CYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm)

Transkript

1 Opgave 1 Leveren spiller en central rolle i lipid metabolismen og i opretholdelse af lipid homeostasen i hele kroppen. Lipidmetabolismen er fejlreguleret hos blandt andet svært overvægtige personer samt hos diabetikere. Galdesyresyntese i leveren, som udgør hovednedbrydningsvejen i cholesterol katabolismen, er reguleret af enzymet cholesterol 7α-hydroxylase (kodet fra genet CYP7A1). Mængden af galdesyre og dens udskillelse er forøget i humane diabetikere og i diabetiske dyremodeller. Behandling med insulin normaliserer mængden og syntesen af galdesyre. Vi vil i denne opgave fokusere på regulering af CYP7A1 ekspression i henholdsvis rotte og menneske. For at bestemme, hvorledes insulin koncentrationen påvirker mængden af CYC7A1 mrna, blev der udført et real-time PCR eksperiment med TaqMan kemi. Spm. A: Beskriv de enkelte trin i et real-time PCR forsøg baseret på Taqman kemi. Du har celler, samt alle de reagenser du ønsker til rådighed. Figur 1 viser resultatet af et realtime PCR eksperiment udført med TaqMan kemi. Udgangsmaterialet for forsøget er hepatocytter (leverceller) fra en human donor. RNA blev isoleret fra disse hepatocytter efter dyrkning 3 timer in vitro i fravær af insulin eller 3 timer i tilstedeværelse af 0,1 nm insulin. Der blev lavet real time PCR med CYP7A1 og Ubiquitin C (UBIC) specifikke primere og prober. UBIC regnes for konstitutivt udtrykt i hapatocytter. CYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm) UBIC (0 nm) Figur 1: Resultatet af et real-time PCR forsøg udført med TaqMan kemi på RNA isoleret fra hepatocytter dyrket i tilstedeværelse af 0 nm insulin eller 0,1 nm insulin i 3 timer. C t værdierne for de to amplificerede produkter er : CYP7A1 (0 nm insulin) = 17,1; CYP7A1 (0,1 nm insulin) = 17,0; UBIC (0 nm insulin) = 21,6; UBIC (0,1 nm insulin) = 23,1. 1

2 Spm. B: Beregn, under forudsætning af at amplifikationseffektiviteten er 100% for alle PCR produkter generet under forsøget i Figur 1, forholdet mellem CYP7A1 mrna i hepatocytter dyrket i tilstedeværelse af 0,1 nm insulin og CYP7A1 mrna i hepatocytter dyrket i tilstedeværelse af 0 nm insulin. Real-time PCR data, som de i Figur 1 viste, blev brugt til at undersøge effekten af insulin på CYP7A1 og PEPCK (fosfoenolpyruvat carboxykinase) mrna i humane hepatocytter dyrket i tilstedeværelse af forskellige insulinkoncentrationer. PEPCK er medtaget som en kontrol. Resultaterne er vist i Figur 2. Figur 2: Effekten af insulin på CYP7A1 og PEPCK mrna i hepatocytter dyrket i forskellige koncentrationer af insulin i 2 timer bestemt ved real-time PCR. CYP7A1 og PEPCK mrna mængderne er hver sat til 1 for celler dyrket i 0 nm insulin. Spm. C: Hvad viser data i Figur 2? Tidligere studier har vist, at transkriptionsfaktoren FoxO1 binder til et insulin respons element (IRE) i promotorerne for glukose-6-fosfatase, insulin-lignende vækstfaktor bindende protein-1, samt tyrosin aminotransferase og medierer derved insulins hæmmende effekt på transkription fra disse promotorer. Bindingen sker til konsensussekvensen T(G/A)TTT(T/G)(G/T). En bioinformatisk analyse af CYP7A1 promotoren fra rotte og menneske identificerede de i Figur 3A viste potentielle IRE elementer. Figur 3B og C viser resultatet af EMSA assays med oligonukleotider indeholdende disse konsensussekvenser samt in vitro fremstillet FoxO1 eller FoxA1 protein. FoxA1 vides at binde nogle IRE elementer og er medtaget som en kontrol. 2

3 Figur 3: A, potentielle IRE elementer i enten rotte (rat) CYP7A1, human CYP7A1 eller den humane Glukose-6-fosfatase (G6Pase) promoter samt en konsensus sekvens. B, EMSA assay med de angivne [ 32 P]-mærkede prober og in vitro fremstillet (TNT lysate) FoxO1 eller FoxA1 protein. +, angiver tilstedeværerelse af FoxO1 eller FoxA1 protein; - angiver fravær af FoxO1 eller FoxA1 protein. T3 og T7 angiver, at TNT lysatet ikke indeholder FoxO1 eller FoxA1 protein. C, EMSA assay med in vitro fremstillet (TNT lysate) FoxO1 eller FoxA1 protein samt [ 32 P]-mærket vildtype rotte CYP7A1 IRE2, mutant IRE2 eller G6Pase prober. + og angiver om de viste komponenter er tilstede eller ej i det enkelte EMSA assay. Competitor, angiver om der er tilsat 100 ganges molært overskud af de angivne kolde oligonukleotider i forhold til de [ 32 P]-mærkede. Spm. D: Hvad viser data i Figur 3? 3

4 For at undersøge reguleringen af rotte CYP7A1 promotoren blev der fremstillet de i Figur 4 viste plasmider, som blev transient transficeret i en levercellelinje, HepG2. Data i Figur 5 viser resultaterne fra dette forsøg. Figur 4: Strukturen af plasmider brugt til forsøget i Figur 5. plucwt, vildtype rotte CYP7A1 promotoren fusioneret til luciferase cdna. De 4 potentielle IRE elementer er angivet. plucmut, magen til plucwt bortset fra at nukleotidsekvensen for det potentielle IRE element, IRE2, er ændret til den i Figur 3C brugte mutant rire2 oligo. Det muterede IRE2 element er angivet med *. pfoxo1, et plasmid indeholdende en konstitutiv CMV (cytomegalus-virus) promoter og FoxO1 cdna. pcontrol, som pfoxo1, bortset fra at FoxO1 cdnaet er fjernet. placz, et plasmid indeholdende en konstitutiv CMV promoter og lacz cdna. 4

5 Figur 5: Relative luciferaseaktiviteter (Reporter Activity) i HepG2 celler transient co-transficeret med en blanding af plucwt, placz samt enten pfoxo1 eller pcontrol eller en blanding af plucmut, placz og enten pfoxo1 eller pcontrol. Den relative luciferaseaktivitet er defineret som ratioen imellem luciferaseaktivitet per mg celleekstrakt og β-galaktosidaseaktivitet per mg celleekstrakt. WT, er de portioner celler der er transficeret med en plasmidblanding indeholdende plucwt, medens IRE2 mutant angiver at cellerne er transficeret med en plasmidblanding indeholdende plucmut. FoxO1, angiver de portioner celler, der er transficeret med en plasmidblanding indeholdende pfoxo1. Control, angiver de portioner celler, der er transficeret med en plasmidblanding indeholdende pcontrol.* angiver, at der er statistisk signifikant forskel på samhørende FoxO1 og kontrol data. Spm. E: Hvad viser data i Figur 5? For at undersøge regulering af den humane CYP7A1 promoter blev der fremstillet en række plasmider, hvori der var fjernet dele af promoterregionen. Resultatet af co-transfektion i HepG2 celler med hvert af disse plasmider og placz plasmidet fra Figur 4 og pfoxo1 eller pcontrol er vist i Figur 6. 5

6 pcontrol pfoxo1 Figur 6: Relative luciferaseaktiviteter målt i HepG2 celler-transient co-transficeret med placz plasmidet fra Figur 4 og plasmider indeholdende derivater af den humane CYPA1 promotor fusioneret til luciferase cdna samt enten pcontrol eller pfoxo1 plasmidet. Fusionerne ph1887, ph371, ph150, ph135 og ph80 indeholder 1887, 371, 150 eller 80 nukleotider opstrøms for transkriptionsstartsitet af CYP7A1 genet fusioneret til luciferase cdna. pgl3 indeholder luciferase cdna uden CYP7A1 promotersekvens. Strukturen af pfoxo1-og pcontrol plasmiderne er vist i Figur 4. *, angiver, at der er statistisk signifikant forskel på samhørende pcontrol og pfoxo1 resultater. Spm. F: Hvad viser data i Figur 6? Det viser sig, at det promoterområde, der er nødvendig for FoxO1 afhængig regulering af den humane CYP7A1 promotor, er kendt som bindingssite for transkriptionsfaktoren HNF4α. For at undersøge den molekylære mekanisme bag den FoxO1 og HNF4α afhængige regulering af den humane CYP7A1 promoter blev der fremstillet de i Figur 7 viste plasmider. 6

7 Figur 7: Strukturen af puasluc som indeholder 5 bindingssites (G) for gærens GAL4p transkriptionsfaktor, en minimal promoter (P TK ) samt luciferase cdna. pgal4-hnf4α indeholder en konstitutiv CMV promoter fusioneret til hybrid cdna kodende for en in frame fusion mellem det DNA bindende domæne (GAL4 DNA ) af GAL4p transkriptionsfaktoren fra gær og det transkriptionsaktiverende domæne (HNF4α TA ) af HNF4α proteinet. Data i Figur 8 viser resultatet af forsøg hvor HepG2 celler er transient cotransficeret med puasluc, placz og kombinationer af plasmider der udtrykker henholdsvis FoxO1, PGC-1α eller GAL4 DNA -HNF4α TA. PGC-1α er en transkriptionel co-aktivator. 7

8 Figur 8: Hep2G celler blev transient co-transficeret med puasluc, placz og de viste kombinationer af plasmider der konstitutivt udtrykker henholdsvis PGC-1α (ppgc-1α), FoxO1 (pfoxo1) eller Gal4 DNA - HNF4α TA (pgal4-hnf4α). Der er til alle forsøg brugt den samme mængde puasluc, placz, pgal4-hnf4α og ppgc-1α plasmid. Der er brugt stigende mængder af pfoxo1 plasmid, hvilket er angivet som ( ). *, angiver at der er statistisk signifikant forskel relativt til søjlen længst til venstre (Gal4-HNF4α +, PGC-1α +, FoxO1 -). Spm. G: Hvad viser data i Figur 8? Figur 9 viser i skematiseret form resultatet af western blot analyse af protein ekstraheret fra hele humane hepatocytter eller protein fra oprensede humane hepatocyt kerner. Til fremkaldelse af western blottene er anvendt antistoffer rettet mod FoxO1, fosforyleret FoxO1, HNF4α eller Aktin. 8

9 Figur 9: Western blot udført på protein isoleret fra humane hepatocytter dyrket i tilstedeværelse af 10 nm insulin i de angivne antal timer. Alle western blot er lavet på hele celleekstrakter (indeholder alle cellens proteiner) fra hepatocytter med undtagelse af forsøget FoxO1 (kerne) hvor der er brugt oprenset kerneprotein. P-FoxO1, brugt et antistof rettet mod fosforyleret FoxO1 protein; FoxO1, brugt et antistof der genkender både fosforyleret og ikke-fosforyleret FoxO1 protein; HNF4α, brugt et antistof rettet mod HNF4α; Aktin, brugt et antistof rettet mod aktin. Aktin antages at være konstitutivt udtrykt i hepatocytter. Spm. H: Hvad viser data i Figur 9? 9