therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog

Transkript

1 November 2013 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 24 Version 1 Til in vitro-diagnostisk brug Til brug med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Storbritannien R DA Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyseteknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder inden for: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nucleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyseteknologier Vores opgave er at sætte dig i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information henvises til

3 Indhold Tilsigtet brug 5 Opsummering og forklaring 5 Procedureprincip 6 Analyser 7 Kontroller 7 Medfølgende materialer 9 Kit-indhold 9 Nødvendige materialer, som ikke medfølger 10 Advarsler og forholdsregler 11 Sikkerhedsinformationer 11 Generelle forholdsregler 11 Opbevaring og håndtering af reagenser 12 Prøveopbevaring og -håndtering 12 Procedure 13 DNA-ekstrahering og -klargøring 13 Protokoller: Prøvevurdering 14 Påvisning af BRAF-mutation 21 Rotor-Gene Q BRAF-opsætning 28 Resultater 35 Dataanalyse af prøvevurdering 35 Dataanalyse af BRAF-mutationspåvisning 37 Bemærkninger til datafortolkning 44 Fejlfindingsvejledning 49 Kvalitetskontrol 50 Begrænsninger 50 Ydelsesegenskaber 51 Tomgrænse (LOB), arbejdsområde og cut-off-værdier 51 Nøjagtighed: Sammenligning med den analytiske referencemetode 52 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013 3

4 Effekt af input-dna på CT-værdier 52 Krydsreaktivitet 54 Værdier for påvisningsgrænse (LOD) 54 Effekten af melanin på kittets resultater 55 Repeterbarhed 56 Reproducerbarhed 56 Symboler 58 Kontaktoplysninger 59 Bestillingsinformation 60 4 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

5 Tilsigtet brug therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er en in vitro-diagnostisk test, som er beregnet til påvisning af fem somatiske mutationer i BRAF-genet, og som giver en kvalitativ vurdering af mutationens status. Der ekstraheres DNA fra formalinfikseret, paraffinindstøbt (FFPE) tumorvæv, som testes ved hjælp af real-time polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet. therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er beregnet til at hjælpe lægen med at identificere patienter med cancer, som måske vil have gavn af målrettet behandling med BRAF, som f.eks. vemurafenib. Tabel 1. Liste over mutationer og COSMIC-id'er* Mutation Basisændring COSMIC-id V600E GTG>GAG 476 V600E-kompleks GTG>GAA 475 V600D GTG>GAT 473 V600K GTG>AAG 474 V600R GTG>AGG 477 * COSMIC-id'er stammer fra Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: Opsummering og forklaring therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er et brugsklart kit til påvisning af fem somatiske mutationer i BRAF-genet ved hjælp af real-time polymerasekædereaktion på Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet. Ved hjælp af ARMS - (Amplification Refractory Mutation System) og Scorpions - teknologier kan therascreen BRAF RGQ PCR-kittet påvise følgende mutationer i codon 600 i BRAF-onkogenet mod en baggrund af vildtype-genomisk DNA. V600E V600E-kompleks (V600Ec) V600D V600K V600R therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013 5

6 De anvendte metoder er meget selektive, og afhængigt af den samlede mængde af DNA muliggør de påvisning af en lav procentdel af mutanter mod en baggrund af vildtype-genomisk DNA. Disse selektivitets- og påvisningsgrænser er overlegne i forhold til teknologier som farveterminatorsekventering. Procedureprincip therascreen BRAF RGQ PCR-kittet bruger to teknologier ARMS og Scorpions til at påvise mutationer i en real-time PCR-analyse. ARMS Allele- eller mutationsspecifik forstærkning opnås ved hjælp af ARMS. Taq DNApolymerase (Taq) er effektiv til at skelne mellem en match og en fejlmatch i 3'- enden af en PCR-primer. Specifikke muterede sekvenser forstærkes selektivt, selv i prøver hvor størsteparten af sekvenserne ikke bærer mutationen. Når primeren er fuldstændigt matchet, fortsætter forstærkningen med fuld effektivitet. Når 3'- basen ikke er matchet, forekommer der kun baggrundsforstærkning på et lavt niveau. Scorpions Påvisning af forstærkning udføres med Scorpions. Scorpions er bifunktionelle molekyler, der indeholder en PCR-primer, som er kovalent kædet til en fluorescensmærket probe. Fluoroforen i proben er knyttet til en quencher, der også er indeholdt i proben, hvilket reducerer fluorescensen. Når proben binder sig til amplikonen under PCR, bliver fluoroforen og quencheren adskilt. Det fører til en målbar øget fluorescens i reaktionsrøret. Kitformat Der leveres fem analyser med therascreen BRAF RGQ PCR-kittet. En kontrolanalyse (Control Reaction Mix (kontrolreaktionsblanding), CTRL) Fire mutationsanalyser (mutantreaktionsblandinger; V600E/Ec, V600D, V600K, V600R) V600E/Ec-analysen påviser både V600E- og V600Ec-mutationer, men skelner ikke mellem dem. Alle reaktionsblandinger er dobbelte og indeholder reagenser til påvisning af mål, der er mærket med FAM, og en intern kontrol, der er mærket med HEX. Den interne kontrolanalyse kontrollerer tilstedeværelse af hæmmere, der kan medføre falsk-negative resultater. 6 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

7 Analyser therascreen BRAF RGQ PCR-kittet indebærer en totrinsprocedure. I første trin udføres kontrolanalysen for at bedømme det samlede BRAF DNA, der kan forstærkes, i prøven. I andet trin udføres både mutations- og kontrolanalyser for at påvise eller afvise tilstedeværelsen af mutant DNA. Kontrolanalyse Kontrolanalysen, der er mærket med FAM, anvendes til vurdering af det samlede BRAF DNA, der kan forstærkes, i prøven. Denne kontrolanalyse forstærker en region af exon 3 af BRAF-genet. Primerne og Scorpions-proben er designet til at forstærke uafhængigt af alle kendte BRAF-polymorfismer. Mutationsanalyser Hver mutationsanalyse indeholder en FAM-mærket Scorpions-probe og en ARMS-primer for at skelne mellem vildtype-dna og en bestemt mutant-dna. Kontroller Bemærk: Alle prøvekørsler skal indeholde positive og negative kontroller. Positiv kontrol Hver kørsel skal indeholde en positiv kontrol i rør 1-5. therascreen BRAF RGQ PCR-kittet indeholder positiv kontrol (PC) for BRAF, der skal bruges som skabelon i den positive kontrolreaktion. De positive kontrolresultater vil blive vurderet for at sikre, at kittet fungerer korrekt inden for de erklærede acceptkriterier. Negativ kontrol Hver kørsel skal indeholde en negativ kontrol ( kontrol uden skabelon ) i rør therascreen BRAF RGQ PCR-kittet indeholder vand til NTC (NTC), der skal bruges som skabelon i kontrollen uden skabelon. Ikke-skabelonkontrollen bruges til at bedømme eventuelle potentielle kontamineringer under kørselsopsætningen og til at vurdere den interne kontrolreaktions ydelse. Bedømmelse af intern kontrolreaktion Hver reaktionsblanding indeholder en intern kontrol ud over målreaktionen. En fejl angiver enten, at der er hæmmere til stede, som kan medføre unøjagtige resultater, eller at der er opstået en operatøropsætningsfejl for det pågældende rør. Hvis den interne kontrol mislykkes, se Prøveanalyse Mutationsanalyser i prøvens interne kontrol Yellow CT-værdi, side 41. Hvis den mislykkede interne kontrol skyldes PCR-hæmning, kan fortynding af prøven reducere hæmmernes effekt, men man skal være opmærksom på, at dette også vil fortynde DNA-målet. Der medfølger et rør med vand til therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013 7

8 fortynding (Fort.) af prøven i kittet. Fortynding af prøver skal udføres med vand til fortynding af prøven (Fort.). Prøvevurdering Det anbefales på det kraftigste at anvende den kontrolreaktionsblanding (Control Reaction Mix (CTRL)), der leveres med therascreen BRAF RGQ PCRkittet, til vurdering af det samlede BRAF DNA, der kan forstærkes, i en prøve. Denne kontrolanalyse forstærker en region af exon 3 af BRAF-genet. Det anbefales kun at opsætte prøverne med kontrolanalysen med den positive kontrol (PC) for BRAF som positiv kontrol og vand til NTC (NTC) som ikkeskabelon-kontrol. Bemærk: DNA-vurderingen skal baseres på PCR og kan afvige fra kvantificering baseret på absorbansmålinger. Der medfølger ekstra kontrolreaktionsblanding (Control Reaction Mix (CTRL)) for at muliggøre vurdering af kvaliteten og kvantiteten af DNA'et i prøverne inden analyse med therascreen BRAF RGQ PCR-kittet. 8 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

9 Medfølgende materialer Kit-indhold therascreen BRAF RGQ PCR-kit (24) Katalognr Antal reaktioner 24 Control Reaction Mix (Kontrolreaktionsblanding) Rød 1 CTRL µl V600E/Ec Reaction Mix (Reaktionsblanding) Lilla 2 V600E/Ec 720 µl V600D Reaction Mix (Reaktionsblanding) V600K Reaction Mix (Reaktionsblanding) V600R Reaction Mix (Reaktionsblanding) BRAF Positive Control (Positiv kontrol for BRAF) Taq DNA Polymerase (Taq DNA-polymerase) Water for NTC (Vand til NTC) Water for Sample Dilution (Vand til fortynding af prøven) Orange 3 V600D 720 µl Lyserød 4 V600K 720 µl Grøn 5 V600R 720 µl Beige PC 250 µl Mintgrøn Taq 138 µl Hvid NTC 1,9 ml Hvid Fort. 1,9 ml therascreen BRAF RGQ PCR Kit Handbook (engelsk) 1 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013 9

10 Nødvendige materialer, som ikke medfølger Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS'er), som kan fås hos produktets leverandør. Reagenser QIAamp DNA FFPE Tissue-kit (QIAGEN, katalognr , se DNA-ekstrahering og -klargøring, side 13) Xylen Ethanol ( %)* Forbrugsvarer 1,5 ml eller 2 ml mikrocentrifugeringsrør (til lysistrin) 1,5 ml mikrocentrifugeringsrør (til elueringstrin) (fås fra Brinkmann [Safe-Lock, katalognr ], Eppendorf [Safe-Lock, katalognr ] eller Sarstedt [Sikkerhedshætte, katalognr ]) Dedikerede pipetter (justerbare) til prøveklargøring Dedikerede pipetter (justerbare) til klargøring af PCR-masterblanding Dedikerede pipetter (justerbare) til dispensering af DNA-skabelon Sterile pipettespidser med filtre (for at undgå krydskontaminering anbefaler vi pipettespidser med aerosolbarriere) Udstyr Thermomixer, opvarmet orbital inkubator, varmeblok eller vandbad, der kan inkubere ved 90 C Bordcentrifuge med rotor til 2 ml reaktionsrør Vortex Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM med fluorescenskanaler til Cycling Green (Cyklus grøn) og Cycling Yellow (Cyklus gul) (påvisning af hhv. FAM og HEX) * Der må ikke bruges denatureret alkohol, som indeholder andre stoffer som f.eks. metanol eller methylethylketon. Dette er ikke en fuldstændig liste over leverandører. Kontrollér, at instrumenterne er kontrolleret og kalibreret i henhold til producentens anbefalinger. 10 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

11 Rotor-Gene Q-software version ,1 ml båndrør med hætter til brug med rotor med 72 brønde (QIAGEN, katalognr eller ) Sterile mikrocentrifugeringsrør til klargøring af masterblandinger Isætningsblok 72 0,1 ml rør, aluminiumsblok til manuel opsætning af reaktioner med enkeltkanalspipette (QIAGEN, katalognr ) Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnostisk brug Sikkerhedsinformationer Når der arbejdes med disse eller ethvert kemisk reagens, anbefaler vi at bruge handsker, laboratoriekitler og beskyttelsesbriller. QIAGEN påtager sig intet ansvar for skader som følge af håndtering af eller kontakt med dette produkt. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (Safety Data Sheets, SDS'er). Disse er tilgængelige online i et praktisk og kompakt PDF-format på adressen hvor det er muligt at finde, få vist og udskrive SDS'et for hvert QIAGEN-kit og hver kitkomponenter. 24-timers nødtelefon Det er hjælp tilgængelig 24 timer i døgnet ved kemiske nødstilfælde eller ulykker på: CHEMTREC Uden for USA og Canada Tlf.: (modtager betaler accepteres) Generelle forholdsregler Brugeren skal altid være opmærksom på følgende: Positive materialer (prøver og positive kontroller) skal opbevares og ekstraheres separat fra alle andre reagenser og tilsættes reaktionsblandingen på et separat sted. Udvis ekstrem forsigtighed for at forhindre forurening af PCR'er med syntetisk kontrolmateriale. Vi anbefaler at bruge separate, dedikerede pipetter til klargøring af reaktionsblandinger og tilføjelse af DNA-skabelon. Klargøring og dispensering af reaktionsblandinger skal udføres i et område, som er adskilt fra skabelontilføjelsen. Rotor-Gene Q-rørene må therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

12 ikke åbnes, når PCR-kørslen er afsluttet. Dette er for at forhindre kontaminering af laboratoriet med produkter efter PCR. Reagenserne til therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er fortyndet optimalt. Vi anbefaler ikke at fortynde reagenserne yderligere, da det kan resultere i tab af ydelse. Vi anbefaler ikke, at der bruges reaktionsvolumener på mindre end 25 µl, da det øger risikoen for falsk-negative resultater. Alle reagenser i therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er formuleret specifikt til optimal ydelse. Alle reagenser, der leveres med therascreenbraf RGQ PCR-kittet, er udelukkende beregnet til brug sammen med de øvrige reagenser i det samme therascreen BRAF RGQ PCR-kit. Hvis der skal opnås optimal ydelse, må reagenserne i kittet ikke udskiftes. Brug kun den Taq DNA-polymerase (Taq), der findes i kittet. Den må ikke udskiftes med Taq DNA-polymerase fra andre kit af den samme eller en anden type eller med Taq DNA-polymerase fra en anden leverandør. Opbevaring og håndtering af reagenser therascreen BRAF RGQ PCR-kittet forsendes på tøris og skal stadig være frosset ved modtagelse. Hvis therascreen BRAF RGQ PCR-kittet ikke er frosset ved modtagelse, hvis den ydre emballage har været åbnet under transporten, eller hvis forsendelsen ikke indeholder en følgeseddel, denne håndbog eller reagenserne, skal der rettes henvendelse til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden, eller besøg therascreen BRAF RGQ PCR-kittet skal straks efter modtagelse opbevares ved -15 C til -30 C i en fryser med konstant temperatur og beskyttes mod lys Scorpions (som det er tilfældet med alle fluorescensmærkede molekyler) skal beskyttes mod lys for at undgå fotoblegning og tab af ydelse. Ved opbevaring i den oprindelige emballage under de anbefalede opbevaringsbetingelser er kittet stabilt indtil den udløbsdato, der er angivet på etiketten. Undgå gentagen optøning og indfrysning. Et reagens må højst nedfryses og optøs 6 gange. Prøveopbevaring og -håndtering Bemærk: Alle prøver skal behandles som potentielt infektiøst materiale. Prøvemateriale skal være humant genomisk DNA, ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejret (FFPE) væv. Prøverne skal transporteres i henhold til standardmetoder inden for patologien for at sikre prøvernes kvalitet. 12 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

13 Tumorprøver er uhomogene, og data fra én tumorprøve vil muligvis ikke være samstemmende med data fra andre præparater fra den samme tumor. Tumorprøver kan også indeholde ikke-tumorvæv. DNA fra ikke-tumorvæv forventes ikke at indeholde de mutationer, der detekteres af therascreen BRAF RGQ PCR-kittet. Procedure DNA-ekstrahering og -klargøring DNA-isolation skal udføres ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue-kit (QIAGEN, katalognr ). Bemærk: therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er udviklet til brug sammen med QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet med manuel ekstraheringsteknik. For at sikre optimal ydelse anbefales det ikke at bruge andre ekstraheringsprodukter og automatiserede systemer. DNA-oprensningen skal udføres i henhold til instruktionerne i QIAamp DNA FFPE Tissue Håndbog med følgende ændringer. Indsaml FFPE-præparater på objektglas. Skrab overskydende paraffin bort rundt om vævsprøverne med en ny, steril skalpel. Skrab vævspræparatet ind i mikrocentrifugeringsrørene med en ny skalpel for hver prøve, der ekstraheres. Det oprensede genomiske DNA skal elueres i µl ATE-buffer (findes i QIAamp DNA FFPE Tissue-kittet). Opbevar det oprensede genomiske DNA ved -15 C til -30 C. DNA-vurderingen skal baseres på den kontrolreaktionsblanding (Control Reaction Mix (CTRL)), der leveres i therascreen BRAF RGQ PCR-kittet og kan afvige fra kvantificering baseret på absorbansmålinger. Der medfølger ekstra kontrolreaktionsblanding (Control Reaction Mix (CTRL)) for at muliggøre vurdering af kvaliteten og kvantiteten af DNA'et i prøverne inden analyse med therascreen BRAF RGQ PCR-kittet. Bemærk: For at sikre tilstrækkeligt DNA til analyse anbefales det. at mindst to FFPE-glas ekstraheres samtidigt i første omgang og vurderes sammen med kontrolanalysen. Hvis der ikke opnås tilstrækkeligt DNA for PCR, kan yderligere glas ekstraheres, og DNA'et pooles. Bemærk: For at sikre tilstrækkeligt DNA til analyse skal FFPE-præparater være mindst 5 µm tykke. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

14 Alle analyser i therascreen BRAF RGQ PCR-kittet genererer korte PCR-produkter. therascreen BRAF RGQ PCR-kittet fungerer imidlertid ikke med meget fragmenteret DNA. Protokol: Prøvevurdering Denne protokol bruges til vurdering af det samlede DNA, der kan forstærkes, i prøver. Vigtige anvisninger før start Gennemlæs Generelle forholdsregler, side 11, før proceduren påbegyndes. Sørg for at være fortrolig med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet, før protokollen påbegyndes. Se brugerhåndbogen til instrumentet. Taq DNA-polymerasen (Taq) eller blandinger, der indeholder Taq DNApolymerase, må ikke vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. Pipettér Taq DNA-polymerasen (Taq) ved at placere pipettens spids lige under væskens overflade, så spidsen ikke dækkes af overskydende enzym. Der kan bedømmes op til 24 prøver med kontrolreaktionsblanding (Control Reaction Mix (CTRL)). Ting, der skal gøres før start Før hver brug skal alle reagenser optøs i mindst 1 time ved stuetemperatur (15-25 C), blandes ved at vende dem 10 gange og centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. Kontrollér, at Taq DNA-polymerase (Taq) har stuetemperatur (15-25 C) inden hver brug. Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. Procedure 1. Optø kontrolreaktionsblandingen (Control Reaction Mix (CTRL)), vand til ikke-skabelon-kontrol (NTC) og positiv kontrol (PC) ved stuetemperatur (15-25 C) i mindst 1 time. Når reagenserne er optøet, skal de blandes ved, at man vender hvert rør 10 gange, så lokale saltkoncentrationer undgås, og derefter centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. 14 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

15 2. Forbered tilstrækkelige mængder masterblanding (kontrolreaktionsblanding [CTRL] samt Taq DNA-polymerase [Taq]) til DNA-prøverne, en positiv kontrolreaktion og en ikke-skabelon-kontrolreaktion i henhold til de volumener, der er anført i tabel 2. Inkluder reagenser til 1 ekstra prøve for at sikre tilstrækkelig ældning til PCR-opsætningen. Masterblandingen indeholder alle de komponenter, der er nødvendige ved PCR, undtagen prøven. Tabel 2. Forberedelse af kontrolmasterblanding* Komponent Control Reaction Mix (CTRL) (Kontrolreaktionsblanding) Taq DNA-polymerase (Taq) Volumen i alt Volumen 19,5 µl (n+1)* 0,5 µl (n+1)* 20,0 µl/reaktion * n = antallet af reaktioner (prøver plus kontroller). Når masterblandingen forberedes, skal der forberedes nok til 1 ekstra prøve (n+1) for at sikre tilstrækkelig ældning til PCRopsætningen. Værdien n må ikke overstige 26 (24 prøver, plus 2 kontroller). 3. Bland masterblandingen grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange. Placer det passende antal båndrør i isætningsblokken i overensstemmelse med layoutet i figur 1. Tilsæt straks 20 µl masterblanding til hvert PCRbåndrør (medfølger ikke). Hætterne skal blive i plastikbeholderen, til de skal bruges. Med henblik på prøvebedømmelse skal der tilsættes kontrolanalysemasterblanding til en positiv kontrolbrønd, en negativ kontrolbrønd og en brønd for hver prøve. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

16 Analyse Kontrol 1 (PC) Kontrol 2 (NTC) Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol Kontrol Figur 1. Layout for prøvevurderingsanalyser i isætningsblokken. Tallene angiver positioner i isætningsblokken og indikerer den endelige rotorposition. 4. Tilsæt straks 5 µl vand til ikke-skabelon-kontrol (NTC) til ikke-skabelonkontrolrøret (PCR-rør nummer 2), og sæt hætte på røret. Tilsæt 5 µl af hver prøve til prøverørene (PCR-rør nummer 3-26), og sæt hætte på rørene. Tilsæt 5 µl positiv kontrol (PC) for BRAF til røret med positiv kontrol (PCR-rør nummer 1), og sæt hætte på røret. Markér rørenes hætter for at vise, hvilken vej rørene skal vende, når de sættes i Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet. 5. Når der er sat hætte på alle PCR-rørene, skal der foretages en visuel kontrol af prøverørenes opfyldningsniveauer for at sikre, at prøven er blevet tilsat alle rørene. 6. Vend alle PCR-rørene (4 gange) for at blande prøverne og reaktionsblandingerne. 7. Placér PCR-båndrørene på de korrekte positioner i rotoren med 72 brønde (figur 1). Hvis rotoren ikke er helt fyldt, skal alle tomme positioner på rotoren fyldes med et tomt rør med hætte på. 8. Placér straks rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q MDx 5plex HRMinstrumentet. Kontrollér, at låseringen (tilbehør til Rotor-Gene Q-instrumentet) er placeret oven på rotoren, for at sikre rørene under kørslen. 16 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

17 9. Åbn Rotor-Gene Q-seriesoftwaren (version ), og åbn skabelonen til therascreen BRAF-mutationsvurderingskørsel. Se instruktioner i, hvordan man henter skabelonen og kontrollerer kørselsparametre i Protokol: Rotor-Gene Q BRAF-opsætning, side 28. Bemærk: Skabelonen til therascreen BRAF-vurderingskørsel skal bruges til kørselsopsætning, og den indeholder vigtige algoritmer, som er nødvendige for korrekt kørselsanalyse. 10. Kontrollér, at den korrekte rotor er valgt, og afkryds feltet for at bekræfte, at låseringen er påsat. Klik på Next (Næste) (figur 2). 1 2 Figur 2. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 3 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

18 11. Skriv navnet på operatøren. Tilføj eventuelle bemærkninger, og kontrollér, at reaktionsvolumen er indstillet til 25, og at der står 1, 2, 3 i feltet Sample Layout (Prøvelayout). Klik på Next (Næste) (figur 3). 1 2 Figur 3. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 12. Kontrollér kørselsparametrene i henhold til instruktionerne i Protokol: Rotor-Gene Q BRAF-opsætning, side 29. Klik på Next (Næste) (figur 4). 3 Cyklusparametrene må ikke redigeres. Figur 4. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel) therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

19 13. Gennemgå oversigten, og klik på Start Run (Start kørsel) for at gemme kørselsfilen og starte kørslen (figur 5). 1 Figur 5. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 14. Når kørslen er startet, åbnes der et nyt vindue, hvor du enten kan angive prøvenavne nu eller klikke på Finish (Udfør) og angive dem senere ved at vælge knappen Sample (Prøve) under kørslen, eller når kørslen er færdig. Hvis du klikker på Finish and Lock Samples (Udfør og lås prøver), kan du ikke ændre prøvenavnene. Brugeren skal være særlig påpasselig ved angivelse af prøvenavne for at sikre korrekte test og analyser af prøver. Bemærk: Ved navngivning af prøver skal tomme brønde efterlades tomme i kolonnen Name (Navn). 15. Analysér dataene i henhold til Dataanalyse af BRAF-mutationspåvisning, side 37, når kørslen er afsluttet. 16. Hvis der kræves kvantiteringsrapporter, skal du klikke på ikonet Reports (Rapporter) på værktøjslinjen i Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-kørselsfilen. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

20 17. I rapportbrowseren skal du klikke på Cycling A Green (Page 1) (Cyklus med A. Grøn (side 1)) under Report Categories (Rapportkategorier) (figur 6). 1 Figur 6. Report browser (Rapportbrowser). 18. Vælg Quantitation (Full Report) (Kvantitering (fuld rapport)) under Templates (Skabeloner) (figur 7). 1 Figur 7. Quantitation report (Full Report) (Kvantitering (fuld rapport)). 19. Klik på Show (Vis) for at generere rapporten. 20. Klik på Save As (Gem som) for at gemme en elektronisk version. 21. Gentag for Cycling A. Yellow (Page 1) (Cyklus med A. Gul (side 1)). 20 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

21 Protokol: Påvisning af BRAF-mutation Denne protokol er til påvisning af BRAF-mutationer. Når en prøve har gennemført prøvevurderingen, kan den testes ved hjælp af BRAF-mutationsanalyserne. Vigtige anvisninger før start Gennemlæs Generelle forholdsregler, side 11, før proceduren påbegyndes. Sørg for at være fortrolig med Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, før protokollen påbegyndes. Se brugerhåndbogen til instrumentet. Taq DNA-polymerasen (Taq) eller blandinger, der indeholder Taq DNA-polymerase, må ikke vortexes, da dette kan inaktivere enzymet. For at udnytte therascreen BRAF RGQ PCR-kittet effektivt skal prøverne grupperes i batch af mindst 6. Mindre batchstørrelser betyder, at der kan testes færre prøver med therascreen BRAF RGQ PCR-kittet. Pipettér Taq DNA-polymerasen (Taq) ved at placere pipettens spids lige under væskens overflade, så spidsen ikke dækkes af overskydende enzym. Ting, der skal gøres før start Før hver brug skal alle reagenser optøs i mindst 1 time ved stuetemperatur (15-25 C), blandes ved at vende dem 10 gange og centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. Kontrollér, at Taq DNA-polymerase (Taq) har stuetemperatur (15-25 C) inden hver brug. Centrifugér røret kortvarigt for at samle enzymet i bunden af røret. Procedure 1. Optø reaktionsblandingerne, vand til ikke-skabelon-kontrol (NTC) og positiv kontrol (PC) for BRAF ved stuetemperatur (15-25 C) i mindst 1 time. Når reagenserne er optøet, skal de blandes ved, at man vender hvert rør 10 gange, så lokale saltkoncentrationer undgås, og derefter centrifugeres kortvarigt for at samle alt indhold i bunden af røret. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

22 2. Forbered tilstrækkelige mængder masterblanding (reaktionsblanding plus Taq DNA-polymerase [Taq]) til DNA-prøverne, en positiv kontrolreaktion og en ikke-skabelon-kontrolreaktion i henhold til de volumener, der er anført i tabel 3. Inkluder reagenser til 1 ekstra prøve for at sikre tilstrækkelig ældning til PCR-opsætningen. Masterblandingerne indeholder alle de komponenter, der er nødvendige ved PCR, undtagen prøven. Tabel 3. Forberedelse af analysemasterblandinger* Analyse Volumen af reaktionsblanding Volumen af Taq DNA-polymerase (Taq) Kontrol 19,5 µl (n+1) 0,5 µl (n+1) V600E/Ec 19,5 µl (n+1) 0,5 µl (n+1) V600D 19,5 µl (n+1) 0,5 µl (n+1) V600K 19,5 µl (n+1) 0,5 µl (n+1) V600R 19,5 µl (n+1) 0,5 µl (n+1) * n = antallet af reaktioner (prøver plus kontroller). Når masterblandingen forberedes, skal der forberedes nok til 1 ekstra prøve (n+1) for at sikre tilstrækkelig ældning til PCRopsætningen. 3. Bland masterblandingen grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange. Placer det passende antal båndrør i isætningsblokken i overensstemmelse med layoutet i figur 8. Tilsæt straks 20 µl masterblanding til hvert PCRbåndrør (medfølger ikke). Hætterne skal blive i plastikbeholderen, til de skal bruges. 22 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

23 Kontroller Prøvenummer Analyse PC NTC Kontrol V600E/Ec V600D V600K V600R Figur 8. Layout for kontrol- og mutationsanalyser i isætningsblokken. Tallene angiver positionen i isætningsblokken og indikerer den endelige rotorposition. 4. Tilsæt straks 5 µl vand til ikke-skabelon-kontrol (NTC) til ikke-skabelonkontrol-pcr-båndrørene (PCR-rør nummer 9-13), og sæt hætte på rørene. Tilsæt 5 µl af hver prøve til prøverørene (PCR-rør nummer 17-21, 25-29, 33-37, 41-45, 49-53, og 65-69), og sæt hætte på rørene. Tilsæt 5 µl positiv kontrol for BRAF (PC) til rørene med positiv kontrol (PCR-rør nummer 1-5), og sæt hætte på rørene. Hver DNA-prøve skal testes med både kontrolanalysen og alle mutationsanalyserne. Markér rørenes hætter for at vise, hvilken vej rørene skal vende, når de sættes i Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet. 5. Når der er sat hætte på alle PCR-rørene, skal der foretages en visuel kontrol af prøverørenes opfyldningsniveauer for at sikre, at prøven er blevet tilsat alle rørene. 6. Vend alle PCR-rørene (4 gange) for at blande prøverne og reaktionsblandingerne. 7. Placér PCR-båndrørene på de korrekte positioner i rotoren med 72 brønde (figur 8). Der kan højst medtages 7 prøver i hver PCR-kørsel. Hvis rotoren ikke er helt fyldt, skal alle tomme positioner på rotoren fyldes med et tomt rør med hætte på. 8. Placér straks rotoren med 72 brønde i Rotor-Gene Q MDx 5plex HRMinstrumentet. Kontrollér, at låseringen (tilbehør til Rotor-Gene Q-instrumentet) er placeret oven på rotoren, for at sikre rørene under kørslen. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

24 9. Åbn Rotor-Gene Q-seriesoftwaren (version ), og åbn skabelonen til therascreen BRAF-vurderingskørsel. Se instruktioner i, hvordan man henter skabelonen og kontrollerer kørselsparametre i Protokol: Rotor-Gene Q BRAF-opsætning, side 28. Bemærk: Skabelonen til therascreen BRAF-mutationsvurdering skal bruges til kørselsopsætning, da den indeholder vigtige algoritmer, som er nødvendige for korrekt kørselsanalyse. 10. Kontrollér, at den korrekte rotor er valgt, og afkryds feltet for at bekræfte, at låseringen er påsat. Klik på Next (Næste) (figur 9). 1 2 Figur 9. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel) therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

25 11. Skriv navnet på operatøren. Tilføj eventuelle bemærkninger, og kontrollér, at reaktionsvolumen er indstillet til 25, og at der står 1, 2, 3 i feltet Sample Layout (Prøvelayout). Klik på Next (Næste) (figur 10). 1 2 Figur 10. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 12. Kontrollér kørselsparametrene i henhold til instruktionerne i Protokol: Rotor-Gene Q BRAF-opsætning, side 28. Klik på Next (Næste) (figur 11). 3 Cyklusparametrene må ikke redigeres. Figur 11. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 1 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

26 13. Gennemgå oversigten, og klik på Start Run (Start kørsel) for at gemme kørselsfilen og starte kørslen (figur 12). 1 Figur 12. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 14. Når kørslen er startet, åbnes der et nyt vindue, hvor du enten kan angive prøvenavne nu eller klikke på Finish (Udfør) og angive dem senere ved at vælge knappen Sample (Prøve) under kørslen, eller når kørslen er færdig. Hvis du klikker på Finish and Lock Samples (Udfør og lås prøver), kan du ikke ændre prøvenavnene. Brugeren skal være særlig påpasselig ved angivelse af prøvenavne for at sikre korrekte test og analyser af prøver. Bemærk: Ved navngivning af prøver skal tomme brønde efterlades tomme i kolonnen Name (Navn). 15. Analysér dataene i henhold til proceduren Dataanalyse af BRAF-mutationspåvisning, side 37, når kørslen er afsluttet. 16. Hvis der kræves kvantiteringsrapporter, skal du klikke på ikonet Reports (Rapporter) på værktøjslinjen i Rotor-Gene Q-kørselsfilen. 26 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

27 17. I rapportbrowseren skal du klikke på Cycling A Green (Page 1) (Cyklus med A. Grøn (side 1)) under Report Categories (Rapportkategorier) (figur 13). 1 Figur 13. Report browser (Rapportbrowser). 18. Vælg Quantitation (Full Report) (Kvantitering (fuld rapport)) under Templates (Skabeloner) (figur 14). 1 Figur 14. Quantitation report (Full Report) (Kvantitering (fuld rapport)). 19. Klik på Show (Vis) for at generere rapporten. 20. Klik på Save As (Gem som) for at gemme en elektronisk version. 21. Gentag for Cycling A. Yellow (Page 1) (Cyklus med A. Gul (side 1)). therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

28 Protokol: Rotor-Gene Q BRAF-opsætning Der henvises til denne protokol i Protokol: Prøvevurdering (side 14) og Protokol: Påvisning af BRAF-mutation (side 21). Temperaturprofilen for den relevante skabelon skal kontrolleres før brug i henhold til nedenstående procedure. Vigtig anvisning før start Skabelonen til therascreen BRAF-vurderingskørsel (figur 15) og skabelonen til therascreen BRAF-mutationsanalyse (figur 16) skal altid anvendes, da de indeholder vigtige algoritmer, som er nødvendige for korrekt kørselsanalyse. Figur 15. Skabelonikon til therascreen BRAF-vurderingskørsel. Figur 16. Skabelonikon til therascreen BRAF-mutationsanalyse. Ting, der skal gøres før start Skabelonen til therascreen BRAF-vurderingskørsel og skabelonen til therascreen BRAF-mutationsanalyse kan hentes på Filen er beskyttet med adgangskoden therascreenbraftemplate. Kopiér skabelonfilerne til en undermappe i mappen Templates (Skabeloner) i Rotor-Gene Q-seriesoftwarens installationsmappe. 28 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

29 Procedure 1. Kontrollér den relevante skabelonen ved at udføre følgende trin. Bemærk: PCR-opsætningsparametrene indstilles automatisk af skabelonerne. Anvend altid de relevante skabeloner, da de indeholder vigtige algoritmer, som er nødvendige for korrekt kørselsanalyse. Kontrollér, at låseringen er påsat Figur 17 Angiv navnet på operatøren og reaktionsblandingen Figur 18 Kontrollér de generelle analyseparametre Figur Start af kørsel Figur 23 Cyklusparametrene er som følger. Tabel 4. Cyklusparametre Cyklusser Temperatur Tid Datahentning 1 95 C 15 minutter Ingen C 60 C 30 sekunder 60 sekunder Ingen Grøn og gul Alle anvisninger henviser til Rotor-Gene Q-softwareversion På illustrationerne er indstillingerne fremhævet med sorte kasser. 2. Dobbeltklik på ikonet for Rotor-Gene Q-seriesoftwaren på skrivebordet på den bærbare computer, der er tilsluttet Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM-instrumentet. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

30 3. Vælg 72-Well Rotor (Rotor med 72 brønde) som rotortype. Kontrollér, at låseringen er påsat, og markér afkrydsningsfeltet Locking Ring Attached (Låsering påsat). Klik på Next (Næste) (figur 17) Figur 17. Dialogboksen New Run Wizard (Guiden Ny kørsel). 4. Skriv navnet på operatøren. Tilføj eventuelle bemærkninger, og angiv reaktionsvolumen som 25. Kontrollér, at der står 1, 2, 3 i Sample Layout (Prøvelayout). Klik på Next (Næste) (figur 18) Figur 18. Angiv navnet på operatøren og reaktionsvolumener therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

31 5. Klik på knappen Edit Profile (Rediger profil) i dialogboksen i New Run Wizard (Guiden Ny kørsel) (figur 19), og kontrollér kørselsparametrene i henhold til de følgende trin. Cyklusparametrene må ikke redigeres. 1 Figur 19. Kontrol af profilen. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

32 6. Kontrollér, at holdeparametrene er korrekte (figur 20). 1 2 Figur 20. Kontrol af holdeparametrene. 7. Kontrollér, at cyklusparametrene er korrekte (figur 21), og klik på OK Figur 21. Kontrol af cyklusparametrene therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

33 8. Klik på Next (Næste). Gennemgå oversigten (figur 22). 1 Figur 22. Gennemgang af oversigten. 9. Klik på Start Run (Start kørsel) for at gemme kørselsfilen og starte kørslen (figur 23). 1 Figur 23. Start af kørsel. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

34 10. Når kørslen er startet, åbnes der et nyt vindue, hvor du enten kan angive prøvenavne nu eller klikke på Finish (Udfør) og angive dem senere ved at vælge knappen Sample (Prøve) under kørslen, eller når kørslen er færdig. Analysér dataene i henhold til mutationsanalyseprotokollen, når kørslen er afsluttet (se Dataanalyse af BRAF-mutationspåvisning, side 37). Hvis du klikker på Finish and Lock Samples (Udfør og lås prøver), kan du ikke ændre prøvenavnene. Brugeren skal være særlig påpasselig ved angivelse af prøvenavne for at sikre korrekte test og analyser af prøver. Bemærk: Ved navngivning af prøver skal tomme brønde efterlades tomme i kolonnen Name (Navn). 34 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

35 Resultater Dataanalyse af prøvevurdering Analysér dataene i henhold til følgende procedure, når kørslen er afsluttet. Softwareanalyseindstillinger 1. Åbn den relevante fil med Rotor-Gene Q-seriesoftwaren Hvis du ikke allerede har navngivet dine prøver før udførelsen af kørslen, skal du klikke på Edit Samples (Rediger prøver). 3. Indsæt navnene på dine prøver i kolonne Name (Navn). Bemærk: Lad navnene på eventuelle tomme brønde stå tomme. 4. Klik på Analysis (Analyse). Klik på Cycling A. Yellow (Cyklus med A. Gul) på analysesiden for at få vist den gule kanal. 5. Klik på Named On (Navngivet på). Bemærk: Dette sikrer, at tomme brønde ikke indgår i analysen. 6. Kontrollér, at dynamic tube (dynamisk rør) er fremhævet. 7. Kontrollér, at slope correct (hældningskorrigering) er fremhævet. 8. Kontrollér, at Linear scale (Lineær skala) er valgt. 9. Kontrollér, at tærsklen er indstillet til 0, Indstil Eliminate Cycles before (Eliminer cyklusser før) til Kontrollér, at ingen kurver krydser tærsklen som et resultat af lineær forstærkning. Bemærk: Se Lineær forstærkning, side 44, for instruktioner i identificering af lineær forstærkning. 12. Kontrollér Yellow CT-værdierne. 13. Klik på Cycling A. Green (Cyklus med A. Grøn) på analysesiden for at få vist den grønne kanal. 14. Klik på Named On (Navngivet på). 15. Kontrollér, at dynamic tube (dynamisk rør) er fremhævet. 16. Kontrollér, at slope correct (hældningskorrigering) er fremhævet. 17. Kontrollér, at Linear scale (Lineær skala) er valgt. 18. Kontrollér, at tærsklen er indstillet til 0, Indstil Eliminate Cycles before (Eliminer cyklusser før) til 15. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

36 20. Kontrollér, at ingen kurver krydser tærsklen som et resultat af lineær forstærkning. Bemærk: Se Lineær forstærkning, side 44, for instruktioner i identificering af lineær forstærkning. 21. Kontrollér Green CT-værdierne. Kørsel af kontrolanalyse Analysér dataene som følger, når kørslen er afsluttet. Negativ kontrol: For at sikre at der ikke er nogen skabelonkontaminering, må kontrollen uden skabelon ikke generere en CT-værdi i den grønne kanal (FAM) under 40. For at sikre at pladen er indstillet korrekt, skal kontrollen uden skabelon vise forstærkning i området 32,53-38,16 i den gule kanal (HEX). De angivne værdier er inden for og inklusive disse værdier. Positiv kontrol: Den positive kontrol (PC) for BRAF skal give en CT-værdi for kontrolanalysen (grøn kanal) på 27,82-33,85. De angivne værdier er inden for og inklusive disse værdier. En værdi uden for dette område angiver, at der er et problem med analyseopsætningen, og derfor kan kørslen ikke fuldføres. Prøvedata må ikke anvendes, hvis en af disse to kørselskontroller er mislykket. Forudsat at begge kørselskontroller er gyldige, skal hver prøves CT-værdi ligge inden for området 20,95-33,00 i den grønne kanal. Hvis prøven ligger uden for området, gives følgende vejledning. Prøveanalyse kontrolanalyse Prøvekontrolanalyse CT <20,95: Prøver med en kontrol-ct på <20,95 skal fortyndes, da dette repræsenterer den nedre ende af det validerede analyseområde. For at påvise hver enkelt mutation på lavt niveau skal de overkoncentrerede prøver fortyndes, så de er i ovenstående interval med den basis, at CT stiger med 1, når der fortyndes 1:1. Hvis prøven er tæt på 20,95, anbefales fortynding for at sikre, at der opnås et resultat fra prøvens testkørsel (BRAF-mutationspåvisning). Prøver skal fortyndes med det vand, der medfølger i kittet (vand til fortynding [Fort.]). Prøvekontrolanalyse CT >33,00: Det anbefales at ekstrahere prøven igen, da en utilstrækkelig DNA-startskabelon vil være til stede til at påvise alle mutationer ved de fastsatte cut-off-værdier for analysen. 36 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

37 Dataanalyse af BRAF-mutationspåvisning Analysér dataene i henhold til følgende procedure, når kørslen er afsluttet. Softwareanalyseindstillinger 1. Åbn den relevante fil med Rotor-Gene Q-seriesoftwaren Hvis du ikke allerede har navngivet dine prøver før udførelsen af kørslen, skal du klikke på Edit Samples (Rediger prøver). 3. Indsæt navnene på dine prøver i kolonne Name (Navn). Bemærk: Lad navnene på eventuelle tomme brønde stå tomme. 4. Klik på Analysis (Analyse). Klik på Cycling A. Yellow (Cyklus med A. Gul) på analysesiden for at få vist den gule kanal. 5. Klik på Named On (Navngivet på). Bemærk: Dette sikrer, at tomme brønde ikke indgår i analysen. Kontrollér, at dynamic tube (dynamisk rør) er fremhævet. 6. Kontrollér, at slope correct (hældningskorrigering) er fremhævet. 7. Kontrollér, at Linear scale (Lineær skala) er valgt. 8. Kontrollér, at tærsklen er indstillet til 0, Indstil Eliminate Cycles before (Eliminer cyklusser før) til Kontrollér, at ingen kurver krydser tærsklen som et resultat af lineær forstærkning. Bemærk: Se Lineær forstærkning, side 44, for instruktioner i identificering af lineær forstærkning. 11. Kontrollér Yellow CT-værdierne. 12. Klik på Cycling A. Green (Cyklus med A. Grøn) på analysesiden for at få vist den grønne kanal. 13. Klik på Named On (Navngivet på). 14. Kontrollér, at dynamic tube (dynamisk rør) er fremhævet. 15. Kontrollér, at slope correct (hældningskorrigering) er fremhævet. 16. Kontrollér, at Linear scale (Lineær skala) er valgt. 17. Kontrollér, at tærsklen er indstillet til 0, Indstil Eliminate Cycles before (Eliminer cyklusser før) til Kontrollér, at ingen kurver krydser tærsklen som et resultat af lineær forstærkning. Bemærk: Se Lineær forstærkning, side 44, for instruktioner i identificering af lineær forstærkning. 20. Kontrollér Green CT-værdierne. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

38 Kørsel af kontrolanalyse Se rutediagrammet for kørsel af kontrolanalysen i figur 24. Green C T- værdi for negativ kontrol Green C T- værdi for positiv kontrol Er Green C T <40? Ja Mislykket kørsel Er Green C T-røret i intervallet 27,82 33,85? Nej Mislykket kørsel Mislykket kørsel/ Intern kontrol er ugyldig Ja Nej Yes Er Yellow C T i intervallet 32,53-38,16? Nej Er den interne kontrols Yellow C T <32,53? Er V600E/Ec Green C T-røret i intervallet 27,49 33,51? Nej Mislykket kørsel Ja No Ja Er den interne kontrols Yellow C T >32,16? Er V600D Green C T-røret i intervallet 27,45 33,47? Ja Nej Mislykket kørsel Ja Mislykket kørsel/ Yellow-forstærkning er negativ for intern kontrol Er V600K Green C T-røret i intervallet 27,28 33,28? Nej Mislykket kørsel Negativ kontrol gennemført Ja Er V600R Green C T-røret i intervallet 27,38 33,38? Nej Mislykket kørsel Ja Fortsæt til prøveanalyse. Positiv kontrol gennemført Figur 24. Rutediagram over kørsel af kontrolanalyse. Se instruktioner i at køre kontrolanalyse på siderne therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

39 Negativ kontrol: For at sikre at der ikke er nogen kontaminering i reaktionsblandingen, må kontrollen uden skabelon ikke generere en CT-værdi i den grønne kanal under 40. For at sikre at pladen blev indstillet korrekt, skal kontrollen uden skabelon vise forstærkning i intervallet 32,53-38,16 i den gule kanal. De angivne værdier er inden for og inklusive disse værdier. Positiv kontrol: Den positive kontrol (PC) for BRAF skal give en CT-værdi for hver BRAF-analyse som vist i tabel 5 i den grønne kanal. De angivne værdier er inden for og inklusive disse værdier. En værdi uden for dette område angiver, at der er et problem med analyseopsætningen, og derfor kan kørslen ikke fuldføres. Bemærk: Prøvedata må ikke anvendes, hvis en af disse to kørselskontroller er mislykket. Tabel 5. Acceptabelt CT-område for reaktionskontroller. Reaktionsblanding Prøve Kanal CT-område Kontrol PC Grøn 27,82-33,85 V600E/Ec PC Grøn 27,49-33,51 V600D PC Grøn 27,45-33,47 V600K PC Grøn 27,28-33,28 V600R PC Grøn 27,38-33,38 Prøveanalyse Green CT-værdi for prøvekontrol Forudsat at begge kørselskontroller er gyldige for kontrolanalysen, skal hver prøvekontrols CT-værdi ligge inden for intervallet 20,95-33,00 i den grønne kanal. Se rutediagrammet over prøveanalyse i figur 25. Hvis prøven ligger uden for området, gives følgende vejledning. Prøvekontrolanalyse CT <20,95: Prøver med en kontrol CT på <20,95 overbelaster mutationsanalyserne og skal fortyndes. For at påvise hver enkelt mutation på lavt niveau skal de overkoncentrerede prøver fortyndes, så de er i ovenstående interval med den basis, at CT stiger med 1, når der fortyndes 1:1. Prøver skal fortyndes med det vand, der medfølger i kittet (vand til fortynding [Fort.]). Prøvekontrolanalyse CT >33,00: Det anbefales at ekstrahere prøven igen, da en utilstrækkelig DNA-startskabelon vil være til stede til at påvise alle mutationer ved de fastsatte cut-off-værdier for analysen. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

40 Green C T-værdi for prøvekontrol. Er kontrolanalysen med Green C T i intervallet 20,95 33,00? Nej Se side 39 i håndbogen for at få en nærmere forklaring. Ja Yellow C T-værdier for mutationsanalyser i prøvens interne kontrol. Er Yellow C T i en analyse <32,53? Ja Røret er ugyldigt. Rørets resultat må ikke bruges. Nej Er Yellow C T >38,16 i en analyse? Ja Rørets Yellow-forstærkning er negativ. Se side 41 i håndbogen for at få en nærmere forklaring. Nej Green C T-værdier for prøvemutationsanalyser. Er hver Green C T for mutation i området 15,00-40,00? Nej Rørets Green-forstærkning er negativ. Se side i håndbogen. Ja Rørets Green-forstærkning er positiv. Beregn C T-værdier for hver mutation. C T = mutation C T kontrol C T Sammenlign C T-værdier med cut-off-værdier fra mutation. Se tabel 6 på side 41 i håndbogen. Er der nogen C T-værdi inden for det angivne C T-område for analysen (positiv forstærkning)? Nej Mutationen ikke påvist. Ja BRAF-mutation registreret for mutationsanalyse. Se, hvordan mutationsstatus bestemmes i tabel 7, side 43. Figur 25. Rutediagram over prøveanalyse. Se yderligere oplysninger på side therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

41 Prøveanalyse Mutationsanalyser i prøvens interne kontrol Yellow CT-værdi Se rutediagrammet over prøveanalyse i figur 25. Alle brønde for hver prøve skal analyseres. Kontrollér, at alle brønde danner et HEX-signal fra den interne kontrol. Der er 3 mulige resultater. Hvis den interne kontrols CT ligger inden for det specificerede område (32,53-38,16), har den positiv Yellow-forstærkning og er gyldig. Hvis den interne kontrols CT ligger over det specificerede område (>38,16), har den negativ Yellow-forstærkning. Hvis der er forstærkning i den grønne kanal for det pågældende rør, er Yellow-forstærkningen gyldig. Hvis der er forstærkning i den grønne kanal for det pågældende rør, er Yellowforstærkningen ugyldig. Hvis den interne kontrols CT ligger under det specificerede område (<32,53), er den ugyldig. Hvis den mislykkede interne kontrol skyldes PCR-hæmning, kan fortynding af prøven reducere hæmmernes effekt, men man skal være opmærksom på, at dette også vil fortynde DNA-målet. Der medfølger et rør med vand til fortynding (Fort.) af prøven i kittet. Prøveanalyse Green CT-værdi for prøvemutationsanalyser Green-værdierne for alle 4 reaktionsblandinger skal kontrolleres i forhold til værdierne i tabel 6. Tabel 6. Acceptable værdier for prøvemutationsreaktion (grøn kanal)* Analyse Acceptabelt CT-område CT-område V600E/Ec 15,00-40,00 7,0 V600D 15,00-40,00 6,9 V600K 15,00-40,00 6,0 V600R 15,00-40,00 7,0 * De acceptable værdier ligger inden for og inkluderer de viste værdier. Hvis Green CT ligger inden for det specificerede område, har den positiv FAM-forstærkning. Hvis Green CT ligger over det specificerede område, har den negativ Green-forstærkning. therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/

42 CT-værdien beregnes som følger for alle mutationsbrønde, der viser positiv FAM-forstærkning, idet det skal sikres, at mutation og kontrol for CT-værdierne er fra den samme prøve. CT = mutation CT kontrol CT Sammenlign CT-værdien for prøven med cut-off-punktet for den pågældende analyse (tabel 6), idet det skal sikres, at det korrekte cut-off-punkt anvendes for hver enkelt analyse. Cut-off-punktet er det punkt, over hvilket et positivt signal potentielt kunne skyldes et baggrundssignal i ARMS-primeren på vildtype-dna. Hvis prøvens CT-værdi er højere end cut-off-punktet, klassificeres den som negativ eller uden for kittets påvisningsgrænser. For hver prøve vil hver mutationsreaktion få en status som påvist mutation, mutation ikke påvist eller ugyldig efter følgende kriterier. Mutation påvist: Green-forstærkning er positiv, og CT er på eller under cut-off-værdien. Hvis der påvises flere mutationer, skal der tildeles mutationsstatus i henhold til tabel 7. Mutation ikke påvist: Green-forstærkning er positiv og CT er over cut-off-værdien. Green-forstærkning er negativ, og Yellow-forstærkning (intern kontrol) er positiv. Ugyldig: Yellow (intern kontrol) er ugyldig. Green-forstærkning er negativ, og Yellow-forstærkning er negativ. Se yderligere forklaring i rutediagrammet (figur 25). Hvis en prøves Yellowforstærkning er negativ i et rør, men dens Green-forstærkning er positiv i et andet rør, kan et mutation påvist -resultat i det andet rør godt anses for at være gyldigt, men den bestemte mutation, der er identificeret, er muligvis ikke tildelt korrekt. Hvis en prøves Yellow-forstærkning er negativ, men dens Green-forstærkning er positiv i samme rør, bør mutation påvist -resultatet anses for at være gyldigt. Hvis et rør er ugyldigt for Yellow (intern kontrol), må resultatet af dette rør ikke anvendes. 42 therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/2013

43 Prøveanalyse Tildeling af status for prøvemutation Når alle mutationsreaktionsrør er vurderet, bestemmes mutationsstatus for prøven på følgende måde. Mutation påvist: En eller flere af fire mutationsreaktioner er positive. Hvis der påvises flere mutationer, skal mutationen rapporteres i henhold til tabel 7. Tabel 7. Bestemmelse af status for prøvemutation V600E/Ec V600D V600K V600R Mutationsstatus Positiv Negativ Negativ Negativ V600E- eller V600Ecpositiv Positiv Negativ Positiv Negativ V600Ec- eller V600Kpositiv Positiv Positiv Negativ Negativ V600D-positiv Negativ Positiv Negativ Negativ V600D-positiv Negativ Negativ Positiv Negativ V600K-positiv Negativ Negativ Negativ Positiv V600R-positiv Mutation ikke påvist: Alle fire mutationsreaktioner er negative. Ugyldig: Ingen mutationsreaktioner er positive, og en eller flere mutationsreaktioner er ugyldige. Bemærk: therascreen BRAF RGQ PCR-kittet er beregnet til at påvise mutationer i BRAF-genet i en DNA-prøve. Når der er angivet en påvist BRAF-mutation for en prøve, skal der kun rapporteres én specifik mutation. Hvis der påvises flere mutationer, skal mutationen rapporteres i henhold til tabel 7. Der kan forekomme nogen krydsreaktivitet mellem mutationsreaktioner. V600E/Ec-analysen kan f.eks. give et positivt resultat, hvis der er en V600Dmutation, V600E/Ec-analysen kan give et positivt resultat, hvis der er en V600Kmutation, og V600K-analysen kan give et positivt resultat, hvis der er en kompleks V600E-mutation. Der kan dog skelnes mellem mutationsstatus ved hjælp af tabel 7. Krydsreaktivitet skyldes, at ARMS-primeren påviser andre mutationer i lignende sekvens efter hinanden. Hvis en anden mutationsanalyse giver et positivt therascreen BRAF RGQ PCR-kit Håndbog 11/