Diplomingeniørprojekt. Sammenligning af procesparametre mellem engangs-fermenter og konventionelle glas- og stål fermenter

Transkript

1 Diplomingeniørprojekt Sammenligning af procesparametre mellem engangs-fermenter og konventionelle glas- og stål fermenter Hajar H. Al-Khafaji Diplomingeniør- Kemi og Bioteknologi Danmarks Tekniske Universitet Lyngby Institut for systembiologi DTU DTU-vejleder: Mhairi Workman Virksomhed: Cercell Virksomheds-vejledere: Per Stobbe og Rasmus Kirstrand Periode 01/ /

2 Diplomingeniørprojekt Dansk titel: Sammenligning af procesparametre mellem engangsfermenter og konventionelle glas- og stål fermenter English title: Comparison of process parameters in single use and conventional glass and steel fermentors Forfatter: Hajar H. Al-Khafaji Studie nummer: ECTS Point: 20 Periode: 01/ / Universitet: Danmarks Tekniske Universitet (DTU) Institut: Institut for Systembiologi (DTU) Virksomhed: Cercell Vejledere: Mhairi Workman (DTU), Per Stobbe og Rasmus Kirstrand (Cercell) Underskrift: Dato: 2

3 Forord Det er et samarbejdes diplomingeniørprojekt, mellem instituttet for System Biologi DTU og virksomheden Cercell. Formålet med dette speciale er sammenligning af procesparametre mellem engangs-fermenter og konventionelle glas- og stål fermenter. Perioden for projektforløbet var fra september 2014 til februar Forsøgene blev udført på instituttet for systembiologi, DTU. Udstyret, værktøjer og apparater blev delvist leveret af DTU og af virksomheden Cercell. E.coli stammen blev leveret af Statens Serum Institut, SSI. Jeg vil gerne takke mine vejledere Mhairi Workman, Per Stobbe og Rasmus Kirstrand for alt deres hjælp, støtte, råd og vejledning gennem projektets forløb. En særlig tak til Per Stobbe for hans støtte og hjælp i laboratoriet og igennem projekt forløbet. Det har været fantastisk at samarbejde med ham. Desuden vil jeg takke Kevin Klejn fra Cercell for hans hjælp med udbringning af bioreaktor. Tak til Bent Svanholm for hans hjælp med sensorerne. Jeg takker Statens Serum Institut for deres samarbejde og udlevering af en E.coli stamme. Sidst men ikke mindst vil jeg takke min søde familie, for deres støtte og motivation til mig igennem projekt forløbet, og jeg vil takke dem for deres pasning af min lille datter. 3

4 Abstract The decision to use single-use systems for manufacturing pharmaceuticals depend on many factors, but the major driving force is a desire to save cost and time. Single-use-fermentor can offer many advantages relative to conventional glass/steel fermentor and has gained wide acceptance in the bio-pharmaceutical industry. The advantages of single-use-fermentor are among others elimination of cross contamination, reductions in water consumption, and eliminating clean in place (CIP) and steam in place (SIP). The project concerns the comparison of process parameters between conventional glass/steel- and single use-fermentor. The process parameters are compared by examining the growth data for a wild-type E. coli bacterium. The transfer coefficient KLa value for two different sizes bioreactor with different turbines and different agitation speed. To investigate the growth data for the wild-type E. coli optical density, dry weight and specific growth rate are determined. For KLa determination, two optical sensors Presens and Hamilton Visiferm are used. KLa values are compared relative to the different sizes of bioreactors, turbines, and the stirring speed sensors. Finally, the KLa values of conventional glass/steel fermentors are compared with KLa values for single-use-fermentors. A KLa value is very crucial for the maximum productivity in microbial fermentation and it can only be achieved by appropriate combination of aeration and agitation. An optimal KLa value will be used as an informative tool to overcome the problem of the difference in geometry and turbines among a variety of bioreactors during upscale from laboratory- to pilot scale fermentors. The optimal KLa value used to prove how much oxygen transfer rate a given bioreactor can provide. The project objective was conducted with satisfactory results. The wild type E.coli showed results that coincide well for conventional glass/steel- and single-use-fermentor. The same applies to KLa values. The deviation of the KLa values are very small for the conventional glass/steel fermentor compared to single-usefermentor. This suggests that single-use-fermentor can deliver the same results as conventional glass/steel fermentor. The two used optical sensors Presens and Hamilton Visiferm can measure almost the same DO concentration in all bioreactor types. The used turbines, Rushton, Smith and Bakker showed some different results. Bakker turbines had the highest KLa value, than Smith turbines and Rushton turbines. The agitation speed had a great influence on the KLa value. The KLa value increases with increasing agitation speed, but at very high agitation speed (2000 rpm) the KLa value can be affected. As well, the bioreactor size have an effect on the KLa value. The KLa value increases with increasing bioreactor size. This applies are both for conventional glass/steel- and single-use-fermentor. 4

5 Resume Beslutningen om anvendelse af engangs-fermenter afhænger af mange faktorer, men den største drivkraft er ønsket om besparelse af omkostninger og tid. Engangs-fermenter kan tilbyde mange fordele i forhold til konventionelle glas/stål fermenter og har opnået bred accept i den bio-farmaceutiske industri. Fordelene ved engangs-fermenter er såsom eliminering af krydskontaminering, reducering af vand forbruget og fjerne clean-in-place (CIP) og steam in place (SIP). Projektet omhandler en sammenligning af procesparametre mellem konventionelle glas/stål- og engangsfermenter. Procesparametrene sammenlignes ved at undersøge vækstdata for en vildtype E.coli bakterie. Desuden bestemmes oxygen masseoverføringskoefficienten KLa for to forskellige fermenter størrelser med forskellige turbiner og forskellige omrøringshastigheder. For at undersøge vækstdata for vildtypen E.coli bestemmes optisk densitet, tørvægt og den specifikke væksthastighed. Til KLa bestemmelse anvendes to optiske sensorer, Presens og Hamilton Visiferm. KLa værdier sammenlignes i forhold til de forskellige fermenter størrelser, turbiner, omrøringshastigheder og sensorer. Sidst men ikke mindst sammenlignes KLa værdier for konventionelle glas/stål fermenter med KLa værdier for engangs-fermenter. En KLa værdi er meget afgørende for den maksimale produktivitet i mikrobiel fermentering og det kunne kun opnås ved en passende kombination af beluftning og omrøring. Den optimale KLa værdi vil blive anvendt som en informativ værktøj til at overvinde problemet med forskellen i geometri og turbiner blandt en række forskellige bioreaktorer under opskalering fra laboratorieskala- til pilotskala fermenter. Samt anvendes den optimale KLa værdi til at bevise, hvor meget oxygen overførselshastighed et givet fermenter kan levere. Projektets formål blev gennemført med nogle tilfredsstillende resultater. Vildtypen E.coli viste resultater som stemmer fint overens med konventionelle glas/stål - og engangs-fermenter. Det samme gælder for KLa værdier. Afvigelsen af KLa værdierne er meget lille for konventionelle glas/stål fermenter i forhold til engangs-fermenter. Dette tyder på at engangs-fermenter kan levere de samme resultater som konventionelle glas/stål fermenter, under disse betingelser som vi udsætter dem for. Desuden ses at de to anvendte optiske sensorer, Presens og Hamilton Visiferm kan måle næsten de samme DO koncentrationer i alle fermenter typer. De anvendte turbiner, Rushton, Smith og Bakker viste nogle forskellige resultater. Bakker turbinen havde den højeste KLa værdi, dernæst Smith turbinen og til sidst Rushton turbinen. Omrøringshastigheden viste en stor indflydelse på KLa værdien. KLa værdien stiger med stigende omrøringshastighed, dog ved meget høje omrøringshastigheder (2000 rpm) kan KLa værdien blive påvirket. Samt har fermenter størrelsen en stor rolle for KLa værdien, KLa værdien stiger med stigende fermenter størrelse. Alt dette gælder for både konventionelle glas/stål- og engangs-fermenter. 5

6 Indholdsfortegnelse Forord... 3 Abstract... 4 Resume... 5 Indledning... 8 Introduktion... 9 Fermenterings historie... 9 Fermenterings-proces... 9 Den specifikke væksthastighed µ Fermenters opbygning Fordel og økonomiske analyse af konventionel glas/ stål - og engangs-fermenter Opskalering Biologiske processer Omrøring Effekt tallet og Reynolds tal Effektforbruget Viskositet og Reologi Baffles KLa Oxygen overførsel fra gas boble til celle Proces teori Faktorer, som påvirker KLa værdien: Effekten af luftmængde på KLa værdien Mekanisk omrørte reaktorer: Ikke mekanisk omrørte reaktorer: Sparger Effekten af omrøring på KLa værdien Effekten af temperaturen på KLa værdien Fordelen ved anvendelse af KLa værdien Sensorer Presens DO sensor Hamilton Visiferm DO sensor

7 Biomasse sensor Materialer og Metoder Vækst bestemmelse Fermentering Forkultur Inokulering af fermenter Prøve udtagning OD DW KLa bestemmelse Resultater Fermentering KLa værdier Konventionelle glas/stål fermenter Engangs-fermenter Diskussion Fremtiden Konklusion Referencer Appendiks A. Fremgangsmåde til vask af engangs-bioreaktor B. LB- medie-sammensætning C. NaCI-opløsning D. Beregning af µ max E. Beregning af KLa værdi

8 Indledning Succesen med konventionelt glas/stål bioreaktor og fermenter har i løbet af de sidste 60 år bekræftet gyldigheden af teori og tekniske principper for skalerbar designs. Den konventionelle glas/stål fermenter kan skaleres fra en liter op til liter og bioreaktor op til liter. Industriens krav til øget effektivitet og reduceret anlægs investeringer har dannet grundlag for design af nye skalerbare engangs- bioreaktor. Største engangsbrug bioreaktor er på 2000 L (arbejdsvolumen) og kan tilbydes fra de 5 store men sælges kun i 500 stk. om året. Der er ingen udsigt at dette volumen øges. Ganske interessant findes der ingen engangfermenter på market. Alene Cercell tilbyder et engang-fermenter produkt i volumen fra 100 ml til 50 liter (arbejdsvolumen). Dette studie beskæftige sig med fermentering. Engangs-fermenter skal kunne leverer rigeligt med oxygen til systemet, fjerne varme fra kulturen meget hurtigt og kontrollerer opløst oxygen, temperaturen, ph osv. Disse udfordringer har konventionelt glas/stål fermenter løst problematikken i små og store skala via en række funktioner og metoder, som er blevet perfektioneret i løbet af de sidste 80 år [1]. Oxygen overførselshastigheden fra en gas-fase til et medie i aerob fermentering er en vigtig parameter i udformningen af en bioreaktor og især en fermenter. Aerobe organismer har brug for ilt for vækst, produktdannelse, og celle vedligeholdelse. Den volumetriske masseoverførselskoefficient, KLa angiver hastigheden af oxygen, der anvendes til fermentering, under hensyntagen til alle oxygen forbrugende variabler i en fermenter. Bestemmelsen af KLa værdi for en fermentering er vigtigt for at opretholde tilstrækkelig overførsel af oxygen i en fermenter [2]. Overførsel af oxygen fra en gas-fase til en væske-fase kompliceres af tilstedeværelsen af celler, produktdannelsen og anti-skummidler. Disse kan ændre boble størrelsen og grænsefladen, som påvirker opløseligheden af oxygen [3]. I dette studie, undersøges de relative effekter af omrøringshastighed, beluftningshastighed og forskellige turbine typer på KLa værdien af engangs-fermenter og konventionelle glas/stål fermenter. Der er mange metoder til at bestemme KLa værdien. Alle metoder anvendes til at evaluere KLa værdien i ideelle blandinger af to faser i en fermenter og en ubetydelig modstand af gasfasen til oxygen overførsel på tværs af grænsefladen [2]. Til denne undersøgelse anvendes den dynamiske gasning ud metode. Denne metode kan direkte bestemme den volumetriske masseoverførselskoefficient i en fermenter, og estimater den volumetriske mikrobielle oxygen optagelse og den gennemsnitlige iltmætning koncentration ved gasvæske-grænseflade [4]. Desuden bliver vækstdata (optisk densitet OD og tørvægt DW) for en vildtype E.coli dyrket i LB medie undersøgt ved anvendelse konventionelle glas/stålfermenter og engangs-fermenter af med samme omrøringshastighed og forskellige fermenter størrelser og forskellige turbiner. 8

9 Introduktion Fermenterings historie Fermentering er en vigtig del af den industrielle mikrobiologi. Kontrolleret fermenteringsteknologi fik sin oprindelse første gang ved fremstilling af vin, og blev perfektioneret i 1940'erne med produktion af antibiotika [5]. Efterhånden begyndte man at fremstille enzymer ved fermentering. Det startede på Grindstedværket og mange andre steder ud i verden, hvor man fremstillede svampeenzymer, og på Kongens Bryghus, hvor en bakteriel amylase blev produceret. I begge tilfælde benyttedes overfladedyrkning, hvor mikroorganismerne sidder på en fast, befugtet fase, og i begge tilfælde var der betydelige produktionsvanskeligheder, fordi dyrkning på fast fase er vanskelig at kontrollere. I dag bliver enzymer (proteiner) fremstillet ved submers fermentering med en veldefinerede kulstof - og kvælstofkilder. Submers fermentering er en proces, hvor kulturen holdes opslemmet og ofte beluftet i en velomrørt tank. Omkring 1950 blev en storskala dansk gæringsindustri til fremstilling af industrielle enzymer etableret, og Novo virksomheden var alt væsentligt den dominerende aktør [6]. I 1995 skrev J. W. Frost og K. M. Draths [5], at "kemien er på vej ind i en ny æra", hvor vedvarende ressourcer og mikrobielle bio-katalysatorer vil være fremtrædende. Plantestivelse, som cellulose affald fra landbruget, og valle fra oste fremstilling er rigelige og vedvarende fermenterbare kulhydrater. I dag er fermenteringsteknologien den primære metode til produktionen i den bioteknologiske industri. Fordelen ved fermenterings teknologien er, at de ikke bruger giftige reagenser eller kræver tilsætning af mellemliggende reagenser. Mikrobiologer søger nu naturligt forekommende mikrober, der producerer ønskede kemikalier. Derudover er de nu i stand til at manipulere mikrober at øge produktionen af disse kemikalier. I de seneste år har mikrobielle fermenteringer blevet revolutioneret ved anvendelse af genetisk manipulerede organismer. Mange fermenteringer bruger bakterier, men et stigende antal involverer dyrkning af mammale celler[5]. Fermenterings-proces Fermentering er et almindeligt anvendt proces i industrien samt i produktionen af mange fødevarer, drikkevarer og lægemidler. Fermenterings-processen bruger mikroorganismer til at konvertere råvarer til et produkt. Fermenteringsprocesser indbefatter kemiske reaktioner, såsom oxidationer, reduktioner, hydrolyse og bio-syntese og dannelsen af celler. Nogle processer kan kræve tilstedeværelsen af luft (aerob), andre uden luft (anaerob). Hastigheden af fermentering afhænger af mikroorganismers koncentrationen, celler, cellulære komponenter og enzymer samt temperatur og ph [7]. Komponenterne i en fermenteringsproces: Uanset typen af fermentering (måske med undtagelse af nogle omdannelse) kan grundlæggende komponenter for fermenteringsproces opdeles i seks trin: 1) Udarbejdelse af medie, der skal anvendes til dyrkning af processens-organisme under udviklingen af podnings kultur og produktions-fermenter. 2) Sterilisering af mediet, fermenter og hjælpeudstyr 3) Udarbejdelse af en aktiv, renkultur i tilstrækkelig mængde til at pode mediet 4) Væksten i organisme i produktions-fermenter under optimale forhold for produktdannelse 5) Ekstraktion af produkt og dets oprensning 6) Bortskaffelse af spildevand produceret ved fremgangsmåden 9

10 Figur 1 viser en generaliseret, skematisk repræsentation af en fermenteringsproces. Figur 1 En generaliseret, skematisk repræsentation af en fermenteringsproces [8] De indbyrdes forhold mellem de 6 komponenter i en fermenteringsproces er illustreret i Figur 1. Hvor et sterilt medie (A) bliver podet med en stok kultur (B) i en ryste kolbe (C) som anvendes til at pode en lille fermenter (D) og en produktions-fermenter (E) med. Når fermenteringsprocessen er overstået, fjernes dyrknings-væsken (F) fra produktions-fermenteren (E) og føres videre til separations processen (G). Her bliver cellerne separerede og bliver derefter sendt videre til oprensnings-proces [8]. Mikrobiel vækst kinetik i en batch-fermentering Mikrobiel vækst kinetik, er forholdet mellem den specifikke vækst hastighed (μ) og koncentrationen af substratet [9]. Batch-fermentering er et lukket system, der indeholder en indledende begrænset mængde næringsstof [8]. Batch-fermentering har nogle fordel og ulemper, ligesom alle andre fermenteringstyper. Disse fordel og ulemper ses for neden. Fordel/ ulemper ved batch-fermentering: Høje koncentration af f.eks. sukker er nødvendigt i begyndelsen, ellers slutter fermenteringen for hurtigt Højt produkt koncentration til slut er muligt Inhibering af fermentering (eller uønsket metabolisme) kan sker på grund af højt substrat eller produkt koncentration Problemer med forureninger er minimalt (pga. kort fermenterings tid) 10

11 En typisk vækstkurve for en bakteriel population, kan ses i Figur 2. Her ses lag, eksponentiel, deceleration vækst, stationær og døde faserne. Figur 2 Typisk vækstkurve for en bakteriel population [9] Denne batch cyklus er opdelt i 5 forskellige faser: Lag fase, eksponentielfase, deceleration vækstfase, stationærfase og dødefasen. Lag fase: Når et friskt medie bliver inokuleret med et mikroorganisme, vil væksten først begynde efter et stykke tid. Denne tidsperiode kaldes lagfasen, og har følgende karakteristika: En periode hvor cellerne tilpasser sig i det nye omgivelser Nye enzymer syntetiseres. En lille stigning i celle masse og volumen, men ingen stigning i celle nummer Længden af denne fase varierer med typen af organisme, podnings-volumen og dyrkningsbetingelser, dårlig podnings tilstand (høj% af døde celler) og næringsfattigt medie Eksponentiel fase: I denne fase har cellerne justeret sig til det nye omgivelser og formerede sig hurtigt (eksponentielt) Balanceret vækst Vækst hastigheden er afhængig af næringsstof Cellepopulation fordobler med regelmæssige tidsintervaller (fordoblingstid) Etableringen af den eksponentiel vækst er afhængig af en række faktorer, en levedygtig podnings kultur, en egnet energikilde, tilstedeværelsen af overskydende næringsstoffer og vækstfaktorer og et passende miljø (temperatur, ph, opløst ilt) Deceleration vækst fase: En meget kort fase, hvor væksten accelererer og dette skyldes: Vigtigt næringsstof i kultur begynder at løbe ud. Dette næringsstof er ofte benævnt vækstbegrænsende substrat. Medier er ofte udformet på en sådan måde, at dette næringsstof er generelt karbon-kilde (dvs. glukose eller andre kulhydrater) Periode af ubalanceret vækst: Celler gennemgå intern omstrukturering for at øge deres chancer for at overleve 11

12 Stationærfase: Med udtømning af næringsstoffer (S 0) og akkumulering af affald og sekundære stofskifteprodukter: Der er ingen vækst i organismen population. Vækst hastigheden er i ligevægt med dødeligheden. Dette kan være som et resultat af følgende: o Udtømning af en eller flere essentielle næringsstoffer o Akkumulering af giftige vækst er forbundet med biproduktet Primære metabolit, eller vækst er forbundet, produktion stopper Sekundær metabolit, eller ikke vækst er forbundet, kan produktionen fortsætte såsom antibiotika, pigmenter Længden af den stationære fase er ofte afhængig af organismen Generelt har bakterier korte stationære faser. Dødefase Den levende organisme population falder med tiden, på grund af en mangel på næringsstoffer og giftige metaboliske biprodukter og Største delen af cellerne vil dør [8],[9],[10]. Den specifikke væksthastighed µ Den specifikke væksthastighed μ er hastigheden af biomassedannelse i en fermenteringsproces. Væksthastigheden er afhængige af generations tiden for organismen, da det er den hastighed organismen formerer sig med [11]. Den specifikke væksthastighed er interessant, da det er vigtige i mange sammenhæng at kende til de forhold, hvor organismen formerer sig hurtigst. Ved en eksponentielt vækst forstås at biomassen øges eksponentielt. Den maksimale væksthastighed bestemmes ud fra eksperimentelle fermenterings data som plottes ind i Excel og vha. den eksponentiel regression bestemmes µ max ved et R- kvadrat større end 0,95. Når organismen vokser eksponentielt, kan dette beskrives ved følgende Ligning 1. Ligning 1 xx = xx 0 ee µtt Her er x biomassekoncentrationen til tiden t, og x 0 er biomassekoncentration til tiden t = 0 og μ er den specifikke væksthastighed, som angives i enheden timer -1 [12]. Fermenters opbygning En fermenter (bioreaktor) er en beholder der indeholder vækstmedie, som består af alle de næringsstoffer en celle skal bruge for at opnå optimal vækst. En fermenter er general forsynet med en omrører vha. en motor, 2 sensorer (ph - og DO- elektroder), sparger, baffles, luftindtag, prøveudtage og køling/varme regulator. Identifikationen af fermenterer illustrerede på nedenstående Figur 3. I de fleste tilfælde vil en fermenter være tilsluttet en computer, som samler alle data fra vækstmediet såsom ilt koncentration, ph, temperatur, gas-flow og omdrejningshastighed. Figur 3 Identifikation af de enkelte dele på en fermenter [10] 12

13 En fermenter kan består af glas/stål og af Polycarbonat, Nylon og rustfrit stål. Begge fermenter består af de samme delelementer, som er vist på Figur 3. Figur 4 viser en konventionel glas/stål fermenter af Sartorius Biostat. Figur 4 Konventionel glas/stål fermenter [13] Figur 5 Viser en engangs-fermenter og en engangs-bioreaktor, som er designet af Cercell Figur 5 Engangs-fermenter Engangs-bioreaktor [14] 13

14 Fordel og økonomiske analyse af konventionel glas/ stål - og engangs-fermenter Engangs-fermenter blev først introduceret til bio-fremstillings-industrien omkring år 1999, og er blevet en alvorlig konkurrent til de konventionelle glas/stål fermenter [15]. I dag er bio-farmaceutiske produkter karakteriseret ved mangfoldighed, stigende efterspørgsel og høje udviklingsomkostninger, som tvinger et stigende antal af bio-videnskabelige virksomheder til at anvende engangs-fermenter [16]. I dag er der en accelererende udvikling inden for brugen af engangsfermenter [17], da engangsfermenter tilbyder mange fordele, såsom reducering i tid og omkostninger i forhold til konventionelle glas/stål fermenter og har opnået en bred accept i den bio-farmaceutiske industri [18]. Engangs-fermenter bliver hovedsaglig anvendt af den farmaceutiske industri, da den farmaceutiske industri fokuserer på den kliniske side af branchen og kræver en stor sterilitet under fremstillingsprocessen af lægemidler [19]. Engangs-fermenter spænder fra lav profil forgæring til høj profil farmaceutiske kompatibel cellekulturer. Den høje indeslutningsniveau af engangsbrug systemer er ikke kun nyttigt for produktion i den bio-farmaceutiske industri, men også til fremstilling af papir, bio-raffinaderier og mælkesyrebakterier i fødevarer[20]. Den mest anvendt form for aerob fermenter i dag, er konventionelle glas/stål fermenter. Ideel til vækst af høj-celle-densitet kulturer i store volumen tanke har konventionelle glas/stål fermenter opstået som industriens foretrukne teknologi [21]. Men høj-celle-densitet kulturer har været en succes for kun et begrænset antal af mikroorganismer eller celletyper, der kan overleve i storskala reaktorer [22]. Desuden har konventionelle glas/stål fermenter været plaget af store ulemper[23]: Investeringer af høj kapital, energi krav og vedligeholdelse behov Forskydning Behov for intensiv rengøring og sterilisation Risikoen for krydskontaminering Der findes mange artikler, undersøgelser, konferencer og møder, som diskuterer økonomi og fordele ved anvendelse af engangs-fermenter i forhold til konventionel glas/stål fermenter Ved anvendelse af glas/stål fermenter går omkostningerne til rengøring og sterilisation, såsom til vand, damp til autoklavering og andre rengøringsmidler [17]. Fordelene ved engangs-fermenter er såsom stigninger i batch succes sats, eliminerer potentiel krydskontaminering, hurtigere overgang mellem kampagner, reduktion i vand- og spildevandsanlæg, og eliminerer clean-in-place (CIP) og steam-in-place (SIP)(Autoklavering). Men en af de primære fordele ved engangs-fermenter er ønsket om at reducere omkostninger og tiden [18]. Risikovurdering for kontaminering er reducerede eller næsten elimineret ved anvendelse af at engangsfermenter. Da hvert system er nyt og sterilt før brug og kan derefter kasseres. I forhold til konventionelle glas/stål fermenter vil høje risiko for kontaminering forekommer fra forkert praktisk udførsel eller menneskelige fejl. Samtidigt kan bekymring for farlige bio-materialer, inddampning og bortskaffelse ikke være et problem, da engangs-bioreaktor kan anvendes som beholdere og kasseres med farligt biomateriale [17],[24]. Jeff Craig [16], global direktør for forretningsudvikling og markedsføring for ATMI Life Sciences, har udtalt, at "De fleste, hvis ikke alle, af bio-producenter overvejer, hvordan man kan integrere engangs-fermenter i deres fremstillinger for at forbedre driftseffektiviteten og reducere omkostningerne". En anden undersøgelse foretaget af BioPlan Associates [16] i 2008, en virksomhed, der sporer tendenser i bio-fremstillinger, afslørede, at engangsfermenter er voksende, og bliver stadig mere populære. Steve Wilkowski fra Dow Corning fortæller, at flere virksomheder begynder at anerkende fleksibilitet og omkostningsmæssige fordele ved anvendelse af engangs-fermenter [16]. 14

15 Ifølge 2009 BioPlan Associates [16] er brugen af engangs-fermenter blevet for doblet fire gang siden 2005 og er stadige i stigende udvikling iblandt bio-farmaceutiske industri for at reducere omkostninger og tiden. Gottschalk siger, at "Ingen fremstillings modeller kan opfylde alle krav til produkter og processer, og der er ingen værdi i at holde sig kun til engangs-fermenter. Han og andre hævder, at i den nærmeste fremtid vil bioproduktionsanlæg sandsynligvis være hybride operationer, som både indeholder konventionelle glas/stål fermenter og engangs-fermenter. Ikke desto mindre vil den stigende brug af engangs-fermenter fortsatte med at sænke omkostningerne og forbedre driftseffektiviteten [16]. En væsentlig fordel ved at bruge engangs-fermenter er besparelsen i generelle produktionsomkostninger på arbejdskraft og materialer. Ved behandlingen af omkostninger af arbejdskraft til montering, sterilisering, rengøring samt udgifter til kemikalier og vand, kan den besparelse opnås signifikant igennem engangsfermenter [24]. Sammenligning af driftsomkostningerne for konventionelle glas/stål- og engangs-fermenter er komplekse, som det ses på Figur 6, Figur 7 og Figur 8. Driftsomkostningerne er beregnet over 10 år ( ). Driftsomkostninger såsom vand, personale, og forsyningsselskaber skal skaleres til en procent, som afspejler de lokale økonomiske markedsforhold. Figur 7 viser priser og mængder som er anvendt til at estimere besparelsen af drift omkostnings for engangsfermenter. Plant kapacitet (antal batch fermenteringer) stiger over den 10-årige periode, som er typisk for mange faciliteter. Plant kapacitet ændrer sig igennem tiden, og det er en vigtig del af evalueringen driftsomkostninger, fordi kapaciteten påvirker udgifterne til engangs-fermenter. Mange driftsomkostninger for konventionelle glas/stål fermenter vil også stige med stigende anlægskapacitet (vand, CIP kemikalier), men nogle, såsom udgifter til rutinemæssig vedligeholdelse, idriftsættelse, validering, og kapital vil ikke ændre sig. Figur 6 Priser, der anvendes til at estimere besvarelse af drift omkostninger for engangs-fermenter [18] 15

16 Figur 7 Priser og mængder som er anvendt til at estimere besvarelse af drift omkostninger for engangsbrug-systemer [18] Figur 8 Estimeret besvarelse af driftsomkostninger for engangsbrug-systemer [18] 16

17 Betydelige besparelser forventes i idriftsættelse og kvalifikation til dette alternativ, som er typisk for engangsbrug applikationer. Dette anvendes som en tidsbesparelse for kun Erfaringen er, at løbende Validerings omkostninger til engangsbrug- og glas/stål fermenter er ens. Figur 8 viser, besparelse af drift omkostninger, og dette varierer med årene med en maksimal besparelse på $ i 2010 og et tab på $ 57,000 i De høje besparelser i 2010 afspejler den ene gang kredit for besparelser i idriftsættelse og kvalificering. Til dette alternativ, forøges besparelsen og anlægskapacitet stiger, dette viser at udgifterne til bortskaffelse af engangs-fermenter er minde end udgifterne til CIP og arbejdskraft for glas/stål fermenter. Ved anvendelse af engangsfermenter vil der tydeligt være en reducering af driftstimerne, hvor der bliver en mindre fuldtidsansat (FTE). Tankegangen er, at spare nogle få hundred timer og ikke reducerer driftsomkostningerne, men blot lysne arbejdsplanen [18],[25]. Opskalering Proces udvikling for stor skala bio-produktion er generelt mere arbejdskrævende, tidskrævende og dyrt end for sammenlignelige ikke-biologiske processer på grund af det store antal individuelle processer og potentielle variabler involveret [26]. Opskalering er et vigtigt og potentielt tidskrævende trin i udvikling af industrielle processer. Det omfatter meget mere end blot at gøre det samme på et større volumen. Det kræver frembringelsen af fast proces forståelse på forskellige skalaer til sikre ensartet kvalitet og titer hele opskalering fra tidlig klinisk forsøg til endelig produktionsskala. Detaljeret forståelse af bioreaktor egenskaber på forskellige skalerer har betydeligt letter udvikling og opskalering af solide produktionsprocesser [27]. Typisk parametre bekymring er ilt overførsel, blanding, og varme-overførsel karakteristika samt den genererede forskydningskræfter. I løbet af de seneste 30 år, har konventionelle glas/stål fermenter udviklet sig som den gyldne standard ved både laboratorier størrelse og ved opskalering [28]. Opskalering kan være en meget kompliceret proces, da reaktor design, omrører design, og gasning strategi kan afvige fra den klassiske tankreaktorer design og principper [29]. Design ændringerne på tværs af skalaer kunne påvirke blande adfærd, oxygen transfer, boble dispersion, og forskellige andre vigtige parametre. Derimod er en homogen kultur miljø på tværs af skalaer en vigtige dyrkningsmetode for parametre som ph, oxygen partialtryk, temperatur, og næringsstofforsyning for at opnår en velkontrollerede og sikker produktionsprocessen [30]. Sartorius Stedim Biotech er en førende leverandør af avanceret udstyr og service til udvikling, kvalitetssikring og produktion af bio-farmaceutiske produkter. Figur 9 viser en oversigt over volumener for engangsfermenter designet af Sartorius Biostat. Af ses at Sartorius Biostat har designet engangs-bioreaktor i op til 1000 l (arbejdsvolumen). Figur 9 Opskalering af engangs-fermenter designet af Sartorius Biostat 17

18 Biologiske processer Biologiske processer er nogle af de mest komplicerede processer. Mange parametre kan påvirke fermenteringsprocessen, og det er ikke altid at disse parametre er kendte. Nogle af parametrene kan være inden for meget kritiske intervaller. Indlysende parametre er fx. impellers type, størrelse og - hastighed. Ikke så indlysende parametre som påvirkes ved blanding, såsom varmeoverførsel, pumpekapacitet, strømningsmønstre, forskydningshastighed og energispredning [31],[32],[33]. Omrøring Omrøring har flere formål i en fermenteringsproces: At holde uopløselige partikler jævnt fordelt i et medie Reducere boble diameter af beluftning og derved at øge gas - væske grænseflade areal Sprede de tilførte komponenter til fermenterings tanken, som fx medie og syre-base, der anvendes til ph regulering Blande indholdet i en fermenter for at sikre en ensartet blanding I de fleste industrielle fermenter udføres omrøringen af en eller flere impeller. En lang række forskellige impeller er blevet udviklet til forskellige væskeforhold [34],[35]. Størstedelen af impeller kan opdeles i to hovedkategorier, aksial - og radial strømning. Den aksiale strømnings impeller er egnet til partikelsuspensioner og høj volumenstrøm. Til fermentering er høj konnektiv strømning vigtig, pga. varmeoverførsel og til suspensionspartikler, til disse formål vil aksiale strømnings impeller være effektive. Energioptagelse er mindre i forbindelse med radiale strømnings impeller sammenlignet med aksiale strømnings impeller, som resulterer i store hastighedsgradienter i en fermenterings væske [36]. Impeller er et aksialt roterende element, som leverer eller absorberer energi. Impellers dynamik kan modelleres ved både Bernoulli's princip og Newtons' 3 lov. Aksial-strømnings-impeller indfører væsentlig forskydningshastighed til væsken og anvendes fx til at blande ikke - blandbare væsker samt til at blande væsker med høj viskositet [37]. Desuden er aksial strømning meget nyttig til at blande væske-faste suspensioner, fordi den forhindrer faste partikler i at stabilisere sig på bunden af tanken [38]. Aksiale strømnings impeller anvender bulk-bevægelse og bruges på homogeniserings processer, hvor øget væske volumenstrøm er vigtig [37].Med en aksial strømning impeller opnås en strømning parallelt med rotationsaksen, som vist på Figur 10. Figur 10 Aksial strømnings impeller i en tank med baffles, (a) tank ses fra siden, (b) tank ses nedefra [39] 18

19 Turbiner er et radialt roterende element i en fermenter. Ambitionen er at reducere ikke ensartethed i væsken, blande opløselige komponenter, sprede gasser og faste partikler såsom celler [40]. Med radiale strømning impeller opnås en strømning vinkelret på rotationsakse, som vist på Figur 11. Figur 11 Radial strømnings impeller i en tank med baffles. (a) tank ses fra siden, (b) tank ses nedefra [38] Rushton, Smith og Bakker turbinerne er relevante for den bioteknologiske industri. Turbinernes navne er opkaldt efter designernes/opfindernes navne. Rushton turbinen har 90 grader vinklede flade blade, som er symmetriske og genererer en stærk radial strømning. En variant af Rushton turbinen er Smith turbinen, hvor bladene er halvcirkel formede, og den genererer radial strømning. Bakker turbinen har asymmetrisk dybt konkave blade design, og den har langt højere gas spredning end Smith og Rushton turbinerne. For både Rushton, Smith og Bakker turbinerne er det nødvendigt at anvende marine impeller til aksial strømning [40]. Figur 12 viser Rushton, Smith og Bakker turbiner Figur 12 Rushton, Smith og Bakker turbiner [41] Figur 13 viser gas spredning for Rushton, Smith og Bakker turbine. Ud fra figuren ses at gas spredning er største ved anvendelse af Bakker turbine. Figur 13 Gas spredning for Rushton, Smith og Bakker turbinerne [41] 19

20 Inden valg af omrører type er det vigtigt at vide, hvilket strømningsmønster der er brug for til formålet. Samtidigt vil andre hensyn spille en rolle, som fx viskositeten. Hvis formålet er at danne en ensartet suspension, ville det være en god ide at anvende en impeller, da den har et gunstigt strømningsbillede og bruger meget mindre energi end turbiner. Hvis omrøreren også skal findele boblerne af en gas, som skal reagere med væsken, vil det være bedst at anvende en turbine-omrører [42]. Design af de forskellige typer impeller er afstemt efter typen af viskositeten og organismer i fermenteringsvæsken. Viskositeten af en blanding kan øges markant under fermenteringsprocessen. En impeller kan være egnet til en fermenteringsproces i begyndelsen, og derefter kan den vise sig at være ineffektiv ved slutning af processen [35],[43]. Som vist på Figur 14 [44] anbefales brug af propeller eller flade-blade turbiner for lavt viskositet væske. Og for højt viskositet anbefales brug af Anchor, Paddles, Gate anchors, Helical screws og Helical ribbons. Figur 14 viser viskositetsområder for de forskellige impeller typer Figur 14 Viskositetsområder for forskellige impeller [45] Til aerobe fermenteringer anvendes mest radialt strømnings turbinen, da den er god for gas spredning [46]. Samtidigt kan der opstå problemer ved ilttilførsel ved aerobe fermenteringer. Da viskositeten af fermenteringsvæske kan blive rigtig høj i løbet af fermenteringsprocessen. Løsningen kunne være anvendelse af langsom omrører med skråtstillede vinger[42], som er vist Figur 15. Figur 15 Langsom omrører med skråtstillede vinger [47] 20