Metodesammenligning af serøse væsker præpararet med udstrygningsteknik og væskebaseret teknik, samt Cellient celleblokke og plasma-thrombin koagler

Transkript

1 Metodesammenligning af serøse væsker præpararet med udstrygningsteknik og væskebaseret teknik, samt Cellient celleblokke og plasma-thrombin koagler Bachelorprojekt: 10 oktober november Bioanalytikeruddannelsen VIA UC, Campus Aarhus Nord Udarbejdet af: René Skov Bærentsen. (99908) I-Vejleder: K-Vejleder: Birthe Bunch Larsen Lektor, cand scient.. Dorthe Ejersbo - Bioanalytikerunderviser CT(IAC) EFCS-gyn Master of Public Health Antal tegn: tegn

2

3 Abstract The aim of this study was to determine how the technical-, staining- and diagnostic quality was affected by implementing automation of preparation of serous fluids. This was achieved by performing split samples on 29 samples. From one half of the samples, slides were made using conventional smears and plasma-thrombin clots while the other half was made using the ThinPrep 2000 system and Hologic Cellient. Samples were blinded and then treated with Papanicolaou (PAP), May Grünwald Giemsa (MGG) and Hematoxylin and Eosin (HE) stains. The following examination of the samples revealed that diagnostic quality was improved by replacing the traditional smear technique with ThinPrep, although there were no noticeable changes to technical and staining quality. Furthermore the study revealed that there were no significant improvements in diagnostic and staining quality by replacing plasma-thrombin clots with Cellient cellblocks, but there were improvements in technical quality. 2

4 Forord Jeg vil gerne takke Afdeling for Klinisk Patologi på Odense Universitets Hospital for at give mig muligheden for at lave mit bachelorprojekt hos dem, samt støtte og rådgivning i forbindelse med udførslen af projektet. Jeg takker Tina Hyldebrandt for instruktion i brugen af ThinPrep og fremvisning af fremstilling af udstrygningspræparater og koagler og resten af personalet på Afdeling for Klinisk Patologi på Odense Universitets Hospital skal takkes for deres hjælp med mikrotomi, fremstilling af immunfarvninger og for at svare på vores spørgsmål når dette var nødvendigt. En særlig tak skal gives til specialeansvarlig overlæge Karen Ege Olsen og min kliniske underviser Dorthe Ejersbo for deres omfattende arbejde med mikroskopering og vurdering af vores prøver. En stor tak til Dorthe Ejersbo og Birte Bunch Larsen for vejledning igennem projektet. Tak til Hologic for at låne os Cellient og Karin Dahl-Olausson for at undervise os i brugen af Cellient. En sidste og stor tak gives til mine medstuderende Mads Merrild og Issa Hassan for deres hjælp og samarbejde under forsøget. De har under hele forløbet været gode sparringspartnere og hjulpet mig til forståelse af emnet. René Skov Bærentsen 3

5 Indhold Abstract... 2 Forord... 3 Indledning... 6 Problembaggrund... 6 Formål... 9 Problemformulering... 9 Teori Serøse væsker Farvemetoder Materialer og Metoder Materialer Reagenser Metoder Indsamling af prøver og præparater Blinding Opstart og indledende undersøgelser Fremstilling af prøver Udstrygninger PT-Koagel ThinPrep Cellient Farvninger PAP farvning MGG farvning HE farvning Immunfarvninger Vurdering af præparater Teknisk kvalitet Farve kvalitet Immunfarvninger Diagnostisk kvalitet Det anvendte scoringssystem

6 Vurdering af resultater Resultater Teknisk kvalitet Farve kvalitet: Diagnostisk kvalitet Diskussion: Metodevalg Projektets opbygning Karakter system Fejlkilder Teknisk kvalitet UST VBT sammenligning Cellient PT-koagel sammenligning Farve kvalitet PAP sammenligning MGG sammenligning HE sammenligning Sammenligning af immunfarvninger Diagnostisk kvalitet UST/VBT Cellient/PT-koagel Konklussion Perspektivering Referenceliste Bilags oversigt

7 Indledning Problembaggrund På Afdeling for Klinisk Patologi (AKP) på Odense Universitets Hospital (OUH) indgår serøse væsker (pleura-, ascites- og perikardievæske) som en del af det diagnostiske grundlag for tumor diagnostik. Ved cancer eller anden sygdom, kan der opstå en øget produktion af serøse væsker omkring lunge, hjerte eller i mavens hulrum (1). Denne væske er diagnostisk interessant, da indholdet af celler, eksempelvis afstødte mesotelceller eller inflammatoriske celler, kan være en indikation på den underliggende sygdom. Formålet med cytologiske undersøgelser af serøse væsker, er at identificere og diagnosticere eventuelle morfologiske forandringer på celler i væsken, for derigennem at stille en diagnose(1). For at identificere celler, farves prøverne og efterfølgende mikroskoperes disse. Rutinemæssigt fremstilles der to præparater ved udstrygningsteknik (UST) samt et plasma-thrombinkoagel (PT-koagel). De to udstrygninger farves efter Papanicolaou (PAP) og May-Grunwald-Giemsa (MGG) farveprotokol, mens koaglet mikrotomeres og farves med Hæmatoxylin-Eosin (HE) farveprotokol(2). PT-koaglet arkiveres og kan benyttes til eventuelt yderligere immunhistokemiske undersøgelser. AKP har erfaring med Thinprep (TP), da dette system allerede benyttes til gynækologiske prøver. Afdelingen forventer derfor, at kunne overføre deres tidligere positive resultater fra indførslen af TP på gynækologiske prøver til serøse væsker. Kvalitetsmæssigt er der flere parametre, som har indflydelse på, hvordan præparaterne i dag kommer til at se ud ved UST. Serøse væsker er ikke en homogen gruppe af prøver, de varierer meget f.eks. indhold af slim, blod osv. Slim og blod kan være diagnostisk relevant, men kan også forstyrre mikroskopering og besværliggøre diagnosticering. Fremstillingen af udstrygninger gør, at der kan være stor forskel i hvordan præparaterne ser ud ved mikroskopering. Dette kan skyldes, at der overføres en dråbe bundfald fra centrifugerør til et objektglas, men da prøver varierer i celleindhold, kan det være svært at afgøre om en dråbe er for meget eller for lidt. 6

8 Skiftende bioanalytikkere til at fremstilling af serøse væsker, kan medføre en mindre forskel i fremstilling af præparater, da fremstillingen udføres manuelt. Serøse væsker udgør et godt vækstmedie for bakterier, hvorfor der kan opstå mikrobiel vækst efter udtagning af prøvemateriale til primær diagnostik. Herved kan restmaterialet blive nedbrudt og gøre det umuligt at foretage omkørsler, da bakterier har ødelagt celler i prøven. Jeg forventer, at disse problemer kan løses ved at indføre væskebaseret teknologi (VBT). ThinPrep er et automatiseret system, hvor prøver oprenses i et methanolholdigt fiksativ, Cytolyt, der lyserer erythrocytter og opløser slim. Dette forventer jeg, vil gøre cellebilledet nemmere at mikroskopere. Cytolyt hæmmer desuden mikrobiel vækst, på grund af den høje methanol koncentration, der dræber eventuelle mikroorganismer i prøven. ThinPrep præparater fremstilles på et apparat (T2000), der suger celler fra et opbevaringsmedie (Preservcyt) over på et filter, og via dette filter overføres cellerne til et objektglas. T2000 suger prøvemateriale op til den detekterer et modtryk, og derved reguleres mængden af celler der tilbageholdes i filteret(3). Herved opstår der ensartethed i præparaterne, som jeg forventer, kan løse problemer med varierende celleindhold og skiftende personale. Når patienter er under mistanke for cancer, indgår de i pakkeforløb, hvilket betyder der er fastdefinerede tidsrammer for forløbet i udredningen og behandlingen af sygdommen. Disse rammer er fastsat for at få en hurtig behandling af patienten, da dette forbedrer patientens overlevelseschancer(4). I dag fremstilles der PT-koagler med henblik på at foretage HE og immunfarvninger. Immunfarvninger er centrale for diagnostik af cancer, da disse er specifikke for bestemte antigener, og ved at undersøge disse kan patologer få diagnostisk relevante informationer om mistænkelige cellers tilstand, såsom celletype, status af mismatch repair gener (MMR), tumor supressor proteiner mm. Cellient er en nyt apparat, som vi vil sammenligne med PT-koagler. Ved at oprense celler som ved VBT og herefter indstøbe dem i en celleblok på Cellient apparatet, kan der på snit fra Cellient celleblokken fremstilles HE farvning og immunfarvninger. Fordelen ved Cellient er, at en celleblok kan fremstilles på 45 minutter (5,6) mens PT-koagler tager op til et døgn at fremstille. Denne forskel kan hjælpe AKP med at overholde tidsrammerne for patienter i pakkeforløb. I et tidligere forsøg af 7

9 Wagner et al er Cellient blevet sammenlignet med blandt andet PT-koagler, og der blev ikke fundet signifikante forskelle imellem de to metoder(7). Jeg håber at kunne genskabe disse resultater. 8

10 Formål At undersøge og vurdere hvorvidt det er muligt, at skifte fra udstrygningsteknik til væskebaseret teknik, samt at skifte fra plasma-thrombin koagler til Cellient celleblokke, for serøse væsker. For at besvare vores problemformulering vil jeg gøre følgende: Jeg vil fremstille splitsamples af ascites, pericadie og peluravæsker, der modtages på AKP, OUH. Den ene sample behandles med de nuværende anvendte metoder til præparering af serøse væsker på AKP, OUH (kaldet rutineprøver). Den anden sample behandles efter Hologics anbefalinger for VBC. Jeg vil farve præparater, fremstillet ved væskebaseret- og udstrygningsteknik, MGG og PAP farning. Jeg vil fremstille præparater fra Cellient celleblokke der HE farves. Jeg vil foretage fire immunfarvninger på snit fra Cellient celleblokke, på de prøver hvor afdelingens patologer har bestilt immunfarvninger. Jeg vil blinde alle præparaterne og herefter mikroskoperes og vurderes farve og teknisk kvalitet af Dorthe Ejersbo, mens diagnostisk kvalitet vurderes af Dorthe Ejersbo og specialeansvarlig overlæge Karen Ege Olsen. Jeg vil i samarbejde med Mads Merrild og Issa Hassan lave en fælles vurdering af alle præparaterne. Jeg vil vurdere præparaternes kvalitet indenfor farve-, tekniske- og diagnostiske kvalitet, vha. udarbejdet pointsystem. Problemformulering Hvordan påvirkes præparaters farve-, tekniske- og diagnostiske kvalitet ved automatisering af præpareringsteknikken til serøse væsker? 9

11 Teori Serøse væsker Serøse væsker er en fællesbetegnelse for væsker, der stammer fra kroppens hulrum omkring peritoneum, perikardie og pleura. Serøse væsker er mukøse væsker, der nedbringer friktion, eksempelvis i forbindelse med udvidelse og sammentrækning af lunge og hjerte(1). Væsken dannes af specialiserede epitelceller, kaldt mesotelceller, i hinden omkring disse organer og bughulen. Udover at danne mukøse substanser i serøse væsker, regulerer mesotelceller også volumet af væske i de beskyttende hinder, ved at optage og sekrere vand (8). Cellebilledet i serøse væsker består udover afstødte mesotelceller, af histocytter, leukocytter og lymfocytter, og dette udgør det raske cellebillede. Mesotelceller er runde og har en eller flere runde kerner, der ligger centralt i cellen. Cellerne er ofte lejret enkeltvis, men kan også ses ligge ende til ende hvor de formes efter hinanden. Mesotelkernen er granuleret, ofte med flere veldefinererede nukleoler.mesotelceller har på cellemembranen microvilli og cillier, der beskytter mesotelecellen fra friktion. (8) Histocytter er specialiserede makrofager. De kan have samme størrelse som mesotelceller og har en eller flere kerner. Deres kerner kan være lejret centrisk og acentrisk. Cytopalsma er mere vakuloseret end ved mesotelceller.(9) Ved infektion eller malign vækst kan der opstå ændringer i cellebilledet, i form af forøgelse i mængden af inflammatoriske celler eller en forandring i mesotelcellerne. Ved malign vækst i mesotelceller kan dette ses ved lavere differentierede celler, med større og evt. flere kerner og mindre cytoplasma. Mesotelceller kan også blive reaktive, hvilket betyder de reagerer på ekstern stimuli, hvilket kan ses som forstørrede kerner grundet den forøgede aktivitet. Det kan derfor være meget svært at skelne imellem maligne og reaktive celler. (10) Serøse væsker bruges til tumordiagnostik. På AKP, OUH farves celler i serøse væsker efter PAP, MGG, HE og evt. immunfarvningsprotokoller. Herved visualiseres celler, og det bliver muligt at mikroskopere disse. Ved at benytte immunfarvninger, bliver det muligt at diagnosticere både primær og sekundære tumorer. 10

12 I dag udføres der på AKP udstrygninger og PT-koagler på serøse væsker. Ved udstrygningsteknik (UST) overføres cellemateriale manuelt til et objektglas. Herefter bliver præparatet enten spray- eller luftfikseret, afhængig af hvilken farvemetode der efterfølgende benyttes på præparatet. Der fremstilles samtidig et PT-koagel, ved at opsuge cellemateriale fra prøven og tilsætte thrombin og plasma. Thrombin aktiverer koagulations kaskaden vha. plasma og cellerne indkapsles i fibrin. PTkoagelet undergår herefter vævsfremføring, der er en proces involverende skiftende koncentrationer af ethanol, xylen og endeligt paraffin, hvorved vand i cellerne erstattes med paraffin. Herefter kan der udføres mikrotomi på PT-koaglet og skæres vævssnit til HE og immunhistokemiske undersøgelser (IHC). Væskebaseret teknik adskiller sig fra konventionelle udstrygnings metode ved, at celler fikseres med en alkohol, der er et koagulerende fiksativ. Thinprep benytter methanol, der denaturerer proteiner hvorved deres tertiære struktur ændres. Herved hæmmes de naturlige nedbrydelsesprocesser, heriblandt apoptose, der indtræffer når celler fjernes fra kroppen og mister tilsætning af ilt og næring, da eksempelvis lyserende enzymer bliver inaktiveret af ændret tertiær struktur. (11) ThinPrep er et system fra Hologic, der benytter væskebaseret teknik, hvor prøver oprenses med Cytolyt væske og opbevares i PreservCyt væske. (3) Både Cytolyt væske og PreservCyt indeholder buffere og methanol. PreservCyt er velegnet til opbevaring af prøver i længere tid,i modsætning til Cytolyt, da Cytolyt også indeholder lyserende enzymer der nedbryder erythrocytter og fjerner blod fra prøven. Når prøven opløses i Cytolyt og efterfølgende centrifigeres, bortvaskes en betydelig mængde slim. Dette giver et forbedret cellebillede, da blod og slim i store mængder bliver forstyrrende ved mikroskopering(3). Thinprep er automatiseret, og prøveforberedelse foregår i vores projekt på maskinen T

13 Figur 1 illustrerer hvordan prøver overføres til objektglas ved Thinprep. Prøven hvirvles først op, hvorefter celler suges op på et non-gyn filter. Herefter overføres celler til objektglas ved at lave et aftryk med filteret. Samtidig laver T2000 et tryk i indersiden af filteret, hvorved celler presses over på objektglaset. Figur 1 illustrerer hvorledes T2000 overfører celler fra prøven til et obektglas. På T2000 hvirvles celler i prøven op, så de ikke bundfældes, hvorefter celler suges op på et non-gyn filter, der overfører celler til et objektglas ved at lave et aftryk med filteret. Ved at danne et overtryk på indesiden af filteret pustes celler fra filteret på objektglasset. (3) På T2000 er der sensorer der detekterer modtryk i filteret, og ved at overvåge trykket kan T2000 homogenicere præparatet, da der suges lige mange celler på filteret ved hver prøve. (3) Cellient fra Hologic er et automatiseret system til fremstilling af celleblokke, som kan anvendes som alternativ til PT-koagler. Celler opkoncentreres i et filter, ved at suge prøvemateriale igennem filteret med vacum. Herefter foretages der vævsfremføring og endeligt indstøbes celler i paraffin. Processen tager 45 minutter, hvorved der spares tid sammenlignet med PT-koagler (6). Det er nødvendigt at farve celleblokken med eosin, da der under vævsfremføring ved brug af xylen opstår klaring, der betyder celler bliver gennemsigtige(11). Uden dette, vil det ved mikrotomi være svært at skelne celler fra paraffin. 12

14 Farvemetoder PAP, MGG og HE farvninger er oversigtsfarvninger, der anvendes til at screene præparater før der foretages special farvninger eller immunfarvninger. Fra oversigtsfarvninger vurderes cellebilledet, kerne- og cytoplasmamorfologi, malignitet og inflammation (11,12). PAP farvning består af en kernefarvning efterfulgt af en cytoplasma farvning. Kernedetaljer visualiseres med hæmatein, der er negativt ladet. Ved at udskifte en ligand med et aluminiumion danner hæmatein et metalkompleksfarvestof, der er positivt ladet. Metalkompleksfarvestoffet binder til fosfatgrupper i nukleinsyrer i DNA, da disse er negativt ladede ved ph 2,7. Herefter foretages der cytoplasmafarvning med en kombination af anionfarvestofferne Orange G, Eosin Y, Light Green samt fosforwolframsyre. Wolframfosforsyre menes at påvirke farveresultater således celler fremstår med rene farver frem for en blanding af flere farver. (12). Farvestofferne har forskellig størrelse, struktur og ladning, hvorved forskellige celletyper farves unikt baseret på eksempelvis komposition af cellens cytoplasma, cellemembranens permeabilitet, metabolisk aktivitet mm. Derved bliver det muligt at differentiere imellem forskellige celletyper. MGG farvning indeholder kationfarvestofferne Azur A og Azur B, der er oxidationsprodukter af Methylenblåt samt anionfarvestoffet Eosin Y. Da der benyttes både kation- og anionfarvestoffer er det vigtigt at fastholde ph ved 7,8 da højere eller lavere ph vil forskyde mængden af farvbare grupper for de farvestofferne og medføre et resultat der ikke er optimalt. Ved at anvende kation- og anionfarvestoffer opnås der en differentiering af forskellige cellekomponenter. (11) Azur B binder til de negativt ladede grupper i proteiner mens Eosin Y binder til positive ladede grupper. Ved MGG farvning, opstår der en unik purpur farvning af cellerkerner. Dette kaldes for Romanowsy- Giemsa effekten, og fremkommer ved at to Azur B danner en dimer der stabiliseres ved hydrofobe interaktioner. Den ene ende af dimeren binder til negativt ladede fosfatgrupper i kernens DNA, mens den ledige negative ladning fra det sekundære Azur B molekyle bindes til et Eosin Y molekyle. 13

15 HE farvning kendes også fra histologi hvor den benyttes som oversigtsfarvning for væv. Ved HE farvning benyttes der ligesom ved PAP farvning metalkompleksfarvestoffet Al-hematein. Dette farver kerner blå. Der benyttes også Eosin Y der farver cytoplasma proteiner lyserøde. PAP og HE farvning er derved meget ens, men forskellen er at HE foretages på formalinfikseret væv, mens PAP foretages på alkoholfikseret væv. (11) Hvis der er behov for yderlige undersøgelser foretages der immunfarvninger, som er farvninger hvor der benyttes antistoffer. Antistoffer er proteiner fremstillet af immunforsvaret, der har affinitet for et specifikt antigen (13, 14). Ved immunfarvning benyttes to antistoffer. Det primære antistof har affinitet for et antigen i prøven og binder til dette. Efterfølgende tilsættes et sekundært antistof der har affinitet for det primære antistof, og binder hertil. Det sekundære antistof er konjugeret med et enzym, ofte Horse-Radish-Peroxidase (HRP). Ved tilsætning af substrat, vil der forekomme en enzymatisk omdannelse af substratet, hvis der i celler på præparatet forekom antigenet som det primære antistof er specifikt for. (14) Ved at benytte forskellige primære antistoffer kan der indsamles information om cellernes opbygning. Vi har i vores projekt benyttet os af fire antistoffer der indgår i et panel af antistoffer benyttet på AKP. Vi bruger antistofferne til at undersøge hvorledes kvaliteten af immunfarvninger bliver påvirket ved et skifte fra PT-koagler til Cellient. Jeg vil her beskrive de fire antigener vores antistoffer retter sig imod. Cytokeratin 7(CK7) er et intermediært filament, der indgår i en celles skelet. Intermediære filamenter findes i alle epiteltyper og i mindre udstrækning glat muskulatur eller endotel. Antistoffet kan benyttes til at vurdere hvilken celletype en celle tilhører. Ved immunfarvning med CK7, vil farvereaktionen ses tydeligst omkring cellekernen og ved cellemembranen, hvor de intermediære filamenter binder til desmosomer. CK7 vil indikere at en tumorcelle er af epitelial oprindelse, og vil ofte være positiv ved adenocarcinom, tumorer i pancreas, carcinoid mm. (14) Epithelial membrane antigen (EMA) er et transmembrant glycoprotein der er knyttet til de fleste epiteltyper. Ved øget celleproliferation og celleaktivitet, ses en øget forekomst af EMA. Det anvendes ofte ved identifikation af carcinomer samt differentiering af forskellige carcinomtyper eksempelvis renalcellecarcinom og binyrebarkcarcinom. (14) 14

16 Thyroid transcription factor 1(TTF1) er et nukleært protein fra en familie af transkriptionsfaktorer, der findes i glandula thyreoidea, resoiratorisk epitel og diencephalon. Da antigenet udelukkende findes i disse celletyper, vil en positiv TTF1 immunfarvning indikere at en malign celle stammer fra thyreoidea eller lunge. (14) Calretinin er et calciumbindende protein, der især er udbredt i centralnervesystemet og perifære nerver, men også findes i mesotelceller, steroride-producerende celler, testes, ovarie mm. En positiv Calretinin farvning kan ses både i cytoplasma og kerne. Calretinin er en af de mest sensitive markører til identifikation af malignt mesotelion. (14) 15

17 Materialer og Metoder Materialer 30 patientprøver bestående af ascites, pleura eller perikardievæske. Fordelingen af prøver 1 perikaridevæske 9 ascitesvæsker 20 pleuravæsker. Diagnose på de indsamlede prøver var: 12 maligne 1 malignitetssuspekt 4 atypiske celler 1 uegnet til specialundersøgelse 2 akut kronisk inflammation 10 ingen maligne celler Afdelingen havde bestilt immunfarvninger på 6 prøver, hvor en prøve senere udgik fra projektet, da der manglede præparater i sættet. Reagenser Jeg henviser til bilag 1 og 2 for reagenser, utensiler og apparatur anvendt i vores forsøg For datasheets for antistoffer benyttet til immunfarvninger henvises til bilag 3, 4, 5 og 6. For datasheets for Cytolyt og PreservCyt, se bilag 7 og 8. Metoder Figur 1 er et flowdiagram over prøvens forløb fra den modtages i laboratoriet, og hvorledes prøver indgår i både rutine og vores projekt. 16

18 Figur 1 flowdiagram over prøvebehandling i vores projekt. Indsamling af prøver og præparater Vi begrænsede vores forsøg til kun at omhandle ascites, pleura og perikardievæske, så derfor blev der ikke indsamlet serøse væsker af andre typer end disse. I perioden fra til blev der indsamlet 1 perikaridevæske, 9 ascitesvæsker og 20 pleuravæsker. Der er ikke sorteret i prøver baseret på klinisk data, dog blev der sorteret baseret på prøvemængde, da vi havde fastsat et krav på minimum 500 ml restmateriale efter udtagelse af 40 ml. til vores forsøg. Dette skyldes, at der skal være tilstrækkeligt restmateriale i tilfælde af et behov for yderligere undersøgelser. Indsamlingen af prøver foregik ved, at der efter fremstilling af rutinepræparater på afdelingen, blev frataget ca. 40 ml væske som centrifugeres. Supernatanten blev dekanteret og bundfaldet genopløst i CytoLyt og opbevaret i køleskab ved 5 Celcius. Indsamlingen blev foretaget af bioanalytikere på afdelingen. 17

19 Samtidig med udtagelse af prøvemateriale til vores forsøg, blev der fra hver prøve rutinemæssigt fremstillet to udstrygninger, til PAP og MGG farvning, samt et PT-koagel, hvor der blev foretaget HE farvning. HE farves rutinemæssigt også på spontankoagler, men vi har valgt ikke at medtage disse, da der ikke forekommer spontankoagler i alle prøver. Hvis der blev fremstillet mere end et PT-koagel per patient, udvalgte vi glas fra det bedste PT-koagel til at indgå i vores undersøgelse. Dette vurderede vi makroskopisk med henblik på lav forekomst af blod, størst muligt vævsnit samt jævnt fordelte celler. Hvis der var behov for yderligere undersøgelser på koaglet, blev der efterfølgende bestilt immunpaneler på snit fra koaglet. Disse præparater benyttede vi til sammenligning med immunfarvninger fremstillet ved Cellient. Blinding Blinding blev foretaget for at mindske bias i forbindelse med vurdering af præparater. Primært ville vi sikre at det ikke var muligt ved vurdering af præparater, at huske den tilsvarende prøve fra anden præpareringsteknik. Dette opnåede vi ved at benytte både afdelingens C numre og vores egne interne numre. Da vi påbegyndte vores forsøg, nummererede vi prøver med fortløbende numre startende fra 1. Dette gjorde, at ThinPrep og Cellient præparater var nummereret Ved UST og koagler benyttede vi afdelingens rutinepræparater, og disse var nummereret med C- numre, hvorfor det ved mikroskopering ikke var muligt at sammenkæde HE præparater fremstillet ved henholdsvis Cellient og PT-koagel fra den samme prøve. Det var ved mikroskopering desuden ikke muligt at sammenligne forskellige farvninger fra samme prøve, da vi opdelte præparater efter farvemetode. Ved nummerering af prøver med interne numre, lavede vi et dokument hvor vi sammenførte C- nummer og internt nummer. Dette dokument blev ikke benyttet før vi var færdige med vurdering af vores præparater. Der er ikke foretaget blinding ved vurdering af immunfarvninger og diagnostisk kvalitet, jeg henviser til diskussionsafsnittet for en redegørelse af årsaget til dette. 18

20 Opstart og indledende undersøgelser For at undgå forskelle imellem de først og sidst fremstillede præparater pga. manglende erfaring i udførsel af prøvepræparering og farvning, indledte vi projektet med at fremstille PAP og MGG præparater på serøse væsker. Vi observerede ved cellerige prøver et problem, da der ikke fremkom et homogent aftryk fra filteret på T2000. Cellerne var derimod koncentreret i en cirkel i udkanten af filterets trykflade. Ved at fremstille 2,5,10,20 og 40 x fortynding med sterilt vand, af en for cellerig prøve, fandt vi et interval af fortyndinger hvor vi fik gode resultater, med 20 x fortynding som det mest optimale. Dette passer med ThinPrep 2000 manualen, hvor det anbefales at fortynde 20 gange i tilfælde af dannelse af en ring på objektglasset (3). Fremstilling af prøver Herunder findes en kort gennemgang af procedurerne benyttet til fremstilling af prøverne i vores projekt. Udstrygninger Der fremstilles rutinemæssigt to udstrygninger på hver patientprøve. Disse udstrygninger fremstilles ved at centrifugere prøvematerialet. Supernatanten dekanteres og en dråbe af bundfaldet overføres til et objektglas. Herefter fordeles prøvematerialet med et hårrør. PAP præparatet sprayfikseres og MGG-præparatet luftfikseres, hvorefter præparaterne farves efter henholdsvis PAP og MGG farveprotokol. I bilag 9 ses fremgangsmåde for fremstilling af udstrygninger. PT-Koagel Fra samme prøve benyttet til udstrygninger, udtages der prøvemateriale som tilsættes plasma og thrombin. Dette henstår i 20 sekunder og koagulerer, og hvis der er behov tilsættes yderligere plasma. Koaglet bliver placeret i en kapsel og gennemgår vævsfremføring til paraffin. Af denne paraffinblok skæres et snit til HE farvning, hvorefter celleblokken gemmes til eventuelt yderligere immunhistokemiske undersøgelser. 19

21 I bilag 9 ses fremgangsmåde for fremstilling af koagler. ThinPrep Ved ThinPrep benyttes samme prøve som ved udstrygninger og koagler. Prøvemateriale overføres til et centrifugerør og centrifugeres. Herefter dekanteres supernatanten og bundfaldet resuspenderes i Cytolyt. Herefter genopløses cellerne ved omrøring på VIBRAX. Igen centrifuges og supernatanten dekanteres hvorefter der tilsættes PreservCyt væske. Efter genopløsning på VIBRAX, henstår prøven i PreservCyt i 15 minutter og overføres fra centrifugerør til Preservcyt beholder. Herefter påsættes preservcyt beholderen T2000, der samtidig tilføres et non-gynækologisk filter og ThinPrep objektglas og startes på program 2. For mere detaljeret beskrivelse af ThinPrep præparering se bilag 10 og 11. Cellient Fra PreservCyt beholderen benyttet til fremstilling af ThinPrep præparater, udtages prøvemateriale til fremstilling af Cellient celleblok. PreservCyt beholderen påføres Hologic Cellient, samt en kapsel med filter og 3 pipettespidser. Efter ca. 45 minutter er cellerne indstøbt i paraffin. Filteret på celleblokken skal fjernes forsigtigt. Celleblokken overføres til en støbeform og indstøbes i en større firkantet blok af parafin, på et modul tilsluttet Cellient. Herefter er klodsen klar til mikrotomi. For mere detaljeret beskrivelse af Cellient vævspræparering se bilag 12. Farvninger Her beskrives kort udførslen for farvning af præparater. PAP farvning PAP farvning blev foretaget på Tissue-Tek DRS 2000, for både UST og VBT. Dette var muligt da apparatet benyttes til UST præparater i rutinen, og var afprøvet til VBT præparater. 20

22 For en detaljeret beskrivelse af PAP farvning se bilag 13. MGG farvning Vi har farvet UST og VBT præparater efter forskellige farveprotokoller. UST er farvet efter afdelingens protokoller på Leica T4040. VBT præparater blev farvet manuelt efter en optimeret farveprotokol vi lånte fra et andet bachelor projekt. Jeg henviser til bilag 14 for en mere detaljeret beskrivelse af MGG farvning på Leica T4040 og bilag 15 for MGG farveprotokol anvendt til VBT præparater. HE farvning HE farvning blev foretaget på snit fra koagler og Cellient celleblokke. Farvningen blev foretaget efter afdelingens egne protokoller på Tissue-Tek Prisma. Se bilag 16 for detaljeret HE farveprotokol. Immunfarvninger Fra prøver hvor der ved rutine undersøgelse var bestilt immunfarvninger, fremstillede vi yderligere fire immunfarvninger på snit fra vores Cellient celleblok. Disse farvninger var CK7, EMA, TTF1 og Calretinin. Alle immunfarvninger blev foretaget på Ventana Benchmark ULTRA, hvor også PT-koagel præparater blev farvet. Der henvises til bilag 17, 18, 19 og 20 for detaljerede beskrivelser af farveprotokoler anvendt til immunfarvning. Vurdering af præparater Vi vurderede vores præparater indenfor tre kategorier: teknisk kvalitet, farve kvalitet og diagnostisk kvalitet. Kriterierne for vurdering af præparater er udarbejdet fra kriterier fundet i kompendium i klinisk cytologi. I fællesskab med Mads Merrild og Issa Hassan vurderede jeg alle præparater med henblik på teknisk kvalitet, farve kvalitet. Vurderingen blev foretaget demokratisk, således flertalet afgjorde karakteren i tilfælde af uenighed. Dorthe Ejersbo vurderede ligeledes præparaterne, så vi havde to vurderinger af alle præparater. 21

23 For diagnostisk kvalitet blev der foretaget vurderinger af Dorthe Ejersbo og Karen Ege Olsen. Teknisk kvalitet Teknisk kvalitet omfatter cellernes bevaring og det generelle cellebillede for præparatet ved mikroskopering. Vurderingen blev foretaget på præparater farvet med PAP farveprotokol for UST og VBT, mens den tekniske kvalitet for Cellient og Koagler blev vurderet på HE præparater. Vi baserede vores karakterer på observationer og forekomsten af: Inflammation Celle lejring (3D gruppe eller monolag) Baggrundsdebris (eksempelvis blod eller slim) Cellernes bevarelse/morfologi Celletæthed Autolyse Farve kvalitet Farve kvalitet omhandler kvaliteten af farvning for alle de benyttede farveprotokoller på henholdsvis UST, VBT, Koagler og Cellient. Vi vurderede: Farveintensitet Farveartefakter Kerne detaljer Cytoplasma detaljer For hver farveprotokol blev der lavet forskellige sæt scoringskriterier, da HE, PAP og MGG er gode til at visualisere forskellige dele af cellen. Det er de samme kriterier der vurderes på, dog med forskellig prioritering. Eksempelvis er PAP farvning god til at vise kernedetaljer, hvorfor der er mere fokus på disse ved vurdering af PAP farvninger, mens MGG er bedre til cytoplasma farvning. (15) 22

24 Immunfarvninger For immunfarvninger benyttede vi andre kriterier end for oversigtsfarvninger. Vi udvalgte i samråd med Dorthe Ejersbo og Karen Ege Olsen fire immunfarvninger der indgik i afdelingens standardpanel. Vurderingen af immunfarvninger blev foretaget på baggrund af: Farvningens specificitet (varierer fra antistof til antistof) Farveintensitet Uspecifik baggrundsfarvning Farve udfældninger Mængde af positive celler. Diagnostisk kvalitet Vurderingen foretages på tilstedeværelse af identificerbare diagnostiske celler, og afgører hvilken fremstillings metode der resultaterer i optimal identifickation af diagnostiske celler. Dette gøres ved at sammenligne præparater fremstillet ved hhv. UST/VBT og Cellient/koagler. 23

25 Det anvendte scoringssystem For at øge reproducerbarheden af vores projekt, har vi fremstillet et scoringssystem, hvor der er sætninger der beskriver hvert trin på karakterskalaen. Herunder følger sætninger benyttet til teknisk og farve kvalitetsvurdering for PAP farvning. De resterende sætninger kan findes i bilag 22, 23 og 24. Karakter Teknisk kvalitet for PAP Farvekvalitet for PAP 0 Et præparat hvor der generelt er for få eller for mange mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er meget blodigt samt inflammatorisk præget, eller udflydende autolyserede celler Et præparat hvor det generelle cellebillede, for raske mesotelceller, er mange farveudfældninger eller farvekomplekser, samt hvor farvningen er hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen kan være utydelig, og det er umuligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. 1 Et præparat hvor der er en acceptabel mængde af mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er præget af let blodig baggrundsstøj, hvor få celler ligger enkeltvis i et monolag, og der forekommer få velafgrænsede celler med en svag grad af autolyse. Et præparat hvor det generelle cellebilleder er en del farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er enten hypo- eller hyperkromatisk, hvor det kun lige er muligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. Der kan forekommer udflydende celler, og i kernen er det kun muligt at skelne om cellen er enkelt eller flerkernet. 2 Et præparat hvor der er en acceptabel mængde af mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er præget af moderat baggrundsstøj og celler ligger primært enkeltvis i et monolag. Der forekommer en tilpas mængde af velafgrænsede celler uden autolyse. Et præparat hvor det generelle cellebillede er få farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er tæt på optimal, dvs. højest let hypo/hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen er tilfredsstillende og det er muligt at genkende cytoplasmastrukturer i en del af cellerne. Ved kernen er antallet af kerner tydeligt, og der kan ses nukleoler 3 Et præparat hvor der er en acceptabel mængde af mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er præget af svag baggrundsstøj og cellerne ligger enkeltvis i monolag, Et præparat hvor der er få eller ingen farvningsudfældninger, og farveintensiteten er optimal. Cytoplasmastrukturer er tydelige og ved mesotelceller ses brushborder. Antallet af kerner ses tydeligt, samt nukleoler kan ses tydeligt, og 24

26 og størstedelen af cellerne er velafgrænsede uden autolyse. kernemembranen kan ses. Tabel 1. Her ses scoringssystemet benyttet til vurdering af teknisk og farve kvalitet for PAP farvning. Sætninger beskriver hvert enkelt karaktertrin på vores skala. Tabellen viser, at der for højere karakterer er krav om en øget detaljeringsgrad. Samtidig ses at der for karakterer 1-3 er krav om en acceptabel mængde raske mesotelceller. Som det kan ses i tabel 1, er der for hvert karaktertrin en gradvis forøgelse af detaljeringsgraden. I tabel 1 ses scoringssystemet for PAP farvning, som er god til at visualisere kernedetaljer. Derfor har vi i vores scoringssystem krav til en højere detaljeringsgrad af kernen for høje karakterer end for lave. For teknisk kvalitet gælder desuden, at karakterer hvor der ikke forekommer en acceptabel mængde mesotelceller automatisk får karakteren 0. Dette skyldes,at vi foretager vores vurderinger baseret på raske mesotelceller. Vurdering af resultater Som vurderingsgrundlag for vores farve og tekniske resultater benytter jeg beskrivende statistik i form af histogrammer, der viser differencen imellem resultater fra de sammenlignede metoder, samt procent fordelinger. Ved at udregne differencen, benytter jeg styrken af vores parrede forsøgsdesign, og histogrammet gør det muligt visuelt, at vurdere om der er tendenser til, at den ene metode får højere karakterer end den anden. Procentfordelinger gør det muligt at vurdere fordelingen af karakterer når der er et forskelligt antal prøver i hver forsøgsrække. Da jeg ikke har fået en tilstrækkelig mængde prøver hvor der er foretaget immunfarvninger, har jeg i stedet for karakterer beskrevet hver enkelt prøve. Der vil derfor ikke indgå statistiske beregninger på immunfarvninger. For diagnostisk kvalitet benytter jeg beskrivende statistik til at vurdere mine resultater. 25

27 Resultater I vores problemformulering vil vi foretage vurdering af teknisk-, farve- og diagnostisk kvalitet på de anvendte metoder. I mit resultatafsnit medtager jeg tabeller og diagrammer, der viser fordelingen af vores resultater, samt anvendt statistik foretaget på data fremkommet ved vurdering af præparater af hhv. Projektgruppen og Dorthe. Det var ikke muligt at identificerer raske mesotelceller i alle prøver. Dette påvirker ikke vurderingen af teknisk kvalitet, da de herved opnår 0 i karakter. For at vurdere farvekvalitet, er det derimod nødvendigt at identificere raske mesotelceller at foretage vurdering på. Derfor har jeg udelukket prøver hvor jeg ikke fandt raske mesotelceller fra databehandling af farvekvalitet. Rimeligheden af dette behandles i diskussions afsnittet. Rådata kan findes i bilag 25, og 28. I bilag 29 er kommentarer fra Karen Ege Olsen til diagnostisk kvalitet Teknisk kvalitet Teknisk kvalitet er undersøgt på henholdsvis PAP og HE farvning, for de anvendte teknikker. I Tabel 2 er projektgruppen og Dorthes resultater samlet for teknisk kvalitet for præparater ved UST, VBT, Cellient og PT-koagel. Ved vurdering af teknisk kvalitet har jeg udelukket to resultater fra Dorthe. Baggrund for dette kan findes i diskussionsafsnit. Vurderet af os Teknisk kvalitet n UST VBT PT-Koagel Cellient Vurderet af Dorthe Teknisk kvalitet n UST VBT PT-Koagel Cellient Tabel 2 Opsummering af karakterer afgivet for teknisk kvalitet for VBC, UST, PT-koagel og Cellient præparater, afgivet af projektgruppen og Dorthe. Karaktererne er optalt og grupperet for at sammenligne karakter fordelingen. To prøver er udelukket fra Dorthes VBT vurdering. 26

28 Hyppighed I tabellen ses at projektgruppen har benyttet lave karakterer ved vurdering af teknikkerne, mens Dorthe har vurderet præparaterne med høje karakterer. Dette kan eksempelvis ses ved Cellient, hvor projektgruppen har vurderet 4 prøver med karakteren 3, mens Dorthe har benyttet samme karakter 14 gange Figur 2 og 3 illustrerer differencen i teknisk kvalitet for henholdsvis VBT-UST og Cellient- PT-koagel på hvert enkelt prøve i et histogram. Projektgruppen og Dortes resultater er medtaget i samme figur VBT - UST: Teknisk kvalitet Differens Interval 0 Projektgruppen n= 29 Dorthe n= 27 Figur 2 Histogram der illustrerer differencen i karakter afgivet for teknisk kvalitet på hver prøve imellem VBT og UST, af projektgruppen samt Dorthe. Positive værdier er udtryk for at prøven har scoret højere karakter i VBT end på UST. Det omvendte gælder for negative værdier. I figur 2 kan ses at projektgruppen ved 9 prøver har vurderet at VBT er bedst, og ved en prøve vurderet UST er bedst. 27

29 Hyppighed Cellient - Koagel: Teknisk kvalitet Differens Interval 0 Projektgruppen n = 29 Dorthe n = 29 Figur 3 Histogram der illustrerer differencen i karakter afgivet for teknisk kvalitet på hver prøve mellem Cellient og koagler, af projektgruppen samt Dorthe. Positive værdier er udtryk for at prøven har scoret højere karakter i Cellient end på koagler. Det omvendte gælder for negative værdier. Der er 29 prøver, da en enkelt er udgået fra forsøget. I Figur 3 kan ses at projektgruppen og Dorthe har vurderet Cellient præparater med højere karakter end PT-koagel præparater henholdsvis 12 og 8 gange, mens PT-koagel præparaterer vurderet bedst 6 og 4 gange. 28

30 Farve kvalitet: Jeg har foretaget vurderinger på præparater farvet med PAP, MGG og HE farveprotokol. Resultaterne farvekvalitet fremgår af tabel 3, hvor jeg har omregnet karakterfordelingen til procentsatser, da der forekommer et varierende antal prøver. Vurderet af projektgruppen Farve kvalitet Antal prøver PAP UST 0 (0 %) 6 (27 %) 12 (51 %) 4 (18 %) 22 PAP VBT 0 (0 %) 14 (52 %) 11 (41 %) 2(7 %) 27 MGG UST 2 (9 %) 9 (39 %) 9 (39 %) 3(13 %) 23 MGG VBT 2 (8 %) 12 (48 %) 9 (36 %) 2(8 %) 25 HE PT-Koagel 1 (5 %) 7 (35 %) 11 (55 %) 1(5 %) 20 HE Cellient 0 (0 %) 3 (15 %) 10 (50 %) 7(35 %) 20 Vurderet af Dorte Farve kvalitet Antal prøver PAP UST 0 (0 %) 9 (37,5 %) 3 (12,5 %) 12 (50 %) 24 PAP VBT 0 (0 %) 0 (0 %) 3(12,5 %) 21 (87,5 %) 24 MGG UST 3 (15 %) 6 (30 %) 2(10 %) 9 (45 %) 20 MGG VBT 0 (0 %) 3 (12,5 %) 5(20,8 %) 16 (66,7 %) 24 HE PT-Koagel 0 (0 %) 7 (33 %) 6 (29 %) 8 (38 %) 21 HE Cellient 3 (14 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 19 (86 %) 22 Tabel 3 Opsummering af karakterer afgivet for farve kvalitet, undersøgt ved MGG og PAP farvning på UST og VBT, samt HE farve kvalitet vurderet på PT-koagel og Cellient præparater. Prøveantallet varierer da jeg har udelukket resultatet afgivet for prøver hvor der ikke forekom mesotelceller at foretage vurdering på. I tabel 3 ses at projektgruppen har vurderet VBT og UST næsten ens for PAP og MGG, men ved HE farvning scorer Cellient højest. Dorthe har benyttet højere karakterer for VBT og Cellient ved alle tre farvninger. I figur 4 og 5 har jeg illustreret differencen af farvekvalitet på alle oversigtsfarvning i histogrammer. Figur 4 viser differencen vurderet af projektgruppen, mens figur 5 er vurderinger af Dorthe. 29

31 Hyppighed Farve kvalitet differens (VBT - UST, Cellient - PT-koagel) (Projektgruppen) Interval 0 0 PAP n = 22 MGG n=22 HE n = 17 Figur 4 Differensplot der illustrerer differencen i karakter for farvekvalitet. Karakterer er afgivet af projektgruppen. Alle farvemetoder er medtaget. Differencen er udregnet som VBT UST, samt Cellient PT-koagel. Positive værdier er udtryk for højere karakter i VBT eller Cellient. Prøveantallet varierer, da jeg har ekskluderet prøver hvor der ikke fandtes mesotelceller. Figur 4 illustrerer at projektgruppen ved PAP farvning har vurderet UST med højere karakterer end VBT på 10 prøver. Ved MGG har projektgruppen ved 9 prøver vurderet UST bedst, mens det tilsvarende for VBT er 6 prøver. Ved HE farvning kan det ses at Cellient er foretrukket 6 gange, mens koaglet er foretrukket 9 gange. 30

32 Hyppighed Farve kvalitet differens (VBT - UST, Cellient - PT-koagel) (Dorthe) Interval PAP n = 20 MGG n=20 HE n = 19 Figur 5 Differensplot der illustrerer differencen i karakter for farve kvalitet. Karakterer er afgivet af Dorthe. Alle farvemetoder er medtaget. Differencen er udregnet som VBT UST, samt Cellient PT-koagel. Positive værdier er udtryk for højere karakter i VBT eller Cellient. Prøveantallet varierer, da jeg har ekskluderet prøver hvor der ikke fandtes mesotelceller. I figur 5 ses at Dorthe har scoret VBT højere end UST for både PAP og MGG, og ved HE farvning er Cellient foretrukket. Ved mikroskopering kommenterede projektgruppen immunfarvninger på Cellient og PT-koagel præparater og beskrev disse med kommentarer til hvert præparat samt en opsummering. Dorthe vurderede begge præparater, men foretog ikke en opsummering. Jeg vil ikke redigere Dorthes kommentarer ved at lave en opsummering. Derfor er begge Dorthes kommentarer medtaget i tabellerne 31

33 I tabel 4, 5, 6 og 7 ses kommentarerne grupperet efter antistof. Prøvenumme Antisto f r Vurderinger - Projektgruppen Vurderinger - Dorthe CK7 3 PT-Koaglet var bedst men meget lidt intenst farvet. Cellient: Cellient sparsomt og kun én positiv celle. Til gengæld flyt cytoplasmatisk reaktion PT-koagel: PT-Koagel bedst (flest celler og kraftig reaktion) 15 Der er mere af cytoplasma der er farvet ved PT-koaglet, hvilket gør den mindre specifik i farvningen. Cellient: Flot positiv reaktion i tumorcellerne, cellerne står tydeligst i Cellient. PT-koagel Flot positiv reaktion i tumorcellerne 18 Ringen ved cellemembranen er meget tyk ved PT-koagler, mens den er tyndere og finere ved cellient. Ved koagler er der langt flere positive celler at vurdere på, men kvaliteten er nok ikke Cellient: Positiv reaktion, mere sparsomt og man kan tydeligt se, at cellerne er mindre her PT-Koagel: Positiv reaktion nær så stor. 19 Svært at vurdere om celler i cellient virkelig er positiv. Mindre uspecifik baggrundsfarvning ved PT-koaglet Cellient: Mest baggrundsfarvning i Cellient. PT-Koagel: Positiv reaktion, PT-koagel bedst. Jeg har bedømt glas: som er det oprindelige glas er skåret dybere 29 Her virker det til at det er PT-koaglet der er bedst. Baggrunden er mere klar. Cellient: Kraftig positiv.pt- Koagel: Kraftig positiv Tabel 4 Kommentarer fra mikroskopering af henholdsvis projektgruppen og Dorthe for immunfarvning med CK7. For projektgruppen er der medtaget opsummering, mens Dorthe har medtaget kommentarer til både Cellient og PTkoagel præparater. Tabel 4 viser enighed om at koaglet er bedst ved prøve 3. Dorthe noterer for prøve 19 at koaglet er bedst og projektgruppen ligeledes om prøve 29. Ved prøve 15 noterer Dorthe at cellerne fremstår tydeligst ved Cellient. Der er enighed om, at Cellient ved prøve 19 fremviser uspecifik baggrundsfarvning. 32

34 Antistof Prøvenummer Vurderinger - Projektgruppen Vurderinger - Dorthe EMA 3 På trods af kvalitetsforskellen i prøverne, er det kun PT-koaglet der evt. kan påvise en malignitet Cellient: Cellient sparsomt materiale og kun få positive celler (Uspecifik reaktion?). PT-koagel: PT-koagel bedst. Flot positiv flage, men en del uspecifik baggrundsfarvning 15 Ved cellient immunet er der flere detaljer, og de er bedre at se på. Cellient: Cellient har kraftigere baggrundsfarvning og kernefarvningen med hæmatein er svær at se. PT-koagel: Flot positiv reaktion i begge. PT-koagel bedst 18 Begge farvninger er lige specifikke i farvningen, det er svært at sammenligne dem med så Cellient: Meget uspecifik farvning i Cellient, der gør det vanskeligt at se en svag reaktion i mesotelcellerne. PT-koagel: Bedst i PT-koagel få positive celler. 19 Ingen EMA bestilt på prøven 29 Cellient og PT-koaglet har ikke fået samme svar i denne prøve. Vi dobbelt tjekkede at begge prøver er farvet med samme protokol, og Cellient: Cellient ikke er overbevisende positivt pga. den kraftige uspecifikke baggrundsfarvning. PT-koagel:: Svag til moderat i PT-koagel. det er de. Tabel 5 Kommentarer fra mikroskopering af henholdsvis projektgruppen og Dorthe for immunfarvning med EMA. For projektgruppen er der medtaget opsummering, mens Dorthe har medtaget kommentarer til både Cellient og PTkoagel. På prøve 19 var der fra afdelingen ikke bestilt EMA. Tabel 5 viser at Dorthe og projektgruppen er enige om at koaglet er bedst i prøve 3, og Dorthe vurderer koaglet er bedst ved prøve 15 og 18. Dorthe noterer uspecifik baggrundsfarvning på Cellient præparater i prøve 15, 18 og

35 Prøvenumme Antisto f r Vurdering - Projektgruppen Vurdering Dorthe TTF1 3 PT-Koaglet har mere baggrundsfarvning end cellient. Cellient: Negativ Prøve. PT-koagel: Negativ prøve 15 Vi har her en positiv og negativ ved samme prøve. Mindre uspecifik baggrundsfarvning ved cellient end set Cellient: Cellient svag farvning og diffus baggrundsfarvning. PT-koagel: Kraftigst reaktion i PT-koagel. før. 18 Mere uspecifik baggrundsfarvning ved cellient end ved PT-koaglet. Cellient: Negativ Prøve. PT-koagel: Negativ prøve 19 Vi har svært ved at tolke om de begge er svært positive, eller om de er negative. Vi så en stor grad af uspecifik baggrundsfarvning ved Cellient og ingen Cellient: I Cellient ingen sikker positiv nukleær reaktion men kraftig uspecifik baggrundsfarvning. PT-koagel: Svag men tydelig nukleær reaktion i PT-koagel ved PT-koaglet. 29 Begge prøver negative Cellient: Negativ prøve, bedst i Cellient hvor der ikke er nogen baggrundsfarvning. PT-koagel: Negativ prøve Tabel 6 Kommentarer fra mikroskopering af henholdsvis projektgruppen og Dorthe for immunfarvning med TTF1. For projektgruppen er der medtaget opsummering, mens Dorthe har medtaget kommentarer til både Cellient og Koagel. I tabel 6 ses at Dorthe noterer kraftigst reaktion i PT-koagel præparater på prøve 15 og 19, og vurderer at Cellient er bedst i prøve 29. Der er uspecifik baggrundsfarvning på Cellient præparater i prøve 15 og 19, og for koagler i prøve

36 Antistof Prøvenummer Opsummering - Projektgruppen Opsummering - Dorthe Calretini n 3 Stor forskel på hvordan de positive celler ser ud. Ved PT-koaglet er de store plamager af farve, mens ved cellient virker det mere som en Cellient: Neg. Reaktion i begge dcs. Ingen mesotelceller. Cellient særdeles sparsomt. PTkoagel Neg. Reaktion i begge dvs. ingen mesotelceller kernefarvning. Der er stor forskel i farveintensiteten. 15 Stor forskel på cellebilledet ved de to præparater. Det ligner to forskellige prøver. Farveintensiteten er også meget forskellig hvor den er meget positiv ved PT-koagel celler og svag/moderat ved cellient. Cellient: Mange positive celler. Svag baggrundsfarvning. Farvninger er koncentreret omkring kernen. PT-koagel: Næsten alle celler er positive, i varierende grad. Det ser ud som om flere celletyper er farvet, da der er variation i hvor der er sket en farvning. Ved nogle er det en membran. 18 Stor forskel i antallet af positive celler. Dette skyldes ikke kun mængden af celler. Mere uspecifik baggrundsfarvning ved cellient Cellient: Meget uspecifik farvning i Cellient, der gør det vanskeligt at se en svag reaktion i mesotelcellerne. Materialet er sparsomt og der ses ingen sikre mesotelceller. PT-koagel: Bedst i PT-koagel 19 Svært at vurdere om celler i cellient virkelig er positiv. Mindre uspecifik baggrundsfarvning ved PT-koaglet Cellient: Cellient er vanskelig at aflæse pga. kraftig uspecifik farvning. PT-koagel: Positiv reaktion i få mesotelceller i PT-koagel 29 Stor forskel i farveintensitet, men mere detaljeret farvning ved Cellient. Cellient: I Cellient ses overvejsende en fin delikat nukleær reaktion - derfor bedst. PTkoagel. Særdeles positiv i cytoplasma i PTkoagel Tabel 7 Kommentarer fra mikroskopering af henholdsvis projektgruppen og Dorthe for immunfarvning med Calretinin. For projektgruppen er der medtaget opsummering, mens Dorthe har medtaget kommentarer til både Cellient og PT-Koagel. I tabel 7 ses at Dorthe vurderer at prøve 18 og 19 er bedst i PT-koaglet, mens Cellient præparater er bedst i prøve 29. Cellient præparater udviser uspecifik baggrundsfarvning ved prøve 18 og