(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT. Patent- og Varemærkestyrelsen (11) DK B1 G 01 N 33/543

Transkript

1 (19) DANMARK (11) DK B1 (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: C 07 K 14/155 C 07 K 7/06 C 07 K 7/08 C 12 P 21/02 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (86) International ansøgning nr: PCT/EP85/00548 (86) International indleveringsdag: (85) Videreførelsesdag: (30) Prioritet: FR GB GB G 01 N 33/543 (73) Patenthaver: Institut Pasteur, rue du Dr. Roux, Paris Cedex 15, Frankrig Centre National de la Recherche Scientifique, 15 Quai Anatole France, Paris, Frankrig (72) Opfinder: Luc Montagnier, 21, rue de Malabry, F Le Plessis Robinson, Frankrig Bernard Krust, 7, rue de Madagascar, F Paris, Frankrig Solange Chamaret, 324 rue Lecourbe, F Paris, Frankrig Jean-Claude Chermann, 2 clos d'ergal, F Elancourt, Frankrig Francoise Barre-Sinoussi, 50, rue d'erevan, F lssy-les-moulineaux, Frankrig Marc Alizon, 71, rue du Cardinal Lemoine, F Paris, Frankrig Pierre Sonigo, 23, rue Gutenberg, F Paris, Frankrig Cole Stewart, 4bis Villa Denise, F Chatillon, Frankrig Olivier Danos, 1 Place Rollet, F Paris, Frankrig Simon Wain-Hobson, 3, rue Jean de la Fontaine, F Montigny Les Bretonneux, Frankrig Francois Clavel, 83 rue de l'assomption, F Paris, Frankrig (74) Fuldmægtig: Zacco Denmark A/S, Hans Bekkevolds Allå 7,2900 Hellerup, Danmark (54) Benævnelse: Antigen, fremgangsmåde til fremstilling af antigenet, fremgangsmåde til diagnosticering samt immunogene præparater,. (56) Fremdragne publikationer: ingen fortsættes

2 (57) Sammendrag: Rensede ekspressionsprodukter af DNA-sekvenser stammende fra genomet af LAV-virus beskrives. Specielt beskrives et glycoprotein med en molekylvægt på ca eller antigen med lavere molekylvægt stammende fra ovennævnte, hvilket rensede produkt er i stand til at genkendes af sera af human oprindelse, der indeholder antistoffer mod LAV-virusen. Andre rensede polypeptider stammende enten fra ovennævnte glycoprotein eller fra kerneproteiner af LAV-virus beskrives ligeledes. Glycoproteinet kan anvendes til fremstilling af immunogene præparater, der er i stand til at neutralisere LAV-virus. Alle nævnte glycoproteiner eller polypeptider kan anvendes som antigener, der kan anvendes ved diagnosticering af LAVantistoffer i sera Era patienter M 40~ p110 p41 p kka 4, 5; errs5":57.1k, * OD D D 41» D pis D FIG.1

3 1 Den foreliggende opfindelse angår et produkt der indeholder polypeptidskelettet af et glycoprotein af LAV kappen samt en fremgangsmåde til fremstilling heraf. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til diagnosticering af antistoffer over for LAV virus, samt et immunogent præparat. 5 Det kausative agens, hvad enten det drejer sig om LAS eller AIDS, et retrovirus er blevet identificeret af F. BARRE-SINOUSSI et al., Science, 220, 868 (1983). Det har følgende egenskaber. Det er T-Iymphotropt; dets foretrukne mål udgøres af Leu 3 celler (eller T4 lymphocytter); det har omvendt 10 transcriptase-aktivitet, hvilket nødvendiggør tilstedeværelsen af Mg+ og udviser stærk affinitet over for pol y(adenylat-oligodeoxy-thymidylat) (poly(a)-oligo(dt) 12-18). Det har en densitet på 1,16-1,17 i en saccharosegradient, en gennemsnitsdiameter på 139 nanometer; og en kerne, der har en gennemsnitsdiameter på 41 nanometer. Antigener af dette virus, specielt et protein 15 p25, genkendes immunologisk af antistoffer, der findes i sera udvundet fra patienter, der er inficeret med LAS eller AIDS. p25-proteinet, der er et kerneprotein, genkendes ikke immunologisk af p24-protein af HTLVI og II vira. Viruset er også uden et p19-protein, der er immunologisk kryds-reaktivt med p19-proteiner fra HTLVI og HTLVII. 20 Retrovira af denne type (somme tider betegnet med den generiske forkortelse LAV) er deponeret i National Collection of Micro-organism Cultures of the INSTITUT PASTEUR of Paris, under numrene 1-232, og Virusstammer lig med LAV i alle henseender set ud fra morfologisk og immunolo- 25 gisk synspunkt er isoleret i andre laboratorier. Der henvises herved til f.eks. retrovirusstammer betegnet HTLV-llI isoleret henholdsvis af R.C. GALLO et al., Science, 224, 500 (1984) og af M.G. SARNGADHARAN et al., Science 224, 506 (1984) og retrovirus isoleret af M. JAY LEVY et al., Science, 25, (1984), hvilket virus er blevet betegnet ARV. For at lette sprogbru- 30 gen vil de sidstnævnte vira, såvel som andre, der har ækvivalente morfologiske og immunologiske egenskaber, i det efterfølgende blive betegnet under

4 2 den generiske betegnelse "LAV". Der henvises også til europæisk patentansøgning indleveret 14. september 1984 med prioritet fra engelsk patentansøgning nr indleveret 15. september 1983 med hensyn til en mere detaljeret beskrivelse af LAV retrovira eller lignende og i anvendelser, som 5 ekstrakterne af disse vira giver anledning til. Til at begynde med var kerne-antigenerne hovedantigeneme af de viruslysater eller ekstrakter, der blev genkendt af serum fra patienter inficeret med AIDS eller LAS i de forsøgssystemer, der på det tidspunkt blev anvendt. Et 10 p42-protein, som viste sig at bestå af et kappeprotein, var også blevet påvist. På samme måde har GALLO et al påvist et p41-protein, der også anses for at være en mulig komponent af viruskappen. Fremgangsmåder til at opnå et LAV-virus er også blevet beskrevet. Der hen- 15 vises specielt til den allerede nævnte artikel af F. BARRE-SINOUSSI et al., med hensyn til præparationen af viruset i T-lymphocytkulturer stammende enten fra blod eller fra navlestrengen eller også fra knoglemarvsceller fra voksne raske donorer. Denne metode omfatter specielt følgende essentielle trin: 20 frembringelse af en viral infektion af disse T-Iymphocytter efter aktivering af et lectin mitogen med en viral suspension stammende fra en urenset supernatant væske af lymphocytter, der frembringer viruset (til at begynde med opnået fra en patient inficeret med LAS eller AIDS), dyrkning af celler infice- 25 ret med TCGF i nærvær af anti-a-interferonfåreserum, rensning af det frembragte virus (produktionen starter sædvanligvis mellem den 9. og 15. dag efter infektion og varer fra 10 til 15 dage), idet rensningen omfatter udfældningen af virus i polyethylenglycol for at frembringe en første 30 koncentration af viruset, herefter centrifugering af det opnåede præparat i en 20-60% saccharosegradient eller i en isotonisk gradient af metrizanid (for-

5 3 handlet under handelsnavnet NYCODENS af NYEGåRD, Oslo) og udvinding af viruset med det bånd, der har en densitet på 1,16-1,17 i saccharosegradienten eller pål 10-1,11 i Nycodensgradienten. 5 LAV-viruset kan også frembringes ud fra permanente cellelinier af type T som f. eks. CEM-linien eller ud fra B-lymphoblastoide cellelinier f. eks. opnået ved transformation af lymphocytterne stammende fra en rask donor med Epstein-Barr-viruset, f.eks. som beskrevet i fransk patentansøgning nr indleveret 9. maj De frembragte permanente cellelinier frem- 10 bringer kontinuert et virus (betegnet LAV-B, når det drejer sig om B-lymphoblastoid-cellelinierne), der er i besiddelse af de essentielle antigene og morfologiske træk fra LAV-vira (bortset fra, at det er indsamlet i et densitetsbånd, der er lidt højere end i det forudgående tilfælde (specielt 1,18) i saccharose). Den endelige oprensning af viruset kan også udføres i en Nycodenzgradient. 15 En metode til at klone DNA-sekvenser, der kan hybridisere med det genome RNA fra LAS, er allerede blevet omtalt i engelsk patentansøgning nr indleveret 19. september Der henvises herved til denne ansøgning, hvad angår materiale, der er fælles for nævnte ansøgning og nærvæ- 20 rende ansøgnings yderligere forbedringer. Opfindelsen har til hensigt at tilvejebringe rensede uændrede virusformer (eller vira, der er mindre forandret ved de anvendte oprensningsmetoder) og metoder til opnåelse af disse uændrede rensede vira. 25 Herudover har opfindelsen til hensigt at tilvejebringe yderligere hidtil ukendte metoder, som ikke alene er værdifulde til afsløring af LAV eller beslægtede vira (i det efterfølgende mere generelt omtalt som "LAV-vira"), men som også har større anvendelighed, specielt til afsløring af specifikke dele af det geno- 30 DNA af disse vira, hvis udtrykelsesprodukter ikke altid direkte kan afsløres ved immunologiske metoder. Herudover har opfindelsen til hensigt at til-

6 4 vejebringe polypeptider indeholdende sekvenser fælles med polypeptider omfattende antigene determinanter indbefattet i proteinerne kodet og udtrykt af LAV-genomet, der forekommer i naturen. Desuden tilvejebringer opfindelsen metoder til afsløring af proteiner beslægtede med LAV-virus, specielt til 5 diagnose af AIDS eller præ-aids eller i modsætning hertil metoder til at afsløre antistoffer over for LAV-viruset eller proteiner beslægtet hermed, specielt hos patienter, der er ramt af AIDS eller præ-aids eller mere generelt hos asymptomatiske bærere og i blod-produkter. Endelig har opfindelsen også til hensigt at tilvejebringe immunogene polypeptider og mere specielt 10 beskyttende polypeptider, der anvendes ved fremstillingen af vaccinepræparater mod AIDS eller beslægtede syndromer. I overensstemmelse hermed angår opfindelsen et produkt, der er karakteriseret ved det i krav 1's kendetegnede del angiven. 15 En uændret renset LAV-retrovirus adskiller sig fra de kendte vira, der er defineret ovenfor, ved at de omfatter en vis mængde af en eller flere kappeantigener der er tilstrækkelig til at kunne visualiseres, dersom viruset mærkes med 35 S-cystein, uden umærket cystein i et forhold på 200 mikrocurie pr. ml 20 substrat. Disse antigener, blandt hvilke specielt glycoproteiner, genkendes selektivt in vitro af sera fra patienter, der er inficeret af AIDS eller LAS eller af sera fra asymptomatiske bærere af viruset. Opfindelsen angår selve antigenerne, specielt med en molekylvægt på ca , der også er i besiddelse af evnen til at blive genkendt af sera fra patienter inficeret med AIDS eller LAS eller af sera fra personer, der er blevet udsat for LAV-vira eller disses analoge. 30 Foretrukne omhandlede antigener udgøres af glycoproteiner.

7 5 Et foretrukket antigen ifølge den foregående definition, der kan opnås fra et lysat af dette virus (eller ved forsigtig rensning af virusets kappe) er et glycoprotein med en molekylvægt i størrelsesorden dalton, bestemt ved dets vandringslængde i forhold til vandringslængdene i det samme van- 5 dringssystem af standardproteiner med kendte molekylvægte. Specielt blev sammenlignende målinger foretaget på en 12,5% polyacrylamidgel under en spænding på 18 V i 18 timer, idet der anvendtes følgende standardproteiner (markedsført af AMERSHAM): 10 - (14C)-methyl lysozym (molekylvægt: 14300), - (14C)-methyl carbondioxid (molekylvægt: 30000), - (14C)-methyl ovalbumin (molekylvægt: 46000), - (14C)-methyl bovint albuminserum (molekylvægt: 69000), - b-(14c)-methyl phosphorylase (molekylvægt: 92500), 15 - (14C)-methyl myosin (molekylvægt: ). Disse glycoproteiner har også evnen til at danne komplekser med concanavalin A, idet komplekset er dissocierbart i nærvær af 0-methyl-_-Dmannopyranosid. De kan også binde til andre lectiner f. eks sådanne, der er 20 kendt under navnet "Lentyl-Lectin". Det foretrukne omhandlede antigen med en molekylvægt på er også følsomt over for indvirkningen af endoglycosidaser. Denne virkning kan fastslås ved fremkomsten af et protein med en molekylvægt at størrelsesordenen ud fra antigenet med en molekylvægt på , idet førstnævnte kan skilles f. eks. ved immuno- 25 præcipitation eller ved en adskillelse, hvor man anvender forskellene i molekylvægt (vandringer forskellige på gelen). Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede produkter, hvilken fremgangsmåde er særegen ved det i krav 14's kendeteg- 30 nede del angivne. Denne fremgangsmåde adskiller sig væsentlig fra de ovenfor nævnte kendte metoder med hensyn til den endelige oprensning.

8 6 Specielt er oprensningen ved den omhandlede fremgangsmåde ikke længere udført i gradienter, men omfatter udførselen af differentielle centrifugeringer udført direkte på den supernatante del af dyrkningssubstratet fra de producerende celler. Disse centrifugeringer omfatter specielt en første centrifugering 5 med en vinkelcentrifugeringshastighed specielt ved omdr. pr. min., der muliggør fjernelse af ikke-virale bestanddele, mere specielt af cellebestanddele, herefter en anden centrifugering ved højere vinkelhastighed, specielt ved omdr. pr. min., hvorved der opnås udfældningen af selve viruset. I en foretrukken udførelsesform udføres den første centrifugering ved omdr. pr. min. i 10 minutter og den anden ved omdr. pr. min. i 20 minutter. Disse er naturligvis kun vejledende værdier, idet det er velkendt af fagmanden at modificere centrifugeringsbetingelserne til opnåelse af adskillelse af de cellulære bestanddele fra de virale bestanddele. 15 Denne modifikation af oprensningen bevirker frembringelsen af virale præparater, ud fra hvilke det nævnte antigen lettere kan isoleres end fra viruspræparater, der er frembragt ved de tidligere nævnte metoder. Under alle omstændigheder kan de vira, der opnås til slut ved den omhandlede frem- 20 gangsmåde, lettere genkendes af sera fra patienter eller fra personer, der har været udsat for LAV-viruset eller for morfologisk og antigent lignende stammer. De omhandlede antigener kan selv fås fra ovennævnte omhandlede vira ved 25 lyse (eller anden passende bearbejdning) af sidstnævnte i nærværelse af et hvilket som helst passende detergent eller ved udvindelse og fraskillelse af de frigjorte antigener. Med fordel udføres lysen af virus i nærværelse af aprotinin eller et hvilket som helst andet middel, der er i stand til at hæmme indvirkningen af proteaser. Fraskillelsen af de omhandlede antigener kan udfø- 30 res ved i og for sig kendte metoder; f. eks. er det muligt at gå videre med adskillelsen af proteinerne ved at anvende deres respektive forskellige vandrin-

9 7 ger i en forudbestemt gel, idet det ønskede protein herefter isoleres fra den zone af gelen, hvor det normalt ville findes ved en elektroforesebehandling under veldefinerede betingelser, idet man tager hensyn til dets molekylvægt. De omhandlede antigener kan imidlertid skilles fra lysatet fra de ovennævnte 5 vira p.g.a. deres affinitet over for lectiner, specielt over for concanavalin A eller lentyl-lectin. Det anvendte lectin er fortrinsvis immobiliseret på en fast understøttelse som f. eks. den tværbundne polymer, der stammer fra agarose og som markedsføres under navnet SEPHAROSE. Efter vask af de bundne antigener med en passende puffer kan antigenerne elueres på en 10 hvilken som helst passende måde, idet man specielt anvender en 0-methyla-D-mannopyranosid i opløsning. En mere grundig rensning af disse antigener kan udføres ved immunopræcipitation med patient-sera, der vides at indeholde antistoffer, der er ef- 15 fektive over for proteinet, ved hjælp af koncentrerede antistof-præparater (polyklonale antistoffer) eller med monoklonale antistoffer mere specielt rettet mod det omhandlede antigen, specielt det, der har en molekylvægt på , nedenfor beskrevet med forkortelsen gp Yderligere detaljer ved opfindelsen vil blive klarlagt i den efterfølgende angi- ver, der beskriver isolering af et omhandlet virus og af antigener, specielt et kappeantigen af viruset, idet der henvises til tegningen, hvor fig. 1 er en fotografisk gengivelse af gelstrimler, der er anvendt til at udføre 25 elektroforese af lysatekstrakter af T-Iymphocytter, henholdsvis inficeret og uinficeret (kontroller) med en LAV-suspension, fig. 2 er et restriktionskort af et komplet LAV-genom (clon X.,119), 30 fig. 3a til 3e er den fuldstændige sekvens af et LAV-viralt genom,

10 8 fig. 4 og 5 viser skematisk dele af de tre mulige aflæsningsfaser af LAVgenomt RNA, herunder de åbne læserammer (ORF), der forekommer i hver af aflæsningsfaserne, og 5 fig. 6 er en skematisk afbildning af den LAV lange endestillede gentagelse (LTR). T-Iymphocytter stammende fra en rask donor og inficeret med LAV 1 under de betingelser der er beskrevet af F. Barre-Sinoussi et Coll., på CEM-celler 10 stammende fra en patient, der er ramt af leukæmi, og også inficeret in vitro med LAV 1, dyrkedes i et substrat indeholdende 200 mikrocurie 35S-cystein og uden umærket cystein. De inficerede lymphocytter dyrkedes i et ikkedenaturerende substrat for at forhindre nedbrydning af det ønskede antigen. Den supernatante væske fra dyrkningssubstratet underkastedes herefter en 15 første centrifugering ved omdr. pr. min. i 10 minutter for at fjerne ikkevirale komponenter, herefter en anden centrifugering med omdr. pr. min. i 20 minutter for at bundfælde viruset. Viruspelleten lyseres herefter med detergent i nærværelse af aprotinin (5%) specielt under de betingelser, der er beskrevet i artiklen af F. Barre-Sinoussi et Coll. 20 Den samme behandling blev gentaget på lymphocytter, der var opnået fra en rask donor som kontrol. De forskellige lysater immunopræcipiteredes herefter med serum fra patien- 25 ter inficeret med AIDS eller LAS. Sera, der stammede fra raske donorer eller fra donorer inficeret med andre sygdomme, immunopræcipiteredes også. Herefter underkastedes substratet elektroforese i en SDS-polyacrylamidgel. Resultaterne er angivet i fig. 1. Gelstrimlerne nummereret fra 1 til 6 blev op- 30 nået fra præparater mærket med 35S-cystein. Strimlerne nummereret 7 til 10 viser resultater opnået på inficerede eller uinficerede lymphocyt-præparater

11 9 mærket med 35S-methionin. Endelig svarer strimlen M til vandringslængden af de ovennævnte identificerede standardproteiner, hvis molekylvægt er angivet i den højere del af figuren. 5 Henvisning til de mærkede virale proteiner angives i figurens venstre side. Det skal bemærkes, at kolonne 7 til 10 viser det specifikke protein p25 af LAV mærket med 35S-methionin. Det samme protein mangler på strimmel 8 til 10 svarende til resultater opnået med et præparat, der stammer fra raske 10 lymphocytter. Kolonne 3 og 5 svarer til resultaterne, der er observeret på præparater opnået fra inficerede lymphocytter og mærket med 35S-cystein. Proteinerne p25 og p18, de karakteristiske kerneproteiner af LAV, og glycoprotein gp110, og- 15 så specifikt for LAV, fandtes også. Afbildninger svarende til et protein p41 (molekylvægt af størrelsesordenen 41000) forekom i de forskellige præparater, skønt mindre distinkt. Det omhandlede virus og det omhandlede antigen kan enten udfældes med 20 lectiner, specielt concanavalin A, eller bindes til en Sepharose-concanavalin A søjle. Specielt kan oprensningen af kappeglycoproteinerne udføres påfølgende måde. Bindingen kan specielt udføres ved at bringe et lysat af LAVvirus opløst i en passende puffer i kontakt med concanavalin-a bundet til Sepharose. En passende puffer har følgende sammensætning: 25 Tris 10 mm NaCI 0,15 M CaCl2 1 mm MgCl2 1 mm 30 Detergent markedsført under navnet Triton 1 /0

12 1 0 ph 7,4 Når der er opnået binding vaskes Sepharose e-concanavalin A med en puffer 5 med samme sammensætning, bortset fra at Triton -koncentrationen sænkes til 0,1%. Eluering udføres herefter med en 0,2 M 0-methyl-a-Dmannopyranosidopløsning i vaskepufferen. Proteinet kan yderligere koncentreres ved immunopræcipitation med antistof- 10 fer indeholdt i patientsera, der er inficeret med AIDS, eller med polyklonale antistoffer, der er opnået fra et serum stammende fra et dyr, der forud er immuniseret mod det "uændrede" omhandlede virus eller ovennævnte protein. Proteinet kan herefter udvindes ved dissociering af komplekset med en opløsning, der har passende indhold af ionsalt. Fortrinsvis immobiliseres anti- 15 stof-præparatet selv på kendt måde på en uopløselig bærer f. eks. af Sepharose B-typen. Det er også muligt at gribe til monoklonale antistoffer secerneret af hybridomer, der forud er præpareret overfor gp 110. Disse monoklonale antistoffer 20 såvel som hybridomerne, der frembringer dem, udgør også en del af den foreliggende opfindelse. En metode til at frembringe og udvælge monoklonale antistoffer rettet mod gp110 glycoproteinet er beskrevet nedenfor. 25 Grupper af Balb/c-mus 6 til 8 uger gamle anvendtes. En gruppe fik viruset indeholdende ovennævnte glycoprotein, en anden et renset glycoprotein gp110. Immuniseringsmetoden, der var identisk for alle mus, bestod af indsprøjtning af 10 mg af det antigene præparat i nærværelse af Freunds kom- 30 plette adjuvans på dag 0, herefter igen, men i nærværelse af Freunds ukom-

13 11 plette adjuvans pådag 14 og uden adjuvans på dag 28 og 42. De tre første indsprøjtninger blev foretaget intraperitonealt, den fjerde intravenøst. Den ikke-secernerende myelomavariant 5,53 P3 x 63 Ag8 resistent over for 5 azaguanin, der selv stammer fra MOPC-21 cellelinien, anvendes. Fusion med immuniserede muse splenocytter udføres i nærværelse af polyethylenglycol 4000 ved hjælp af metoden beskrevet af Fazekas de st-groth og Scheidegger på den 45. dag. Selektionen af hybriderne i RPMI i "HAT"-substrat udføres på plader med 24 brønde (kendt under betegnelsen 10 Costar) ved at anvende de samme dyrkningsmetoder. Hybridomer, der frembringer antistoffer af tilstrækkelig specificitet, klones herefter i plader 96 brønde i nærværelse af et "føde" lag af syngene thymocytter. De således selekterede producerende cloner opformeres herefter i brøndplader stadig i tilstedeværelsen at thymocytter. Når der ses sammenfyldning i en af brøndene, injiceres klonen intraperitonealt i en Balb/c-mus, der er behandlet med en injektion Pristane 8 dage forud og/eller holdt i flydende kultur. 20 Fem forskellige metoder muliggør karakterisering af klonerne, der frembringer antistoffer med passende specificitet. I et første stadie bestemmes de hybrider, der frembringer antistoffer, ved en ELISA-test, der afslører museimmunoglubiner i de supematante væsker. Ud fra denne første selektion søges supernatante dele, der har antistoffer rettet mod virale bestanddele 25 ved hjælp af en ELISA-test, der afslører anti-lav-antistoffer, eller ved immunofluorescens på virusproducerende humane celler. Til slut analyseres de supernatante væskedele ved radioimmuno-præcipitation af virus mærket med cystein og ved hjælp af Western-blot-metoden på virale præparater, hvilket muliggør bestemmelse af disse anti-lav-antistoffers specificitet. 30

14 12 Celler opnået fra de forskellige fusioner anbringes under dyrkning i 648 brønde. Mikroskopisk undersøgelse heraf viser, at hoveddelen af disse brønde indeholder en enkel hybridklon, der er i stand til at vokse i et "HAT" selektivt substrat. Mere end 50% af disse frembringer antistoffer, der forårsager et 5 positivt respons under ELISA-antivirusundersøgelse. De mest repræsentative fusioner undersøges ved hjælp af Western-blot-metoden og adskillige af dem subklones, idet man tager hensyn til deres respektive specificitetsreaktiviteter i antivirus ELISA og deres opførsel under dyrkningsbetingelserne. De hybrider, der mere specielt selekteres, er de, der frembringer antistoffer, der se- 10 lektivt vil genkende det virale glycoprotein gp110, der har en molekylvægt på ca. 110 KD. Alle subkloningerne giver anledning til kloner, der frembringer antistof, der efter udtrykkelse, indsprøjtes i syngene mus. Analyse af tilstedeværende antistoffernes specificitet i de forskellige ascites væsker bekræfter specificiteten af ascites antistofferne med hensyn til gp De opnåede monoklonale antistoffer kan i sig selv anvendes til at rense proteiner indeholdende et antigensted også indeholdt i gp110. Opfindelsen angår derfor også disse rensningsmetoder som sådan. Fremgangsmåden kan med fordel anvendes på viruslysater eller T-lymphocytlysater eller andre cel- 20 ler, der frembringer LAV eller lignende, når man har passet på at undgå den ukontrollerede fraskillelse af gp110 under rensningsproceduren af viruset, inden lysen heraf. Det er ikke nødvendigt at nævne, at metoden også kan anvendes på en hvilken som helst opløsning indeholdende gp110 eller et protein, polypeptid eller glycoprotein omfattende et antigensted, der normalt er 25 båret af kappeproteinet og genkendt af det monoklonale antistof.'for at udføre metoden immobiliseres de monoklonale antistoffer med fordel på en fast understøttelse, fortrinsvis tilpasset affinitetschromatografimetoder. For eksempel fikseres disse monoklonale antistoffer på et agarosegitter med tredimensional tværbinding markedsført under navnet Sepharose af det svenske 30 Pharmacia Aktieselskab f. eks. ved hjælp af cyanbromidmetoden.

15 13 En foretrukken udførelsesform er en fremgangsmåde til adskillelse af de nævnte antigener, hvorved man bringer en blanding af antigenerne, herunder de omhandlede (f. eks. et viruslysat eller ekstrakt) i kontakt med en affinitets- 5 søjle, der indeholder nævnte monoklonale antistoffer for selektivt at binde polypeptider, proteiner eller glycoproteiner, der selektivt genkendes af de monoklonale antistoffer, at man udvinde sidstnævnte ved dissociering af antigen-antistofkomplekset ved hjælp af en passende puffer, specielt en opløsning af passende ionstyrke som f. eks. et salt, fortrinsvis ammoniumacetat 10 (der ikke giver nogen rest ved frysetørring af præparatet) eller en opløsning syrnet til ph 2-4 eller til en glycinpuffer med samme ph, og at man udvinder de eluerede polypeptider, proteiner eller glycoproteiner. Det er klart, at opfindelsen også omfatter polypeptidfragmenter med lavere 15 molekylvægte, og som indeholder antigene sted, der kan genkendes af de samme monoklonale antistoffer. Det er klart for fagmanden, at rådigheden over monoklonale antistoffer, der genkender gp110 glycoproteinet, også giver muligheder for mindre peptidsekvenser eller fragmenter indeholdende det fælles antigensted eller epitop. Fragmenter af mindre størrelse kan opnås 20 ved at anvende velkendte metoder. For eksempel omfatter en sådan metode spaltning af det oprindelige større polypeptid med enzymer, der er i stand til at spalte det ved specifikke steder. Som eksempel på sådanne proteiner kan nævnes enzymet fra Staphylococcus aureus V8, a-chymotrypsin, "museunderkæbekirtelprotease" forhandlet af Boehringer Company, Vibrio alginolyti- 25 cus chemovar isophag-collagenase, der specifikt genkender peptidet Gly-Pro og Gly-Ala osv. Det er også muligt at opnå polypeptider eller fragmenter af kappeantigener af viruset ved at klone fragmenter udskåret fra et cdna opbygget af genome 30 LAV-varianter.

16 14 Fig. 2 og 3 er restriktionskort over et sådant cdna omfattende i alt 9,1-9,2 kb. Polypeptiderne kodet af cdna-fragmenter er anbragt i området, der strækker sig mellem Kpnl stedet (stilling 6100) og Bglll stedet (stilling 9150) af restriktionskort i fig. 2. Tilstedeværelsen af et karakteristisk sted fra et kap- 5 peantigen fra LAV-viruset eller lignende i et vilkårligt polypeptid udtrykt (i en passende værtcelle transformeret forud med et tilsvarende fragment eller med en vektor indeholdende dette fragment) kan afsløres med et hvilket som helst passende immunologisk middel. 10 Specielt angår opfindelsen yderligere polypeptider kodet af cdna-fragmenter defineret nedenfor specielt i fig. 4. Selve nucleinsyrefragmenterne, herunder en cdna-variant svarende til et helt LAV-retroviralt genom, er karakteriseret ved en række restriktionssteder i efterfølgende orden (fra 5'-enden til 3'- enden). 15 Beliggenheden af de efter hinanden beliggende steder på hele LAV-genomet (se også restriktionskortet over X.J19 i fig. 1) er angivet i det efterfølgende i forhold til Hindlil-stedet (valgt som beliggenhed 1), der er beliggende i R- regionen. Beliggenhederne er bestemt med en nøjagtighed på bp: 20 Hind III 0 Sad I 50 Hind III 520 Pst I Hind III 1100 Bgl II 1500 Knp I 3500 Knp I 3900 Eco RI Eco RI 5300 Sal I 5500

17 Knp I 6100 Bgl II 6500 Bgl II 7600 Hind III 7850 Bam HI 8150 Xho I 8600 Knp I 8700 Bgl II 8750 Bgl II 9150 Sac I 9200 Hind Ill 9250 En anden DNA-variant indholder evt. et yderligere HindIll omtrent ved koordinat Der henvises yderligere til fig. 1, der viser et mere detaljeret re- 15 striktionskort over hele dette DNA (XJ19). Yderligere detaljerede polypeptidsekvenser og tilhørende nucleotidsekvens af omhandlede foretrukne polypeptider er angivet i figurerne 4a-4e. 20 Opfindelsen angår yderligere andre foretrukne polypeptidsekvenser (glycosy- lerede eller ikke glycosylerede), der vil blive omtalt i det efterfølgende. Sekvensbedømmelse og bestemmelse af stederne af særlig interesse udførtes på en rekombinant-fag svarende til?.j19 omhandlet i nævnte britiske pa- 25 tentansøgning nr En metode til fremstilling heraf er omtalt i denne ansøgning. Hele rekombinant-fag DNA'et fra klon XJ19 (omhandlet i den tidligere ansøgning) lydbehandledes som beskrevet i forsøgsrapporten af DEININGER 30 (1983), Analytical Biochem. 129, 216. DNA'et blev repareret ved hjælp af et Klenow-reaktion i 12 timer ved 16 C. DNA'en blev elektroforese

18 16 behandlet gennem en 0,8% agarosegel, og DNA i størrelsesordenen bp blev afskåret og elektroelueret og udfældet. Genopslæmmet DNA (i 10 mm Tris, ph 8; 0,1 mm EDTA) ligeledes ind i M13mp8 RF DNA (afskåret med restriktionsenzymet Smal og herefter alkalisk phosphateret), idet der 5 anvendtes T4 DNA- og RNA-ligaser (Maniatis T et al. (1982) - Molecular cloning - Cold Spring Harbor Laboratory). En E. coli-stamme betegnet TG1 anvendtes til yderligere undersøgelse. Denne stamme havde følgende genotype: å,lac pro, supe, thi.f'trad36, proab, laclq, ZL5M15,r Denne E. coli TG1-stamme havde den særhed, at den muliggjorde, at rekombinanter let kunne genkendes. Den blå farve af cellerne transficeret med plasmider, der ikke rekombinerer med et fragment af LAV DNA, bliver ikke påvirket. I modsætning hertil giver celler transficeret med et rekombinant plasmid indeholdende et LAV DNA-fragment hvide kolonier. Metoden, der 15 anvendtes, er omhandlet i Gene (1983), 26, 101. Denne stamme blev transformeret med ligationsblandingen under anvendelse af Hanahanmetoden (Hanahan D (1983) J. Mol. Biol. 166, 557). Celler blev udpladet på en tryptose-agaroseplade med IPTG og X-gal i blød agaro- 20 se. Hvide plaque blev enten udtaget og undersøgt eller undersøgt direkte in situ under anvendelse af nitrocellulosefiltre. Deres DNA blev hybridiseret med nick-translaterede DNA-indskud af puc18 HindlIl subkloner af XJ19. Dette muliggjorde isoleringen af plasmider eller subkloner af k, der er identificeret i den efterfølgende tabel. Med hensyn til denne tabel skal det bemær- 25 kes, at betegnelsen for hver plasmid er efterfulgt af deponeringsnummeret for en cellekultur af E. coli TG1 indeholdende det tilsvarende plasmid i "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes" (C.N.C.M.) i Pasteur Institutet i Paris, Frankrig. En ikke-transformeret TG1 cellelinie blev også deponeret i C. N.C.M. under nr Alle disse deponeringer blev foretaget den november Størrelsen af de tilsvarende indskud stammende fra LAVgenomet er også angivet.

19 17 TABEL 5 Hovedtræk ved de rekombinante plasmider - pj19-1 plasmid (1-365) 0,5 kb Hind Sac 1 Hind III 10 - pj19-17 plasmid (1-367) 0,6 kb Hind Pst 1 - Hind 111 pj19-6 plasmid (1-366) 1,5 kb 15 Hind III (5') Bam HI Xho I Kpn I 20 Bgi II Sac I (3') Hind III - pj19-13 plasmid (1-368) 6,7 kb 25 Hind Ill Bgl II Kpn 1 Kpn I 30 Eco RI Eco RI

20 18 Sal I Kpn I Bgl II 5 Bgl II Hind III (3') Positivt hybridiserende M13 fagplader dyrkedes indtil 5 timer, og det enkeltstrengede DNA blev ekstraheret. 10 M13mp8 subkloner af XJ19 DNA blev sekvenseret efter dideoxymetoden og - teknologien udviklet af Sanger et al (Sanger et al (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 og M13-kloning og sekventeringshåndbogen, AMERSHAM (1983). Den 17-mer oligonucleotide primer a- 35SdATP 15 (400ci/mmol, AMERSHAM) og 0,5X-5X puffer gradientgeler (Biggen M.D. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ) anvendtes. Gelerne blev aflæst og anbragt i computeren under programmerne udviklet af Staden (Staden R. (1982), Nucl. Acids Res. 10, 4731). Alle velegnede referencer og metoder kan findes i AMERSHAM's M13-klonings og sekventeringshåndbog. 20 Den fuldstændige DNA-sekvens af XJ19 (også betegnet LAV-Ia) er vist i fig. 4-4e. Sekvensen blev genopbygget fra sekvensen af fag XJ19 indskuddet. Num- 25 mereringen starter ved cap-bindingsstedet, der blev lokaliseret eksperimentelt (se det efterfølgende). Vigtige genetiske elementer, de vigtigste åbne læserammer og deres forudbestemte slutprodukter er angivet sammen med HindIll-kloningsstederne. De potentielle glycosyleringssteder i env-genet er angivet med en streg ovenover. Den NH2-terminale sekvens af p259ag be- 30 stemt ved protein-mikrosekvensering er rammet ind.