Michaelis-Menten ligning (3) kan omformes til (mellemregninger er udeladt): (5) [S] 1 = V 0 V max [I] K [S] + (1+ ) Ki V M max Måling af den initiale reaktionshastighed ved varierende substratkoncentration og kendt inhibitorkoncentration giver, i analogi med Figur 3, side 5, datarepræsentationen vist i Figur 4, side 6 i Af Figur 4, side 6 fremgår, at K M (den tilsyneladende K M for det inhiberede enzym) er større end K M uden tilstedeværelse af inhibitor. Derimod er V max uændret, idet kendetegnet for kompetitiv inhibering er, at virkningen kan elimineres ved tilstrækkelig høj substratkoncentration. Substrat og inhibitor konkurrerer om det samme "bindingssite". Tilstedeværelsen af inhibitor medfører en mindsket effektivitet af enzymet. [I] Ki ( 1+ ) K V M max [S] V0 + inhibitor - inhibitor α = 1 V max i [I] K = + M Ki ( 1 ) KM [S] 3.2 Non kompetitiv inhibering Figur 4: Enzymkinetisk plot med eller uden kompetitiv inhibitor. De to linjer er parallelle. K i M (den tilsyneladende K M for det inhiberede enzym) er større end K M uden inhibitor med en faktor (1+[I]/K i ), mens V max er uforandret. Side 6/27

7 Ved non-kompetitiv inhibering, der også er reversibel, bindes substrat og inhibitor til forskellige "sites". Binding af substrat udelukker ikke binding af inhibitor, men ved inhibitorbinding forhindres enzymet i at udføre sin katalytiske virkning på substratet, eksempelvis gennem en ændring af enzymets tredimensionale struktur. Reaktionsskemaet har følgende udseende: (6) E + S ES E + P + + I I EI or ESI Ingen reaktion K i E og K i ES udtrykker henholdsvis enzymets og enzym-substrat kompleksets affinitet overfor inhibitoren. I den aktuelle fremstilling antages K i E = K i ES, hvilket forekommer, når inhibitorbinding foregår upåvirket af substratbinding. Michaelis-Menten ligningen (3) kan omformes til (mellemregninger er udeladt): (7) [S] [I] 1 = (1+ ) V 0 Ki V max K [S] + V m max I analogi med Figur 3, side 5 fås datarepræsentationen vist i Figur 5, side 7 [S] [I] K (1+ ) K V i M max V0 [I] α = (1+ ) K 1 V i max + inhibitor - inhibitor [S] -K M Figur 5: Enzymkinetisk plot med eller uden non-kompetitiv inhibitor. Inhibering med non-competitiv inhibitor resulterer i en forhøjning af hældningskoefficient med en faktor (1+[I]/K i ), altså en lavere tilsyneladende V i max, mens K M er uændret Side 7/27

8 Virkningen af non-kompetitiv inhibering kan ikke elimineres ved at forøge substratkoncentrationen. Da inhibitorbindingen er uafhængig af substratets binding til enzymet, vil tilstedeværelsen af inhibitor resultere i en tilsyneladende lavere aktiv enzymkoncentration i blandingen. V max er således mindre end V max (inversen af V max bliver i forhøjet med en faktor (1+[I]/K i ), hvorimod K M er uændret. 4. Faktorer af betydning for enzymaktivitet Udover substrat-/enzymkoncentrationen og tilstedeværelse af inhibitorer er der flere andre faktorer, der influerer på enzymers aktivitet. Kun nogle af de normalt mest betydningsfulde nævnes i denne forbindelse: Temperatur: Ligesom ved reaktioner, der ikke er enzymkatalyserede, forøges reaktionshastigheden ved en enzymanalyse, når temperaturen hæves. Ved høje temperaturer observeres imidlertid oftest, at reaktionshastigheden igen aftager, hvilket skyldes denaturering og inaktivering af enzymet. Figur 6: Arrhenius afbildning ph: Aktiviteten af de fleste enzymer er stærkt ph-afhængig med et veldefineret phoptimum. Af den grund er det nødvendigt at udføre enzymatiske analyser i et medium med et bestemt tilstrækkelig bufferkapacitet. Enzymaktivitetens ph-afhængighed er begrundet i de ioniserbare grupper i enzymet (og evt. i substratet), samt enzymstabilitet påvirker ph profilen Cofaktorer: Mange enzymers aktivitet er afhængig af relativt svagt bundne organiske cofaktorer (coenzymer) eller metalioner. Under oprensningen af et enzym bør man være opmærksom på sådanne krav, idet nogle separationsprocedurer kan adskille enzym og cofaktor med tab af aktivitet til følge. Side 8/27

9 Allosteriske effektorer: Nogle enzymer besidder egenskaber, der antyder, at de har regulatorisk betydning for metabolismen. Den katalytiske aktivitet af et allosterisk enzym reguleres gennem interaktion med metabolitter, der bindes til et allosterisk "site", forskelligt fra det aktive "site". 5. Enzymanalyse Under isoleringen af et enzym fra biologisk materiale, og i mange andre tilfælde, er det nødvendigt at kunne måle enzym specifikaktivitet. Dette opnås almindeligvis ved at måle enzymets koncentration, samt aktivitet ved faste, kontrollerede betingelser (ph, ionstyrke, temperatur m.m.). I den biokemiske litteratur dækker udtrykket enzymanalyse over den praktiske udførelse af enzymmålinger (det kaldes ofte enzymassays). Typisk, foregår enzymanalysen ved optimale forsøgsbetingelser, hvor analysen udviser størst aktivitet og samtidigt er mindst påvirkeligt af variationer i forsøgsbetingelserne. Fastlæggelse af passende analysebetingelser er derfor første trin ved rutinemæssig måling, kinetiske undersøgelser eller oprensning af et enzym. Helt essentielt gælder det for udførelse af enzymanalyser, at man må udføre kontroleksperimenter: 1. Den målte reaktion skal vises at være begrundet i enzymatisk aktivitet, 2. Det målte analytiske respons skal være lineært korreleret til reaktionstiden og enzymkoncentrationen. I en såkaldt kinetisk analyse følges reaktionshastigheden kontinuerlig, og det er således muligt at konstatere, om nedbrydningen af substrat foregår lineært med tiden. De fleste enzymmålinger foregår imidlertid som fast-tid analyser, der er baseret på en enkelt måling efter en defineret reaktionstid. 6. Introduktion til phosphataser Phosphataser er enzymer, der katalyserer hydrolysen af phosphatmonoestre under frigivelse af uorganisk phosphat. O (8) RO P O - Phosphatase -2 + H 2 O ROH + HPO 4 O - Phosphataser er vidt udbredt i naturen og kan inddeles i to grupper. 1. Specifikke phosphataser som kun er aktive overfor et meget begrænset udvalg af substrater. I disse tilfælde er det almindeligvis ikke vanskeligt at påpege en physiologisk betydning for enzymet. F.ex. fructosediphosphat phosphatase (fructose-1,6-di-p fructose-6-p + P i ), der katalyserer en intermediær reaktion i gluconeogenesen. Side 9/27

10 2. Uspecifikke phosphataser, der også findes i de fleste organismers celler, har ekstrem bred substratspecificitet. På basis af deres ph-optimum klassificeres de generelt i sure phosphataser og alkaliske phosphataser. Planters frø er ofte rige på sure phosphataser. Almindeligvis forøges phosphataseaktiviteten markant i det spirende frø for senere at aftage, efterhånden som spiren udvikles. Den præcise physiologiske funktion af denne phosphataseaktivitet kendes ikke. Muligvis har den betydning for frigivelse af uorganisk phosphat fra organisk bundne, lagrede former, f.eks. inositolhexaphosphat (phytinsyre). Det frigivne uorganiske phosphat kan indgå i det spirende frøs metabolisme (nukleotidsyntese) Til at illustrere de forhold, der er af speciel betydning ved måling af enzymaktivitet, anvendes der i dette eksperiment en præparation af sur phosphatase fra hvedekim. Endvidere undersøges nogle generelle enzymkinetiske egenskaber. Den anvendte analyse drager fordel af phosphatasens brede specificitet ved at benytte det syntetiske substrat, p-nitrophenylphosphat (pnpp). Den enzymkatalyserede hydrolyse af substratet bestemmes ved photometrisk måling af p-nitrophenol der frigives ved reaktionen (9). (9) O - O N + O O - Phosphatase O P O - + H 2 O N + O O - -2 OH + HPO 4 NaOH opløsningen har en meget basisk ph værdi og derved stopper phosphataseaktivitet. Den høje ph værdi p-nitrophenol lys-absorberende egenskab på grund af phenolate jonens ekstra resonans struktur (10). O - (10) OH + OH -1 N + N + O O O - O - + H 2 O Side 10/27

11 EKSPERIMENTELT 1. Kort beskrivelse af de forskellige deløvelser Det eksperimentelle arbejde indledes med en præsentation af en række forsøg, der er blevet udført med henblik på at undersøge og optimere det aktuelle phosphatase-analyse. Erfaringerne herfra anvendes ved undersøgelsen af hvedekimphosphatasens kinetiske egenskaber. A: Absorptionsmaksimum Udføres ikke Figur 7: Afbildning af absorptionen af p-nitrophenol(at) som funktion af bølgelængden. Absorptionsmaksimum for p-nitrophenol er 405 nm, og da nitrophenylphosphat ikke absorberer nævneværdigt ved 405 nm, bliver denne bølgelængde benyttet ved kvantificering af p-nitrophenol(at) i deløvelserne B-F. B: Standardkurve for p nitrophenol Udføres af alle hold på første øvelsesdag Beregning af μm produkt (p-nitrophenol), der dannes ved analysen, kan foretages ud fra den molære ekstinktionskoefficient eller ud fra en standardkurve. I det aktuelle tilfælde optegnes standardkurve, dvs. en kurve der angiver sammenhængen mellem en kendt koncentration af p-nitrophenol og absorbansen ved 405 nm. C: Sammenhæng mellem reaktionshastighed og tid Udføres af ulige hold på første øvelsesdag Ved undersøgelse af temperatur- og ph-optimum for den enzymkatalyserede reaktion anvendtes initial reakionshastighed. Derfor bliver der indledningsvis bestemt et enzym-/substrat-koncentrationsforhold, hvor reaktionshastigheden er konstant under hele inkubationsperioden. Dette viser sig at være specielt vigtigt ved den aktuelle analyse, fordi phosphatasen produktinhiberes. Side 11/27

12 D: ph optimum Udføres af lige hold på første øvelsesdag Phosphataseaktivitet måltes i inkubationsbuffer med varierende ph. Den spontane (ikke-enzymatiske) hydrolyse af substrat er ofte ph-afhængig, men er i dette tilfælde ubetydelig. Dette forhold blev undersøgt (og korrigeredes for) ved udførelse af et analogt kontrolforsøg med varme-inaktiveret enzym. Man skal være opmærksom på, at buffertype og ionstyrke kan influere på reaktionshastigheden. E: Temperaturoptimum Udføres ikke eksperimentelt Phosphatase aktivitet blev målt ved inkubation ved varierende temperatur (se Figur 8). Der korrigeredes igen for spontan hydrolyse. 0 Ln(reactionshastighed) /T (K -1 ) Figur 8: Phosphataseaktivitet som funktion af inkuberingsmedietstemperatur Arrhenius' afbildning. F1 F3: Enzymkinetiske undersøgelser Udføres af alle hold den 2.øvelsesdag I denne øvelse bestemmes de karakteristiske K M og V max for phosphatase/pnitrophenylphosphat systemet (F1). Endvidere undersøges mekanismen ved inhibering med 2 forskellige anioner. (Uorganisk phosphat -anioner og fluorid-anioner). Enzymet sur phosphatase er inaktivt ved højt ph og den enzymkatalyserede spaltning af p- nitrophenylphosphat stoppes derfor ved overførslen til 0,1 M NaOH. Side 12/27

13 2. Fremgangsmåde Plan for udførelse af metode For at få et godt flow i øvelsesforløbet startes metoderne i nævnte rækkefølge: Udføres af 1. Dag Deløvelse B: Standardkurve for p-nitrophenol Alle hold Deløvelse C: Sammenhæng mellem reaktionshastighed og tid Ulige hold Deløvelse D: ph- optimum Lige hold 2. Dag Deløvelse F: Enzymkinetiske undersøgelser Deløvelse F1: Uden tilsætning af inhibitor Deløvelse F2: Tilsætning af inhibitor (uorganisk phosphat) Deløvelse F3: Tilsætning af inhibitor (kaliumfluorid) Alle hold Ulige hold Lige hold NB: I deløvelse C, D og F udveksler det ulige og lige hold på samme bordside rå data, således at alle hold kan fortage databehandling og rapportering af alle deløvelserne. For at spare tid aflæses mikrotiterbakken først når begge deløvelser er kørt (begge dage). Arbejdsgangen ved udførelse af deløvelserne C; D og F, (enzymkinetiske undersøgelser) anskueliggøres i følgende video: Video 05: Enzymkinetik Side 13/27

14 Deløvelse B. Standardkurve for p nitrophenol (anjon) (udføre af alle hold) Standardkurven anvendes i Deløvelse C, D og F til kvantificering af p-nitrophenol i de enzymkinetiske undersøgelser. Materialer: 8 reagensglas 4 ml 60 µm p-nitrophenol i 0,02 M NaOH 5 ml 0,1 M NaOH Afpipetteringsskema: ml ml ml ml ml ml ml ml 60 μm p-nitrophenol 0 0,050 0,100 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 0,1 M NaOH. 1,000 0,950 0,900 0,800 0,600 0,400 0,200 0 μm p-nitrophenol 1. I 8 reagensglas afpipetteres 0,0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 og 1,0 ml 60 μm p-nitrophenol opløsning. 2. Hvert glas fyldes op til et totalt volumen på 1,000 ml med 0,1 M NaOH (se skemaet ovenover). 3. Vortex (blandes på en omryster) prøverne omhyggeligt NB: Overfør og mål først serien samtidig med dagens anden deløvelse. 4. 0,300 ml af hver prøve og blindprøve (0,1M NaOH) overføres til en mikrotiterbakke (Anvend den udleverede skabelon. Se også Appendiks 2: Skabelon til påsætning i mikrotiterbakker; side 26 ) og absorptionen måles ved 405 nm. i en mikrotiterbakke-læser (rum 021). Appendiks 1: Guide til Epoch mikrotiterbakke-læser, side Databehandling se Rapportering 1: Deløvelse B, side 22 Side 14/27

15 Deløvelse C: Sammenhæng mellem reaktionshastighed og tid (udføres af ulige hold og de rå data udveksles med det lige hold på samme bordside) Materialer 18 reagensglas (10 ml) 2 ml 0,1 M MES buffer ph 6,0 (tilsat 0,5M NaCl) 1,1 ml 12,5 mm Substrat (p-nitrophenylphosphat i 0.1 M MES buffer ph 6,0) 2 ml demineraliseret H 2 O (tappes fra den orange vandhane) 0,2 ml Enzym (Phosphatase 2mg/mL 0,002% (v/v) Triton X-100) M r =55000 (isbad) 32 ml 0,1 M NaOH (dispenser justeret til 2,00 ml) I denne deløvelse er forsøgsserien sat op med 2 reaktionsblandinger L og H (~lav og høj substratkoncentration). For at kunne følge udviklingen af p-nitrophenol over tid, udtages der efter tilsætning af enzym en prøve fra begge reaktionsblandinger efter inkubering i 0, 3, 6, 9, 12, 16, 20 og 30 min. Dannelsen af p-nitrophenol i den udtaget prøve stoppes straks ved at overføre den til O,1M NaOH (stopreagens). Farveudviklingen måles efterfølgende ved 405nm. For at kunne håndtere flere reaktionsblandinger i samme forsøgsserie, forskydes tilsætning af enzym (start af inkubering) med 30. sekunder. Før start af assay: afpipetteres med dispenser 2,00 ml 0,1 M NaOH (stopreagens) i 2x8 reagensglas, mærket med glasnummer L og H (~lav og høj substratkoncentration) samt inkuberingstiden henholdsvis 0, 3, 6, 9, 12, 16, 20 og 30 min. (f.eks. L-0; H-0..L-3; H-3 osv.) Afpipetteringsskema: Glas nr. L H 0,1 M MES buffer ph 6,0 1,000 1,000 12,5 mm p-npp (Substrat) (p-nitrophenylphosphat) ml ml 0,050 1,000 H 2 O 1,350 0,400 Præ-inkuberes 5 min. ved 37 C Assay: 1. Buffer, 12,5 mm p-npp (substrat) og H 2 O afpipetteres i reagensglas (se skema ovenfor), vortex (blandes på en omryster) og anbringes (ca. 5 min.) i varmeblokken (37 o C). Efter ca. 5 minutters præ-inkubering er der opnået temperaturligevægt. Prøven forbliver i varmeblokken under inkuberingen. 2. I ventetiden gøres alt klart: Stopur; enzym på is; mærkede reagensglas med stopreagens; tomt stativ til at flytte de stoppede prøver over i; pipetter indstilles, spidser, shaker, krukke til brugte spidser. Opstil det hele så du får en nem arbejdsgang. Prøv evt. med vand når først forsøget Side 15/27

16 startes er der ikke tid til andet en at koncentrerer sig. Assayen udføres af 2 personer hvor A tilsætter enzym og omryster og B udtager fra reaktionsblandingerne, overfører til stopreagenset, vortex prøven og stiller reagensglasset i et andet stativ for at bibeholde overblikket Det er en god ide at tage reagensglasblanding op af varmeblokken de få sek. det tager at tilsætte enzym og udtage substrat. Herved sikre I at pipetten ikke dyppes for langt eller ikke nok ned i væsken. 3. Stopuret startes, idet glas L tilsættes 0,100 ml phosphataseopløsning (enzym) og vortex hurtigt men effektivt. 0,180 ml reaktionsblanding afpipetteres derefter omgående over i et reagensglas der indeholder 2,00 ml 0,1 M NaOH (glasset er mærket L-0)og vortex prøven, - denne prøve kaldes "0-tids"-prøven. 4. Nøjagtigt til t = 30 sek. afpipetteres enzym i glas H; vortex, og "0-tids"- prøven udtages som under pkt. 3 (glasset med 0,1 M NaOH er mærket H-0) 5. 0,180 ml reaktionsblanding udtages fra de enkelte glas efter inkubering i 3, 6, 9, 12, 16, 20 og 30 min. (husk 30 sek. intervallet) og afpipetteres omgående over i 2,00 ml 0,1 M NaOH og vortex. 6. 0,300 ml af hver prøve overføres til en mikrotiterbakke (Anvend den udleverede skabelon. Se også Appendiks 2: Skabelon til påsætning i mikrotiterbakker; side 26) og absorptionen måles ved 405 nm. i en mikrotiterbakke-læser (rum 021). Se Appendiks 1: Guide til Epoch mikrotiterbakke-læser, side Databehandling se Rapportering 2: Deløvelse C, side 22 Side 16/27

17 Deløvelse D: ph optimum (udføres af lige hold og de rå data udveksles med det ulige hold på samme bordside) Materialer: 30 reagensglas (10 ml) 1 ml af hver Buffer (ph 3, 4, 5, 6 og 7) o ph3+4+5 indeholder 0,1M citrat-buffer; tilsat 0,5M NaCl o ph 6: 0,1 M MES buffer ph 6,0; tilsat 0,5M NaCl o ph 7: 0,1 M HEPES buffer ph 7,0; tilsat 0,5M NaCl 1 ml 50 mm Substrat (p-nitrophenylphosphat i H 2 O) 6 ml H 2 O (tappes fra den orange vandhane) 0,5 ml Enzym (Phosphatase 2mg/mL 0,002% Triton X-100) M r =55000 (isbad) 50 ml 0,1 M NaOH (dispenser justeret til 2,00 ml) I denne deløvelse er forsøgsserien sat op med 5 reaktionsblandinger 3, 4, 5, 6, og 7 (~ ph i reaktionsblandingen). For at kunne følge udviklingen af p-nitrophenol over tid, udtages der efter tilsætning af enzym en prøve fra alle reaktionsblandinger efter inkubering i 0, 3, 6, 9 og 12, min. Dannelsen af p-nitrophenol i den udtaget prøve stoppes straks ved at overføre den til O,1M NaOH (stopreagens). Farveudviklingen måles efterfølgende ved 405nm. For at kunne håndtere flere reaktionsblandinger i samme forsøgsserie, forskydes tilsætning af enzym (start af inkubering) med 30. sekunder. Før start af assay: afpipetteres med dispenser 2,00 ml 0,1 M NaOH (stopreagens) i 5x5 reagensglas, mærket med glasnummer 3-7 (~ph) samt inkuberingstiden henholdsvis 0, 3, 6, 9 eller 12 min (f.eks. 3-0; ; 4-3 osv.) Afpipetteringsskema: NB: Her anvendes substrat med høj koncentration (50mM) Glas nr ph 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 ml ml ml ml ml 0.1 M Buffer (forskelige ph) 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 H 2 O 1,200 1,200 1,200 1,200 1, mm p-npp i H 2 0 (substrat) (p-nitrophenylphosphat) 0,200 0,200 0,200 0,200 0,200 Præ-inkuberes 5 min. ved 37 C Assay: 1. Buffer, 50 mm p-npp (substrat) og H 2 O afpipetteres i reagensglas (se skema ovenfor), vortex (blandes på en omryster) og anbringes (ca. 5 min.) i varmeblokken (37 C). Efter Side 17/27

18 ca. 5 minutters præ-inkubering er der opnået temperaturligevægt. Prøven forbliver i varmeblokken under inkuberingen. 2. I ventetiden gøres alt klart: Stopur; enzym på is; mærkede reagensglas med stopreagens; tomt stativ til at flytte de stoppede prøver over i; pipetter indstilles, spidser, shaker, krukke til brugte spidser. Opstil det hele så du får en nem arbejdsgang. Prøv evt. med vand -når først forsøget startes er der ikke tid til andet en at koncentrerer sig. Assayen udføres af 2 personer hvor A tilsætter enzym og omryster og B udtager fra reaktionsblandingerne, overfører til stopreagenset, vortex prøven og stiller reagensglasset i et andet stativ for at bibeholde overblikket Det er en god ide at tage reagensglasblanding op af varmeblokken ipetten ikke dyppes for langt eller ikke nok ned i væsken. 3. Stopuret startes, idet glas 3tilsættes 0,100 ml phosphataseopløsning (enzym) og vortex hurtigt men effektivt. 0,180 ml reaktionsblanding afpipetteres derefter omgående over i et reagensglas der indeholder 2,00 ml 0,1 M NaOH (glasset er mærket 3-0) og vortex prøven, - denne prøve kaldes "0-tids"-prøven. 4. Nøjagtigt til t = 30 sek. afpipetteres enzym i glas 4, vortex og "0-tids"- prøven udtages som under pkt. 3 (glasset med 0,1 M NaOH er mærket 4-0) 5. På samme måde til sættes enzym og 0-tids prøve udtages fra reaktionsblandingen: Glas 5 til t = 1min., Glas 6 til t = 1 30 Glas 7 til t = ,180 ml reaktionsblanding udtages fra de enkelte glas efter inkubering i 3, 6, 9, og 12 min. (husk 30 sek. intervaller) og afpipetteres omgående over i 2,00 ml 0,1 M NaOH og vortex. 7. 0,300 ml af hver prøve overføres til en mikrotiterbakke (Anvend den udleverede skabelon. Se også Appendiks 2: Skabelon til påsætning i mikrotiterbakker; side 26) og absorptionen måles ved 405 nm. i en mikrotiterbakke-læser (rum 021). Appendiks 1: Guide til Epoch mikrotiterbakke-læser, side 25 Databehandling se Rapportering 3: Deløvelse D, side 23 Side 18/27

19 DAG 2 Deløvelse F1 F3. Enzymkinetiske undersøgelser Denne øvelse indeholder 3 forsøgsserier, hvoraf 1 hold udfører 2 af serierne: Forsøgsserie F1: Ikke-inhiberet (udføres af alle hold) Forsøgsserie F2:Inhiberet med 2,4 mm uorganisk phosphat (udføres af ulige hold) Forsøgsserie F3: Inhiberet med 2 mm Kaliumfluorid (KF) (udføres af lige hold) De rå data fra serie F2 og F3 udveksles (samme bordside) Materialer til F1, F2 og F3 ( 2 hold) 4 x 36 reagensglas(10ml) 4 x 6 ml 0,1 M MES buffer ph 6,0 (tilsat 0,5M NaCl) 4 x 3 ml 12,5 mm Substrat(p-nitrophenylphosphat i 0.1 M MES buffer ph 6,0) 100 ml H 2 O (tappes fra den orange vandhane) 4 x 0,6 ml Enzym (Phosphatase 2mg/mL 0,002% Triton X-100) M r =55000 (isbad) 1 ml 60mM natriumphosphat ph 6,0 (Forsøgsserie F2) 1 ml 50 mm KF i H 2 O (Forsøgsserie F3) 4 x 60 ml 0,1 M NaOH (dispenser justeret til 2,00 ml) I denne deløvelse er forsøgsserien sat op med 6 reaktionsblandinger a, b, c, d, e og f (~ stigende substratkoncentrationer). For at kunne følge udviklingen af p-nitrophenol over tid, udtages der efter tilsætning af enzym en prøve fra alle reaktionsblandinger efter inkubering i 0, 3, 6, 9 og 12 min.. Dannelsen af p-nitrophenol i den udtaget prøve stoppes straks ved at overføre den til 0,1M NaOH (stopreagens). Farveudviklingen måles efterfølgende ved 405nm. For at kunne håndtere flere reaktionsblandinger i samme forsøgsserie, forskydes tilsætning af enzym (start af inkubering) med 30. sekunder. Forsøgsserie F1: Ikke-inhiberet Før start af assay: afpipetteres med dispenser 2,00 ml 0,1 M NaOH (stopreagens) i 6x5 reagensglas, mærket med glasnummer a-f samt inkuberingstiden henholdsvis 0, 3, 6, 9 eller 12 min (f.eks. a-0; b-0..a-3; b-3 osv.) Afpipetteringsskema: Glas nr. a b c d e f ml ml ml ml ml ml 0,1 M MES buffer ph 6,0 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 12,5 mm p-npp (Substrat) (p-nitrophenylphosphat) 0,060 0,075 0,150 0,250 0,500 1,000 H 2 O 1,340 1,325 1,250 1,150 0,900 0,400 Præ-inkuberes 5 min. ved 37 C Side 19/27

20 Assay: 1. Buffer, 12,5 mm p-npp (substrat) og H 2 O afpipetteres i reagensglas (se skema ovenfor), vortex (blandes på en omryster) og anbringes (ca. 5 min.) i varmeblokken (37 o C). Efter ca. 5 minutters præ-inkubering er der opnået temperaturligevægt. Prøven forbliver i varmeblokken under inkuberingen. 2. I ventetiden gøres alt klart: Stopur; enzym på is; mærkede reagensglas med stopreagens; tomt stativ til at flytte de stoppede prøver over i; pipetter indstilles, spidser, shaker, krukke til brugte spidser. Opstil det hele så du får en nem arbejdsgang. Prøv evt. med vand -når først forsøget startes er der ikke tid til andet en at koncentrerer sig. Assayen udføres af 2 personer hvor A tilsætter enzym og omryster og B udtager fra reaktionsblandingerne, overfører til stopreagenset, vortex prøven og stiller reagensglasset i et andet stativ for at bibeholde overblikket Det er en god ide at tage reagensglasblanding op af varmeblokken de få sek. det tager at tilsætte enzym og udtage substrat. Herved sikre I at pipetten ikke dyppes for langt eller ikke nok ned i væsken. 3. Stopuret startes, idet glas a tilsættes 0,100 ml phosphataseopløsning (enzym) og vortex hurtigt men effektivt. 0,180 ml reaktionsblanding afpipetteres derefter omgående over i et reagensglas der indeholder 2,00 ml 0,1 M NaOH (glasset er mærket a-0)og vortex prøven, - denne prøve kaldes "0-tids"-prøven.4 Nøjagtigt til t = 30 sek. afpipetteres enzym i glas b; vortex, og "0-tids"- prøven udtages som under pkt. 3 (glasset med 0,1 M NaOH er mærket b-0) 5. På samme måde tilsættes enzym og 0-tids prøve udtages fra reaktionsblandingen: Glas c til t = 1min., Glas d til t = 1 30 Glas e til t = 2 Glas f til t = ,180 ml reaktionsblanding udtages fra de enkelte glas efter inkubering i 3, 6, 9, og 12 min. (husk 30 sek. intervaller) og afpipetteres omgående over i 2,00 ml 0,1 M NaOH og vortex. NB: Overfør og mål først serien samtidig med dagens anden forsøgsserie. 7. 0,300 ml af hver prøve og blindprøve (0,1M NaOH) overføres til en mikrotiterbakke (Anvend den udleverede skabelon. Se også Appendiks 2: Skabelon til påsætning i mikrotiterbakker; side 26) og absorptionen måles ved 405 nm. i en mikrotiterbakke-læser (rum 021). Appendiks 1: Guide til Epoch mikrotiterbakke-læser, side Databehandling se Rapportering 4: Deløvelse F, side 23 Side 20/27

21 Forsøgsserie F2 og F3: Inhibering med uorganisk phosphat og KF Eksperimentet (Forsøgsserie F1 pkt.1-8) gentages, hvor 0,1 ml af det tilsatte H 2 O erstattes med en inhibitor: Forsøgsserie F2: 100µL 60 mm Phosphat ph 6.0 (udføres af ulige hold) Forsøgsserie F3: 100µL 50 mm KF i H 2 O (udføres af lige hold) Se afpipetteringsskemaet nedenfor. Husk udveksling af data! I denne deløvelse er forsøgsserien sat op med 6 reaktionsblandinger A, B, C, D, E og F (~ stigende substratkoncentrationer som i forsøg F1 og ens mængde inhibitor i reaktionsblandingerne). For at kunne følge udviklingen af p-nitrophenol over tid, udtages der efter tilsætning af enzym en prøve fra alle reaktionsblandinger efter inkubering i 0, 3, 6, 9 og 12 min.. Dannelsen af p-nitrophenol i den udtaget prøve stoppes straks ved at overføre den til 0,1M NaOH (stopreagens). Farveudviklingen måles efterfølgende ved 405nm. For at kunne håndtere flere reaktionsblandinger i samme forsøgsserie, forskydes tilsætning af enzym (start af inkubering) med 30. sekunder. Afpipetteringsskema: Glas nr. A B C D E F ml ml ml ml ml ml 0,1 M MES buffer ph 6,0 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 12,5 mm p-npp (Substrat) (p-nitrophenylphosphat) 0,060 0,075 0,150 0,250 0,500 1,000 H 2 O 1,240 1,225 1,150 1,050 0,800 0,300 Inhibitor 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 Præ-inkuberes 5 min. ved 37 C Side 21/27

22 RAPPORTERING Aflevering: Indhold og form Beregn og afbild resultaterne som beskrevet i afsnittene Rapportering 1-4 nedenfor. NB: HUSK udveksling af rå data,i deløvelse C, D og F. Aflever en rapport/hold der indeholder rå data, grafer, samt alle mellemberegningerne (Rapportering 1-4), og svar på de supplerende spørgsmål (Rapportering 5) side 24. Rapporten afleveres elektronisk på CampusNet (27023 Opgaver og vælg aktuel ugedag og øvelsesnummer). Ved aflevering noteres holdnummer i kommentarfeltet. I bedes anvende det udleverede Word-dokument med rapporteringsafsnittet og udfyld forsiden før aflevering. Excel-filer mm. uploades i samme opgavebesvarelse. Tidsfristen for aflevering vil fremgå af opgavebesvarelsen på CampusNet. Som udgangspunkt vil afleveringsfristen for tirsdagsholdet være førstkommende mandag efter afsluttet forsøgsgang, og førstkommende onsdag for torsdagsholdet. Rapportering 1: Deløvelse B Standardkurve for p-nitrophenol (anjon) Beregn [pnp] koncentrationen i μm (μmol/l) i hvert glas og afbild standard kurven med [pnp] på x-aksen og A 405 på y-aksen. Tilføj en lineær trendlinje som skal bruges for at beregne produkt koncentrationen i deløvelserne C, D og F. (når blind er fratrukket så bør trendlinjen gå så nært så muligt igennem skæringspunktet (0,0)) Huske at korrigere for blindværdien (middeltal) ved at trække denne fra alle værdierne Rapportering 2: Deløvelse C Sammenhæng mellem reaktionshastighed og tid Beregn produktkoncentrationerne [pnp] (μm) i reaktionsblandingerne ved de forskellige tidspunkter for de to substratkoncentrationer ved hjælp af standardkurven (deløvelse B). Husk at korrigere for blindværdien og den fortyndingsfaktoren der opstår ved udtag fra reaktionsblandingen over i stopreagenset. Afbild [pnp] (μm) mod tiden (min) for begge substratkoncentrationsserier i samme graf (excel). Anvend plottet ovenfor for at beregne V o (start reaktionshastigheden) μm/min dannet pnp) for hver substratkoncentration, ved at lave en lineær regression i grafen af [pnp] mod tiden for hver serie (Kun den lineære del af plottet beskriver den initiale reaktions hastigheden!). Side 22/27

23 Rapportering 3: Deløvelse D ph optimum Beregn produktkoncentrationerne [pnp] (μm), i reaktionsblandingerne ved de forskellige tidspunkter for hver ph ved hjælp af standardkurven (deløvelse B) Husk at korrigere for blindværdien og den fortyndingsfaktor der opstår ved udtag fra reaktionsblandingen over i stopreagenset. Afbild [pnp] (μm) mod tiden (min) for alle ph-serierne i samme graf (excel). Anvend plottet ovenfor for at beregne V o (start reaktionshastighed) (μm/min dannet pnp) for hvert ph, ved at lave en lineær regression i grafen af [pnp] mod tiden for hver serie. Plot de beregnede reaktionshastigheder mod ph for at visualisere ph profilen. Rapportering 4: Deløvelse F Enzymkinetiske undersøgelser F1 (uden tilsat inhibitor). Beregn reaktionshastighed (V o ) for hver substratkoncentration på samme måde som i deløvelserne C og D. Plot alle pnp-tid data serier i samme graf med lineær regressionens trendlinje for hver substratkoncentration. De beregnede hastigheder afbildes i et Hanes plot. Anvend det retlinjet sammenhæng mellem [S]/V o og [S] i Hanes plot for at beregne V max, K M samt beregn k cat (s -1 ) for reaktionen fra V max og den totale enzymkoncentrationen (Stryer kap. 8). Husk at lave hensigtsmæssige enhed forvandlinger F2-3 For de inhiberede reaktioner, foretages de samme beregninger som i F1, og Hanes plot afbildningerne af de inhiberede reaktionen plottes på samme graf som for reaktionen uden tilsat inhibitor. i i De relevante kinetiske parametrene V max eller K M beregnes for hver inhibitor. Endvidere, beregnes [I] (inhibitor koncentrationen i reaktionsblandingen) fra stamopløsningskoncentrationen. Beregn K i for hver inhibitor ved at anvende den specifikke sammenligning for hver type af inhibition. (Se Figur 4: Enzymkinetisk plot med eller uden kompetitiv inhibitor.; side 6 og Figur 5: Enzymkinetisk plot med eller uden non-kompetitiv inhibitor.; side 7 ). Side 23/27

24 Rapportering 5: Supplerende spørgsmål Spørgsmål til deløvelse B 1. Hvorfor måles p-nitrophenolat ved 405 nm? Absorptionen er størst Ja Nej Absorption ændring som funktion af en lille ændring i bølgelængden (A=f(λ); hvis λ 1 = λ±2 nm) tip: størrelsen af tangentens hældning ΔA er mindst størst Spørgsmål til deløvelse C 2. I hvilket tidsinterval er reaktionshastigheden lineær 0-10 min 0-30 min 3. I hvilket tid interval skal start reaktionshastighed måles? 0-10 min 0-30 min 4. Angiv mulige forklaringer for at V aftager med tiden Spørgsmål til deløvelse D 5. Hvad er ph-optimum (max V o ) for den enzymkatalyserede reaktion? ph 6. Ved hvilken af de to nævnte ph-værdier har en lille ændring af ph (±0.3 ph enheder) størst betydning for den målte phosphatase aktivitet. ph 4.0 ph 6.0 Spørgsmål til deløvelse E 7. Hvad er temperaturoptimum (konkluderes fra Arrhenius plot Figur 8, side 12) ca. ºC 8. Ud fra Figur 8, side 12 beregnes aktiveringsenergien (E a (kj/mol) for den enzymkatalyserede reaktion (Husk mellemregningerne!). Spørgsmål til deløvelse F 9. Hvilken type inhibering observeres med 1. Uorganisk phosphat 2. Kaliumfluorid/Natriumfluorid: 10. Hvad kaldes inhiberingen med uorganisk phosphat også? Side 24/27

25 APPENDIKS Appendiks 1: Guide til Epoch mikrotiterbakke læser Hvis computeren IKKE er startet: Tænd computeren og log ind. a) Brugernavn: BIO-D1746\admin (venstre computer) eller BIO-D1747\admin (højre computer). b) Kodeord: 123 Hvis Epoch læseren IKKE er tændt: Tænd for Epoch læseren på tænd/sluk knappen på fronten af Epoch læseren. a) Lad læseren udføre selvtest (lyset i tænd knappen skal lyse konstant). Opstart af protokol 1. Hvis softwaren Gen5 IKKE er startet: a) Start Gen5 fra skrivebordet ved at dobbelt-klikke på Gen b) Under Create a new item, klik på Experiment. 2. Hvis softwaren Gen5 er startet: a) Klik på ikonet i menubaren, eller Klik på File og derefter New experiment. Læsning af protokol: 3. Vælg den ønskede protokol og klik på Ok. 4. Klik på ikonet (Read plate) 5. Indtast holdnummer under Runtime prompts og klik på READ. 6. Ilæg pladen i læseren og klik på Ok. 7. Gem data-filen på USB-stick, (bliver gemt som en Excel-fil 8. Luk den viste Excel-fil. 9. Ny læsning a. ved samme bølgelængde (protokol) start fra punkt 4. b. ved anden bølgelængde (protokol) start fra punkt 2. Afslutning: Kør pladeholderen ind ved at trykke på knappen ved siden af tænd/sluk knappen på fronten af Epoch læseren. Sluk Epoch læseren på tænd/sluk knappen på fronten af Epoch læseren. Sluk computeren. Side 25/27

26 Appendiks 2: Skabelon til påsætning i mikrotiterbakker Dag 1 B: Standarkurve µl 60 µm p-nitrophenol C:Sammenhæng Hastighed/tid (Ulige hold) A ,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Bl Bl Bl Bl B L0 L3 L6 L9 L12 L16 L20 L30 C H0 H3 H6 H9 H12 H16 H20 H30 D Blank 0.1M NaOH D: ph-optimum (Lige hold) E F G H Dag 2 F1 Uden inhibitor F2 eller F3 Med inhibitor min A a0 a3 a6 a9 a12 A0 A3 A6 A9 A12 2 B b0 b3 b6 b9 b12 B0 B3 B6 B9 B12 Substrat konc 3 C c0 c3 c6 c9 c12 C0 C3 C6 C9 C12 4 D d0 d3 d6 d9 d12 D0 D3 D6 D9 D12 5 E e0 e3 e6 e9 e12 E0 E3 E6 E9 E12 6 F f0 f3 f6 f9 f12 F0 F3 F6 F9 F12 Blank: 0.1M NaOH G Bl Bl Bl Bl Bl H Side 26/27

27 Appendiks 3: Beskrivelse af anvendte kemikalier Beskrivelse af opløsninger/ kemikalier I denne øvelse vil udleverede opløsninger/kemikalier, der kan være sundhedsskadelige eller påvirke miljøet, være mærket med faresymbol, R (risiko)- og S(sikkerheds)-sætninger og disse skal nærlæses inden brug af opløsningen. Hvis opløsninger skal bortskaffes som farligt affald vil I få informationer om hvordan de bortskaffes. Side 27/27