HbA1c. HPLC på Tosoh G8 sammenlignes med kapillærelektroforese på MiniCap Sebia

Transkript

1 HbA1c HPLC på Tosoh G8 sammenlignes med kapillærelektroforese på MiniCap Sebia Vibeke Toubro Mette Hult Linda Larsen Dorte Krüger 2015/2016

2 Forside Titel: HbA1c Undertitel: HPLC på Tosoh G8 sammenlignes med kapillærelektroforese på MiniCap Sebia Forfattere: Vibeke Toubro, Mette Hult, Antal anslag: Vejledende sideantal: 47 I-Vejleder: Adjunkt Merete Rasmussen, University College Sjælland Næstved K-Vejleder: Bioanalytikerunderviser Lis Arlington Ølholm, Klinisk Biokemisk Afdeling Holbæk sygehus Projektperiode: 5. oktober januar 2016, udført på Klinisk Biokemisk Afdeling Holbæk sygehus Projekttype: Coverbillede: ref. Side 2 af 47

3 Forord: Vi vil gerne sige stor tak til Klinisk Biokemisk afdeling på Holbæk Sygehus, for at få lov at skrive vores bachelor projekt hos dem. Stor tak til ledelse, afdelingsledelse samt personalet for deres interesse og imødekommenhed over for os og vores projekt. Alle har været søde til at besvare vores finurlige spørgsmål undervejs. Og tak til personalet for at være behjælpelig med at indsamle patientprøver med varianter, der er brugt i forsøget. Tak til Lars Bendixen, Videnschef/Knowledge Manager og Mette Janniche, Produktchef, begge fra ILS, for udlån af Minicap Sebia til vores bachelorprojekt. Lars og Mette har været behjælpelige med introduktion til apparatet, til fremsendelse af ekstra utensilier og til besvarelse af spørgsmål både på telefon og via . Endvidere har Lars givet os grundig undervisning i Minicap Sebias analyseprincip og hvordan man læser elektroferogrammer. Tak til vores kliniske vejleder Lis Arlington Ølholm, Bioanalytikerunderviser på Klinisk Biokemisk afdeling, Holbæk Sygehus, for at lede os på rette vej gennem hele vores bachelor projekt. Lis har forsøgt at få os til at bevare roen og fokus gennem hele forløbet, og fået os til at spise elefanten i mundrette bidder fra en ende af, således at projektet er forblevet overskueligt og samtidig holdt på et fagligt passende niveau. Tak til vejleder Merete Rasmussen, adjunkt på Bioanalytikeruddannelsen på UCSJ Næstved, for i samarbejde med klinisk vejleder, at lede os på rette vej gennem vores bachelor projekt. Merete har givet os gode råd og vejledning i at skrive en fornuftig rapport, og kommet med gode kommentarer, spørgsmål og små guldkorn undervejs i skriveprocessen. Tak til Palle Skov Bratholm, Kemiker på Klinisk Biokemisk afdeling, Holbæk Sygehus, for at supervisere og hjælpe med opklaring af statistiske mysterier, og anden problematik der opstod undervejs. Tak til Christina Mortensen, Bioanalytiker på Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved Sygehus, for indsamling af patientprøver med hæmoglobinvarianter, der er brugt i forsøget. Sidst men ikke mindst, retter vi en stor tak til vores familier og venner, der har ydet stor forståelse og støtte gennem hele uddannelsen på 3½ år. De har fundet sig i mange humørsvingninger, men alligevel serveret kaffe når lektielæsningen trak ud på de sene aftentimer. Side 3 af 47

4 Indholdsfortegnelse: Resumé:... 6 Baggrund: 6 Formål: 6 Materialer og Metoder:...6 Resultater:...6 Konklusion:.6 Forkortelser og ordforklaringer:... 7 Introduktion:... 8 Diabetes Mellitus:...8 HbA1c:.9 Varianter:..10 Analyseprincip HPLC: 12 Analyseprincip Kapillærelektroforese: 15 Enheder for HbA1c: 17 Problemformulering: Metodiske overvejelser: Intraseriel impræcision:.20 Interseriel impræcision:.20 Effekt af nedfrysning/sammenligning af Tosoh G8 og MiniCap Sebia:...21 Sammenligning af abnorme prøver på Tosoh G8 og MiniCap Sebia:..23 Etik:...24 Økonomi:...24 Materialer og metoder: Apparatur:.25 Materialer:...25 Tosoh G8:..25 MiniCap Sebia:...25 Metoder: Intraseriel impræcision:.26 Interseriel Impræcision:.26 Effekt af nedfrysning:...26 Sammenligning af Tosoh G8 og MiniCap Sebia:..26 Sammenligning af abnorme prøver på Tosoh G8 og MiniCap Sebia:..27 Økonomi:...27 Resultater: Side 4 af 47

5 Effekt af nedfrysning:...28 Intraseriel impræcision:.30 Sammenligning af Tosoh G8 og MiniCap Sebia:..30 Interseriel impræcision:. 31 Sammenligning af abnorme prøver på Tosoh G8 og MiniCap Sebia:..32 Eksempler på kromatogrammer og elektroferogrammer ved abnorme prøver:. 35 Økonomi:..36 Diskussion: Konklusion: Perspektivering: Litteraturliste: Side 5 af 47

6 Resumé: Baggrund: For at diagnosticere og monitorere diabetes, undersøges niveauet af glykeret hæmoglobin i blodet, HbA1c. En lille del af befolkningen har en eller flere mutationer der er involveret i syntesen af hæmoglobin. En hæmoglobinvariant der bevirker, at patienten ved analyse med nuværende HPLC-metode, ikke kan få et HbA1c-svar. Formål: For at reducere antal inkonklusive svar, undersøges det, om Minicap Sebia kan afgive flere HbA1c-svar end Tosoh G8. Desuden undersøges de to metoders overensstemmelse, ved at analysere på prøver uden hæmoglobinvarianter. Materialer og metoder: 120 blodprøver indsamles fra patienter hvor HbA1c er rekvireret og svar afgivet. 54 normalprøver og 64 abnorme prøver analyseres på hhv. Tosoh G8 og Minicap Sebia. Da de abnorme prøver er nedfrosset til -80 C, undersøges om nedfrysningen har relevant betydning for analyseresultatet ved en parret t-test, regressionsligning og korrelationskoefficient. Analysemetoderne på apparaterne sammenlignes med regressionsligning, korrelationskoefficient og differensplot på normalprøverne. På abnorme prøver undersøges antal besvarelser på hvert apparat. Med differensplot sammenlignes HbA1c resultaterne på apparaterne, hvor samme svar følges med egen reference gives. Resultater: For både Tosoh G8 og Minicap Sebia vises at nedfrysning er uden afgørende betydning, og der er god korrelation mellem resultaterne (SD 0,7 mmol/mol og 1,0 mmol/mol, og R² = 0,999 og R² = 0,998). Metodesammenligning viser god overensstemmelse ( R²= 0,996 og regressionsligning y = 1,006x - 0,126). Minicap Sebia giver svar på 26 flere abnorme prøver end Tosoh G8. Konklusion: Minicap Sebia kunne blive et fordelagtigt supplement for Tosoh G8, da flere hæmoglobinvarianter, især HbE, kan besvares med HbA1c værdi. Side 6 af 47

7 Forkortelser og ordforklaringer: ADA The American Diabetes Association BCC Laboratorie IT-system til behandling af analyseresultater m.m. BIAS Statistisk udtryk for skævhed CTL Control Level CV Variationskoefficient DSKB VUK Dansk Selskab for Klinisk Biokemi Udvalg for Kvalitetssikring DCCT The Diabetes Control and Complicatios Trial eag estimated Average Glucose EDTA Ethylendiamintetraeddikesyre Hb - Hæmoglobin HPLC High Performance Liquid Chromatography IFCC International Federation of Clinical Chemistry ILS VidensCenter Danmark KBA Klinisk Biokemisk Afdeling LMV LaboratorieMedicinsk Vejledning NGSP National Glycohemoglobin Standardization Program PIANO IT-system til validering af HbA1c på Tosoh G8 SD Spredning / Standarddeviation UKPDS The United Kingdom Prospective Diabetes Study Side 7 af 47

8 Introduktion: På Biokemisk afdeling i Holbæk, analyseres HbA1c ved hjælp af HPLC på Tosoh G8. HbA1c er betegnelsen for irreversibelt glykeret hæmoglobin, der kan give et billede af den gennemsnitlige mængde af glukose i blodet gennem de foregående 2-3 måneder. Analysen af HbA1c bruges i forbindelse med diagnosticering og monitorering af diabetespatienter. Ind imellem bliver der udgivet svaret; Patienten har en hæmoglobinvariant og bør derfor følge eget referenceinterval, da Tosoh G8 ikke kan beregne det præcise resultat for HbA1c. Til tider kan der slet ikke udgives et HbA1c svar. For at kunne optimere svar udgivelsen og forbedre økonomien, undersøges det, om der er noget at vinde ved at indføre Minicap Sebia, som med et andet analyseprincip muligvis vil kunne supplere Tosoh G8, så der kan udgives flere svar. Minicap Sebia er et apparat, der måler HbA1c ved hjælp af kapillærelektroforese. Diabetes Mellitus: Diabetes Mellitus er et stigende problem, og er den hyppigste endokrine sygdom i Danmark. Indenfor de sidste 10 år er antallet af diagnosticerede fordoblet, og tal fra Diabetesforeningen viser, at i 2015 har godt danskere, ca. 6 %, af befolkningen, diagnosen Diabetes Mellitus, hvor type 2 tegner sig for størstedelen med ca. 80 %. Det skønnes derudover at ca har type 2 diabetes uden at vide det. (1, 2) Overordnet kan diabetes deles op i type 1 og type 2-diabetes, men fælles for de to typer er, at kroppens celler har problemer med at optage glukose. Type 1-diabetes er kendetegnet ved nedsat eller manglende produktion af insulin på grund af en autoimmun nedbrydning af β- cellerne i pancreas. Ved type 2-diabetes er det insulinens virkning på kroppens celler, der er svækket. Insulin virker ved at binde sig til en ekstracellulær tyrosinkinasereceptor, som er en prædannet, men inaktiv dimer. Insulinreceptorer findes på alle kerneholdige celler, men det primære målvæv er fedtvævet, musklerne og leveren. (3) (4) Med diabetes følger også risikoen for sygdomme, der giver skader på bl.a. hjerte, nyrer, øjne og fødder. Risikoen for disse følgesygdomme øges jo dårligere blodsukkeret er reguleret. Ca. 33% af alle diabetikere har en hjerte karsygdom, og i perioden havde 4,5% haft alvorlige øjenkomplikationer, og 1,1% havde fået foretaget en amputation. Prognosen forud siger, at ca danskere vil have diabetes i år (5) Foruden at forringe livskvaliteten væsentligt for diabetespatienter, er sygdommen også en stor post i samfundsøkonomien. Diabetes koster det danske samfund ca. 31,5 milliarder kroner om året, hvoraf sygehusene bruger ca. 7 milliarder kroner på behandling af diabetes og følgesygdomme. (1) Side 8 af 47

9 HbA1c: Niveauet af glukose i blodet giver et øjebliksbillede af den metaboliske tilstand i kroppen. Ønskes et langtidsbillede af sygdommens forløb bestemmes i stedet HbA1c. HbA1c defineres af IFCC, som irreversibelt glykeret hæmoglobin. Analyse på HbA1c anvendes til diagnosticering af diabetes type I og II, og til kontrol af korrekt diabetesbehandling. Den diagnostiske grænse for diabetes baseret på HbA1c, ligger på over 48 mmol/mol.(3) Hæmoglobin er i blodbanen i 120 dage, og ved at måle mængden af glykeret hæmoglobin, fås et billede af glukoseniveauet over de sidste 2-3 måneder. Hos en person der ikke har diabetes, vil 4-6 % af den totale mængde hæmoglobin være glykeret, mens der hos en ubehandlet type 1-diabetes patient kan være op til 15%. (3) Omkring 90 % af blodlegemerne er erytrocytter, og deres funktion er at transportere O 2 og CO 2 rundt i kroppen. Erytrocytterne transporterer O 2 fra lungerne ud til kroppens celler ved hjælp af hæmoglobin. Hæmoglobin består af fire globinkæder. To ens α-kæder og to ens β-, γ-, δ- eller ε-kæder, der dannes ud fra hver deres gener, globingener. I fosterstadiet er der en overvægt af embryonalt hæmoglobin, som senere overtages af HbF. Nogle måneder efter fødslen, erstattes størstedelen af HbF med HbA, og i voksenalderen har man over 95% HbA og ca. 2% HbA2. (3, 4)(Fig. 1) Figur 1: Typer af hæmoglobin Billede lånt fra: [ ] Når der er glukose til stede i blodet, vil det kunne bindes irreversibelt til β-kæden i HbA, som så betegnes HbA1c. Bindingen mellem glukose og HbA sker i to trin, og er en ikkeenzymatisk glykering. I det første trin, der er en hurtig prcoces, dannes en kovalent binding mellem glukosens aldehydgruppe og valin i β-kædens N-terminal. Det dannede produkt, kaldet labilt HbA1c, er en aldimin, og er ikke stabilt, dvs. der er tale om en reversibel proces. Side 9 af 47

10 Andet trin i glykeringen er en langsom proces, hvor aldiminen irreversibelt omdannes til en ketoamin ved en såkaldt Amadoriomlejring, og produktet er stabilt HbA1c (fig. 2). Mængden af HbA1c er direkte proportional med glukosekoncentrationen i blodet, og da det er en stabil forbindelse, forsvinder det først fra blodet, når hæmoglobinet bliver nedbrudt. (4, 6) Figur 2: Her ses bindingen af glucosens aldehydgruppe til hæmoglobin. Første stadie hvor det bliver reversibelt labilt A1c og til sidst den irreversible del hvor det stabile HbA1c dannes. Billede lånt fra : [ ] Acetyleret hæmoglobin kan ifølge Rikke Borg, læge ved Steno Diabetes center,(7) i nogle tilfælde give en falsk forhøjet HbA1c værdi, og jævnfør Chachou et al. i artiklen Influence of in vivo hemoglobin carbamylation on HbA1c measurements by various methods (8) kan carbamyleret hæmoglobin også influere på resultatet. Varianter: Det anslås at ca. 7% af verdens befolkning har en eller flere mutationer, som er involveret i syntesen af hæmoglobin. Der findes over 1200 kendte hæmoglobinvarianter. De mest almene Hb-varianter verden over er HbS, HbE, HbC og HbD. (9, 10) Nogle varianter kan have indvirkning på HbA1c analysen, idet små ændringer i aminosyresekvensen kan ændre den tertiære struktur i globinerne og deres ladning. Ved HbA1c analyserne via HPLC og kapillærelektroforese, hvor hæmoglobinfraktionerne adskilles via deres ladning og størrelse, kan resultatet blive påvirket. Når man kigger på HbA1c, er det desuden vigtigt at være opmærksom på hæmoglobinvarianter, der ændrer erytrocyttens levetid. Hvis erytrocytterne har en forkortet levetid, kan det give et falsk lavt resultat, idet erythrocytternes levetid ikke er lang nok til at hæmoglobinen bliver stabilt glykeret. (11, 12) Et eksempel på en hæmoglobinvariant der mindsker erytrocyttens levetid er β-thalassæmi. β- thalassæmi skyldes en reduceret mængde β-globin, og kan skyldes en nærmest uendelig mængde forskellige mutationer i de to β-gener. Ved β-thalassæmi ses ofte en forhøjet mængde HbA2. (13) Side 10 af 47

11 De vigtigste varianter, der interfererer med HbA1c analysen generelt via alle analysemetoder er: HbS, også kaldet sickle cell disease grundet erytrocytternes udseende, hvor der er sket en punktmutation i det 6.codon på β - genet, beliggende på kromosom 11. Dette medfører en aminosyresubstitution, hvor valin erstatter glutaminsyre. Ved homozygoti giver det svær anæmi, og ved heterozygoti med HbA kan det give anledning til en mild anæmi, men er oftest uden symptomer. (9, 11) HbC skyldes også en punktmutation i det 6.codon på β - genet, som i dette tilfælde medfører en aminosyresubstitution af glutamin til lysin. Ved homozygoti og heterozygoti med HbA giver HbC ingen symptomer, hvorimod ved heterozygoti med eksempelvis HbS kan ses en svær anæmi. (11) HbD skyldes en punktmutation i codon 121 på β - genet, som gør at glutaminsyre udskiftes med glutamin. Ved heterozygoti med HbA er HbD uden symptomer, men kan give en mild hæmolytisk anæmi ved homozygoti. (9, 10, 11) HbE er lidt anderledes, idet der både sker en punktmutation i codon 26, som gør at lysin erstatter glutaminsyre, men det gør også at der dannes et alternativt splice site på det transskriberede mrna. I ca. 40% af tilfældene gør dette splice site at der bliver dannet et ikke funktionelt protein. I de sidste ca. 60% dannes der et modificeret β-globin. (11) Hos nyfødte er ca. 80% af hæmoglobinet HbF. Op til fødslen aktiveres β - generne og γ- generne inaktiveres. Dette gør, at HbF falder til normalt niveau indenfor de første seks levemåneder og erstattes af HbA. Hos enkelte individer sker dette dog ikke, og HbF vil fortsat være høj. Denne form for variant vil være asymptomatisk, da den eneste forskel på HbA og HbF er, at HbF har en smule højere iltaffinitet. Årsagen kan være deletioner i δ- og β-generne eller punktmutationer i promotorregionen af et af γ-generne, som gør at det ikke inaktiveres som normalt. (6, 9) De mest almindelige af Hb-varianterne ses dog ikke så tit blandt europæer, men typisk blandt mennesker fra andre dele af verden. For eksempel findes HbS typisk i Afrika, Indien og dele af Mellemøsten. HbC ses ofte i Vestafrika, og HbD i Punjab i Pakistan.(14) (fig. 3) Side 11 af 47

12 Figur 3: Figuren viser fordelingen af de mest almindelige Hb-varianter i verden. Billede lånt fra: HbA1c in Diabetes - case studies using IFCC units, Edited by Stephen Gough et al., Wiley - Blackwell 2010 Analyseprincip HPLC: For at forstå problemet med at analysere hæmoglobinvarianterne ved hjælp af HPLC, redegøres i det følgende afsnit for analyseprincippet. EDTA-blod fortyndes og hæmolyseres, hvorefter det pumpes ind i en kation-kolonne. Afhængigt af deres ladning bindes de forskellige hæmoglobin-fraktioner til kolonne materialet med forskellig styrke. Ad tre omgange pumpes derefter tre buffere med stigende saltkoncentration igennem kolonnen. Den ændrede saltkoncentration bevirker at de forskellige fraktioner elueres på forskellige tidspunkter fra kolonnen. De ledes derpå til en detektor, og måles fotometrisk ved 415 nm.(fig. 4) Ud fra målingerne genereres et kromatogram, hvor hæmoglobinet er opdelt i 6 fraktioner: HbA1a, HbA1b, HbF, HbLA1c (labilt HbA1c), HbSA1c (stabilt HbA1c) og HbA0. Ud fra arealet på kromatogrammet kvantiteres det forskellige hæmoglobin, og omregnes til procent af det totale areal.(15) (Fig. 5) Figur 4: Figuren viser analyseprincippet HPLC. Billede lånt fra: [ ] Side 12 af 47

13 For optimal aflæsning af et kromatogram ønskes en god adskillelse samt smalle og symmetriske toppe. Således også for at kunne definere en patientprøves indhold af forskellige hæmoglobin fraktioner. For at kunne fortolke adskillelsen af toppene udregnes antal teoretiske bunde, der er et udtryk for HPLC-kolonnens effektivitet. D.v.s. at jo højere antal teoretiske bunde, des bedre kolonne effekt. Det er således en form for kvalitetssikring af kolonnen, idet brede toppe vil betyde et lavere antal teoretiske bunde, der igen kan betyde to ting. Enten at der gemmer sig en variant under toppen, eller at kolonnen skal udskiftes. Figur 5: Kromatogram for en normal prøve. Hæmoglobinfragmenterne genkendes i rækkefølgen A1a, A1b, F, LA1c, SA1c og A0 ud fra deres respektive retentionstider. Absorbansen måles ved 415nm og sættes som funktion af retentionstiden.(16) Ydermere skal den teoretiske bund være > 250. Hvis antal teoretiske bunde bliver for lav, kan det tyde på at kolonnen er for gammel, eller at der evt kan ligge en Hb-variant gemt. Som nævnt kan nogle hæmoglobinvarianter interferere med HbA1c analysen, så der ikke kan afgives et HbA1c-svar. Dette udtrykkes som beskrevet, enten ved flere eller bredere toppe, hvilket igen bevirker at der ikke kan beregnes en værdi for HbA1c og dermed ikke afgives et HbA1c-svar. I de tilfælde hvor der ikke kan afgives et HbA1c-svar på grund af en Hb-variant, kan der i stedet rekvireres en fruktosamin-analyse. Fruktosamin er glykeret til albumin og andre proteiner (fig. 6), og ikke til hæmoglobin som HbA1c er. Albumin har en halveringstid på ca. 17 dage, mod hæmoglobin på ca.120 dage. Derfor afspejler kontrol af fruktosamin middelglukoseværdien for de seneste 2-3 uger, modsat 2-3 måneder for HbA1c. Patienterne kan derfor følges via Unilabs, hvor de følger deres eget referenceinterval med fruktosamin i stedet. Kontrol af fruktosamin kan ligeledes anvendes til patienter med gestationel diabetes Side 13 af 47

14 eller andre hæmatologiske sygdomme, der påvirker erytrocytternes levetid. Denne metode er dog mere omkostningsfuld idet analysen, der udføres hos Unilabs, koster ca. 619 kr. (17) Figur 6: Fruktosamin dannes ved binding af glucose til protein. Denne proces sker i to trin, hvor første er reversibelt og andet trin, dannelse af fruktosamin, er irreversibelt. Billede lånt fra: [ ] Ifølge artiklen Performances of capillary electrophoresis and HPLC methods in HbA1c determination: diagnostic accuracy in HbS and HbD-Iran variants' presence af Dessi et al. (18) er kapillærelektroforese en lige så god analyse til Hba1c som HPLC. Sammenlignet med HPLC, viste kapillærelektroforese også at have visse fordele når der var varianter til stede. Eksempelvis blev en variant HbD-Iran påvist ved kapillærelektroforese ved tydelig fraktion separation, der muliggjorde en korrekt besvarelse af HbA1c værdien, mens varianten ikke blev detekteret ved HPLC metoden. Ved HPLC metoden blev HbA1c værdien ligeledes estimeret alt for lavt i forhold til kapillærelektroforese svaret. Endvidere henviser artiklen også til at analyser på heterozygote HbAS varianter gav for lave HbA1c svar ved HPLC analysemetoden.(18) I artiklen Hemoglobin E disease and glycosylated hemoglobin af Yedla et al. (19) beskrives hvordan blandt andet HbE varianter giver fejlagtigt lave HbA1c svar ved HPLC metoden, og det anbefales at bruge andre metoder som for eksempel elektroforese i sådanne tilfælde. Det påpeges, at det er vigtigt at overveje risikoen for uhensigtsmæssige HbA1c målinger hos personer med diabetes, og hvilken indvirkning det kan have på behandlingen. At der skal være fokus på ethvert resultat, som ikke passer på det kliniske billede, og derfor bør undersøges nærmere. (19) I artiklen Erroneous HbA1c measurements in the presence of β-thalassemia and common Chinese hemoglobin variants af Ji et al. (20) konkluderes det, at β-thalassæmi kan forårsage fejl i HbA1c bestemmelse ved hjælp af Variant II Turbo-system, som måler ved hjælp af HPLC. HbE heterozygoti eller HbE homozygositet forstyrrede HbA1c analyserne, mens Capillarys 2 Flex Piercing systemet, som måler via kapillærelektroforese, fandt alle Hb varianter samt HbA1c hos patienter med β-thalassæmi, og kunne angive resultater med stor Side 14 af 47

15 nøjagtighed.(20) Minicap Sebia er en mindre udgave af Capillarys 2 Flex Piercing, men bygger på samme analyseprincip. Analyseprincip Kapillæreletroforese: HbA1c analysen er baseret på princippet om kapillærelektroforese i fri opløsning. Hæmoglobinfraktioner bliver adskilt i silica kapillærrør via deres elektroforetiske mobilitet og elektroosmotisk strømning ved en høj spænding i en alkalisk buffer. Hæmoglobinfraktionerne detekteres direkte ved en absorbans på 415 nm. i kapillærrørets katodeende (fig.7). 415 nm er den specifikke absorbansbølgelængde for hæmoglobiner. Figur 7: Analyseprincippet for kappilærelektroforese. Billede lånt fra: t=275&revision=1 [ ] Denne direkte detektion giver en nøjagtig relativ kvantificering af individuel HbA1c fraktion. Hæmoglobinerne detekteres i følgende rækkefølge fra katode til anode : HbA2/HbC, HbE, HbS/HbD, HbF, HbA0, anden Hb (inkl. mindre HbA1) og så HbA1c (fig. 8). Side 15 af 47

16 Figur 8: Elektroferogram for en normal prøve. Elektroferogrammet læses fra højre mod venstre, dvs. at det der detekteres først er HbA2 ved værdien 240, derefter HbA0 i mellem 140 og 180, efterfulgt af andet HbA, også indeholdende HbA1a og HbA1b, ved værdien mellem 100 og 140 og til sidst HbA1c mellem 60 og 80. Absorbansen måles ved 415 nm som afspejles i højden på toppene. Billede lånt fra: ESL Biosciences Electrophoresis Bulletin no. 2 Feb pdf [ ] HbA1c-analysen på Minicap Sebia er uden interferens fra de mest almindelige Hb varianter, da de bliver adskilt fuldstændig fra HbA1c s øvrige fraktioner. På Minicap Sebia bliver svaret udregnet via forholdet mellem HbA1c arealet/hba0+hba1c arealet, inden det korrigeres i forhold til kalibreringen. Derfor bliver HbA1a og 1b ikke medregnet, som de gør på Tosoh G8. (21, 22) Til vores forsøg låner vi en Minicap Sebia fra ILS, som analyserer for HbA1c ved kapillærelektroforese. Vi vil undersøge om man via denne metode, kan komme uden om problemet med varianter som gemmer sig bagved HbA1 C, og man dermed kan afgive svar på nogle af de prøver, som man ville have holdt tilbage ved den nuværende HPLC metode. I artiklen Evaluation of the Sebia Minicap Flex Piercing capillary electrophoresis for hemoglobinopathy testing af Oyaert et al. har de også sammenlignet brugen af HPLC og kapillærelektroforese med Minicap Sebia. Deres resultater er, at Minicap Sebia er acceptabel med en impræcision på mindre end 2%, og kan bruges til screening af diabetes og som opfølgning på Hb varianter. Ydermere har de også fundet visse problemer med HPLC, som blandt andet interferens fra forskellige varianter. De konkluderer dog ikke, at Minicap Sebia yder bedre end HPLC, men at den kan bruges på lige fod. (23) Ligeledes er konklusionen i artiklen Multicenter evaluation of hemoglobin A1c assay on capillary electrophoresis af Marinova et al. at siden kapillærelektroforesen kom frem, er metoden udviklet på lige fod med HPLC, og er mindst lige så god. I denne undersøgelse hvor de sammenlignede kapillærelektroforese med veletablerede metoder, fandt de også frem til en god korrelation, r > 0,985. (19) Side 16 af 47

17 Enheder for HbA1c: For at få en ensrettet og standardiseret svarafgivelse verden over på HbA1c analysen, er der gennem tiden nedsat forskellige komiteer og lavet forskellige studier omkring diabetes og HbA1c. Fra 1980 til 1990 blev der lavet en del studier, som påviste sammenhæng mellem glykæmisk kontrol og diabeteskomplikationer. I 1988 blev der udgivet et stort konsensus dokument, der dog ikke formåede at overbevise om sammenhængen mellem bedre kontrol af HbA1c og færre komplikationer. Først i 1993, da det store studie for diabeteskontrol, The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT), blev udgivet, blev det slået fast hvor vigtig en indikator HbA1c er. DCCT omhandlede kun type 1 patienter, men der blev samtidig lavet et lignende studie med type 2 patienter, The United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS), som også slog fast at der er en direkte sammenhæng mellem HbA1c og risikoen for diabetes komplikationer. (24) DCCT studiet var et stort studie, som kort tid efter førte til at The American Diabetes Association (ADA) anbefalede en HbA1c-værdi på under 7% DCCT og en behandlingsværdi, når Hba1c var på 8% DCCT eller derover. Dog var dette svært at føre ud i livet for klinikerne, da der manglede en standardisering af måleenhederne. De kunne ikke vide, om deres måleresultat stemte overens med studiet fra DCCT. Derfor blev der i 1993 oprettet en komite, der havde til formål at udvikle en plan for standardisering af HbA1c. (24) I 1996 begyndte det amerikanske National Glycohemolglobin Standardization Program, NGSP, at implementere anbefalingerne. NGSP anbefaler at HbA1c-koncentrationen angives i DCCT % også kaldet NGSP enheden. Samtidig blev der dannet en komite, The International Federation for Clinical Chemistry, IFCC, som udviklede en referencemetode til måling af HbA1c. Denne metode kan anvendes af producenter af HbA1c analyseapparater til kalibrering. IFCC angiver HbA1c koncentrationen i mmol/mol også kaldet IFCC enheden. IFCC resultater er 1,5-2,0% lavere end NGSP resultater, hvilket skabte en del bekymringer hos blandt andet NGSP og andre kliniske organisationer. (24, 25) I 2004, 2007, 2009 og 2011 blev der afholdt møder med deltagere fra blandt andet europæiske, amerikanske og japanske diabetesorganisationer omkring standardiseringen af HbA1c. Man besluttede at anbefale, at resultater for HbA1c angives både i IFCC enheden, mmol/mol, uden decimaler, altså hvor mange mmol er HbA1c ud af den samlede mængde mol hæmoglobin, og i DCCT enheden, %, men med én decimal, hvor % er HbA1c ud af den samlede hæmoglobinmængde. (26) På Tosoh G8 udgives svaret i begge enheder, dog med én decimal i IFCC og to decimaler i NGSP. Når svaret udgives i BCC til rekvirenten afgives det i mmol/mol, IFCC enheden og som eag, estimated average glucose, der angives i mmol/l. eag er en estimeret middelglukoseværdi baseret på HbA1c, som er let at forholde sig til, og er ment som hjælp til den enkelte diabetiker. Side 17 af 47

18 Minicap Sebia er kalibreret med IFCC kalibratorer, og resultater på prøver og kontroller bliver derfor målt i IFCC enheden mmol/mol. Herefter bliver de omregnet, efter den internationale anerkendte master equation til DCCT enheden. Minicap Sebia afgiver altså svar i begge enheder, ligesom Tosoh G8, den angiver det dog kun med de anbefalede decimaler. (27) Der skal være sporbarhed til IFCC, uanset om svarafgivelsen gives i IFCC-enhed eller DCCT/NGSP enhed. Til omregning mellem de to målangivelser anvendes ligningerne HbA1c DCCT % = 0,0915* HbA1c IFCC mol/mmol + 2,153 ( the master equation ) eller HbA1c IFCC mmol/mol = 10,93 * HbA1c DCCT % - 23,54. (27) Side 18 af 47

19 Problemformulering: Hvor vidt kan Minicap Sebia erstatte eller supplere Tosoh G8 i de tilfælde hvor patienten ikke kan få et HbA1c svar med den nuværende HPLC metode? Hvad vil en metodesammenligning af HbA1c-analysen på henholdsvis Minicap Sebia og Tosoh G8 vise? Hvilke økonomiske aspekter vil der være ved at anskaffe en Minicap Sebia? Side 19 af 47

20 Metodiske overvejelser: Det skal testes om Minicap Sebia kan bruges som supplement til Tosoh G8. Forsøget består af flere delforsøg, hvor det vurderes om der er overensstemmelse mellem Tosoh G8 og Minicap Sebias resultater. Derudover undersøges om Minicap Sebia giver flere HbA1c svar på abnorme prøver end Tosoh G8, og om nedfrysning har betydning for resultaterne på de to apparater. Derudover skal Minicap Sebias analytiske variation undersøges. Intraseriel impræcission: Da Minicap Sebia ikke er valideret på KBA i Holbæk, vælges at lave en intraseriel måling for at kontrollere repeterbarheden. Ideelt set skulle analyserne foretages på både høj, lav og middelværdi, men der vælges kun at analysere på én værdi for at være sikre på at have reagens nok til alle analyser. Der vælges en patientprøve med en HbA1c værdi tæt på den diagnostiske grænse (48 mmol/mol), da det er dette område der er klinisk relevant. Prøven analyseres 20 gange i træk i en serie. (fig. 9) Ud fra resultaterne af den intraserielle kørsel beregnes SD og CV. Det skal undersøges, om den beregnede SD og CV ligger indenfor de anbefalede kvalitetssikrings grænser. Der tages udgangspunkt i Westgards anbefalinger for HbA1c og i dokumentationsrapporten fra 2004, hvor Tosoh G8 blev valideret på KBA Holbæk. Her var CV % på 1,5, hvilket stemmer overens med Westgaards anbefalinger på 1,5%. (28, 29) Figur 9: Flowdiagram over den intraserielle impræcision. Interseriel impræcision: Der ønskes også at udføre interseriel impræcision på Minicap Sebia, men da vi kun har reagenskit med det samme lotnummer, er det ikke muligt at foretage analyser, hvor lot. nr. er udskiftet, og forsøget udføres derfor ikke helt korrekt. Der vælges at anvende kontrollerne til bestemmelsen. Kontrollerne er kun opgivet i DCCT. De lave kontroller har en targetværdi på 5,1 DCCT % +/- 0,6, og de høje kontroller har en targetværdi på 7,7 DCCT % +/- 0,7 oplyst fra Sebia. Ved hver opstart skal der analyseres en høj og en lav kontrol. Og før shutdown om eftermiddagen analyseres enten en høj eller en lav kontrol lav på lige datoer og høj på ulige datoer. Den af Sebia tilladte acceptgrænse er temmelig bred, og skal ifølge Sebia benyttes ved Side 20 af 47

21 opstart af nyt apparat eller ibrugtagning af nyt lot. nr. Det skal undersøges, om det er muligt at indsnævre dette acceptområde. Sebia anbefaler at finde middelværdien for kontrollen ved at analysere den gentagende gange, og benytte denne som target for kontrolværdien. Acceptværdierne skal da gerne ligge på DCCT % +/- 0,3 og DCCT % +/- 0,4 på henholdsvis lav og høj kontrol. På baggrund af analyseresultaterne i den periode forsøget varer, beregnes derfor ny SD og CV. Det undersøges om de nye værdier ligger inden for Sebias grænser samt DSKB VUKs anbefalinger for varians på 2,8 CV % for dag til dag analyser på HbA1c analysen.(27) For at få et visuelt overblik laves to grafer (en for høj og en for lav kontrol). De fra Sebia oplyste acceptgrænser før og efter beregning af middelværdi indtegnes samt SD grænserne. (fig. 10) Figur 10: Flowdiagram over den interserielle impræcision Effekt af nedfrysning/sammenligning af Tosoh G8 og Minicap Sebia (HPLC og kapillærelektroforese): Det tænkes at indsamle en stikprøve på 60 EDTA stabiliserede fuldblodsprøver fra rutinen, som allerede er analyseret på Tosoh G8, og udgivet med svar uden kommentarer om interfererende variant. De udvælges over flere dage blandt den daglige kørsel af HbA1c på Tosoh G8 på Klinisk Biokemisk afdeling (KBA) i Holbæk, således at HbA1c resultaterne på patientprøverne er jævnt fordelt i måleområdet. Dette for at sikre at eventuelle afvigelser i et bestemt område opdages. Antallet af prøver er udvalgt ud fra Region Sjællands valideringsrapport for klinisk biokemiske afdelinger, der anbefaler 40 patientprøver udvalgt over min. 3 dage. (30) De udvalgte prøver analyseres på Minicap Sebia, og da der ved metodesammenligningen af abnorme prøver analyseres på prøver, der har været nedfrosset, påtænkes det også at fryse de Side 21 af 47

22 almindelige prøver ned til -80, optø dem og derefter re-analysere på både Tosoh G8 og Minicap Sebia, for at se om nedfrysningen har nogen indflydelse på HbA1c resultatet. Ifølge artiklen First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) as a new analyzer for HbA1c assay by capillary electrophoresis af Jaisson et al. (31), skulle nedfrysning til -80 ikke have nogen indflydelse, men det vælges alligevel at undersøge dette, da det er en vigtig faktor i vores prøver. Jaisson et. al har desuden undersøgt om tilstedeværelsen af bilirubin og triglycerider i prøvematerialet kunne have en indflydelse, men her fandt de ingen relevans, og derfor tester vi ikke for dette. (20) For at undersøge om der er forskel på analyseresultaterne før og efter nedfrysning, laves først et qq-plot for at undersøge om data er tilnærmelsesvis normalfordelte, da dette er en forudsætning for at bruge de statistiske metoder der tænkes anvendt. Herefter beregnes middelværdien af differencen på de parvise målinger (før og efter frys). Der tænkes udført en parret t-test, da denne kan vise om middelværdien af differencerne er lig med nul - altså om der er signifikant forskel på resultaterne før og efter frys. Vores H 0 hypotese er, at middelværdien på differencerne er lig med nul - altså at der ikke er forskel på om prøverne fryses eller ikke, og vores H 1 hypotese er at der er forskel på middel differencerne. Da der kan forekomme signifikans ved parret t-test på en stor mængde data, på trods af lille difference, påtænkes det også at danne xy-plot med korrelation og regressionsligning, for at få overblik over sammenhængen mellem de målte værdier. Til metodesammenligningen af Tosoh G8 og Minicap Sebia (HPLC og Kapillærelektroforese) vælges at benytte resultaterne fra analyserne, der foretages efter at prøverne har været frosset, så resultaterne fra begge sammenligninger (alm. og abnorme prøver) er fra prøver, der præanalytisk er behandlet ens. Parret t-test er ikke altid velegnet til en metodesammenligning af analysemetoder, idet denne ikke giver oplysninger om BIAS, og outliers og den heller ikke viser hvordan resultaterne fordeler sig indenfor måleområdet (32) Vi vælger dog at lave parret t-test som supplement for at se om der er signifikans. H 0 hypotesen er, at middelværdien på differencerne er lig med nul - altså at der ikke er forskel på analysemetoderne. H 1 hypotesen er, at der er forskel på middel differencerne - og dermed forskel på analysemetoderne. Der vælges at kigge på 95 % konfidensintervallet. Derudover skal der beregnes SD på resultaterne og laves et differensplot. Herefter skal der laves et xyplot med korrelationskoefficient R 2, som udtrykker hvor stor sammenhæng der er mellem data, samt lineær regression, y= ax+b, som giver hældningen og BIAS. (fig. 11) Til at få et overblik over om der evt. er afvigelser på målinger i de høje eller lave områder laves et differensplot, hvor SD grænserne indtegnes ud fra BIAS. Det vælges at forholde sig til resultaterne som de foreligger og tage alle eventuelle outliers med, da der ikke er forudsætninger for at fravælge måleresultater, som ikke lige passer ind. Side 22 af 47

23 Figur 11: Flowdiagram over effekt af nedfrysning og sammenligning af Minicap Sebia og Tosoh G8. Sammenligning af abnorme prøver på Tosoh G8 og Minicap Sebia: Til metodesammenligningen af de abnorme prøver indsamles disse fra geografierne Holbæk og Næstved i perioden primo maj til ultimo oktober. Prøverne udvælges i Piano ud fra kriterierne, at det ikke er muligt at udgive et HbA1c svar, eller at svaret er tilknyttet en kommentar om, at patienten formentlig er bærer af en Hb-variant, og derfor bør følge eget referenceinterval. Prøverne nedfryses til -80 i opbevaringsperioden, da man ved frysning til -20 og efterfølgende optøning, risikerer erytrocytfraktioner, der kan interferere med analysen, idet de laver ekstra toppe på kromatogrammerne og elektroferogrammerne. (31) Efter optøning skal prøverne analyseres på Minicap Sebia og ud fra resultaterne beregnes hvor stor en procentdel af de indsamlede prøver, der vil kunne udgives et HbA1c svar på uden interferens. (fig. 12) Der skal også laves et skema over HbA1c resultaterne på de prøver, som besvares med at patienten skal følge egen reference. For at se om der er overensstemmelse mellem HbA1 svarene fra Tosoh G8 og Minicap Sebia, laves xy-plot med lineær regression og korrelation samt et differensplot. Derud over skal der udvælges illustrative kromatogrammer og elektroferogrammer, som tydeliggør forskellen på resultaterne på Tosoh G8 og Minicap Sebia. Side 23 af 47

24 Figur 12: Flowdiagram over sammenligning af abnorme prøver på Minicap Sebia og Tosoh G8. Etik: På alle patientprøver, med og uden Hb-varianter, er der i forvejen rekvireret en HbA1canalyse, og der foreligger et svar hos rekvirenten. Der er derfor ingen etiske problemstillinger i forbindelse med indsamling og analysering af udvalgte prøver. Da patienten er henvist fra enten egen læge, diabetesambulatoriet eller anden klinisk læge, må vi også stole på at der er eller bliver fulgt op på patienten hvis denne har fået et ikke brugbart svar på HbA1c analysen. Derfor er der heller ikke her nogen etiske dilemmaer, hvis forsøget skulle vise sig at kunne give yderligere svar. Økonomi: Økonomien spiller en stor rolle når der tales om at diagnosticere og monitorere diabetespatienter. Det skal undersøges hvad en enkelt analyse koster på henholdsvis Tosoh G8 og Minicap Sebia, så der er et sammenligningsgrundlag. Derudover påtænkes at se på analysen fruktosamin. Den er ligeledes en vigtig parameter for de diabetespatienter, der har en hæmatologisk sygdom, som påvirker erythrocytlevetiden. Her kan den nuværende analysemetode ikke give svar på HbA1c. Der skal ses på, om det rent økonomisk kan forsvares at investere i en Minicap Sebia som supplement til Tosoh G8, i fald dette apparat viser sig velegnet. Det påtænkes at finde priser fra ILS på apparater og reagenser, samt priser på reagenser og apparatur på Tosoh G8 fra Klinisk Biokemisk afdeling i Holbæk. Til afklaring af disse spørgsmål påtænkes at rette henvendelse til ILS omkring priser på Minicap Sebia og reagens. Priser på Tosoh G8 og tilhørende reagenser skal fremskaffes på Holbæk Biokemisk afdeling, hvor det endvidere påtænkes at indhente information omkring fruktosamin fra overlæge Poul Jannik Bjerrum. Side 24 af 47

25 Materialer og metoder: Apparatur: HbA1c analyserne på blodprøverne blev analyseret på hhv. Tosoh HLC-723G8, serienr.: fra Alere A/S og Minicap Sebia Flexpiercing, SN92737, fra ILS. Seriekørsel af udpippeteret og fortyndet blodprøve blev kørt på Minicap Sebia Flexpiercing, SN92737, fra ILS. Materialer: 1 EDTA stabiliseret fuldblodsprøve med et resultat på 47,4 mmol/mol, udvalgt i Piano fra foregående dags rutine. 54 EDTA stabiliserede fuldblodsprøver uden interfererende varianter, udvalgt i Piano fra dagens rutine. Udvalgte resultater fordelte sig over både høje og lave HbA1c værdier. 64 EDTA stabiliserede fuldblodsprøver, analyseret på Tosoh G8, hvor en variant påvirker HbA1c svaret. Prøverne er udvalgt i Piano, samlet og nedfrosset til -80 C. Tosoh G8: Til HbA1c analysen på Tosoh G8 blev anvendt Elution Buffer Hsi No 1 (800 ml succinat buffer med < 0,06 % natriumazid, Katalognr. HOS KS , Produkt ID: ), Elution Buffer Hsi No 2 (800 ml succinat buffer med < 0,06 % natriumazid, Produkt ID: ), Elution Buffer Hsi No 3 (800 ml succinat buffer med < 0,06 % natriumazid, Katalognr HOS KS , Produkt ID: ) og Hemolysis/Wash Solution (2000 ml indeholdende vand, EDTA, Triton X samt < 0,1% natriumazid, Katalognr HOS 18431L + KS 18431L, Produkt ID: ) Derudover er der ved analysen på Tosoh G8 brugt racks med plads til 10 glas, Cobas kopper til fortyndede prøver, forfilter og en kolonne. Der blev brugt interne kontroller fra Alere, HbA1c level 1 og level 2. Minicap Sebia: Til HbA1c analysen på Minicap Sebia blev brugt alkalisk ph-buffer (normal og abnorm, Lot: 16025/01), Hæmolyseopløsning (lot: 13055/01) og Wash solution (25 ml stamopløsning opløses til 250 ml demineraliseret vand, lot: 11055/01). Der blev anvendt kontrolmateriale i to niveauer (lot: level 1: 15124/02, lot level 2: 16124/02). Derudover blev anvendt pipette Sartarius ųl.(ce nr. MV13608, kalibreret ), pipette satarius ųl.(ce nr , kalibreret ), engangspipetter, reagens cups, filtre (lot nr.: 1776A), beholdere til brugte kopper, spidsrør og propper. Side 25 af 47

26 Metoder: Intraseriel impræcision: Til at undersøge Minicaps Sebia repeterbarhed blev en blodprøve udvalgt i Piano, med et HbA1c resultat på 47,4 mmol/mol, der ligger tæt på den diagnostiske grænseværdi på 48 mmol/mol. Fra prøven afpippetteredes 50 ųl fuldblod ud i hver af 20 spidsrør mærket med en low volume etiket. Derefter tilsattes 250 ųl hæmolyseopløsning, lot: 13055/01, i hver spidsrør, der efterfølgende blev analyseret lige efter hinanden på Minicap Sebia. Ud fra resultaterne af de 20 analyser beregnedes middelværdi, SD og CV. Interseriel impræcision: Ved analysering på Minicap Sebia blev der over en 14 dages periode kørt kontroller level 1 og level 2 før hver kørsel og en kontrol efter endt kørsel (ca prøver), hvor der skiftevis blev brugt level 1 og 2. Kontrolmaterialet blev ved modtagelse tilsat 750 ųl. demi-vand, udportioneret til prøverør og frosset ned til -20. Kontrollerne blev inden hver analysering tøet op i køleskab i 45 min., og efter brug igen frosset ned til -20. Da kontrollerne er frysetørret ved modtagelse, er alle erytrocytterne hæmolyserede, og de kan derfor nøjes med at blive frosset ned til -20. Ud fra HbA1c resultaterne blev SD og CV beregnet og sammenlignet med DSKB VUKs anbefalinger for varians på 2,8 % for dag til dag analyser på HbA1c. Det blev også undersøgt om resultaterne lå indenfor Sebias acceptgrænser som anbefales beregnet på middeltallet af adskillige analyser. Til visuelt overblik blev der dannet to grafer (en for høj og en for lav kontrol), hvor de oplyste acceptgrænser fra Sebia samt de nye beregninger af SD blev indtegnet. Effekt af nedfrysning: 54 blodprøver uden interfererende varianter blev udvalgt i Piano og analyseret på Minicap Sebia, hvorefter de blev frosset ned til -80. For at se om nedfrysningen havde nogen markant indvirkning på resultaterne, blev prøverne optøet og analyseret igen på hhv. Tosoh G8 og Minicap Sebia. Resultaterne blev tastet ind i et Excel ark. Der blev lavet et qq-plot, middelværdi af differencerne for de parvise målinger blev beregnet og der blev lavet parret t-test på resultaterne. Endvidere blev der lavet et xy-plot med korrelation og regressionsligning. Sammenligning af Tosoh G8 og Minicap Sebia (HPLC og kapillærelektroforese): Ud fra resultaterne af analyserne på hhv. Tosoh G8 og Minicap Sebia blev der udregnet middelværdi af differencer af de parvise målinger, SD og BIAS. Derefter blev lavet et xy-plot med korrelationskoefficient og lineær regression. Derudover blev lavet et differensplot, hvor SD grænserne blev indtegnet ud fra bias. Endelig blev der som supplement lavet en parret t- Side 26 af 47

27 test for at se om der er signifikant forskel på de to analysemetoder. Der blev brugt signifikansniveau 0,05 og antal frihedsgrader 47. Sammenligning af abnorme prøver på Tosoh G8 og Minicap Sebia: 64 abnorme blodprøver blev udvalgt i Piano, ud fra resultater med kommentarerne Patienten er bærer af en Hb-variant og bør derfor følges med eget referenceinterval og Værdien kan ikke udgives grundet abnorme Hb varianter. Se LMV. Prøverne blev herefter opbevaret ved -80, optøet og analyseret på Minicap Sebia. Af resultaterne blev udregnet hvor stor en procentdel af de testede abnorme prøver, der ville kunne udgives et HbA1c svar på efter analysen på Minicap Sebia. Der blev udvalgt 4 billeder til illustration af forskellene på HPLC og kapillærelektroforese svarene. Derudover blev der lavet et skema over HbA1c resultaterne på de prøver som på begge apparater blev besvaret med at patienten skal følge egen reference. der blev lavet xy-plot med regressionsligning og korrelation samt differensplot for at se om der var sammenhæng mellem HbA1c svarene på det to apparater. Økonomi: Der blev indhentet priser på apparater og reagenser på Minicap Sebia og Tosoh G8 hos henholdsvis ILS og afdelingsledelsen på Klinisk Biokemisk afdeling i Holbæk. Ud fra disse oplysninger blev prisen på en enkelt HbA1c analyse beregnet på de to apparater. Derudover blev prisen på en enkelt fruktosamin analyse ved opsætning på Konelab på KBA Holbæk beregnet, til baggrund for sammenligning med prisen på en enkelt analyse hos Unilabs. Side 27 af 47

28 Resultater: Udtræk fra Klinisk biokemisk afdelings system viste, at der var lavet HbA1c analyser i perioden Heraf blev 45 analyser besvaret med koden HBA05* Patienten er bærer af en Hb-variant og bør derfor følges med eget referenceinterval. 51 analyser blev besvaret med koden HBA03* Værdien kan ikke udgives grundet abnorme Hb varianter. Se LMV Det vil sige at 0,2 % af prøverne i perioden ikke kunne besvares fyldestgørende. Effekt af nedfrysning: Til bedømmelse af om nedfrysning har betydning for analyseresultatet, blev der i alt udvalgt 54 normalprøver fra rutinen. Under nedfrysning blev fire prøver ødelagt, idet glasset var sprunget, og to analyser blev senere fravalgt, da analyserne af disse prøver ikke gav noget resultat på Minicap Sebia grundet en fejl. De resterende 48 normalprøver blev analyseret på Tosoh G8 før frys og igen efter frys ved -80. Qq-plot viser at resultaterne er tilnærmelsesvis normalfordelte (fig. 13). Differencen på middelværdierne gav 0,4 mmol/mol. Parret t-test gav t-værdi 3,66 og tabelopslag for signifikansniveau 0,05 gav 2,01, hvilket medfører at H 0 hypotesen om at der ikke er forskel på middeldifferencen forkastes. Korrelationskoefficient R² = 0,999 og lineær regression y=1,000x - 0,371. (fig. 15) Resultater på Minicap Sebia før og efter frys ved -80 viser ved qq-plot at være tilnærmelsesvis normalfordelte (fig. 14). Differencen på middelværdierne gav 0,5 mmol/ mol. Parret t-test gav t-værdi 3,36 og tabelopslag gav p-værdi 2,01 ved signifikansniveau på 0,05, hvilket medfører at H 0 hypotesen om at middeldifferencerne er 0 forkastes. Korrelationskoefficient R²=0,998 og lineær regression y=0,993x-0,144. (fig. 16). Figur 13: qq-plot for HbA1c resultater før og efter frys på Tosoh G8 viser at data er tilnærmelsesvis normalfordelte Side 28 af 47

29 Figur 14: qq-plot for HbA1c resultater før og efter frys på Minicap Sebia viser at data er tilnærmelsesvis normalfordelte. Figur 15: Tosoh G8 - HbA1c resultater før frys (x-aksen) og efter frys (y-aksen). Korrelationskoefficient R² = 0,999 og lineær regression y=1,000x - 0,371. Figur 16: Minicap Sebia- HbA1c resultater før frys (x-aksen) og efter frys (y-aksen). Korrelationskoefficient R²=0,998 og lineær regression y=0,993x-0,144. Side 29 af 47

30 Intraseriel impræcision: Minicap Sebias repeterbarhed blev udført ved 20 analyser på samme prøve valgt fra rutinen med resultat på 47,4 mmol/mol på Tosoh G8. Analyse af den ufortyndede prøve gav resultatet 50,0 mmol/mol på Minicap Sebia. De 20 analyser på fortyndingerne gav et middelresultat på 49,1 mmol/mol, SD var 1,1 mmol/mol og CV 2,1 %. Sammenligning af Tosoh G8 og Minicap Sebia (HPLC og kapillærelektroforese): 48 normalprøver blev analyseret efter nedfrysning til -80. Beregnet middeldifference, svarende til bias, gav -0,15 mmol/mol. I xy-diagram dannede regressionsligningen y=1,006x - 0,126 og korrelationskoefficienten R 2 blev 0,996 (fig. 17). Differensplot viste at værdierne ligger jævnt spredt omkring 0 både i de høje og lave værdier. Med indsættelse af nyt nulpunkt efter beregnet middeldifference (BIAS) på -0,15 ligger 34 af resultaterne indenfor +/- 1SD, 13 af resultaterne ligger mellem +/- 1 og 2 SD, mens et enkelt ligger mellem 2 og 3 SD (fig. 18). Parret t-test gav teststørrelse 0,76 som ved tabelopslag ved 47 frihedsgrader gav p-værdi 2,01, hvilket bekræfter H 0 hypotesen. Figur 17: HbA1c resultater på normalprøver på Minicap Sebia(y-aksen) og Tosoh G8 (x-aksen) med korrelationskoefficient R 2 = 0,996 og og lineær regression y=1,006x - 0,126. Side 30 af 47

31 Figur 18: Tosoh G8- Minicap Sebia mmol/mol. Blå stiplet linje - BIAS på -0,15, gul stiplet linje SD +/- 1,4 og rød stiplet linje 2SD +/- 2,8 Interseriel impræcision: Der blev foretaget i alt 24 analyser på lav kontrol med target værdi 5,1 DCCT% +/- 0,6. Analyserne gav SD 0,07 DCCT % afrundet til 0,1 DCCT % og CV på 1,5 %. Middelværdien for analyserne blev 5,1 DCCT % Fra Sebias anbefalinger om target værdi +/- 0,3 DCCT % fås acceptområdet 4,8-5,4 DCCT% (fig. 19). Der blev foretaget i alt 26 analyser på høj kontrol med target værdi 7,7 DCCT % +/- 0,7. Analyserne gav SD 0,09 DCCT % afrundet til 0,1 DCCT% og CV 1,3%. Middelværdi for analyserne blev 7,5 DCCT %. Fra Sebias anbefalinger om target værdi +/- 0,4 DCCT % fås acceptområdet 7,3-8,1 DCCT% (fig. 20).. Side 31 af 47

32 Figur 19: Lave kontrolværdier Minicap Sebia. blå linier - target værdi fra Sebia DCCT% 5,1 +/- 0,6 ved ibrugtagning og lot skifte. Grønne linjer - targetværdi +/- beregnet 1SD (0,08 DCCT% afrundet til 0,1 DCCT%) af analyseresultaternes middelværdi der gav 5,1 DCCT%. Gule linjer - targetværdi +/- 2SD. Røde linjer - Sebias acceptgrænser som fås af middelværdien på gentagne analyser på kontrollen (5,1 DCCT%) +/-0,3 DCCT%, hvilket giver acceptområde 4,8-5,4 DCCT%. HbA1c CTL 1-1 (blå firkanter) er resultater foretaget på den ene kapillær, HbA1c CTL 1-2 (røde firkanter) er resultater af den anden kapillær, CTL1-1 (grøn trekant) er resultater på den ene kapillær målt før shutdown om eftermiddagen og CTL2-2 (X) er resultater målt på den anden kapillær før shutdown om eftermiddagen. Figur 20: Høje kontrolværdier Minicap Sebia. blå linier - target værdi fra Sebia DCCT% 7,7 +/- 0,7 ved ibrugtagning og lot skifte. Grønne linjer - targetværdi +/- 1SD på analyseresultaterne (0,09 DCCT% afrundet til 0,1 DCCT%). Gule linjer - targetværdi +/- 2SD. Røde linjer - nye acceptgrænser beregnet ud fra Sebias anbefalinger om at tage udgangspunkt i middelværdien af gentagende analyser (7,5 DCCT%) +/- 0,4 DCCT%, hvilket giver acceptområde 7,1-7,9 DCCT%. HbA1c CTL 2-1 (blå firkanter) er resultater på den ene kapillær, HbA1c CTL 2-2 (røde firkanter) er resultater af den anden kapillær, CTL2-1 (grøn trekant) er resultater på den ene kapillær målt før shutdown om eftermiddagen og CTL2-2 (X) er resultater målt på den anden kapillær før shutdown om eftermiddagen. Sammenligning af abnorme prøver på Tosoh G8 og Minicap Sebia: De 64, ifølge Tosoh G8 abnorme prøver, blev samlet sammen på forskellige geografier over en periode på seks måneder. Disse blev analyseret på Minicap Sebia, og resultaterne blev sammenholdt med resultaterne fra Tosoh G8. Ud af disse er 27 svaret med samme resultat. 21 af de 27 er svaret at patienten er bærer af en Hb variant og bør derfor følges med eget referenceinterval, hvoraf Minicap Sebia har identificeret 1 af disse med for høj HbA2, som tyder på en beta-thallæsami. 5 af de 27 er ikke svaret, og 1 er svaret uden variant, men med meget høj HbA1c værdi på begge apparater. Side 32 af 47

33 Ud af de 64 er der ikke udgivet svar på 15 prøver på Tosoh G8 på grund af detektionen af en HbE variant, da HbE ikke kan modregnes HbA1c på dette apparat. Dette er der korrigeret for på Minicap Sebia, og der er derfor udgivet HbA1c svar på dette apparat med kommentaren, at patienten er bærer af en Hb variant, og bør følges med eget referenceinterval. På 11 af de 64 prøver er der udgivet normalt HbA1c svar på Minicap Sebia, hvor det ikke på Tosoh G8 har været muligt grundet anden interferens. På 8 af de 64 prøver er der udgivet et HbA1c svar med variant på Minicap Sebia, hvor det ikke var muligt at udgive dette svar på Tosoh G8. I to tilfælde er der udgivet et HbA1c svar med variant på Tosoh G8, men prøverne kunne ikke svares på Minicap Sebia, da en variant interfererer med HbA0, og der er en forhøjet HbA2, som tyder på en b-thalassæmi. I et af tilfældene er prøven svaret på Tosoh G8, men ikke på Minicap Sebia på grund af interferens. Det vil sige, at i 42 % af tilfældene har Tosoh G8 og Minicap Sebia samme resultat. I knap 5 % har Tosoh G8 kunne udgive et HbA1c svar, hvor Minicap Sebia ikke har kunnet udgive svar, og i 53 % af tilfældene har Minicap Sebia kunne udgive et HbA1c svar, hvor det ikke er muligt at få svar på Tosoh G8. (tabel 1) Tabel 1: Antal og procentangivelse af analyseresultater på Minicap Sebia og Tosoh G8 af 64 abnorme prøver. De 21 abnorme prøver, som på begge apparater blev besvaret med, at patienten skal følge eget referenceinterval, gav ved sammenligning af HbA1c resultaterne med xy-plot en korrelationskoefficient R 2 = 0,992 og regressionsligning y = 1,098x - 4,198. Ved differensplot fordeler værdierne sig jævnt omkring 0, med en tendens til at Tosoh G8 resultaterne er højere end Minicap Sebias værdier ved lave HbA1c værdier, mens Minicap Sebia resultaterne er større end Tosoh G8 ved høje HbA1c værdier (fig. 21 og 22) Side 33 af 47