Specialeforsvar Biogene Aminer i

Transkript

1 Specialeforsvar Biogene Aminer i Dansk Vin Ved: Steinar Solli Albretsen Vejleder: Professor Steen Honoré Hansen Dias 1

2 Overblik Formål Biogene Aminer (BA) i vine Vinbrygning Resultater og Diskussion Konklusion Perspektivering Dias 2

3 Formål At undersøge indholdet af BA i danske rødvine Udvikling af metode Optimering af metode Validering af metode Dias 3

4 Biogene Aminer Forbindelser med relativt lav molekylvægt Er toksiske, enten direkte eller indirekte. Forekommer i levnedsmidler der er fremstillet ved fermentering Dias 4

5 Vinbrygning i 1. Vindruer høstes 2. Stilkerne fjernes og og druerne knuses Dias 5

6 Vinbrygning i igen 3. Gærceller tilsættes tt (fermentation) 4. Drueblandingen presses Dias 6

7 Vinbrygning i igen, igen 5.Mælkesyrebakterier kt tilsættes (Malolaktisk Fermentation ti MLF) 6.Vinen sættes til lagring Dias 7

8 Malolaktisk fermentation (MLF) årsag til BA i vin? Dias 8

9 Aminosyrer i druer materiale for BA syntese Histidin Tyrosin Phenylalanin TILGÆNGE- LIGE AMINO -SYRER Ornithin Tryptophan Lysin Arginin Dias 9

10 Biogene aminer deriveret fra aminosyrer HISTAMIN TYRAMIN PHENETHYL- AMIN SPERMIDIN Histidin Tyrosin Phenylalanin SPERMIN TRYPTAMIN TILGÆNGE- LIGE AMINO -SYRER Ornithin PUTRESCIN Arginin AGMANTIN Tryptophan p Lysin SEROTONIN CADAVERIN Dias 10

11 Malolaktisk l k fermentation ti O OH NH 2 HO tyrosin NH 2 -CO 2 HO tyramin O H 2 N ornithin NH 2 OH -CO 2 H 2 N putrescin NH 2 O H 2 N OH H 2 N NH 2 lysin NH 2 -CO 2 cadaverin O OH NH 2 NH 2 -CO 2 Dias 11 phenylalanin phenethylamin

12 Analyse af BA BA udviser ikke fluorescens, og absorberer UV lys i ringe grad Molekyler l kan påføres overstående egenskaber, ved derivatisering BA kan separeres med UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) Dias 12

13 Dias 13 Derivatisering i - AQC fra Waters

14 Derivatisering i af Aminer/Aminosyrer i Dias 14

15 Waters - Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Dias 15

16 Dias 16 Pumpe (Binary Solvent Manager)

17 Dias 17 Autoinjektor (Sample Manager)

18 Dias 18 Kolonne

19 UPLC kontra HPLC Mindre partikelstørrelse i UPLC kolonner Kræver højere pumpetryk Resulterer i effektiv separation af signaler Dias 19

20 Kolonnematerialer l C18 kolonne R 1 O SiH O 18 R 1 Phenyl-hexyl kolonne R 1 O SiH O 6 R 1 Dias 20

21 C18 kolonne (øverst) kontra Phenyl kolonne (nederst) Dias 21

22 Dias 22 UV detektor (PDA)

23 Dias 23 Fluorescens detektor (FLR)

24 Dias 24 Massespektrometer t (SQ)

25 1000xBA EUx 10e Indledende d d Forsøg His 3.06 Tyr? EtOH Put Cad Phe 7.31 IS 7.51 FLR 1000xBA AU 1000xBA1 UV % MS Dias 25

26 Vin tilsat t BA standarder d xC (2) ACQUITY FLR ChA Ex266,Em473 nm 0.75 Range: x 10e Put Phe Cad 7.32 His Tyr IS xC (1) PDA Ch1 247nm@4.8nm Range: EU AU xC 1: SIR of 9 Channels ES TIC 3.55e7 % Time FLR UV MS Dias 26

27 Anvendelse af detektorerne UV og FLR detektorer gav tydelige signaler. FLR detekterede udelukkende fluorescerende stoffer - specificitet MS gav signaler samt identifikation Dias 27

28 Histamin i Serie No. SQD: B07SQD071R 2x 326 (2.818) Cm (319:335-(290: :452)) Nov :52:10 1: Scan ES e M+D+H= = 282 % Histamin Molekylvægt 111 Dias m/z

29 2x 653 (5.645) Cm (649:661) 100 Putrescin Serie No. SQD: B07SQD071R Nov :52:10 1: Scan ES+ 1.97e M+2xD+H= 88+2x170+1 = 429 H 2 N NH 2 % Putrescin Molekylvægt: m/z Dias 29

30 Etanol 2x 638 (5.515) Cm (629:647) Serie No. SQD: B07SQD071R 20-Nov :52:10 1: Scan ES+ 3.38e M+D+H= = 217 % Etanol Molekylvægt: m/z Dias 30

31 Detektion med SIR (Single Ion Recording) xC (2) ACQUITY FLR ChA Ex266,Em473 nm x Range: xC (1) PDA Ch Range: xC 10: SIR of 1 Channel ES TIC (IS2) 3.11e xC 9: SIR of 1 Channel ES+ 98 TIC (Phenethylamin) 9.60e xC 8: SIR of 1 Channel ES TIC (Cadaverin2) 4.96e xC 7: SIR of 1 Channel ES TIC (Putrescin2) 5.53e xC 6: SIR of 1 Channel ES TIC (Tyramin) 4.47e xC 3: SIR of 1 Channel ES TIC C( (Histamin) e6-2 Time EU x 10e4 AU % % % % % % Dias 31

32 Eksperimentelt / Resultater t Indledende UPLC analyser Vine Bestemmelse af BA i vin Bestemmelse af BA i brygnings proces Metode Bestemmelse af BA i druer med og uden skimmel Matrix effekt Flow BA- standarder Recovery LOD & LOQ Reproducerbarhed Standardkurve Afsmitning Dias 32

33 Indledende d d analyser og problemer Masi Campotiorin2 i Sm (SG, 2x2) 2) (2) ACQUITY FLR ChA Ex266,Em473 E nm 3.17 Range: Area EU x 10e Masi Campotiorin2 Sm (SG, 2x2) (1) PDA Ch1 247nm@4.8nm Range: 1e Area 1.0e e Masi Campotiorin2 3: SIR of 1 Channel ES TIC (Histamin) e5 AU % Time Separation at af Histamin Dias 33

34 Indledende d d analyser og problemer igen Standard (2) ACQUITY FLR ChA Ex266,Em473 nm 7.16 Range: EU x 10e Standard (1) PDA Ch1 247nm@4.8nm Range: AU Standard % : Scan ES+ TIC 6.90e Time Dobbeltderiverede e ede BA Dato og klokkeslæt Dias 34

35 Indledende analyser og problemer igen igen 1000xBA EUx10e4 1000xBA AU xBA % Etanol signal IS og Phenethylamin eluering samtidigt Dias 35

36 Validering i Afsmitning Linearitet (Standardkurve) Reproducerbarhed Matrix effekt (Standardadditionskurve) LOD og LOQ Recovery Dias 36

37 Vinanalyser Indhold af BA i Danske og udenlandske vine Dannelse af BA under vinbrygning af Danske vine BA i friske druer, og i druer med skimmel Dias 37

38 Histamin i i vin Histamin i vin Histamin Shiraz 2003 potiorin 2005 Nugan S 005 Zintaudel Masi Campo Sweet Blue Skærsøgård ård Gold Top Skærsøgård rd Silver Top Leon Millot Skaller 2008 Leon Millot Rose 2008 Rondo Skaller 2008 Bardo Maglietta Rossa 2004 Bishop Shiraz 2006 Gigondas Cuvee Pre Iron Stone 200 Prestige 2006 Vine Sweet Gold Skærsøgård S Skaller 2008 Skærsøgård S n Rosé 2008 Stengården S Stengården gården 2008 gården 2007 Stengå Koncentration (mg/l) Stengå Dias 38

39 Histamin i i vin Grænseværdier i europa: Tyskland (2 mg/l) 7 Frankrig (8 mg/l) Schweiz (10 mg/l) Belgien (5-6 mg/l) Ikke farlige mængder Histamin Koncen ntration (mg/l L) Histamin i vin Histamin 0 Bardo Maglietta Rossa 2004 Bishop Shiraz Gigondas 2006 Cuvee Prestige 2006 Iron Stone 2005 Zintaudel Masi Campotiorin 2005 Nugan Shiraz 2003 Vine Dias 39

40 Tyramin i vin Tyramin i vin Tyramin Shiraz 2003 potiorin 2005 Nugan S 005 Zintaudel Masi Campo Iron Stone 200 d Sweet Blue Skærsøgår ård Gold Top Skærsøgård Silver Top Leon Millot Skaller 2008 Leon Millot Rose 2008 Rondo Skaller 2008 Bardo Maglietta Rossa 2004 Bishop Shiraz 2006 Gigondas Cuvee Pre Prestige 2006 Vine d Sweet Gold Skærsøgård S Skaller 2008 Skærsøgård S n Rosé 2008 Stengården S gården 2008 gården 2007 Steng Stengården Koncentration (mg/l) Steng Dias 40

41 Putrescin i vin Putrescin i vin Putrescin an Shiraz 2003 mpotiorin 2005 Nuga øgård Gold Top Skærsøg gård Silver Top Leon Millot lot Skaller 2008 Leon Millot Rose 2008 Rondo Skaller 2008 Bardo Maglietta Rossa 2004 Bishop Shiraz 2006 Gigondas Cuvee e Prestige 2006 Iron Stone Zintaudel Masi Cam ård Sweet Blue Skærsøg ård Sweet Gold Skærsøgår en Skaller 2008 Skærsøgår den Rosé 2008 Stengården tengården 2008 Stengård tengården 2007 Ste Ste Dias 41 Vine Koncentration (mg/l) )

42 1,4 12 1,2 1 0,8 06 0,6 0,4 0,2 0 Cadaverin i vin Cadaverin i vin Cadaverin Shiraz 2003 potiorin 2005 Nugan S Skærsøgård S Sweet Gold Sweet Blue Skærsøgård Gold Top Skærsøgård rd Silver Top Leon Millot Skaller 2008 Leon Millot Rose 2008 Rondo Skaller 2008 Bardo Maglietta Rossa 2004 Bishop Shiraz 2006 Gigondas Cuvee Prestige 2006 Iron Stone Zintaudel Masi Campo Vine Skaller 2008 Skærsøgård S n Rosé 2008 Stengården S gården 2008 gården 2007 Stengå Stengården Stengå Koncentration (mg/l) Dias 42

43 1,6 1,4 1, ,8 0,6 0,4 02 0,2 0 Phenethylamin i vin Phenethylamin i vin Phenethylamin hiraz 2003 iorin 2005 kaller 2008 Skærsøgård Swe weet Gold Skærsøgård Swe weet Blue Skærsøgård Gold Top Skærsøgård Silver Top Leon Millot Skall aller 2008 Leon Millot Rose 2008 Rondo Skaller 2008 Bardo Maglietta Ross ssa 2004 Bishop Shira hiraz 2006 Gigo gondas Cuvee Prestig stige 2006 Iron Stone Zintaudel Masi Campotio Nugan Shir Vine Rosé 2008 Stengården Skal rden 2008 Stengården Ro rden 2007 Stengård Stengård Koncentrati on (mg/l) Dias 43

44 Totalindhold ld af BA i de analyserede vine De analyserede vines totale BA indhold Phenethylamin Cadaverin Putrescin Tyramin Histamin Koncentration (mg/l) 0 Stengård rden 2007 Stengård rden 2008 Stengården Rosé 2008 Stengården Skaller 2008 Skærsøgård Swe weet Gold Skærsøgård Swe weet Blue Skærsøgård Gold Top Skærsøgård Silver Top Leon Millot Skaller 2008 Leon Millot Rose 2008 Rondo Skaller 2008 Bardo Maglietta Ross ssa 2004 Bishop Shira hiraz 2006 Gigo gondas Cuvee Prestig stige 2006 Iron Stone Zintaudel Masi Campotio iorin 2005 Nugan Shir hiraz 2003 Vine Dias 44

45 Koncentration ti af BA i forskellige procestrin Vinbatch G3 - Rødvin med skaller 6,000 5,000 Små ændringer i 4,000 3,000 koncentration af 2,000 1,000 BA Danske vine indeholder lave koncentrationer af BA Svært at trække konklusioner Dias 45 Koncentra ation (mg/l) /L) Koncentration (mg/ 0,000 0,500 0, ,400 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0, ,050 0,000 Vindruer Vindruer Inden gærtilsætning Inden gærtilsætning Efter endt fermentation Procestrin Efter endt tmlf Efter lagring Vinbatch G3 - Rødvin med skaller Efter rendt fermentation Procestrin Efter endt MLF Efter lagring Tyramin Putrescin Cadaverin Phenethylamin Tyramin Cadaverin Phenethylamin

46 Koncentration af BA i druer med og uden skimmel BA i druer med og uden skimmel 6 5 Koncentrati ion (mg/l) Phenethylamin Cadaverin Putrescin Tyramin Histamin 0 U. Sk M. Sk Drue Dias 46

47 Konklusion Danske vine der blev undersøgt, ser ud til at indeholde BA i lavere koncentration end udenlandske Dannelse af BA kommer ikke udelukkende fra MLF Druer ramt af skimmel, har vist at indeholde signifikant større mængder af BA end friske druer Dias 47

48 Perspektivering i Bedre separation af Histamin Bedre forståelse af det dårlige recovery af Histamin, i Putrescin og Cadaverin Større forsøg med flere danske og udenlandske vine. Større fokus på vine af ens prisklasse og kvalitet Dias 48

49 Tak til Professor Steen Honoré Hansen Firmaet Waters ved Hedehusene, specielt Rune Frederiksen De ansatte ved Institut A, FARMA Jesper Tungelund Larsen Henrik Elsner fra Stengården Sven Moesgård fra Skærsøgård Dias 49

50 Dias 50 Tak for mig!