Dobbelt immundiffusionstest for fødevarers indhold af æg.

Størrelse: px

Starte visningen fra side:

Download "Dobbelt immundiffusionstest for fødevarers indhold af æg."

Birthe Ludvigsen
2 år siden
Visninger:

Dobbelt immundiffusionstest for fødevarers indhold af æg. Indhold Kort introduktion til metoden 1 Lærevejledning 2 Elevvejledning 5 Kort introduktion til metoden Æg bruges i mange fødevarer som f.eks.

Den metode, der bruges her, er dobbelt immundiffusion. Princippet i en immundiffusion er, at der sker en udfældningsreaktion (præcipitation), når et antigen møder et tilsvarende antistof.

1 Dobbelt immundiffusionstest for fødevarers indhold af æg. Indhold Kort introduktion til metoden 1 Lærevejledning 2 Elevvejledning 5 Kort introduktion til metoden Æg bruges i mange fødevarer som f.eks. hamburger, pasta og mange is-typer. Mange er allergiske overfor æg- selv i meget små mængder. Det er muligt at spore minimale mængder af både blomme og hvide ved at bruge æg-albumin-antistof. Den metode, der bruges her, er dobbelt immundiffusion. Princippet i en immundiffusion er, at der sker en udfældningsreaktion (præcipitation), når et antigen møder et tilsvarende antistof. Ved at lade udfældningen ske i en gel, kan udfældningen ses som udfældningslinier eller buer hvor antigen og tilsvarende antistof mødes. Herved kan man teste for enkeltstoffer i forskellige blandinger (som f.eks. ovennævnte fødevarer). Udfældningerne sker, fordi antigen og antistof har mere end et bindingssted. Derved dannes der store sammenfiltrede (cross-linked) udfældninger i de zoner, hvor de mødes. Der skal være et passende forhold mellem mængden af antigen og antistof for at danne en tydelig udfældningsreaktion. Dobbelt-immundiffusion er meget specifik og følsom og benyttes nu til diagnoser, proteintests samt sammenligning af antigen og antistof. Vejledningen til forsøget er udarbejdet fra EIBE Unit 8, Praktisk Immunologi med tilladelse fra Birgit Sandermann Justesen. Biotech Academy BioCentrum-DTU Søltofts Plads DTU - Bygning Kgs. Lyngby bioteket@biocentrum.dtu.dk

2 Lærervejledning Formålet med forsøget er, at teste forskellige fødevarer for indhold af æg-albumin. Eleverne kan forestille sig, at de har været til en fest hvor en af deres klassekammerater pludseligt får fødevareallergi-symptomer og kommer på hospitalet. Denne person bliver her testet for diverse allergier og der konstateres æg-albumin allergi. Eleverne i klassen skal herefter forsøge at hjælpe deres kammerat ved at finde ud af hvilke fødevarer, der indeholder æg-albumin. Tidsforbrug 1. dag: 60 minutter plus natten over indtil der måtte være dannet linier/buer og så ca. 20 minutter til resultattest. En eventuel farvning af præparatet tager yderligere 2t45min. Sikkerhedskrav Der stilles ingen særlige sikkerhedskrav. Noter Brøndmønster det er nødvendigt at udstikke brøndene i et regulært mønster- se elevvejledning. Start ved kanten af gelen, så der eventuelt kan blive plads til flere tests på samme plade. Brug et sugerør eller en tilskåret plastikpipette til at udstikke brøndene. Der dannes hurtigere udfældninger, hvis afstanden mellem brøndene er lille: 5mm afstand vil vise resultater efter ca. 24 timer mens afstand på 10mm vil vise resultater efter 48 timer. Efter første dag Hvis der benyttes objektglas og det er varmt i laboratoriet, må objektglassene opbevares fugtigt, f.eks. i en lukket petriskål med et fugtet filterpapir. Skal de opbevares i flere dage, anbefales det at tilsætte papiret en smule konserveringsmiddel (f.eks. Atamon) for at hæmme skimmeldannelse. Pas på ikke at skade gelen. Objektglassene er klare efter et døgn, men kan opbevares op til en uge i køleskab. Referenceopløsning Da det kan være vanskeligt at lave referenceopløsningen, kan det være en god ide først at piske lidt æggehvide; det flydende herfra kan anvendes hertil. Side 2

3 Æg-albumin antistof Frysetørret antistof opløses i TRIS-buffer; vejledning hertil følger med det leverede antistof. Den afmålte oplæsning placeres i eppendorfrør, som opbevares i fryseren. Affald Alt affald skal behandles som almindeligt affald. Farvning Det er ikke nødvendigt at farve præparaterne, men det kan hjælpe til at se resultaterne tydeligere. Amido-black eller Coomassie-Blue kan anvendes til dette formål og kan købes i mange større kemikalievirksomheder. Udstyr og materialer -Agaroseopløsning (1% i TRIS-buffer) -Centrifuge -Eddikesyre (konc.) -Eppendorfrør -Filterpapir -Fugtkammer til opbevaring af objektglas (f.eks. petriskål med fugtet filterpapir) -Kanin-antiserum mod æg-albumin (Pharmacia AS-23) -Lille blender -Methanol -Mikropipetter: 0-10 ml -NaCl (0,9% opløsning) -Objektglas eller små petriskåle (5cm i diameter) -Referenceopløsning (0,01% æggehvide opløst i ionbyttet vand) -Tilskårne plastikpipetter (2,5mm i diameter) til brøndudstikning -TRIS-buffer 0,01M, ph 8. Følgende ting skal kun bruges hvis præparaterne skal farves: -Amido-black opløsning (0,1g Amido-black opløst i 100mL blanding af eddikesyre, methanol og ionbyttet vand (i forholdet 10:70:20) eller Coomassie Brilliant Blue opløsning -Affarver (eddikesyre, methanol og ionbyttet vand i forholdet 10:70:20) -Farveglas til gelfarvning -Hårtørrer -Vægt, max. 1kg Side 3

4 Elevvejledning For et par dage siden var din klasse til fødselsdagsfest med fin middag og alt hvad der dertil hører. Til dessert blev der serveret en lækker chokolademousse som de fleste af jer spiste med stor fornøjelse. Men lige pludseligt bliver en af dine klassekammerater utilpas og hæver kraftigt op i svælget og får derved vejrtrækningsproblemer. Personen bliver straks kørt på hospitalet og senere bliver det her konkluderet, at personen lider af allergi overfor æg. Allergi overfor æg er blot en af de fødevareallergier mange danskere lider af. Fødevareallergi vil, ved kontakt med de indholdsstoffer som man ikke kan tåle, udløse en reaktion der kan have forskellige symptomer som kløe på hud og i øjne, astmasymptomer samt kraftige mavesmerter med opkast og diarré i slemme tilfælde. Du kan læse mere om fødevareallergi her: Der findes utroligt mange fødevarer der indeholder bestanddele fra æg og det er ikke altid helt åbenlyst hvilke det drejer sig om. I denne øvelse skal du derfor teste forskellige fødevarer for indhold af æg så din stakkels klassekammerat ved med sikkerhed, hvad der kan spises og hvad der bør udelades. Metoden du skal anvende er dobbelt immundiffusion, som er beskrevet i afsnittet om immunkemiske metoder (LINK). Her vil du anvende antistoffer overfor æg og direkte teste forskellige fødevarer på en agarose gel hvor antistofferne og antigenerne vil have mulighed for at diffundere mod hinanden og danne en udfældningslinie. Fremgangsmåde Tilberedning af prøver 1. 5g prøve i 5mL vand blendes grundigt 2. Centrifuger blandingen i 15 min ved 6000 omdrejninger/min (eller 10min ved 9500 omdrejninger/min) 3. Filtrere supernatanten gennem et stykke stof ned i et reagensglas. Side 4

5 Gelstøbning 4. Opløs under opvarmning og omrøring den nøjagtige mængde agarose i TRISbuffer (1%). Til en 5cm petriskål bruges 3-5 ml og til objektglas 3,5 ml. PAS PÅ- DET KOGER LET! 5. Afkøl til Placer petriskål/objektglas på et bord tæt på kanten og fjern låget. 7. Hæld den varme gel i petriskålen/objekglasset så den får en højde på ca. 2mm og tildæk. 8. Lad gelen størkne- det tager 5-10 min. Udstik brøndene 9. Brug den tildannede plastikpipette til at udstikke brøndene med en diameter på ca. 2,5mm. Brøndsiderne skal være lodrette! Fjern den udstukne gel ved hjælp af en nål eller sug med pipetten. Lav et af disse brøndmønstre: Tilsæt antistof 10. Nummerer brøndene med en spritpen på undersiden af glasset/skålen 11. Fyld brønden i midten med antistof (anti-æg-albumin). OVERFYLD IKKE BRØNDEN! Tilsæt antigen 12. Fyld hver anden af de ydre brønde med antigen. OVERFYLD IKKE BRØNDENE! 13. Fyld de resterende brønde med dine prøver. Noter hvilke prøver der er i de forskellige brønde. OVERFYLD IKKE BRØNDENE! Lad væsken diffundere gennem gelen natten over i fugtkammeret, enten ved stuetemperatur eller i køleskabet 14. Dagen efter kan du iagttage de hvide linier/buer (udfældningszoner i positive tilfælde), når du holder skålene/glassene mod en mørk baggrund. Farvning (hvis det ønskes) 15. Fjern de ikke-udfældede proteiner ved at placere gelen i en 0,9% NaClopløsning i 60 min ved stuetemperatur. 16. Erstat saltopløsningen med ionbyttet vand og lad det trække i endnu 60 min Side 5

6 17. Fjern vandet og pres resten af vandet ud på følgende måde: læg 10 lag filterpapir forsigtigt oven på gelen og læg max 1kg pres på i 15 min 18. Tør gelen med en hårtørrer 19. Dæk gelen med en farveopløsning i ca. 10 min 20. Fjern farveopløsningen og affarv overskudsfarve med affarveopløsningen i 10 min. Gentag evt. affarvningsprocessen. Resultater Målegrænsen for æggehvide er 2,5mg i 100g prøve. Hvis der er nok kyllingeprotein i prøven, kan du iagttage udfældninger. Æggeblomme indeholder æggehvideproteiner nok til, at udfældning også er mulig. Side 6

Relaterede dokumenter

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA sekvens,