Metode udvikling af Carba NP testen

Transkript

1 Metode udvikling af Carba NP testen Peter Ehlert Jensen (155665) Vejledere Erica Bracher Jørgen Bioanalytikerunderviser Turi Neubauer Cand. Scient., Ph.D. Lektor Antal tegn med mellemrum: 5536

2 Forord Dette bachelorprojekt er udarbejdet på bioanalytikeruddannelsen, VIA University College Aarhus af en bioanalytikerstuderende. Det praktiske arbejde er udført i samarbejde med Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Aalborg Universitetshospital. Projekts formål er at undersøge vurdere Carba NP testen evne detektere carbapenemase aktivitet ved bakterier med henblik på at udvikle en hurtig test til at diagnosticere carbapenemresistente bakterier, der kan implementeres til klinisk brug. Opgaven er henvendt til andre bioanalytikerstuderende, ansatte på mikrobiologiske afdelinger og andre med interesse for emnet. Jeg vil gerne takke Erica Bracher Jørgensen og Turi Neubauer for deres engagement og god vejledning i skriveprocessen. Speciel tak til Erica for hendes indsat i den praktiske del af projektet med hjælp til indsamling af prøvemateriale og vejledning indenfor mikrobiologisk arbejdsgang. Jeg vil takke personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital for deres støtte og forståelse i projekt perioden, og tak til Klinisk Biokemisk Afdeling Aalborg Universitetshospital for lån af apparatur og reagenser samt vejledning indenfor biokemiske principper Underskrift Side 1 af 42

3 Resumé Baggrund Carbapenem resistente bakterier er et stigende problem, der truer folkesundheden. Der er set tilfælde af carbapenem resistente bakterier i Danmark, hvor hospitaler forsøger at mindske smitterisikoen ved at isolere patienterne. En hurtig test til bestemmelse af carbapenemase aktivitet er nødvendig for at sikre hurtig isolation/af-isolation. Formål Formålet var at udvikle en Carba NP test, der kan detektere og differentiere carbapenemase typerne med henblik på at implementere testen til diagnostisk brug. Materialer og metoder Et panel af carbapenemase producerende stammer samt kontrolstammer med andre resistensmekanismer blev analyseret ved tre forskellige Carba NP tests baseret udefra hvilken ph-indikator der blev anvendt. Phenolrødt, bromthymolblåt og neutralrødt var de ph indikatorer der blev testet. Til differentiering af carbapenemase klasser blev bakteriestammerne analyseret ved Carba NP testen med enzyminhibitorerne tazobactam og EDTA. Holdbarheden på Carba NP test reagensets blev også testet efter opbevaring ved 5 o C i fjorten dage. Resultater Carba NP testen med phenolrødt havde klare farveomslag, der var tydelige at tolke. Bromthymolblåt havde farveomslag, som var transparente og derved svære at tolke visuelt. Neutralrødt blev ekskluderet, fordi farveomslagene var for dårlige til visuel tolkning. Carba NP testen påviste en sensitivitet på 84 % og specificitet på 100. Reagenset der blev opbevaret ved 5 o C i fjorten dage kunne ikke påvise carbapenemase aktivitet. Konklusion Phenolrødt var den bedste ph-indikator til Carba NP testen på grund af gode farveomslag der var tydelige at tolke visuelt. Carba NP testen detekterede og differentierede alle klasse A og B carbapenemaser. Klasse D og andre carbapenemaser med lav katalytisk aktivitet overfor imipenem var vanskelige at detektere. Carba NP testen var simpel, hurtig og effektiv til at detektere carbapenemase aktivitet, men holdbarheden på reagenset var barriere der kunne hinde implementering til diagnostisk brug. Side 2 af 42

4 Baggrund Projektet fokus er at undersøge mulighederne for at udvikle en analysetest der kan detektere carbapenemresistente bakterier. Carbabepemresistente bakterier er et stigende problem på verdensplan, hvor øget forekomst af carbapenemresistens er observeret ved Enterobacteriaceae og Pseudomonas spp. Carbapenemer er den sidste gruppe af β-lactamantibiotika, som kan anvendes til behandling af bakterier med multiresistens(1) og er den gruppe af β-lactamer, der kan bruges til behandling i mod bakterier med extended spectrum β-lactamases(esbl). Den øgede forekomst af bakterier med ESBL har medført til overforbrug af carbapenemer, hvilket har induceret til carbapenem resistens blandt Enterobacteriaceae(2). Hospitals infektioner er primært forårsaget af Enterobacteriaceae ved transplantationer, intensivafdelinger eller operation og patienter indenfor den gruppe er sårbare over for en infektion med carbapenem resistente bakterier. Carbepenemresistente bakterier (CRB) har været kendt i Europa siden begyndelsen af 10 (3). Senest i år 2013 er prævalensen i Europa ifølge en rapport fra Europen Center for Disease Prevention and Control (ECDC) fordelt, så lande som Grækenland og Italien ligger øverst på den epidemiologiske skala med et 5-tal, som svarer til en epidemisk situation(4). Der er endnu ikke ind berettelses pligt i Danmark ved fund af CRB, og prævalensen er derfor ukendt. Det første tilfælde af CRB i Danmark blev fundet i Resistensformen er detekteret i forskellige bakteriearter deriblandt familien Enterobacteriaceae samt Pseudomonas aeruginosa og Acinetobacter baumannii. Fra 2008 til 2011 er der i Danmark indberettet 15 tilfælde af positive carbapenemresistente Enterobacteriaceae. I 2012 blev der indberettet et udbrud af carbapenem resistente A. baumannii i Hovedstadsområdet på 20 tilfælde. Tilfælde af carbapenemresistens i P. aeruginosa i Danmark er også observeret(5). Side 3 af 42

5 Ved fund af en CRB på Aalborg Universitetshospital følges retningslinjerne for isolation af patienter på enestue, for at mindske risiko for spredning til andre patienter på hospitalet (bilag 1) For at sikre en hurtig isolation/af-isolation, er det vigtigt at detektere CRB indenfor en kort svartid. I den forbindelse har Mikrobiologisk speciale på AUH pr. 1. august 2013 valgt at indføre Rapid CARB Screenkit i deres daglige rutine for at kunne påvise CRB. Rapid CARB screenkit kan påvise carbapenemase aktivitet, som findes ved carbapenem resistente bakterier, med en svar tid på 2 timer. Mikrobiologisk speciale på Aalborg Universitetshospital oplevede, at nogle bakterier, der ikke havde carbapenemase aktivitet, blev tolket som falsk positive ved RCS og alternative tests med kort svartid og høj sensitivitet og specificitet var efterspurgt. Carbapenem resistens kan detekteres ved fænotypiske metoder som den modificerede hodge test KPC+MBL confirm kit og MASTDIS ID carbapenemase. Testene har dog lang svar- tid og det er påvist at disse metoder har lav sensitivitet og specificitet overfor CRB(6). Molekylærbiologiske tests kan anvendes, men testene er dyre og har lang svartid, og kræver speciel ekspertise for at kunne bruges(7). Nordmann et. al. har udviklet en biokemisk test, der kan detektere carbapenemase aktivitet ved CRB inden for en kortere svartid, end de fænotypiske samt molekylærbiologiske tests. Produktet er døbt Carba NP testen og har påvist en diagnostisk sensitivitet og specificitet på 100 % (7). Dortet et al. videreudviklede Carba NP testen, så den også kunne differentiere mellem carbapenemasetyperne (1). Det er relevant at undersøge, hvorvidt denne test kan anvendes i klinisk sammenhæng til at påvise CRB, da der er behov for en hurtig test til at detektere CRB for at forhindre spredning af hospital infektioner med disse resistensmekanismer(7). Side 4 af 42

6 Problemformulering Hvorledes kan vi designe en Carba NP test, som kan detektere og differentiere de enkelte carbapenemase enzymgrupper hos bakterier og hvilke muligheder samt konsekvenser vil det have ved at implementere denne test i klinisk brug? Målformulering For at designe en Carba NP test, der kan detektere og differentiere de enkelte carbapenemase enzymgrupper vil vi: Anvende metodedesignet fra Nordman et al, hvor vi sammenligner phindikatorerne, Phenolrødt, neutralrødt og bromthymolblåt. På baggrund af diagnostisk sensitivitet og specificitet udvælge den mest optimale ph-indikatorer. Undersøge holdbarheden for reagenset ved Carba NP testen ved at vurdere den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Anvende metodedesignet fra `Dortet et al. hvor vi undersøger enzym inhibitorerne tazobactam natrium salt og EDTA. Via diagnostisk sensitivitet og specificitet vurdere inhibitorernes evne til at differentiere carbapenemaseklasserne. Side 5 af 42

7 Teori Beta Lactam antibiotika. Beta(β)-lactam antibiotika betegnes som en gruppe af bredspektret antibiotika, der anvendes til bakteriel behandling. De består af en β-lactamring, hvor nogle typer indeholder en sekundær ring struktur. De inddeles i undergrupperne penicilliner, cephalosporiner, cephamyciner, monobactamer og carbapenemer. Deres antimikrobielle effekt virker ved at inaktivere penicilin-binding-proteins som standser peptidoglykan syntesen (). Manglende peptidoglykan i bakteriernes cellevæg øger det osmotiske stres, hvilket inducerer til lysering af bakterien(8). β-lactamer har lav toksicitet overfor mennesker og er blevet anvendt i klinisk praksis siden 140 som det mest anvendte antibiotika på verdensplan(10, 11). Carbapenem antibiotika og resistens Carbapenemerne er en β-lactam gruppe, der omfatter typerne imipenem, meropenem, ertapenem og doripenem. De anvendes til behandling i mod et bredt spektrum af gram positive og gram negative bakterier. Carbapenemerne er stabile overfor de fleste β-lactamaser her i blandt AmpC og extendedspectrum -β-lactamses(esbl), hvilket gør dem anvendelige til behandling af multiresistente bakterier(). Resistens overfor carbapenemer ses, når bakterierne udvikler lav affinitet overfor carbapenemet ved PBP 2a. Forhøjet affinitet til efflux pumper gør det muligt for bakterien at udskille antibiotika heriblandt carbapenemer. Tab af poriner, der nedsænker membran permabiliteten gør det vanskeligt for carbapenemet at penetrere bakterien cellemembran. Bakterien kan endvidere ødelægge carbapenemet via enzymer, der omtales carbapenemaser(). Carbapenemase-producerende bakterier Carbapenemase-producerende bakterier er en gruppe af bakterier, der syntetiserer enzymgruppen carbapenemase. Carbapenemase er en β-lactamase, der inaktiverer b-lactamer ved at hydrolysere β- lactamringen. Carbapenemaser kan hydrolysere et bredt spektrum af β-lactamer her i blandt. penicilliner, cephalosporiner, monobactamer og carbapenemer. (12) Carbapenemaser inddeles i klasserne A, B og D udefra deres aminosyre homologi.(13) Klasse A består af typerne NMC/IMI, SME, GES og KPC. De hydrolyserer β-lactamer via serin i det aktive center og inhiberes af clavulansyre samt tazobactam(13). Generne kan være placeret både kromosomalt samt i et plasmid. I klinisk sammenhæng er KPC den mest almindelige enzymtype og behandlingsmulighederne er få da typen er multiresistent overfor mange β-lactamer.(8) Side 6 af 42

8 I klasse B findes typerne NDM, VIM og IMP. De hydrolyserer alle β-lactamer med undtagelse a monobactamer. De klassificeres også som metallo-beta-lactamases(mbl), fordi hydrolyseringen kun forløber ved tilstedeværelse af Zn +2 i det aktive center. De inhiberes ikke af clavulansyre og tazobactam, men af metal-bindere som etylen-diamin-tetra-eddikesyre(edta)(12). MBL typer findes ofte ved hospital infektioner med multiresistente K. pneumonia hvor mortalitetsraten varierer fra 18 til 67 %.(8) Klasse D består af typen OXA. De hydrolyserer et bredt spektrum af cephalosporiner og kan svagt hydrolysere carbapenemer. Klasse D hydrolyserer β-lactamer via serin ved det aktive center. Klasse D carbapenemaser kan ikke inhiberes ved brug af clavulansyre, tazobactam og EDTA. Prævalensen af bakterier, der producerer OXA-48 er stigende og der er set tilfælde i lande som Frankrig, Holland og Storbritannien. K. pneumonia og E. coli er de bakterier, hvor prævalensen af OXA-48 er højest. Kombineret med ESBL og nedsat permabilitet kan disse bakterier have resistens overfor carbapenemer. Prævalensen af OXA-48 kan desuden være undervurderet fordi carbapenemasen er svær at detektere(8). Carba NP testen Carba NP testen(cnp) er en analyseprocedure, der anvendes til at detektere carbapenemaseaktivitet ved bakterier. CNP er baseret på et enzymatisk analyseprincip, der detekteres kolorimetrisk. Imipenem undergår hydrolysering ved tilstedeværelse af carbapenemase enzymer, hvilket inducerer til et syreholdigt miljø, der detekteres ved et farveskift forårsaget af en ph-indikator(7). Testen består af et analysereagens indeholdende Phenolrødt, ZnSO 4, imipenem og destilleret vand. Bakteriestammer lyseret og tilsættes til reagenset, hvorefter prøven inkuberes ved 37 o C i op til 2 timer. Bakteriestammer der har carbapenemaseaktivitet, vil forårsage et farveskift fra rød til gul/orange i analysereagenset(7). Side 7 af 42

9 Materialer og metode Artikel valg til metoden Vi har valgt at anvende forsøgs designet fra Nordman et al. (7) til at undersøge, hvilken en af phindikatorerne Phenolrødt, bromthymolblåt og neutralrødt, der var bedst ved Carba NP testen. På baggrund af resultaterne fra Dortet et al. (1), valgte vi at undersøge EDTA og tazobactams evne til at klassificere carbapenemase klasserne. Nordman et al. er et kontrolleret ikke randomiseret forsøg, der er udgivet i Emerging Infectious Diseases, som er en peer reviewed journal med en impact factor på 5,3. Dortet et al. er et kontrolleret ikke randomiseret forsøg, som er udgivet i Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, der bl.a. behandler minireviews, og har en impact factor på 4,565. Prøveindsamling Vi indsamlede 1 carbepanemase-producerende stammer. Tre fra klasse A, tretten fra klasse B og tre fra klasse D. Prøvernes carbapenemase profil var bestemt via Hel-genom-sekventering. Fjorten kontrolstammer blev inkluderet i forsøget. Kontrolstammerne skulle være konfirmeret som noncarbapenemase producerende bakterier via hel-genom sekventering. Vi ville undersøge, hvorvidt andre resistensmekanismer kunne interferere med udfaldet fra Carba NP testen. Til det formål var det nødvendigt at kontrolstammerne havde andre β-lactamaser eller resistensmekanismer. Seks stammer havde ESBL typer, hvor to også havde reduceret cellevægspermabilitet. Fire stammer havde AmpC, hvor en prøve også havde reduceret cellevægspermabilitet. To stammer med porintab blev også inkluderet. De sidste to stammer havde ingen resistensmekanisme, der var detekteret, men de blev inkluderet som kontrolstammer fordi de var konfirmeret som non-carbapenemase producerende og havde resistens overfor imipenem, ertapenem og meropenem. Alle prøver blev analyseret som blindtests ved ph-indikatorforsøgene, men ved inhibitor forsøgene kendte vi prøvernes udfald ved Carba NP testen, dog var klasserne stadig ukendt. Test af ph-indikatorer Vi har valgt at sammenligne tre ph-indikatorer ved Carba NP testen. phenolrødt valgte vi, fordi indikatoren anvendes ved Nordman et al. samt Dortet et al(1,7). Bromthymolblåt valgte vi, fordi Pires et al. har anvendt indikatoren til Carba NP testen med succes(15). Neutralrødt har vi valgt, fordi ph-omslagsintervallet (ph:6,8-8,0) er tæt på de ph-omslagsintervaller, som er gældende for Phenolrødt (ph: 6,5-8,0) og bromthymolblåt(ph: 5,8-7,6)(14)Vi valgte at ph-værdien for analysereagenserne skulle være i mellem 7,0-8,0 på baggrund af Nordman et al og Dortet et al. som an- Side 8 af 42

10 vendte en ph ved deres reagens på 7,8(1,7) samt Pires et al. der anvendte en ph værdi ved 7,0 med succes.(15) Fremstilling af analysereagenser. Vi producerede phenolrødtopløsningen ved at tilsætte 0,5g Phenolrødt(PanReac AppliChem) til 100mL methanol for at opnå en koncentration på 0,5 % wt/vol. Neutralrødtopløsningen blev produceret ved at tilsætte 0,3g neutralrødt(panreac AppliChem) til 100mL ethanol. Bromthymolblåtopløsningen(PanReac AppliChem)var produceret og havde en koncentration på 0,1 % wt/vol Analysereagenset blev fremstillet ved at tilsætte 33,2 ml destilleret vand til 4 ml phindikatoropløsning. Analysereagenset fik tilsat Zinksulfat(VWR chemicals) til en slutkoncentration på 0,1 mmol/l. Vi justerede ph ved en gradvist tilsætning af 1N NaOH til ph var imellem 7,0 og 8,0. Herefter tilsatte vi Tianam(Merch Sharp & Dohme) til en koncentration af 6mg/ml. Kontrolreagenset blev fremstillet via overstående fremgangsmetode, uden tilsætning af Tianam. De anvendte ph-værdier for analysereagens og kontrolreagens ved hvert forsøg er beskrevet i tabel 1 Tabel 1. Analysereagenser og kontrolreagensers ph værdier. ph-indikator. ph. Analysereagens med Tianam ph Kontrolreagens Phenolrødt 8,08 7,07 Bromthymolblåt 7,48 7,46 8,08 7,07 7,48 7,46 Neutralrødt 7,5 7,5 Fremgangsmåde. Resistensbestemmelse blev foretaget ved EUCAST disk diffusions (16) Bestemmelsen blev foretaget for imipenem, ertapenem og meropenem(rosco Diagnostica A/S) hvor vi anvendte de kliniske breakpoints fra EUCASTs retningslinjer(17). Resistensbestemmelsen blev udført for at fastslå en mulig korrelation mellem resistens ved carbapenemer og Carba NP testen. Vi overførte bakteriestamme fra en Mueller-hinton plade(ssi Diagnostica) til Tris lyseringsbuffer(b-per Bacterial Protein Exstraction, Thermo Scientific). Koncentration af bakteriemasse i lyse- Side af 42

11 ringsbuffer blev bestemt ved at sammenligne tætheden med en McFarland standard på 4,0(Prolab Diagnostica). Ved Phenolrødt ph 8,08 anvendte vi 200 µl lyseringsbuffer, men vi forøgede mængden til 400 µl ved de resterende forsøg for at gøre det nemmere at vurdere en Mcfarland koncentration på 4,0. Suspensionen blev omrystet i 1 minut ved vortexapparatur(ika Vortex 1) og derefter inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Herefter blev suspensionen overført til Eppendorfrør(Eppendorf 1,5 ml) og centrifugeret(eppendorf Centrifuge 5417c) ved 3000 g i 5 minutter. Tredive µl af supernantanten blev overført til en mikrotitterplade(nunc TM ) med 100 µl af både analysereagens og kontrolreagens(se figur 1), og derefter inkuberet ved 37 o C i 2 timer. figur 1. Forsøgsdesign for ph-indikatorer ved inkubationstiden 0. Phenolrødt Bromthymolblåt Neutralrødt 30 µl af supernanten fra suspensionen der indeholdt Tris lyseringsbuffer og bakteriestamme, tilsat til 100 µl reagens ved hver brønd. I: Analysereagens med Tianam K: Kontrolreagens. Farvetolkning. Følgende kriterier til farvetolkning blev bestemt forud for forsøgenes start. 1. Prøver med carbapenemase aktivitet skulle have et klart farvesomslag ved analysereagenset, der indeholdt Tianam, hvis det skulle tolkes som positiv for carbapenemaseaktivitet. Det klare farveomslag er som følgende for hver indikator: Phenolrødt: Farveomslag fra rød til gul/orange tolkes som positiv for carbapenemase aktivitet. Bromthymolblåt: Farveomslag fra grøn til gul tolkes som positiv for carbapenemase aktivitet. Neutralrødt: Farveomslag fra mørkerød til violet tolkes som positiv for carbapenemase aktivitet (se figur 2) 2. Hvis der var farveskift ved kontrolreagenset, ville svaret blive forkastet. Side 10 af 42

12 Figur 2. Farvetolkningskriterier for analysereagenser med phenolrødt, bromthymolblåt og neutralrødt. Neutralrødt Bromthymolblåt Neutralrødt Prøve 1. Positiv Prøve 2. Positiv Prøve 3. Negativ Prøve 1. Positiv Prøve 2. Negativ Prøve 1. Positiv Prøve 2. Negativ Carba NP test med inhibitorer. På baggrund af resultatet ved ph-indikatorforsøgene valgte vi at anvende Phenolrødt til Carba NP testen med inhibitorer(cnpi). Vi ønskede at reproducere resultaterne fra Phenolrødt ph 7,07 og afprøve EDTA og tazobactam til at differentiere carbapenemasetyperne. Fremstilling af reagenser Samme fremgangsmåde til fremstilling af analyse og kontrolreagenser ved ph indikatorforsøgene blev anvendt ved produceringen af analyse og kontrolreagenser til CNPI forsøgene. I analysereagenset med med Tianam og tazobactam natrium tilsatte vi tazobactam(sigma Aldrich) til en koncentration af 4mg/ml I analysereagenset med Tianam og EDTA tilsatte vi 0,6M Kalium-EDTA(Bie & Berntsen) til en slutkoncentration på 0,1 mmol/l. Vi tilsatte ikke Zinksulfat til dette reagens da zink ioner kan inhibere EDTAs virkning. ph værdier for analysereagenser er beskrevet i tabel 2 Side 11 af 42

13 Tabel 2. Analysereagensernes ph værdier. Navn og forsøgsnummer Analysereagens ph-værdi CNPI Forsøg 1 CNPI forsøg 2 Tianam Tianam + Tazobactam Tianam + EDTA Kontrol Tianam Tianam + Tazobactam Tianam + K-EDTA Kontrol 7,11 7,11 7,22 7,11 7,41 7,41 7,2 7,41 CNPI forsøg 3 Tianam + Tianam + Tazobactam Tianam + K-EDTA Kontrol 7,17 7,17 7,12 7,17 Fremgangsmåde Vi anvendte samme fremgangsmåde til bakterielysering fra ph-indikatorforsøgene. 2 timers inkubation blev anvendt ved CNPI forsøg 1 og 2. Inkubationsperioden blev forlænget til 2,5 timer ved CNPI forsøg 3. Figur 3. Forsøgsdesign for CNPI forsøg ved inkubationstiden 0 30 µl af supernanten fra suspensionen indeholdende Tris lyseringsbuffer og bakteriestamme, tilsat til 100 µl af analysereagens ved hver brønd I: analysereagens med Tianam IT: analysereagens med Tianam og tazobactam E: analysereagens med Tianam og K-EDTA) K: Kontrolreagens Side 12 af 42

14 Farvetolkning Følgende kriterier er bestemt forud forsøgets start til klassificering af carbapenemase klasser. Klasse A: Farveomslag fra rød til gul/orange i brønd I og E Klasse B: Farveomslag fra rød til gul/orange i brønd I og IT Klasse D: Farveomslag fra rød til gul/orange i brønd I, IT og E Negativ : Intet farveomslag ved alle brønde. (Se figur 4) Farveomslag ved kontrolreagens betød at resultatet blev forkastet. Figur 4. Farvetolkningskriterier for klasse A, B og D ved CNPI forsøg. Prøve 1 Klasse A Prøve 2 Klasse B Prøve 3 Klasse D Prøve 4 Negativ I: analysereagens med Tianam; IT: analysereagens med Tianam og tazobactam; E: analysereagens med Tianam og EDTA; K: Kontrolreagens. Holdbarhedsforsøg Analyse og kontrolreagens fra phenolrødt ph 7,07 blev opbevaret ved 5 o C i fjorten dage. Reagenserne blev herefter testet for de samme bakterieprøver for at undersøge, om de kunne reproducere de samme resultater, der var opnået ved phenolrødt ph 7,07. Statistik. Diagnostisk sensitivitet og specificitet blev beregnet ved alle ph-indikator samt CNPI forsøg, hvor resultater fra hel-genom sekventering blev anvendt som den gyldne standard. (se bilag 2 for beregnings eksempel) Resultaterne blev anvendt til at udvælge den mest optimale ph-indikator for Carba NP te Side 13 af 42

15 Resultater Følgende resultatafsnit omhandler billedresultaterne fra ph-indikatorforsøg med Phenolrødt, Bromthymolblåt og Nautralrødt samt Carba NP test m. inhibitorer forsøg. ph-indikatorforsøg Billedresultater for phenolrødt 8,08 og 7,07 Phenolrødt ph 8,08 påviste 11 ud af 1 prøver carbapenemaseproducerende bakterier (CPB)hvilket gav en sensitivitet på 58 %(figur 5) Prøve 2, 4, 5, 11, 16 og 1 havde intet farveomslag. Ved prøve 6 og 12 kan der ses en rød farve med orange skær. Farvekriterierne blev ikke opfyldt hvilket resulterede i at disse to prøver blev erklæret negative for carbapenemase aktivitet. Figur 5. Resultater ved phenolrødt ph 8,08. A. Resultater for carbapenemase producerende bakterier. B. Resultater for kontrolstammerne. Figur 5: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved phenolrødt ph 8,08 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet. Numre 1-1 er CPB(se tabel 3) Numre er kontrolstammer(se tabel 4) I: række med tianam analysereagens. K: række med kontrolreagens. Sand positive er markeret med firkant og har farveomslag fra rød til gul/orange ved I-rækker. Sensitivitet % Specificitet % Kontrolstammerne havde intet farveomslag hvilket gav en specificitet på 100 %. Der er klar farveforskel mellem I og K brønde ved sande positive prøver. Side 14 af 42

16 Phenolrødt ph 7,07 påviste 14 ud af 1 prøver der var positive for carbapenemaseaktivitet og fik derfor en sensitivitet på 74 % (figur 6.) Prøve 6, 11 og 16, der var falsk negative ved phenolrødt ph 8,08 blev detekteret ved dette forsøg. Prøve 12 have svagt farveskifte, der ikke opfyldte farvetolkningskriterierne. Prøve 2, 4, 5 og 1 blev ikke påvist ved dette forsøg. Specificiteten var 100 %, fordi kontrolstammerne ikke havde et farveomslag ved I-rækker. Der er tydelig farveforskel mellem I og K brønde ved sande positive prøver. Figur 6. Resultater ved phenolrødt ph 7,07 A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier. B. Resultater for kontrolstammer Figur 6: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved phenolrødt ph 7,07 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet. Numer 1 til 1 er CPB(se tabel 3) Nummer 20 til 33 er kontrolstammer(se tabel 4) Sensitivitet % Specificitet % I: række med tianam analysereagens. K: række med kontrolreagens. Sand positive er markeret med firkant og har farveomslag fra rød til gul/orange ved I-rækker Side 15 af 42

17 Billed resultater for bromthymolblåt ph 7,48 og 7,46 Bromthymolblåt ph 7,48 påviste 15 ud af 1 prøver med carbapenemaseaktivitet hvilket gav en sensitivitet på 78 %. Prøve 2, 4, 5 og 1 blev ikke påvist. (figur 7) Figur 7. Resultater ved Bromthymolblåt ph 7,48 A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier. B. Resultater for kontrolstammer Figur 7: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved bromthymolblt ph 7,48 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet Numer 1 til 1 er CPB(se tabel 3) Nummer 20 til 33 er kontrolstammer(se tabel 4) Sensitivitet % Specificitet % I: række med tianam analysereagens. K: række med kontrolreagens. Sand positive er markeret med firkant og har farveomslag fra grøn til gul ved I-rækker Kontrolstammer havde intet farveudslag hvilket gav en specificitet på 100 %. Reagenset har et transparent udseende og farveforskellen mellem I og K brønde er ikke tydelig. Side 16 af 42

18 Bromthymolblåt ph 7,46. påviste ud af 1 prøver med carbapenemase aktivitet, hvilket gav en sensitivitet på 47 % (Figur 8). Prøve 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11,12 16 og 1 havde intet farveomslag ved.. Der var intet farveudslag ved kontrolstammerne og specificiteten blev 100 %. Farveforskellen mellem I og K brønde er ikke tydelig og reagenset har transparent udseende. Figur 8. Resultater ved Bromthymolblåt ph 7,46 A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier. B. Resultater for kontrolstammer. Figur 8: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved bromthymolblt ph 7,46 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet Nummer 1 til 1 er CPB(se tabel 3) Nummer 20 til 33 er kontrolstammer(se tabel 4) Sensitivitet % Specificitet % I: række med tianam analysereagens. K: række med kontrolreagens. Sand positive er markeret med firkant og har farveomslag fra grøn til gul ved I-rækker Side 17 af 42

19 Billede resultater for Neutralrødt ph 7,5 Neutralrødt ph 7,5 påviste 1 ud af 1 prøver med CPB hvilket gav en sensitivitet på 0,5 % (figur ) Prøverne fra 1 til 17 samt nr. 1 havde intet farveomslag. Prøve 18 var violet ved I-rækken og kunne tolkes som positiv for carbapenemase aktivitet. Ydermere ses der svagt farveomslag ved prøve 13, men farveomslaget opfylder ikke farvetolkningskriterierne. Kraftigt bundfæld i I og K rækker kunne observeres ved prøverne 1, 3, 4,, 14, 15 og 18. Figur. Resultater ved Neutralrødt ph 7,5 A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier B. Resultater for kontrolstammer Figur : Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved Neutralrødt ph 7,58 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet Nummer 1 til 1 er CPB(se tabel 3) Nummer 20 til 33 er kontrolstammer(se tabel 4) I: række med tianam analysereagens. K: række med kontrolreagens. Sand positive er markeret med firkant og har farveomslag fra mørkerød til violet ved I-rækker Senitivitet % Specificitet % 0,5 N/A Der ses tydelig farveforskel ved alle prøver efter 2 timers inkubation i forhold til 0 timers inkubation (figur 2), hvor prøverne er gået fra mørkerød til lysorange. Specificitet kunne ikke beregnes ved dette forsøg, da kontrolstammer viste forskellige udfald som ikke opfyldte farvetolkningskriterierne. Prøve 21, 22, 23, 26, 27, 28 og 2 havde kraftigt bundfæld ved både I og K rækker Side 18 af 42

20 Carba NP test m. inhibitorer CNPI forsøg 1 påviste 7 ud af 1 prøver, der havde carbapenemaseaktivitet, hvilket gav en sensitivitet på 36 % (figur 10) Forsøget påviste to prøver med klasse A carbapenemaser. De resterende fem var fra klasse B. Det lykkedes ikke at påvise prøver med klasse D carbapenemaser ved dette forsøg. Forsøget kunne påvise en specificitet på 100 % i det ingen kontrolstammer havde farveomslag. Figur 10. Resultater ved Carba NP test m. inhibitorer nummer 1. A. Resultater for carbapenemaseproducerende stammer. B. Resultater for kontrolstammer. Figur 10: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved CNPI forsøg 1 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet. I: analysereagens med tianam; IT: analysereagens med tianam og tazobactam; E: analysereagens med tianam og EDTA K: kontrolreagens Prøve 1 til 1 er CPB (se tabel 3) Prøve er kontrolstammer (se tabel 4) Sensitivitet (%) Specificitet (%) Sand positive er markeret med firkant. Klasse A har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I og E Klasse B har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I og IT Klasse D har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I, E og IT Side 1 af 42

21 CNPI forsøg 2 påviste 15 ud af 1 prøver med carbapenemase aktivitet og fik en sensitivitet på 78 % (figur 11) Alle 3 prøver med klasse A carbapenemase blev detekteret. Testen detekterede 12 ud af 13 prøver med klasse B carbapenemase, hvoraf prøve 5 ikke blev detekteret. Testen kunne ikke detektere klasse D carbapenemaser. Forsøget påviste en specificitet på 100, da ingen kontrolstammer havde farveomslag. Figur 11. Resultater ved Carba NP test m. inhibitorer forsøg 2. A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier. B. Resultater for kontrolstammer. Figur 11: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved CNPI forsøg 2 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet. I: analysereagens med tianam; IT: analysereagens med tianam og tazobactam; E: analysereagens med tianam og EDTA K: kontrolreagens Prøve 1 til 1 er CPB (se tabel 3) Prøve er kontrolstammer (se tabel 4) Sand positive er markeret med firkant. Klasse A har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I og E Klasse B har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I og IT Klasse D har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I, E og IT Sensitivitet (%) Specificitet (%) Side 20 af 42

22 CNPI forsøg 3. påviste 17 ud af 1 prøver med carbapenemase aktivitet (figur 12) Alle prøver med klasse Aog B blev detekteret. Testen påviste en prøve med klasse D carbapenemase. Kontrolstammerne havde intet farveudslag ved dette forsøg, hvilket gav en specificitet på 100 % Figur 12. Resultater ved Carba NP test m. inhibitorer forsøg 3. A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier. B. Resultater for kontrolstammer Figur 12: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved CNPI forsøg 3 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet. I: analysereagens med tianam; IT: analysereagens med tianam og tazobactam; E: analysereagens med tianam og EDTA K: kontrolreagens Prøve 1 til 1 er CPB (se tabel 3) Prøve er kontrolstammer (se tabel 4) Senstivitet (%) Specificitet (%) Sand positive er markeret med firkant. Klasse A har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I og E Klasse B har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I og IT Klasse D har farveomslag fra rød til gul/orange ved brønd I, E og IT Side 21 af 42

23 1Tabel 3. Resultater ved Carba NP test m. inhibitorer for carbapenemase producerende bakterier. Carbapenemase klasse (prøvenummer.) Slægt og art β-lactamaseprofil Resistenszone (mm) Klasse ifl. Carba NP test m. inhibitorer IMP MER ERT A, B, D eller negativ (-) Klasse A (3)K. pneumonia (6) K. pneumonia (13)K. pneumonia KPC-3 + SHV + TEM KPC KPC A A A Klasse B (1) E. coli (5) Ps. Aeruginosa (7) K. pneumonia (8) K. pneumonia () C. freundii (10) E. coli (11) A. baumanii (12) E. coli (14) C. freundii (15) C. freundii (16) A. baumaniik (17) K. pneumonia (18) E. coli VIM-4 VIM NDM NDM + CTX-M CMY-2 NDM VIM-1 + CTX-M grp1. + TEM NDM VIM-4 NDM NDM NDM NDM NDM B B B B B B B B B B B B B Klasse D (2) E. coli (4) Ukendt (1) K. pneumonia OXA-48 + TEM OXA-48 OXA D - - Tabel 3. Oversigt over udfaldet for Carba NP testen m. inhibitorer for carbapenemase producerende bakterier. Prøverne er inddelt i carbapenemase klasse hvor deres prøvenummer fra figur 5 til 12 samt slægt og art er beskrevet. Prøvernes β- lactamase profil som er detekteret via hel genom sekventering er inkluderet. Bakteriernes følsomhed overfor imipenem, meropenem og ertapenem beskrives via farvekoder hvor: Gul: Resistent Grøn: Intermediær Ingen farve: Sensitiv Turkis: Breakpoints ikke angivet. Det samlede resultat fra CNPI forsøg 1,2 og 3 er noteret enten som klasse A, B, D eller negativ for testene. Side 22 af 42

24 Tabel 4. Resultater ved Carba NP test m. inhibitorer for kontrolstammer. β-laktamase type (Prøvenr.) Slægt og art β-laktamaseprofil Resistenszone (mm) Klasse ifl. Carba NP test m. inhibitorer IMP MER ERT A, B, D eller negativ(-) ESBL (5) E. coli (7) E. coli (15)E. coli (17)K. pneumonia VEB-1 TEM-52 CTX-M grp 1. CTX-15 + SHV ESBL + reduceret cellevægspermabilitet (24) E. coli (25) Kl. oxytoca CTX-M grp 1. CTX-M grp 1. + TEM AmpC (3) K. pneumonia (13)E.coli (2)K. pneumonia (13)E. coli DHA-1 CMY-2 Wild type AmpC + reduceret cellevægspermabilitet ()23 Ps. Aeruginosa Kromosomal AmpC Porintab (12) Ps. aeruginosa (21) Ps. Aeruginosa Carbapenemase MBL, OXA og KPC negativ (22)Ps. aeruginosa (23)Ps. aeruginosa Tabel 4. Oversigt over udfaldet fra Carba NP testen m. inhibitorer for kontrolstammerne. Prøverne er inddelt i β-lactamase type hvor andre resistensmekanismer også er inkluderet. Prøvenummer fra figur 5 til 12 er beskrevet samt bakteriernes slægt og art. β-lactamase profilen der er detekteret via hel genom sekventering er inkluderet. Bakteriernes følsomhed overfor imipenem, meropenem og ertapenem beskrives via farvekoder hvor: Gul: Resistent Grøn: Intermediær Ingen farve: Sensitiv Turkis: Breakpoints ikke angivet. Det samlede resultat fra CPNI 1,2 og 3 er noteret enten som klasse A, B, D eller negativ for testene. Side 23 af 42

25 Holdbarhedsforsøg Analyse og kontrolreagens fra Phenolrødt ph 7,07 var blevet opbevaret ved 5 o C i fjorten dage og testet udefra samme fremgangsmåde ved Phenolrødt ph 7,07. Vi fandt her 0 ud af 1 prøver med carbapenemase aktivitet og fik derfor en sensitivitet på 0 % (figur 13) Kontrolstammerne havde intet farveomslag hvilket vil give en specificitet på 100 % Figur 13. Resultater ved holdbarhedsforsøg for Pphenolrødt ph 7,07 A. Resultater for carbapenemaseproducerende bakterier B. Resultater for kontrolstammer Figur 13: Oversigt over resultaterne for CPB og kontrolstammer ved holdbarheds forsøget med Phenolrødt ph 7,07 med beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet. Numre 1-1 er CPB(se tabel 3) Numre er kontrolstammer(se tabel 4) I: række med tianam analysereagens. Sensitivitet (%) Specificitet (%) K: række med kontrolreagens. Sand positive er markeret med firkant og har farveomslag fra rød til gul/orange ved I-rækker Side 24 af 42

26 Diskussion ph-indikatorforsøg Phenolrødt Sensitiviteten ved Phenolrødt ph 8.08 på var lavere i forhold til Phenolrødt ph 7,07. Ved at reducere ph-værdien ved Phenolrødt ph 7,07 med 1,01 påviste vi flere carbapenemase-producerende bakterier. Ændring af ph påvirkede ikke specificiteten, da alle kontrolstammerne var negative. Farveomslagene ved sande positive prøver var tydelige og dermed god til visuel tolkning. Den tydelige farveforskel mellem I og K brønde gjorde Phenolrødt til den ideelle indikator for Carba NP testen. Testen kunne ikke producere en sensitivitet på 100 % som Nordman et al. hvor de også anvender Phenolrødt(7). Bromthymolblåt Bromthymolblåt ph 7,48 påviste højere sensitivitet på 78 % i forhold til Bromthymolblåt ph 7,46 som påviste en sensitivitet på 47 %. Forskellen på ph ved de to forsøg var 0,02 og derved af ingen betydning. Andre fejlkilder har haft indvirkning på resultatet ved Bromthymolblåt ph 7,46. Kontaminering ved Mueller hinton pladerne er en mulighed. Fejl ved udsåningsproceduren gjorde at prøver der blev anvendt til Bromthymolblåt ph 7,46 kunne være kontamineret hvilket havde interfereret med testen.. Farveomslagene ved Bromthymolblåt forsøgene kunne ses ved visuelt, men farverne var transparente hvilket gjorde det problematisk, at vurdere farveforskellen mellem analysereagenset med tianam og kontrolreagenset.(figur8 og 7) Vores Bromthymolblåt forsøg kunne ikke producere en sensitivitet på 100 %. Pires et al. kunne med Blue-Carba testen påviste en sensitivitet på 100 %. Her anvendte de bromthymolblåt som ph-indikator. De angav her et reagens som havde en mørkeblå farve ved ph 7,00(15). Reagenset ved Bromthymolblt ph 7,48 og 7,46 havde en grøn/turkis farve ved en ph der var højere. (Figur 1) Det kan være en fejlmåling af ph da vi tilsatte NaOH til vores reagens, som har betydet at ph var lavere end antaget. Den mørkeblå farve som produceres ved reagenset i Pires et al. er fordelagtig til farvetolkning fordi der er tydelig farveforskel mellem I og K brønde, ved deres forsøg.(15) Neutralrødt Neutralrødt ph 7,5 havde den laveste sensitivitet af alle ph-indikatorforsøgene på 0,5 %. Prøve 18 fik et farveomslag der opfyldte farvetolkningskriterierne og gav mulighed for at Neutralrødt kunne anvendes til carba NP testen. Den lave sensitivitet kan skyldes kontaminering ved bakteriepladerne, Side 25 af 42

27 fordi vi anvendte de samme bakterieprøver fra bromthymolblåt ph 7,46. Analyse - og kontrolreagenset dannede bundfæld i mikrotitterpladerne efter 2 timers inkubation i varmeskab. Bundfældet kunne stamme fra ph-indikatoren, da den ikke var opløst i reagenserne. Vi observerede den sammenhæng mellem bundfæld og ændret farveintensitet da prøver med bundfæld havde ændret farve i reagenset fra mørkerød til lysorange.(figur ) Valg af ph indikator til Carba NP test m. inhibitorer Vi valgte at anvende phenolrødt som ph-indikator til Carba NP testen m. Inhibitorer (CNPI) fordi farveomslagene ved de sande positive var bedre til visuel vurdering end farveomslagene ved bromthymolblåt - og neutralrødt reagenserne. Bromthymolblåt ph 7,48 havde påvist den højeste sensitivitet af alle ph- indikatorforsøg på 78 %. Sensitiviteten ved Phenolrødt ph 7,07 var 74 %. Prøve 12 blev ikke detekteret ved Phenolrødt ph 7,07 fordi farveomslaget(figur 6) ikke opfyldte farvetolkningskriterierne(figur 1). Farveomslaget ved prøve 12 opfyldte farvetolkningskriterierne for Bromthymolblåt ph 7,46 hvilket var årsagen til en højere sensitivitet ved Bromthymolblåt ph 7,46 i forhold til Phenolrødt 7,07. Carba NP test m. inhibitorer Det var essentielt at denne test kunne reproducere de samme resultater, der var gældende for Phenolrødt ph 7,07 da det var på baggrund af dette forsøg, at valget af ph-indikator var foretaget. Carba NP test m. inhibitorer(cnpi) forsøg 1 kunne ikke reproducere de samme resultater, der var påviste ved Phenolrødt ph 7,07. CNPI forsøg 1 havde en sensitivitet på 36 %. Fejl ved udsåningsproceduren betød, at vores prøver ikke bestod af renkulturer. Fejlen blev rettet ved CNPII forsøg 2. Dette forsøg reproducerede det ønskede resultat fra Phenolrødt ph 7,07. Testen kunne dog ikke påføre et farveskift ved prøve 2, 4 og 1 som havde klasse D carbapenemaser. En klasse B type blev ikke detekteret (se figur 11)hvilket også var gældende ved Phenolrødt ph 7,07(se figur 6). Testen påviste carbapenemase aktivitet ved prøve 12, som ikke var mulig at detektere ved Phenolrødt ph 7,07. Prøve 12 havde voldt problemer ved ph-indikatorforsøgene, fordi det kun lykkedes at fremkalde et farveskift, der levede op til farvetolkningskriterierne(se figur 5 og 6). Årsagen til farveskiftet ved prøve 12 er uklar. CNPII forsøg 2 har en ph værdi ved analysereagenset med Tianam på 7,41. Phenolrødt ph 7,07. Det indikerer, at ph ikke har haft en betydning for farveskiftet, da en højere ph i analysereagens forlænge reaktionstiden da ph-falde skal mere før farveomslaget forekommer. Hvis ph var den parameter, der påvirkede reaktionstiden, burde et farveskift ved prøve 12 Side 26 af 42

28 også forekomme ved Phenolrødt ph 7,07, fordi ph er lavere, og farveomslaget vil derfor kræve kortere inkubationstid. Mængden af enzym er også en paramter, der påvirker reaktionstiden(need kilde). Vi anvender en McFarland standard på 4,0 til at vurdere mængden af bakteriestamme i lyseringsreagenset. Dette bliver gjort via visuel vurdering og ikke altid af den samme fagperson ved alle forsøg. Det kan være fejlkilder, der har medført, at enzymmængden i prøve 12 var større ved CNPII forsøg 2 end Phenolrødt ph 7,07. CNPII forsøg 3 påviste den højeste sensitivitet (84 %) af alle ph-indikator samt CNPI forsøg, der var undersøgt ved dette projekt. Inkubationstiden var forlænget med 30 minutter ved CNPI forsøg 3. Forlængelse af inkubationstiden farveomslag der opfyldte farvetolkningskriterierne en prøve med klasse D carbapenemase samt en prøve med klasse B carbapenemase(prøve: 5). Prøverne var falsk negative igennem hele projektet. Testen kunne ikke detektere de to resterende prøver med klasse D carbapenemaser(prøve: 4 og 1). Manglende farveomslag ved prøver med klasse D carbapenemase kunne observeres hele projektet og var en af årsagerne til, at phindkator samt CNPI forsøgene ikke kunne påvise en sensitivitet på 100 %, som var tilfældet ved Nordman et al og Dortet el al studierne. Disse studier havde inkluderet prøver med klasse D carbapenemaser uden at påvise falsk negative resultater(1,7).. Klasse D carbapenemaser, som inkluderer OXA typerne, har generel lav katalytisk aktivitet overfor imipenem. Typerne OXA-48, OXA-54 samt en usekventeret OXA-type de eneste klasse D typer, der har en signifikant højere katalytisk aktivitet overfor imipenem(18). Den katalytiske aktivitet er lavere ved OXA-48, hvis den sammenlignes med Klasse A carbapenemasen KPC-3. Enzymers katalytiske egenskaber overfor et given substrat omtales som steadystate kinetic parameters og er defineret som K m /K cat (mm -1 s -1 )(18). KPC-3 K m /K cat værdier over for imipenem er 150 mm -1 s -1 (21). OXA-48 har en K m /K cat værdi over for imipenem på 145 mm -1 s -1 (1). Det betyder, at OXA-48 hydrolyserer imipenem ved lavere hastighed end KPC-3. Vi observerede denne forskel ved alle ph-indkator samt CNPI forsøg. Farveomslaget ved prøve 3, som er en KPC- 3, skiftede fra rød til gul efter 2 timers inkubation, mens intet farveomslag kunne observeres ved prøver med OXA-48 efter 2 timers inkubation. Manglende detektion af prøve 5 var også tendens ved hele projektet. Prøve 5 er en klasse B cabapenemase af typen VIM. VIM typer har lave K m /K cat værdier i forhold til NDM og KPC typer (20, Side 27 af 42

29 21). Vi kunne påvise prøve 5 ved at forlænge inkubationstiden med 30 minutter. Den ekstra inkubationstid var ikke nødvendig for prøve 1, 10 og 12, som også er VIM typer. Ved CNPII forsøg 3 havde disse tre prøver gult farveomslag i modsætning til prøve 5, der havde et orange farveomslag, hvilket betød, at prøve 5 hydrolyserede imipenem langsommere. Det indikerer enten en forskel på enzymmængden i brøndende eller biologisk variation ved VIM typerne, der giver dem forskellige aktivitetsniveauer. Vasoo et al. diskuterede VIM typernes lave aktivitets niveau. De fandt en sammenhæng mellem VIM typer og langsomme farveomslag ved Carba NP testen og mente, det var på grund af VIM typernes lave K m /K cat værdier i forhold til andre klasse B carbapenemaser(22). Problemer ved detektion carbapenemaser med lav aktivitet er forekommet ved andre studier, der har valideret Carba NP testen. Tijet et al. fandt problemer ved bakteriestammer med OXA-48 typer. De påviste en sensitivitet på 72,5 % ved Carba NP testen, hvilket skyldes manglende farveomslag hos bakteriestammer med OXA-48 enzymer. De forøgede mængden af bakteriemasse og anvendte zirconia beads til at effektivisere lyseringsproceduren. Ændringerne fremkaldte farveomslag ved femten prøver med OXA-48 typer, som var falsk negative ved tidligere forsøg, og sensitiviteten blev forbedret til 80 % (22). Mængden af bakteriestamme, der tilsættes til lyseringsreagenset, er en vigtig faktor, der skal overvejes hvis Carba NP test skal detektere carbapenemase typer med lav aktivitet over for carbapenemer. Zirconia beads bliver anvendt ved Tijet et al studiet for at effektivisere lyseringseffekten.(22) Andre reagenser kan også anvendes til lyseringsproceduren. Et studie, der havde til formål at udvikle en Carba NP test til detektion af carbapenemase aktivitet i Acninetobacter spp. Fastslog, at den originale Carba NP test ikke var følsom nok til at detektere carbapenemase aktivitet fra Klasse D carbapenemaser da deres hydrolyseringseffekt var for svag til at blive detekteret.. De modificerede Carba NP testen ved at anvende Natriumchlorid (NaCl) i stedet for Tris lyserinsbuffer.(23) Dette eliminerede buffereffekten, som kunne have en negativ virkning på analysen. De fandt en sensitivitet og specitivitet på henholdsvis. 4,7 % og 100 % ved denne test, som de døbte CarbAcineto testen. Dette var væsentlig højere end for Carb NP testen, hvor de fik en sensitivitet og specificitet på 11, % og 100 %. Carba NP testen fandt alle klasse B typer, men kunne ikke detektere GES eller OXA typer. CarbAcineto testen fandt til gengæld alle carbapenemasetyperne med undtagelse af få GES typer. Dette indikerer, at buffereffekten fra Tris lyseringsbuffer kan hæmme detektionen af carbapenemaser med lav aktivitet. (23) Regulering af substratmængden er en mulighed for optimering. Vasoo et al udførte forsøg med Carba NP testen, hvor de forøgede mængden af imipenem til 6 mg/ml. Analysereagenset blev derud- Side 28 af 42

30 over tilsat direkte til Tris lyserinsbufferen med bakteriestamme og derefter omrøstet i fem sekunder. Hermed blev centrifugeringsproceduren ekskluderet. Disse ændringer gjorde, at de kunne påvise carbapenemase typer, som havde været negative ved en Carba NP test, hvor imipenem koncentration på 3 mg/ml(21) CarbAcinto testen anvendte ligeledes en koncetration af imipenem ved 6mg/ml. De diskuterede dog ikke fordelen ved den forøgede substrat koncentration. (23) Interferens fra andre resistensmekanismer. Specificiteten ved alle CNPI forsøg var 100 %, da farveomslag ikke forekom ved kontrolstammerne. Kontrolstammerne havde andre resistensmekanismer, hvoraf nogen medvirkede til resistens overfor flere carbapenemer men disse stammer forårsagede ikke farveomslag ved CNPI testene. Lignende resultater kunne opserveres ved Nordmann et al. og Dortet et al. som påviste en specificitet på 100 % ved kontrolstammer med andre resistensmekanismer.(1, 7) Tazobactam og EDTAs effekt ved Carba NP test m. inhibitorer. Tazobactam inhiberede klasse A carbapenemaserne effektivt. Prøver med klasse A ikke kunne hydrolysere imipenem ved i IT brønde, som derved forblev røde. Dortet et al. reporterede lignende resultater for tazobactam med sensitivitet på 100 % for klasse A carbapenemaser (1) Farveskift forekom ikke ved E brøndennde for bakterier med klasse B carbapenemase. Det indikerer, at EDTA inhiberer disse metallo-enzymer effektivt og er brugbar til klassificering af klasse B carbapenemaser. Peter et al. har også påvist gode inhibitor egenskaber for EDTA. Med en sensitivitet og specificitet på 3,3 % og 6,6 % lykkedes det dem at detektere og klassificere de fleste kliniske prøver med klasse B carbapenemaser. De observerede dog blev inhiberet tilstrækkelig ved alle prøver, hvor brønde med imipenem og EDTA fik et farveomslag efter 2 timers inkubation(6). Vi observerede ikke den manglende inhibition, da samtlige prøver med Klasse B carbapenemase forblev røde ved E brønde, selv efter 2,5 timers inkubation. Carba NP testens kliniske anvendelighed Carba NP testen har vist glimrende resultater ved klasse A carbapenemaser. Specielt KPC er en carbapenemase type, der kan detekteres ved denne test(7, 1, 22). Typen er den mest almindelige klasse A, der findes i klinisk sammenhæng(12). Testen er også effektiv til at detektere klasse B carbapenemase(3, 4, 13) reporteret udbrud af bakterier med klasse B carbapenemaser globalt(8) og det er essentielt, at der udvikles en test, der kan detektere disse carbapenemaser inden for en kort svar- Side 2 af 42

31 tid. Carba NP testen tilbyder en analyse, der kan detektere carbapenemaseproducerende bakterier med kort svartid og høj sensitivitet og specificitet i forhold til de fænotypiske metoder som den modificerede hodge test, KPC+MBL confirm kit og MASTDIS ID carbapenemase test (22). Testen er enkelt at udføre og kan implementeres til ressourcefattige laboratorier, der ikke kan anvende de molekylærdiagnostiske metoder, som er dyre og har længere svartid(1). Ved at inkludere tazobactam og EDTA kan testen anvendes til at differentiere carbapenemase klasserne, hvor især klasse A og B kan detekteres ved brug af tazobactam og EDTA(1). Mikrobiologiske laboratorier, der har høj forekomst af bakterier med OXA-48 typer eller andre CPB med lave katalytisk aktivitet, bør overveje om implementering af Carba NP testen kan være en fordel. De forskellige optimeringsforslag, der angives i dette projekt, bør overvejes, hvis Carba NP testen skal anvendes til at detektere klasse D carbapenemaser og andre carbapenemaser med lav katalytisk aktivitet. Ulempen ved CNP er den arbejdsbyrde, det kræver at fremstille testen. Reagensfremstillingen er en procedure, der kræver tid og reagensernes holdbarhed er ikke undersøgt. Vi undersøgte holdbarheden ved analyse og kontrolreagenset for Phenolrødt ph 7,07 efter opbevaring i fjorten dage ved 5 o C. Analysereagenset kunne reproducere resultaterne fra Phenolrødt ph 7,07, da ingen prøver fik farveomslag. anvendes til diagnostisk brug, er det nødvendigt at undersøge, hvordan holdbarheden ved reagenset kan forlænges. Österblad et al. Oplevede, at imipenem i deres analysereagens degraderede hurtigt selvom det blev opbevaret ved -70 o C(22). Det indikerer at opbevaring på frys ikke er tilstrækkeligt for at få en Carba NP test med lang holdbarhed. Alternativet til Carba NP testen er Rapid CARB Screen kit(rcs) fra ROSCO Diagnostica. Rapid CARB Screen kit detekterer hydrolysering af β-lactamringen ved et carbapenem via et farveomslag fra en ph-indikator. Imipenem og ph indikator er samlet i en tablet, der tilsættes til enzymsuspensionen bestående af 50 µl Tris lyserinsbuffer og 100 µl saline opløsning.(26) Huang et al. har lavet en komparativ analyse af Carba NP testen(cpn) og Rapid CARB Screenkit(RCS). RCS påviste end højere sensitivitet på 8 % end CPN med en sensitivitet på 7 %. Specificiteten var dog lavere ved RCS. Testen havde en specificitet 83 % hvor CPN havde en på 100 %. Det skyldes bland andet, at RCS producerede resultater, der ikke kunne tolkes, fordi tabletten ikke blev opløst. Derudover var der farveomslag, der ikke opfyldte kriterierne(25). RCS tilbyder en procedure, der er nemmere at udføre end ved CNP, da det ikke er nødvendigt at producere et analysereagens, hvor forskellige Side 30 af 42