Inspirationsdag 8. januar 2010 Workshop: Bioteknologi fra gen til proteindesign

Transkript

1 Inspirationsdag 8. januar 2010 Workshop: Bioteknologi fra gen til proteindesign Arrangeret af Sektion for Biomolekylære Videnskaber, Biologisk Institut, Københavns Universitet Ansvarlige: Karen Skriver, lektor, Helle Blæsild, kommunikationsmedarbejder, Birthe B. Kragelund, lektor, Kaare Teilum, adjunkt, Martin Willemoës, lektor, Gert Dandanell, lektor, Michael Riis Hansen, post. doc, Jakob Winther, professor, Januar 2010 [] 1

2 Workshoppen Bioteknologi fra gen til proteindesign giver mulighed for at arbejde eksperimentelt og in silico med enzymet alkalisk fosfatase i forsøg, som vil kunne implementeres i gymnasieundervisningen. Der vil også være mulighed for at diskutere forskningsområder inden for proteinstruktur, -design og - engineering med forskere, der kan bestilles som foredragsholdere i gymnasiet. Program : Intro. (rum ) Bioteknologi fra gen til proteindesign ved Karen Skriver : Programpakke 1 (rum ; 6 deltagere): Produktion og oprensning af alkalisk fosfatase. Ansvarlige: Karen Skriver og Charlotte O Shea. Programpakke 2 (rum ; 12 deltagere): Kinetiske analyser af alkalisk fosfatase. Ansvarlige: Michael Riis Hansen og Gert Dandanell. Programpakke 3 (rum ; 10 deltagere): Strukturanalyser af alkalisk fosfatase. Ansvarlige: Birthe Kragelund og Kaare Teilum. Præsentation af forskningsområder i rum Martin Willemoës Design af enzymer Enzymdesign er en fremtidig teknologi med et enormt potentiale. Enzymer bruges f. eks. i vaskepulver, papirindustri over fødevareindustri til avanceret blødermedicin og i tilvejebringelsen af miljøvenlig biobrændsel. Den begrænsning, som samtidig er en eftertragtet egenskab i anvendelsen af enzymteknologi, er specificiteten overfor et substrat; givet at man har været afhængig af naturligt forekommende enzymer som de hovedsageligt findes i mikroorganismer. Ved i heldige tilfælde at ændre lidt på enzymets egenskaber har man kunnet udvide det "rum" af enzymaktiviteter som naturen har stillet til rådighed. Forskningsgruppen Protein Design Consortium arbejder langsigtet på at opstille metoder, både eksperimentelle og computermæssige, der skal muliggøre frit at kunne designe et enzym, der kan katalysere en hvilken som helst kemisk reaktion. Dette arbejde og vores udgangspunkt kan du høre nærmere om. Kaare Teilum Protein engineering som værktøj til at forstå sygdomsrelateret proteinudfældning I en række alvorlige sygdomme såsom type II diabetes, Alzheimers- og Parkinsons sygdom samt amyotrofisk lateral sklerose (ALS) udfælder specifikke protein i de berørte væv. Udfældningerne har ofte karakter af fibriller (små fibre af protein). På trods af den tydelige ophobning af fibriller i disse sygdomme tyder meget på, at fibrillerne i sig selv, ikke er farlige for det væv, de befinder sig i. Det, der giver anledning til sygdommene, er derimod snarere mindre forstadier til fibrillerne, og der har gennem de seneste år været stor interesse for at forstå, hvordan og hvorfor fibrilforstadierne giver anledning til sygdomme. En vigtig brik i denne forståelse ville være at kende strukturerne af fibrilforstadierne, men det er indtil videre ikke lykkedes at bestemme disse. Ved hjælp af protein engineering kan forskellige forstadier i udfældningen af de enkelte proteiner stabiliseres i tilstrækkelig grad til, at deres strukturelle egenskaber kan analyseres. Her kan du høre om, hvordan [] 2

3 protein engineering bruges i klarlæggelsen af, hvordan proteinet superoxid dismutase danner udfældninger i ALS. Jakob Winther Forudsigelse af proteinstrukturer fra aminosyresekvenser og omvendt Proteiners struktur defineres af rækkefølgen af de aminosyrer som de er opbygget af. Aminosyrekæden folder i proteiner op i mere eller mindre komplicerede tredimensionelle strukturer (som fx vist på forsiden af denne folder) og proteiners funktion vil almindelighed være fuldstændig afhængige af at strukturen dannes rigtigt. Dette kan fx være som enzymer eller som proteiner der qua deres struktur kan danne komponenter der kan specifikke ting som fx at indgå i spindelvæv eller muskelfibre. Vi vil gerne aflure hvordan en specifik sekvens af aminosyrer danner en bestemt proteinstruktur. Det vil fortælle os en masse om hvilke protein de tusindvis af nye gener som identificeres hver eneste dag giver ophav til, men det vil også give os mulighed for at vende problemstillingen om og spørge: Givet denne struktur, hvilken sekvens af aminosyrer skal vi lave vha gensplejsning for at få dem til at folde op på den ønskede måde. Hvis vi kan forudsige dette vil vi på sigt kunne generere nye proteiner som kan ting som ikke kendes fra naturen. Det er bl.a. disse muligheder vi er i færd med at undersøge vha nogle simple biologiske modeller, bioinformatik og computertid : Evaluering ved Helle Blæsild og Karen Skriver samt diskussion med professor, Pierre Clément.. Frugt og drikkevarer i rum [] 3

4 Alkalisk fosfatase Introduktion I programpakkerne arbejdes med alkalisk fosfatase som et alternativt til de enzymer, der normalt benyttes til at bestemme steady-state enzymkinetiske parametre i gymnasiale undervisningsforløb. Dette er enzym er oplagt til gymnasieforsøg, fordi det er et meget stabilt enzym og har en interessant biologisk funktion. Ud over forsøg, der vil kunne udføres i gymnasiernes undervisningslokaler, præsenterer vi oplæg til programpakker, der vil kunne udføres som demonstrationsøvelser ved Biologisk Institut. Disse involverer bl.a. størrelsesbestemmelse vha. massespektrometri og stabilitetsbestemmelse vha. biofysiske analyser baseret på kalorimetri og fluorescensspektroskopi. Desuden kan mutantenzymer, dannet ved site-directed mutagenese, undersøges for aktivitet. Enzymet alkalisk fosfatase (AP) AP er et enzym, der katalyserer hydrolyse af fosforsyreestere, hvorved der dannes en alkohol- og en fosfatforbindelse (Fig. 1). Enzymet er kendt for at kunne fjerne fosfatgrupper i 5- og 3-positioner fra mange typer molekyler, blandt andet nukleotider. Det anvendes derfor i molekylærbiologi i forbindelse med arbejde med DNA, da disse ofte har fosfatgrupper i 5 positioner. Mængden af alkalisk fosfatase i blodet hos mennesker kan benyttes i diagnostisk sammenhæng. Fig. 1. Hydrolyse af en fosforsyreester vha. alkalisk fosfatase I de foreslåede forsøg oprenses AP fra en baterie, E. coli, i det AP findes i det periplasmatiske rum, uden for cellemembranen, i bakterier. Det gør oprensningen af enzymet nemmere, og enzymet har opnået stor grad af stabilitet for at overleve i dette miljø. E. coli AP er en dimer bestående af monomerer med en størrelse på ca. 49 kda. AP binder både zink- og magnesiumioner. ph optimum for AP fra E. coli er, som navnet antyder i det basiske område, og er 8,0 [] 4

5 Arbejdspakke 1 Produktion og oprensning af AP fra E. coli vha. osmotisk chok og varmebehandling* AP oprenses* fra det periplamatiske rum i E. coli stamme HO1064 (HO1064: F - aracam arad DE(lac)U169 trpam malam rpsl rela thi deod gsk-3 udp supf pstscab-phou ). Protokoller Vækst og oprensning 1) Pod 10 ml Luria Broth medium med en HO1064 koloni. Lad kulturen gror natten over ved 37 C. 2) Overfør 1 ml kultur til 1 l Luria Broth i en 5 l kolbe. Lad kulturen gro ved 37 C, 180 r.p.m., til sen stationær fase (ca. 28 timer). 3) Høst cellerne ved centrifugering 8000 r.p.m. i 10 min. Beregn celleudbyttet ved vejning. 4) Vask cellerne i 300 ml 10 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl 2, ph 7,4. Centrifuger 8000 r.p.m. i 10 min og hæld supernatanten fra. Gentag 3 gange. 5) Resuspender cellerne i 60 mm Tris-HCl, ph 7,4 (1 gram pr. 10 ml) og tilsæt samme volumen 40 % sukrose. Tilsæt etylen-diamin-tetra-eddikesyre til 5 mm. 6) Overfør suspensionen til en større kolbe og ryst i 10 min. ved stue temperatur. 7) Centrifuger 15 min r.p.m. i 10 min, hæld supernatanten fra og placer bundfaldet på is. 8) Resuspender cellerne, som holdes på is, forsigtigt i 2 ml 40 % sukrose. 9) Tilsæt kold H 2 O (2 gange volumen af tilsat 60 mm Tris-HCl, ph 7,4). Herved frigives AP fra cellerne. 10) Overfør suspensionen til en ren kolbe og inkuber ved 4 C, 200 r.p.m. i 10 min. 11) Centrifuger 8000 r.p.m. i 15 min. og gem supernatanten. 12) Mål volumen af supernatanten og tilsæt Tris-HCl, ph 7,4 til 10 mm og MgCl 2 til 10 mm. Gem 1 ml til senere brug. 13) Udfæld proteinet ved langsomt (over 30 min.) at tilsætte ammoniumsulfat til 80 % mætning ved 4 C under omrøring. Lad opløsningen stå under omrøring i yderligere 30 min. 14) Centrifuger ammoniumsulfat bundfaldet ned ( r.p.m., 10 min) og resuspender i 50 ml TMZP (10 mm Tris-HCl, 1 mm MgCl 2, 10 μm ZnSO 4, 100 μm NaH 2 PO 4, - indstil ph til 7,4 med HCl). 15) Dialyser mod 1 l TMZP. 16) Fordel dialysatet i 1,5 ml rør og opvarm til 80 C på en varmeblok. 17) Centrifuger r.p.m. i 5 min. 18) Analyser oprensningsforløbet ved natriumdodecylsulfat (SDS)- polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). *AP kan også fås i oprenset form ved henvendelse til en af ovennævnte kontaktpersoner Gelelektroforese Proteinoprensningsforløb og renhedsgraden af proteinpræparationer undersøges som regel ved gelelektroforese. Molekyler med en nettoladning vil vandre i et elektrisk felt i retning mod den elektrode, der har modsat retning af molekylets nettoladning. Den elektroforetiske mobilitet afhænger af molekylets nettoantal af ladede grupper og dets størrelse. Elektroforese til analyse af [] 5

6 proteiner udføres som regel i et stabiliserende medium, en gel, der består af polyakrylamid. Polyakrylamidgeler fremstilles ved kopolymerisering af akrylamid og N,N -methylenbisakrylamid, der fungerer som krydsbinder. Natrium dodecylsulfat (SDS) polyakrylamidelektroforese (PAGE) kan benyttes til at estimere proteiners molekylvægt. Proteinet denatureres ved kogning med en opløsning af SDS, der er et anionisk detergent. Derefter separeres proteinerne i en polyakrylamidgel. Et protein denatureres, d.v.s. at den rumlige struktur ødelægges, når det koger i en opløsning af SDS. Proteinet vil samtidig få maskeret sine ladninger, fordi SDS bindes til det. Da SDS bindes til proteinet i et konstant forhold (1,4 gram SDS per gram protein) udjævnes ladningsforskelle, der skyldes sidekædernes ionisering. Resultatet bliver, at separationen vha. elektroforese kun afhænger af proteinets længde. Ved elektroforese i en polyakrylamidgel med 0,1 procent SDS vil der være en lineær sammenhæng mellem logaritmen til molekylvægten og den relative vandringslængde for protein-sds-komplekset. Molekylvægten kan bestemmes ved at behandle en række markørproteiner med kendt molekylvægt på samme måde og konstruere en standardkurve på grundlag af disse markører (Fig. 2). Fig. 2 Bestemmelse af molekylvægt ved SDS-PAGE. Man kan benytte forskellige støbestande og gelkar til SDS-PAGE. Ved Sektion for Biomolekylære Videnskaber benyttes et system fra BioRad ( yselector). [] 6

7 Arbejdspakke 2 Alkalisk phosphatase fra Escherichia coli enzymkinetik Phosphorylering og dephosphorylering af proteiner og stofskifte intermediater er udbredt i alle organismer og har i mange tilfælde vigtige regulatoriske funktioner (fx signaltransduktionsveje). Da dephosphorylering er kritiske reaktioner i cellesignalerings processer er phosphataser involveret i en lang række sygdomme. Her anvendes alkalisk phosphatase (AP) fra den gram negative bakterie Escherichia coli (E. coli) som katalyserer hydrolyse af phosphorsyreestre. ZN-ATOMER ER NØDVENDIGE FOR DEN ENZYMATISKE AKTIVITET. Dette enzym har en række fordele som model enzym. Det eksporteres gennem den indre membran ud i det periplasmatiske rum og kan derfor adskilles fra bakterierne ved at udsætte dem for et osmotisk shock. Enzymet er i modsætning til de fleste andre E. coli proteiner varmestabilt, hvilket gør oprensningen lettere og det kan derfor oprenses på de fleste gymnasier uden krav til avanceret apparatur. Enzymaktiviteten er let at bestemme og kan i den simpleste version bestemmes uden brug af et spektrofotometer. AP følger Michaelis-Menten kinetik og hæmmes kompetitivt af produktet uorganisk fosfat (HPO 4 2-, P i ) hvilket gør den velegnet til at illustrere basal enzymkinetik. Lidt om Spektroskopi (fra ref 1) En farvet opløsning indeholder kemiske forbindelser, som absorberer synligt lys ved bestemte bølgelængder. Dette udnyttes ved spektrofotometri, hvor der måles hvor meget lys ved en bestemt bølgelængde, der kan passere igennem en opløsning i forhold til en referenceopløsning. Størrelsen der måles, kaldes som bekendt absorbans. Den angives med et A og har ingen enhed. Absorbansen ved en bestemt bølgelængde afhænger af lysvejen (l i cm), koncentrationen af stoffet (her i mm) og en konstant ε λ som kaldes den molare absorptionskoefficient (ekstinktionskoefficienten, enhed fx M -1 cm -1 ). Sammenhængen kaldes Lambert-Beers lov: A = ε λ l [stof] Absorptionskurven har et karakteristisk forløb for det pågældende stof, og det er især interessant at vide, for hvilken bølgelængde den største absorption findes. Produktet i denne øvelse para-nitro-phenolation (pnp) har et absorptionsmaximum ved bølge-længden 405 nm, hvor den molare absorptions-koefficient ε λ er lig med 1850 M -1 cm -1 (talværdi stammer fra målinger foretaget på Panum Instituttet). Ved 410 nm er ε 410, ph8 (pnnp pnp) = 1620 M -1 cm -1 (ref 2). Lysvejen i forsøget er 1 cm. Med Lambert-Beers lov i hånden kan koncentrationen af reaktionsproduktet P beregnes, når [] 7

8 absorptionen måles, eller som vi er interesseret i dette forsøg, koncentrations-ændringen pr tid kan bestemmes ud fra ændringer i absorptionen pr tid : V = d[p]/dt = (1/ε λ l) da/dt Reaktionshastighed Michaelis-Menten enzymkinetik (ref 1) For simple enzymreaktioner har man iagttaget to karakteristiske egenskaber; i) når substratkoncentrationen er forholdsvis lille, så følger omdannelsen til produkt ofte, hvad der svarer til en første ordens reaktion med hensyn til substratkoncentrationen, og ii) når substratkoncentrationen er forholdsvis høj, så følger omdannelsen til produkt ofte, hvad der svarer til en nulte ordens reaktion med hensyn til substratkoncentrationen. I 1913 fremsatte Leonor Michaelis og Maud Menten en model for enzymreaktioner, som kunne forklare disse iagttagelser. Modellen fører frem til den såkaldte Michaelis-Menten ligning, i hvilken der indgår nogle størrelser, som kan karakterisere enzymreaktionen, nemlig Michaelis-Menten konstanten, K m, den maximale reaktionshastighed V max og hastighedskonstanten k cat, også kaldet enzymets turnover number. Michaelis-Menten ligningen benyttes stadig til at beskrive mange enzymers reaktionsforløb. I denne øvelse skal de tre konstanter K m, V max og k cat bestemmes for enzymet alkalisk phosphatase. I parentes bemærket kan nævnes at i midten af 1940 erne arbejdede Maud Menten også med dette enzym. Den enzymkatalyserede reaktion kan kort beskrives ved tre reaktioner. Substratet, S, bindes til enzymet, E, og der dannes et enzym-substrat kompleks, ES. Komplekset kan enten gå i stykker igen, hvorved substratet og enzymet gendannes, eller det kan omdannes til produktet P og enzymet. Til hver af de tre reaktioner er knyttet en hastighedskonstant. k 1 k cat E + S ES E + P k -1 Hvis det antages: i) substratkoncentrationen er meget større end enzymkoncentrationen, ii) omdannelsen af enzym-substrat kompleks til produktet og enzymet er hastighedsbestemmende og iii) koncentrationen af enzym-substrat komplekset ikke ændrer sig, kan Michaelis-Menten ligningen udledes: Fig 1 Ligningen viser sammenhængen substratkoncentrationen og reaktionshastigheden (se figur 3). For Michaelis-Menten konstanten, K m, den maximale reaktionshastighed V max og hastighedskonstanten k cat, gælder følgende ([E] o er enzymkoncentrationen): K m = (k -1 k cat )/k 1 og V max = k cat [E] 0 Hvis hastigheden V afbildes som funktion af substratkoncentrationen (fx begyndelses-koncentrationen), vil forløbet blive som det ses på figur 1. Grafen kan benyttes til at bestemme K m og V max. Der findes dog andre metoder, som er bedre kan benyttes til dette formål. [] 8

9 I dette forsøg findes typiske værdier for Michaelis-Menten konstanten, K m, omkring 0,15 µm, mens V max afhænger meget af enzymkoncentrationen, fra omkring 3 μm/min ved lave enzymkoncentrationer til omkring 10 μm/min ved høje enzymkoncentrationer. Det skal nævnes, at det langt fra er alle enzym-reaktioners substratafhængighed, som kan beskrives ved Michaelis-Menten modellen. Ved at bestemme initialhastigheden ved en række forskellige substratkoncentrationer kan en mætningskurve med aktivitet (V o ) som funktion af [S] tegnes. K m og V max kan bestemmes ved at fitte datapunkterne i et kurvefitteprogram til Michaelis-Menten ligningen. Man kan også tage det reciprokke af Michaelis-Menten ligningen hvorved fås: Fig 2 Når 1/V 0 afbildes som funktion af 1/[S] fås en ret linje med hældningen lig med K m /V max og afskæring med y-aksen lig med 1/V max (se figur 2). Hæmning af enzymaktiviteten Enzymers aktivitet kan påvirkes af forskellige hæmning. I dette tilfælde kan AP aktiviteten hæmmes af dets eget produkt P i, som er en kompetitiv hæmmer, dvs P i og substrat (i dette forsøg pnnp) konkurrerer om bindingen til det frie enzym. Dette påvirker K m mens V max ikke ændres. Michaelis-Menten ligningen for kompetitiv hæmning ser således ud:, og hvor Ved at måle initialhastigheder ved forskellige hæmmer koncentrationer kan K i (dissociationskonstanten) bestemmes ved kurve-fitning til ovenstående ligning. Spektrofotometer: Cecil CE series Målinger Reaktionerne foregår direkte i spektrofotometer kuvetter, og reaktionsmedierne blandes direkte i disse. Indstilling af spektrofotometeret Bølgelængden indstilles på 410 nm ved at trykke på Go to, 410, enter (E). Kinetik: [] 9

10 Kinetik programmet beregner reaktionshastigheder ved at måle hastigheden hvormed absorptionen ændrer sig som funktion af tiden og kan således måle initial hældninger. Kinetik programmet aktiveres ved først at trykke på Quant Kinetics Menu Kinetics Indtastning af parametrene i Kinetic programmet Den ønskede værdi for de forskellige parametre indtastes og accepteres med E. Taster man forkert før man har trykket E kan der slettes med C. Da man ikke på forhånd kender den ønskede værdi for alle parametrene må man gætte sig lidt frem. Man kan når forsøget er afsluttet, gå ind i Kinetics reprocess og ændre på alle parametre undtagen end time som ikke må være begrænsende. Vejledende værdier for startparametre: 1) Enter start time [m:s]: sættes altid til ) Enter time1 [m:s]: sættes typisk til ) Enter time 2 [m:s]: sættes typisk til ca. 2 min efter time 1 (dvs sættes til 02:30) 4) Enter end time [m:s]: Sættes typisk til ) Enter factor sættes altid til (1/ε 410 = μm cm) 6) Enter min Abs: sættes til ) Enter max Abs: sættes til ) Enter scale [s/cm]: Dette er skalaen på x-aksen. Sættes til 40 Spektrofotometeret nulstilles på kuvettens indhold ved at trykke på Zero før assayet startes. Reagenser 1 M Tris-HCl ph8 4 M NaCl 5 mm ZnCl 2 H 2 O (hvid farvekode) 2x Buffermix (200 mm Tris-HCl ph8, 1 M NaCl, 200 µm ZnCl 2 ) (gul farvekode) 15 mm pnpp (opløst i 10 mm Tris-HCl ph8) (grøn farvekode) 1 mm pnpp (fortyndet i 10 mm Tris-HCl ph8) (blå farvekode) 1 mm P i ph8 (rød farvekode) [] 10

11 Enzym Alkalisk phosphatase (AP) er oprenset fra E. coli HO1064 (F - aracam arad DE(lac)U169 trpam malam rpsl rela thi deod gsk-3 udp supf pstscab-phou) (ref 3). Enzymet ligger i TMZP buffer (10 mm Tris-HCl, 1 mm MgCl 2, 10 μm ZnSO 4, 100 μm NaH 2 PO 4 ph7.4). Det udleverede enzym er fortyndet i 10 mm Tris-HCl ph8.0 til en koncentration på 2,4 µg/ml (0.05 nm) (koncentrationen er estimeret udfra en SDS polyacrylamidgel og absorbtion ved 280 nm). Det aktive enzym består af to identiske subunits (hver på 471 aminosyrer og Mr= 49434g/mol). Normalt måles enzymaktiviteter ved 25 C (eller 37 C), men i denne øvelse måles der ved stuetemperatur da de fleste gymnasier sandsynligvis ikke har termostaterede spektrofotometre. [] 11

12 A. Bestemmelse af K m og V max µl µl µl µl Aktivitet Assay H 2 O 2x mix pnpp pnpp [pnpp] (15 mm) (1 mm) µm ΔA410/min µm/min ) Mix vand, buffermix og pnpp direkte i cuvetten og nulstil spektrofotometret. 2) Start assayet ved at tilsætte 10 µl AP (50 ng), mix ved omrøring og straks derefter starte målingen ved at trykke på RUN. 3) Efter et par minutter kan reaktionen stoppes og hældningen (initialhastigheden) kan bestemmes ved at t1 og t2 lægges på et passende sted hvor kurven er linear. Databehandling: Ved at afbilde enzym aktiviteten (fx µm produkt dannet per min eller blot ΔA410/min) som funktion af substratkoncentrationen fås en mætningskurve. K m og V max kan bestemmes direkte ved at punkterne fittes til Michealis-Menten ligningen i et kurve-fitting program eller, i mangel af software, bestemmes ud fra et et Lineweaver-Burk plot hvor 1/V afbildes som funktion af 1/[S]. [] 12

13 B. Bestemmelse af K m(app), V max(app) K I(Pi) Ved [P i ] = 50 µm µl µl µl µl µl Aktivitet Assay H 2 O 2x mix P i pnpp pnpp [pnpp] (1 mm) (15 mm) (1 mm) µm ΔA410/min µm/min ) Mix vand, buffermix, pnpp og P i direkte i cuvetten og nulstil spektrofotometret. 2) Start assayet ved at tilsætte 10 µl AP (50 ng), mix ved omrøring og straks derefter starte målingen ved at trykke på RUN. 3) Efter et par minutter kan reaktionen stoppes og hældningen (initialhastigheden) kan bestemmes ved at t1 og t2 lægges på et passende sted hvor kurven er linear. [] 13

14 C. Bestemmelse af K m(app), V max(app) K I(Pi) Ved [Pi] = 100 µm µl µl µl µl µl Aktivitet Assay H 2 O 2x mix P i pnpp pnpp [pnpp] (1 mm) (15 mm) (1 mm) µm ΔA410/min µm/min ) Mix vand, buffermix, pnpp og P i direkte i cuvetten og nulstil spektrofotometret. 2) Start assayet ved at tilsætte 10 µl AP (50 ng), mix ved omrøring og straks derefter starte målingen ved at trykke på RUN. 3) Efter et par minutter kan reaktionen stoppes og hældningen (initialhastigheden) kan bestemmes ved at t1 og t2 lægges på et passende sted hvor kurven er linear. [] 14

15 Øvrige forsøg (protokoller under udvikling): Det er let at udvide karakteriseringen med en lang række forsøg. Her er det nok at lave enkelt punkts asssays dvs assays ved høj substratkoncentration hvor aktiviteten ikke påvirkes af at en del af substratet forbruges. 1) AP kræver en Zn 2+ ion for at være aktiv. Her er AP opbevaret i en buffer med ZnCl 2, men det er let at fjerne Zn 2+ vha overskud af EDTA. Kinetikken af både inaktivering (med EDTA) og reaktivering (med overskud af ZnCl 2 ) kan let bestemmes. 2) Aktiviteten af AP afhænger af ionstyrken hvilket kan undersøges ved at ændre NaCl koncentration i en række assays. 3) ph optimum kan bestemmes vha en række buffere med forskelligt ph. Bemærk at ionstyrken af fx Tris-HCl buffer afhænger stærkt af ph. Dette kan udregnes og ionstyrken kan holdes konstant ved at ændre NaCl koncentrationen. 4) AP er temmelig varmestabil og bliver under oprensningen opvarmet til 80 C i 20 minutter. Varmestabiliteten af AP kan måles ved at inkubere enzymet ved fx 95 C. Ved at udtage prøver til forskellige tider og måle aktiviteten han en halveringstid bestemmes [] 15

16 Arbejdspakke 3 Strukturanalyser af Alkalisk Fosfatase [] 16

17 Introduktion til Struktur og Funktion af Alkalisk Fosfatase Enzymer er fantastiske mikromaskiner, hvis atomare strukturer udgør finmekanikken i selve processen. For at forstå hvorledes et enzym virker og for at kunne ændre denne funktion ved hjælp af proteindesign, er det vigitgt at kende dets struktur i detaljer. Der findes kun to metoder, hvormed man kan opnå denne information, nemlig krystallogfrafi og røngten diffraktion, samt kerne magnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Begge disse metoder frembringer koordinater (x,v,z) for atomerne i enzymet (og andre biomolekyler) og disse kan visualiseres i dertil fremstillede programmer, de såkaldte molekylære viewers. For alkalisk fosfatase (AP) er der løst en stort sæt af strukturer og en søgning i strukturdatabasen giver mere en 60 hits. For alkalisk fosfatase fra E. coli nedbringes antallet lidt, men der er stadig mange at vælge imellem. Spørgsmået er, hvilken struktur man bedst er tjent med at vælge som analyseplatform. Det afhænger i høj grad af formålet med analysen og målet for ens design. Typisk findes der strukturer af forskellige varianter af enzymet (mutanter) og strukturer af komplekser med forskelllige ligander og inhibitorer. Vi har udvalgt et minimeret basissæt, som vil tjene som råmateriale for dagens in silico analyse. Vi skal gennem strukturanalyser af AP allerførst lære at bruge selve programmet og derigennem opnå forståelse for proteiners struktur. Derefter vil vi prøve at designe et sæt af enzymevarianter, som vi vil forvente enten vil have forskellige egenskaber i form af øget/sænket enzymaktivitet, ændret ph optimum eller ændret protein stabilitet. For at kunne lave nogle kvalificerede valg og ikke arbejde gennem trial and error analyser, anvender man ofte in silico værktøjer. Vi vil introducere to af disse værktøjer på kurset, PROPKA, der er et værktøj som udfra en strukturfil, kan beregne pka værdier for alle ioniserbare grupper i proteinet (input PDB fil). Det andet værktøj er ERIS som forudsiger ændringer i proteinet globale stabilitet på baggrund af en mutation. Dette værktøj arbejder også udfra en strukturfil. Begge programmer beskrives kort til sidst i denne oversigt. I øvelsen vil vi først give en kort introduktion til en strukturfil (PDB fil), til selve analyseprogrammerne (PyMOL, PROPKA, ERIS), og til hvorledes I kan løse dagens opgave. Der foreligger ikke et egentligt facit for selve designprocessen. Altså er udvælgelsen af, hvilken type variant af alkalisk fosfatase I ønsker at frembringe, helt jeres valg. Vi vil naturligvis være tilstede under øvelsen og være behjælpelig med programmerne. Rigtig god fornøjelse Kaare Teilum og Birthe Kragelund [] 17

18 OPGAVEARK Følgende opgaver og analyser kan gennemføres på workshopdagen 1) Beskriv den overordnede struktur 2) Vis aminosyrerester i det aktive site (indenfor 5 Å) af PO4 i 1ED8 wt med PO ) Identificer ligander til PO 4 3, Mg 2+, Zn 2+ i 1ED8, og undersøg de samme rester i 1ED9 hvor der ikke er PO 4 3 bundet. Er der forskelle og ligheder? 4) Forklar hvordan Ser102 er aktiveret for nucleofilt angreb af en fosfoester. 5) Foreslå punktmutationer i det aktive site eller andre steder der vil a) ødelægge aktiviteten b) ændre ph optimum c) ændre proteinets stabilitet [] 18

19 Oversigt over tilgængelige strukturer af alkalisk fosfatase denne table indeholder oversigt over de tre strukturfiler, der skal udgøre basis for øvelsen PDB kode Molekyle Kommentarer 1ED8 Alkalisk fosfatase E. coli Inhiberet med uorganisk fosfat PO4 1ED9 Alkalisk fosfatase E. coli Uinhiberet Indeholder også magnesium, zink og sulfationer Indeholder også magnesium, zink og sulfationer 3DPC Alkalisk fosfatase E. coli mutantprotein I kompleks med fosforpeptid [] 19

20 Introduktion til PDB filer Hvad er PDB? The Protein Data Bank (PDB) er et arkiv (en database) over eksperimentelt bestemte tredimensionale strukturer af biologiske makromolekyler. Databasen anvendes globalt af forskere, undervisere og studerende. De data, der er indeholdt i databasen, er molekylernes atomare koordinater (rumlige placering (x,y,z) for hvert atom), bibliografiske citationer, den primære struktur (sekvensen), sekundær struktur information, krystallografiske struktur faktorer og eksperimentelle NMR data. PDB serverne The Worldwide Protein Data Bank (wwpdb) er en organisation, der systematiserer deponering, data processering og fordelingscentre for PDB data. Grundlæggerne er RCSB PDB (USA), MSD EBI (Europa) og PDBj (Japan). BMRB (USA) gruppen kom med I wwpdb i Missionen for wwpdb er til stadighed at bibeholde et eneste globalt arkiv over makromolekylære strukturelle data, gratis og frit tilgængeligt for hele den globale verden. Antallet af tilgængelige strukturer i PDB databasen stiger hele tiden. Den 22 december 2009 var antallet strukturer. En struktur er repræsenteret af en fil og alle strukturer har et firekarakters navn, feks. 1RW5. Nyttige links: PDB fil formatet En PDB fil er en helt almindelig tekstfil! Du kan læse den med hvilken teksteditor du har tilgængelig. De første linier i en pdb fil ser nogenlunde såden her ud: HEADER PROTEIN BINDING 19 NOV 03 1RJH TITLE STRUCTURE OF THE CALCIUM FREE FORM OF THE C TYPE LECTIN TITLE 2 LIKE DOMAIN OF TETRANECTIN og dette fortsætter de næste linier Der findes ligeledes en stort antal af programmer, der kan læse pdb filformatet, og vise en 3 dimensinal struktur på skærmen (se nedenfor). Record Format Enhver PDB fil kan ses som et antal af liner afsluttet med en end of line indikator. Hver linie består af 80 kolonner og er derfor også selvidentificerende. De føste seks kolonner af hver linie besåt af [] 20

21 et navn, ventrestillet og blank fyldt. Dette navn skal være et eksakt match med at af de navne der findes i databasen. PDB filen kan også ses som en samling af filer. Hver type fil indeholder en eller flere linier. Hver fil kan ydermere indeles i sektioner. Sektioner Tabellen nedenfor opsummerer de forskellige sektioner i en PDB fil og de forskellige felter (record types) de består af: Section Title: Summary descriptive remarks Remark: Bibliography, refinement Primary Structure: Peptide and/or nucleotide sequence and the relationship between the PDB sequence and that found in the sequence database(s) Heterogen: Non standard HET groups Secondary structure Connectivity: Chemical connectivities Miscellaneous features: Features within the macromolecule Crystallographic: Crystallographic cell Coordinate transformation: Coordinate transformation operators Coordinate: Atomic coordinate data Connectivity: Chemical connectivity Bookkeeping: Summary information, end of file marker Record Types HEADER, OBSLTE, TITLE, CAVEAT, COMPND, SOURCE, KEYWDS, EXPDTA, AUTHOR, REVDAT, SPRSDE, JRNL REMARKs 1, 2, 3 & annotations DBREF, SEQADV, SEQRES, MODRES HET, HETNAM, HETSYN, FORMUL HELIX, SHEET, TURN SSBOND, LINK, HYDBND, SLTBRG, CISPEP SITE CRYST1 ORIGXn, SCALEn, MTRIXn, TVECT MODEL, ATOM, SIGATM, ANISOU, SIGUIJ, TER, HETATM, ENDMDL CONECT MASTER, END Titelsektion Denne sektion indeholder de felter, der bruges til at beskrive eksperimentet og det biologiske makromolekyle for denne PDB ingang HEADER: Uniquely identifies a PDB entry through the idcode field. This record also provides a classification for the entry. Finally, it contains the date the coordinates were deposited at the PDB. o HEADER PROTEIN BINDING 19 NOV 03 1RJH TITLE: Contains a title for the experiment or analysis that is represented in the entry. It should identify an entry in the PDB in the same way that a title identifies a paper. COMPND: Describes the macromolecular contents of an entry. SOURCE: Biological and/or chemical source of each biological molecule in the entry. KEYWDS: Set of terms relevant to the entry. EXPDTA: Information about the experiment. AUTHOR: The names of the people responsible for the contents of the entry. REVDAT: History of the modifications made to an entry since its release. JRNL: Primary literature citation that describes the experiment which resulted in the deposited coordinate set. AUTH: List of authors associated with the cited article or contribution to a larger work TITL: Title of the reference. [] 21