Sammenligning af paneler til antistofidentifikation ved brug af AutoVue Innova. Comparison of Panels for Antibody Identification using AutoVue Innova

Transkript

1 Kapitel: Forord UNIVERSITY COLLEGE SYDDANMARK SAMMENLIGNING AF PANELER TIL ANTISTOFIDENTIFIKATION VED BRUG AF AUTOVUE INNOVA Comparison of Panels for Antibody Identification using AutoVue Innova Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, Sygehus Lillebælt Vejledere: Hanne Nielsen & Anja Dalsgaard Jørgensen Antal tegn: Undertegnede bioanalytikerstuderende bekræfter herved, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf Bekendtgørelse om prøver i erhvervsrettede videregående uddannelser nr af 16/12/2013 kap. 5, 19 1

2 Kapitel: Forord Forord Først og fremmest vil jeg gerne takke mine to medstuderende, Kamilla Christensen og Sebastian Christensen, for godt samarbejde omkring projektet. Det har været en fornøjelse at arbejde sammen med jer. Derudover skal der lyde en stor tak til produktspecialist Kent Elkrog fra Ortho Clinical Diagnostics, for hjælp til opsætning af analyseapparatur, lån af software og ikke mindst alt den tid, han har brugt på vejledning, både gennem fysiske møder og via mail. Personalet på Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling på Vejle Sygehus og Kolding Sygehus fortjener også en stor tak, både for at hjælpe os med at indsamle prøver, og for deres tålmodighed og velvilje under projektets praktiske udførelse. Abstract Baggrund: Der findes forskellige paneler til identifikation af irregulære antistoffer. Her sammenlignes tre udvalgte paneler fra Ortho Clinical Diagnostics, Odense Universitetshospital og Bio-Rad. Panelerne vurderes på deres evne til korrekt at identificere irregulære antistoffer, samt på brugervenlighed og pris. På KIBA, SLB, udføres antistofidentifikation manuelt. På afdelingen findes dog allerede apparaturet AutoVue Innova, der kan udføre automatisk antistofidentifikation. Automatisering af analysen kan være en fordel for afdelingen. Metode: Prøvemateriale analyseres med hvert panel på AutoVue Innova. Der anvendes patienprøver og eksternt kontrolmateriale fra NEQAS. Softwaren Resolvigen 3 anvendes til at tolke reaktionsmønstre og finde frem til et antistofsvar. Svaret sammenholdes med svar fra afdelingens analysesvar og NEQASrapporter. Resultater: Der kunne ikke konstateres signifikant forskel i antallet af korrekte antistofidentifikationer imellem panelerne. Var der kun et antistof i prøven, fandt Resolvigen 3 det korrekte antistof, eller havde behov for yderligere analyse i 100 % af tilfældene, mens der ved to antistoffer var overensstemmelse eller behov for yderligere analyse i ca. 80 % af prøverne. Konklusion: Alle panelerne kan anvendes til antistofidentifikation. En kombination af panelerne fra Bio-Rad og OUH anbefales, eftersom disse har givet de bedste resultater, og desuden er billigst. Automatisering af analysen vil være en klar fordel for afdelingen, da risikoen for fejl mindskes, og bioanalytikeren får mere tid til andre opgaver. 1

3 Kapitel: Abstract Indhold Baggrund... 4 Formål... 5 Problemformulering... 5 Teoretisk baggrund... 5 Kort omkring blodtypesystemer... 5 Rh-systemet... 6 Aktivering af immunsystemet ved møde med fremmed antigen... 7 Antigenpræsenterende celler... 7 Aktivering af CD4+ T-celler... 8 B-celler og deres aktivering... 9 Antistoffers opbygning og virkemåde Transfusionskomplikationer Akut hæmolytisk transfusionskomplikation Forsinket hæmolytisk transfusionskomplikation Undersøgelse for irregulære blodtypeantistoffer Panelundersøgelse på AutoVue Innova Resolvigen 3 software til tolkning af reaktioner Metode og materialer Indsamling af prøvemateriale Forbehandling af prøvemateriale Klargøring af paneler Pilotprojekt Projektets udførelse Titrering af prøvemateriale Databehandling Litteratursøgning Etiske overvejelser Resultater Resultater baseret på patient- og NEQAS-prøver Resultater baseret på NEQAS-prøver

4 Kapitel: Abstract Titerværdier på udvalgte prøver Diskussion Projektets udførelse Diskussion af titreringsprojektet Diskussion af projektets resultater Fordele og ulemper ved panelerne Score og Errors anvendelighed ved tolkning af antistofsvar Automatisering frem for manuel antistofidentifikation Implementering af Resolvigen Antistofidentifikation ved brug af AutoVue Innova på KIBA, Kolding Sygehus Konklusion Perspektivering Litteraturliste Illustrationer Bilag 1 tolkning af score og error Bilag 2 antigrammer Bilag 3 dokumentation af oplyste priser Bilag 4 Projektprotokol Bilag 5 Titreringsvejledning Bilag 6 specialanalyser udført på KIBA, Vejle Bilag 7 rådata

5 Kapitel: Baggrund Baggrund Den første succesfulde blodtransfusion blev foretaget tilbage i 1828 af den engelske læge James Blundell.(1) Siden dengang er der sket en enorm udvikling, en lang række blodtypesystemer er blevet opdaget, og der er en langt større forståelse for de forholdsregler, der skal tages inden en blodtransfusion udføres. Dette betyder også, at transfusion med blodkomponenter i dag er en langt sikrere behandling end det var dengang, og blodtransfusion er i dag livsnødvendig behandling for en række patientgrupper. Der blev i 2014 foretaget transfusioner af erytrocytsuspensioner i Danmark, hvoraf kun 14 førte til transfusionskomplikationer, og ingen med dødelig udgang.(2) Inden en patient kan modtage en blodtransfusion er der en række undersøgelser der skal udføres for at sikre, at donorens blod er forligeligt med patientens. Hvis det gennem en screentest viser sig, at patienten har dannet antistoffer mod et eller flere blodtypeantigener, er det vigtigt at kunne identificere det eller de antistoffer, for at undgå en transfusionskomplikation ved transfusion med uforligeligt blod. Derfor udføres en antistofidentifikation. Der kan anvendes en række forskellige teknikker til denne analyse, og indenfor den seneste årrække er det også blevet muligt at automatisere denne analyse. Automatiseringen medfører en række nye muligheder, bl.a. bliver det muligt at anvende software til at tolke analysesvar, hvor de hidtil er blevet tolket af en bioanalytiker. Til antistofidentifikation anvendes et panel af suspensioner indeholdende testerytrocytter. Når patientens plasma blandes med disse erytrocytter, vil eventuelle antistoffer reagere med deres tilsvarende antigener, og på baggrund af det fremkomne mønster er det muligt at identificere, hvilket antistof der er tale om. Et godt panel gør det muligt at identificere klinisk relevante antistoffer, når de optræder alene, og skal også gerne kunne vise hyppige kombinationer af antistoffer. Kravene til hvilke antistoffer, der skal kunne identificeres, opstilles i Transfusionsmedicinske Standarder, TMS, der udgives af Dansk Selskab for Klinisk Immunologi.(3) Paneler udbydes fra forskellige producenter, og der er stor forskel på det enkelte panels antigram. Desuden er der forskel på prisen, og eftersom der udføres mange antistofidentifikationer årligt, kan selv en lille prisforskel blive stor. Det er derfor nærliggende at sammenligne udvalgte paneler, for at undersøge hvilket panel, der bedst kan anvendes til antistofidentifikation til den mest fornuftige pris. 4

6 Kapitel: Formål Formål På Sygehus Lillebælt foretages antistofidentifikation på Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling, KIBA, på Kolding Sygehus. Afdelingen anvender apparaturet AutoVue Innova til blodtypebestemmelse og screentest, men udfører antistofidentifikation manuelt. AutoVue er også i stand til at udføre antistofidentifikation, og det er derfor nærliggende at undersøge, hvilken betydning det vil have for KIBA, Kolding, at overgå til automatiseret antistofidentifikation på AutoVue. For at optimere kvaliteten af antistofidentifikationen sammenlignes tre paneler; et in-house panel fremstillet på Odense Universitetshospital, samt to kommercielle paneler fra henholdsvis Ortho Clinical- Diagnostics og Bio-Rad. Panelernes evne til korrekt at identificere irregulære antistoffer vurderes ud fra kriterier som distinkte reaktionsmønstre og evne til at identificere kombinationer af antistoffer. Desuden vurderes den økonomiske konsekvens ved at vælge det enkelte panel. Problemformulering Hvordan adskiller panelerne fra Ortho-Clinical Diagnostics, Bio-Rad og Odense Universitetshospital sig fra hinanden ved identifikation af irregulære antistoffer på AutoVue Innova? Hvilke konsekvenser vil det have for Klinisk Immunologisk og Biokemisk Afdeling på Kolding Sygehus, at anvende panelerne til identifikation af irregulære antistoffer på AutoVue Innova? Teoretisk baggrund I det følgende gennemgås den teori, der ligger til grund for projektet, herunder en beskrivelse af blodtypesystemer, immunsystemets antistofproduktion, og transfusionskomplikationer. Desuden gennemgås analyseprincippet på AutoVue Innova samt en kort præsentation af Resolvigen 3, det software der er anvendt til tolkning af reaktionsmønstre. Kort omkring blodtypesystemer Der findes 30 anerkendte blodtypesystemer, og ca. 300 kendte blodtypeantigener. Ved blodtransfusion skal der tages hensyn til de klinisk relevante, da der ellers kan ske voldsomme immunreaktioner, som i værste fald kan være dødelige for recipienten. De to vigtigste blodtypesystemer er AB0- og Rh-systemerne. Antigenerne i AB0-systemet er oligosaccharider på overfladen af erytrocytterne, og de enkelte blodtyper bestemmes af de endestillede kulhydratmolekyler på kæderne. Hvis der kun findes basiskæden, H-kæden, på erytrocytterne er blodtypen 0, mens blodtype A har N-acetylgalaktosamin endestillet på H-kæden, og B 5

7 Kapitel: Teoretisk baggrund har galaktose, se figur 1. Der kan også ses en kombination af de to, og blodtypen vil så være AB. Grunden til, at AB0-systemet er så vigtigt er, at der 6-12 måneder efter fødslen ses antistoffer i blodet mod de antigener, som personen ikke selv har. En enkelt transfusion med uforligeligt blod vil derfor medføre alvorlige komplikationer. AB0-antistoffer er som de eneste blodtypeantistoffer primært af IgM-type, og kaldes også regulære eller komplette antistoffer. Da AB0-antistoffer altid findes i blodet, er disse ikke relevante i forbindelse med en screentest, den anvendes udelukkende til at undersøge for irregulære antistoffer, der dannes hvis immunsystemet møder erytrocytter med antigener, som de ikke kender, fx efter en transfusion eller under graviditet. Der vil derfor i det følgende udelukkende blive fokuseret på blodtypesystemer, der kan forårsage dannelse af irregulære antistoffer, hvoraf det vigtigste system er Rh-systemet.(1,4) Figur 1. Antigenopbygningen i AB0-systemet. Blodtype 0 har kun H-antigen, mens A og B har et ekstra kulhydratmolekyle koblet på H-kæden. AB har en kombination af H-kæder med henholdsvis N-acetyl-galaktosamin og galaktose. Rh-systemet Rh-antigener findes kun på erytrocytterne, hvilket er tilfældet for langt de fleste blodtypeantigener, bortset fra AB0, som findes på alle celler. Rh-systemet består af to tætkoblede gener, RHD og RHCE, der findes på kromosom 1. Alle Rh-antigener kan føre til immunisering. Der er fire alleler for RHCE (CE, Ce, ce og ce) mens der er to alleler for RHD, nemlig D og d. Ved d er der sket en deletion af genet, og man har således et tomt locus. Findes D på blot det ene kromosom vil det udtrykkes på erytrocytterne, og vedkommende er RhD positiv. RhD er klart det mest immunogene Rh-antigen, og det bliver især relevant hvis en RhD-negativ kvinde bliver gravid med et RhD-positivt barn. Under graviditet eller fødsel kan der opstå mindre 6

8 Kapitel: Teoretisk baggrund blødninger, hvor fostrets erytrocytter kommer over i moderens blodbane. Moderens immunsystem vil reagere på disse erytrocytter, og begynde produktion af antistoffer mod D. Irregulære antistoffer er hovedsageligt af IgG-klassen, og de kan trænge igennem placenta, og bindes til fostrets erytrocytter, hvilket vil føre til fagocytose af disse og efterfølgende anæmi hos fostret. Hvis blødningen først sker ved fødslen vil barnet ikke påvirkes særligt af antistofproduktionen, men det bliver et problem, hvis kvinden igen bliver gravid med et RhD-positivt foster. De dannede antistoffer mod D vil så trænge gennem placenta og sensibilisere fostrets erytrocytter og føre til nedbrydning af dem. Det kan dog modvirkes ved at kvinden får RhD-profylakse, hvilket er en injektion med anti-d, som vil reagere med eventuelle erytrocytter fra fostret i moderens blod, der dermed fagocyteres før immunsystemet når at reagere, og et immunrespons undgås. Ved en blodtransfusion tages der i første omgang kun hensyn til AB0 og RhD blodtypen, men hvis der dannes irregulære antistoffer, er der en række andre blodtypesystemer, der bliver relevante, hvoraf de vigtigste er Rh, Kell, Duffy og Kidd.(1,4) Aktivering af immunsystemet ved møde med fremmed antigen Det adaptive immunsystem består af en række celler, der arbejder sammen om at danne et immunrespons. Der er tre celletyper, der er vigtige ved dannelse af et antistofrespons: antigenpræsenterende celler, T- celler og B-celler. De antigenpræsenterende celler starter immunresponset ved at præsentere fremmed antigen for T-cellerne, der aktiveres og efterfølgende aktiverer B-celler. B-celler udvikles ved aktivering til plasmaceller, der producerer antigenspecifikke antistoffer. Herunder gennemgås antigenpræsentationen samt den efterfølgende aktivering af celler, der til slut fører til antistofproduktion.(4) Antigenpræsenterende celler Når fremmed antigen kommer ind i kroppen, opfanges det af antigenpræsenterende celler, der vil fremstille det på deres overflade ved hjælp af MHC-II molekyler. Udefrakommende antigener kan kun præsenteres på celler, der har MHC-II molekyler, og de findes kun på dendritiske celler, monocytter, makrofager og B-celler disse celler kaldes med en fællesbetegnelse antigenpræsenterende celler. De antigenpræsenterende celler optager det fremmede antigen ved endocytose, nedbryder det til mindre peptider på aminosyrer, der bindes til MHC-II. Komplekset MHC-II og antigen præsenteres herefter på cellens overflade. Processen ses i figur 2 figuren illustrerer også præsentation på MHC I molekyler, men eftersom disse ikke er relevante for blodtypeantistoffer, gennemgås disse ikke.(4) 7

9 Kapitel: Teoretisk baggrund Figur 2. Venstre side illustrerer præsentation af antigen på MHC I, der præsenterer antigen, der findes intracellulært. Højre side illustrerer præsentationen af antigen på MHC II, der kun findes på antigenpræsenterende celler. MHC II præsenterer antigener, der findes ekstracellulært, ved at de optages gennem endocytose, nedbrydes og bindes sammen med MHC II, hvorefter dette kompleks præsenteres på cellemembranens overflade. Blodtypeantigener fremstilles på MHC II. Aktivering af CD4+ T-celler Der findes forskellige slags lymfocytter i immunsystemet, overordnet T- og B-lymfocytter. T-celler kan yderligere inddeles i CD4+ og CD8+ T-celler. I det følgende vil der udelukkende fokuseres på CD4+ T-celler, da det er disse der kan aktivere B-celler og dermed føre til antistofproduktion. CD4+ T-celler aktiveres gennem tre signaler. På overfladen af T-cellen findes T-cellereceptorer, TCR, der genkender og binder til MHC-II på den antigenpræsenterende celle. I forbindelse med TCR findes molekylkomplekset CD3, der sammen med CD4 sender et signal ind i T-cellen, Signal 1. Dette signal får T- cellen til at udtrykke CD40-ligand, CD40L, på overfladen af membranen, som reagerer med CD40 på den antigenpræsenterende celle. Bindingen sender signal ind i den antigenpræsenterende celle, som opregulerer ekspressionen af CD80 eller CD86 på sin membran. CD80 eller CD86 binder til CD28 på T-cellen, hvilket medfører signal 2 til T-cellen. Signal 2 får T-cellen til at øge produktionen af IL2 samt danne IL2- receptorer på sin membran. IL2 er en vækstfaktor, og når den bindes til IL2-receptorerne på T-cellen får det den til at prolifere. Den antigenpræsenterende celle producerer og udskiller signalstoffer, der får de nydannede T-celler til at differentiere til forskellige typer af T-celler. I dette tilfælde ønskes aktivering af B- celler, og der udskilles derfor IL4,hvilket får T-cellerne til at differentiere til Th2-celler, der kan aktivere B- 8

10 Kapitel: Teoretisk baggrund celler. Signalstofferne udgør Signal 3, og Th2-cellerne er nu fuldt aktiverede. Processen ses i figur 3 herunder.(4) Figur 3. Aktivering af en CD4+ T-celle. T-cellereceptoren, TCR binder til MHC II på den antigenpræsenterende celle, APC. Der sendes signal ind i T-cellen, der påvirker til opregulering af CD40L. CD40L binder til CD40 på APC, hvilket medfører opregulering af CD80 eller CD86 på APC. De binder til CD28 på T-cellen, hvilket sender signal 2 ind i denne. Signal 2 medfører proliferation af T-cellen, og efterfølgende differentieres til en bestemt type T-celle på baggrund af cytokinpåvirkning fra APC. B-celler og deres aktivering B-celler har tre funktioner i immunsystemet: antistofproduktion, antigenpræsentation og cytokinproduktion. B-celler har membranbundne immunglobuliner, mig, på overfladen, disse kaldes B- cellereceptorer, BCR. Ligesom T-celler skal B-celler aktiveres før de er funktionelle, og aktiveringen består ligeledes af tre signaler. Signal 1 sendes ind i cellen når antigen krydsbindes til mindst to BCR. Binding til mere end to BCR forstærker signalet. Bindingen fører til internalisering af BCR og antigen, der nedbrydes og antigen præsenteres på MHC-II på membranen. Samtidig opreguleres CD80 og CD86 ekspressionen. En aktiveret Th2-celle, der er specifik for det pågældende MHC-II og antigen kompleks, vil nu binde sig til B- cellen, og der dannes en immunologisk synapse mellem de to celler. Th2-cellens binding til MHC-II molekylet medfører et signal ind i Th2-cellen, nøjagtigt som ved dens aktivering, og den begynder at udtrykke CD40L på membranen. CD40L reagerer med CD40 hos B-cellen, og Signal 2 sendes ind i denne. Signal 2 gør B-cellen i stand til at lave et immunglobulin klasseskift; oprindeligt kan B-cellen kun udskille IgM og IgD antistoffer, men den er nu i stand til at lave et skifte til at udskille IgG, IgA eller IgE. Signal 3 skabes af en binding mellem CD28 på Th2-cellen og CD80 og CD86 på B-cellen, hvilket sender signal til Th2- cellen, der fører til cytokinproduktion, bl.a. IL4, der får B-cellen til at prolifere når det bindes til IL4- receptorer på B-cellens overflade. Samtidig påvirkes B-cellen af andre cytokiner, primært fra Th2-cellen, der 9

11 Kapitel: Teoretisk baggrund påvirker den til immunglobulinklasseskift, i tilfælde med blodtypeantigener vil der skiftes til IgG antistoffer. Efter mange celledelinger differentierer B-cellen til antistofudskillende plasmacelle. En enkelt plasmacelle kan udskille tusindvis af antistoffer i sekundet. Aktivering af B-cellen ses i figur 4.(4) Efter et immunrespons vil størstedelen af plasmacellerne gå til grunde, men en lille del af dem differentieres til memoryceller, der hurtigt kan aktiveres hvis immunsystemet igen møder det samme antigen. Der findes både T- og B-memoryceller. Memorycellerne er grunden til, at et immunrespons vil ske meget hurtigere anden gang immunsystemet møder det samme antigen. Samtidig stiger affiniteten mellem antigen og antistof for hver gang der sker et immunrespons mod det samme antigen.(4) Figur 4. B-celleaktivering. MHC II på B-cellen binder til T-cellereceptoren, TCR på en Th-celle. Bindingen medfører opregulering af CD40L på Th2-cellen, der reagerer med CD40 på B-cellen, hvilket sender signal 2 ind i B-cellen. Signalet gør den i stand til at foretage et immunglobulinklasseskift. Binding af CD28 på Th2-cellen til CD80 eller CD86 sender signal 2 ind i Th2-cellen, og får den til at udskille cytokiner. Der udskilles både vækstfaktorer og cytokiner, der påvirker til immunglobulinklasseskift når der er tale om blodtypeantigener skiftes der til IgG antistoffer. Antistoffers opbygning og virkemåde Der findes fem forskellige immunglobulinklasser, der i immunresponset har forskellige funktioner. Den type antistoffer, der dannes ved mødet med fremmede blodtypeantigener, er IgG antistoffer, og derfor vil der udelukkende blive fokuseret på denne type. IgG antistoffer er opbygget af en tung og en let peptidkæde, der med disulfidbroer bindes sammen med endnu en tung og en let kæde. Hver af kæderne har både et variabelt og et konstant område; det variable område giver mulighed for stor variation i aminosyresammensætningen i kæderne og det er denne variation, der gør det muligt for antistofferne at 1 0

12 Kapitel: Teoretisk baggrund binde specifikt til det enkelte antigen. Den konstante kæde har også en vigtig funktion, på denne del findes et område, der genkendes af receptorer på fagocytter, og kan binde komplementfaktoren C1. Når der secerneres antistoffer mod fremmede blodtypeantigener, vil de binde til deres specifikke antigener på overfladen af erytrocytterne; erytrocytterne bliver dermed sensibiliserede. Fagocytter har som nævnt receptorer på deres overflade, der genkender og binder til et område på antistoffernes konstante del. De vil derigennem binde til de fremmede erytrocytter og fagocytere dem. Fagocytter findes i stort antal i milten, og nedbrydningen vil derfor hovedsageligt foregå der.(4) Enkelte antistoffer, fx Jk a, kan desuden aktivere komplementsystemet gennem den klassiske aktiveringsvej. Når antistof er bundet på overfladen af erytrocytten, kan komplementfaktoren C1 binde til antistoffet, hvilket starter aktiveringen. C1 består af tre underenheder af proteiner: C1s, C1q og C1r. C1q binder til antistofferne, hvilket aktiverer C1r til at fraspalte C1r og C1s. Når C1s er frit kan det spalte en anden komplementfaktor, C4 til C4a og C4b. C4b binder til overfladen af erytrocytten. Samtidig spalter C1s C2 til C2a og C2b, og C2a bindes til C4b; der er dannet komplekset C4bC2a. Dette er en C3-konvertase, der kan spalte inaktivt C3 til aktivt C3 (C3a og C3b). C3b bindes herefter til konvertasen, der dermed bliver en C5- konvertase. Denne spalter C5, og C5b binder komplementfaktorerne C6 og C7. Dette kompleks binder til cellemembranen på erytrocytten, og rekrutterer C8, der gennemborer cellemembranen. Til dette kompleks bindes en række C9 molekyler i en cirkel, så der dannes en åben pore ind i cellen, kaldet membranangrebskompleks, MAC. Gennem denne pore vil ioner strømme ud af cellen mens vand strømmer ind, og erytrocytten vil svulme op og gå i stykker.(4) Antistofproduktionen vil altså i begge tilfælde føre til, at de transfunderede erytrocytter nedbrydes. Transfusionskomplikationer For at undgå transfusionskomplikationer, findes en lang række forholdsregler, der skal overholdes. På trods af disse vil der dog stadig opstå komplikationer af forskellig sværhedsgrad efter 0,5 % af transfusionerne. Der kan være forskellige årsager til disse komplikationer, herunder gennemgås de komplikationer, der kan skyldes irregulære antistoffer hos recipienten.(3,5) Akut hæmolytisk transfusionskomplikation Akut hæmolytisk transfusionskomplikation opstår indenfor 24 efter transfusionen. Den kan være både intravaskulær, hvor erytrocytter nedbrydes i blodkarrene pga. komplementaktivering, eller den kan være ekstravaskulær, hvor nedbrydningen primært foregår i milten. Den intravaskulære hæmolytiske reaktion 1 1

13 Kapitel: Teoretisk baggrund forårsages som oftest af transfusion med AB0-uforligeligt blod, da IgM-antistofferne mod AB0-antigenerne er stærkt komplementaktiverende. Enkelte irregulære antistoffer som fx Jka er ligeledes komplementaktiverende, og kan forårsage intravaskulær hæmolyse. Hæmolysen medfører frigivelse af erytrocytternes indhold til blodbanen, bl.a. hæmoglobin, der i høje koncentrationer er toksisk.(6) Der ses en lang række symptomer som feber, trykken for brystet, kulderystelser, kvalme, hovedpine, dyspnø, rødmen af huden, brændende smerter ved infusionsvenen, blodtryksfald og udvikling af hæmolytisk shock. I svære tilfælde, som ved AB0-uforlig kan reaktionen være dødelig.(1,3) Der kan ligeledes forekomme akut ekstravaskulær hæmolyse. Denne forårsages af irregulære antistoffer, ofte Rh og Kell antistoffer, der sensibiliserer de transfunderede erytrocytter. Da disse antistoffer ikke eller kun svagt er komplementaktiverende, vil nedbrydningen af erytrocytterne foregå ekstravaskulært, hovedsageligt i milten, da der her findes mange makrofager. Symptomerne på akut ekstravaskulær hæmolyse er ikke ligeså alvorlige som ved den intravaskulære, da indholdet af erytrocytterne ikke frigives til blodbanen. Recipienten kan få feber og kulderystelser, og en blodprøve vil vise hæmoglobinfald samt stigning i bilirubinkoncentrationen. Pga. forhøjet bilirubin kan recipienten udvikle icterus.(1,3) Forsinket hæmolytisk transfusionskomplikation En forsinket hæmolytisk reaktion opstår mellem 24 timer og 28 dage efter en blodtransfusion. Den er sjældent alvorlig eller behandlingskrævende. Komplikationen kan opstå hos recipienter, der tidligere har dannet antistoffer, som ikke længere er påviselige i plasma. Hvis recipienten derfor transfunderes med donorerytrocytter med det modsvarende antigen, vil der opstå et sekundært immunrespons mod antigenet. Koncentrationen af antistoffet vil stige, og det vil reagere med de transfunderede erytrocytter, der efterfølgende nedbrydes ekstravaskulært. Der vil derfor ikke ske den forventede stigning i hæmoglobinkoncentrationen efter transfusion.(1,3) Undersøgelse for irregulære blodtypeantistoffer Forud for enhver blodtransfusion, udføres en typebestemmelse og en BAC-test på recipienten. BAC-testen er en kontrol af blodtypen, samt en screentest for irregulære antistoffer. Screentesten udføres ved, at recipientens plasma blandes med tre suspensioner af donorerytrocytter, der tilsammen præsenterer alle de klinisk relevante antistoffer. Det er opstillet i Transfusionsmedicinske Standarder, TMS, hvilke antigener der skal være repræsenteret i en screentest.(3) Hvis screentesten er positiv, skal der udføres en antistofidentifikation, for at identificere det eller de antistoffer, der findes i recipientens plasma. Der udføres desuden altid en antistofidentifikation efter en transfusionskomplikation.(3) 1 2

14 Kapitel: Teoretisk baggrund Til undersøgelsen anvendes søjleagglutination, der udføres i LISS/Coombs gelkort. Øverst i søjlen tilføres erytrocytsuspension samt recipientens plasma. Hvis recipienten har antistoffer rettet mod nogle af de antigener, der findes på erytrocytterne vil de binde til dem, og erytrocytterne bliver sensibiliserede. Da irregulære antistoffer er af IgG typen, kan de ikke selvstændigt agglutinere erytrocytterne. Derfor er der tilsat Coombs reagens til gelkortene, som indeholder antihumant globulin, anti-igg, der vil binde antistofferne på erytrocytternes overflade sammen, og dermed dannes der et agglutinat af erytrocytter. Denne teknik kaldes Indirekte AgglutinationsTeknik, IAT. Ved efterfølgende centrifugering vil agglutinerede erytrocytter blive liggende øverst i søjlen, da agglutinaterne ikke kan trænge igennem gelen, mens uagglutinerede erytrocytter vil ligge på bunden af søjlen. Det betyder at der ved positiv reaktion ses erytrocytter over eller suspenderet i gelen, mens alle erytrocytter vil ligge på bunden af søjlen ved negativ reaktion.(7) Recipientens plasma undersøges overfor et panel af donorerytrocytter, der er nøje udvalgt. Et panel består typisk af 11 donorer. Derudover medtages ofte en suspension af recipientens egne erytrocytter, for at undersøge for autoantistoffer. Alle paneldonorerne skal være blodtype 0, for at der ikke sker reaktioner med AB0-antigener. Panelsammensætningen skal gøre det muligt at skelne mellem de forskellige klinisk relevante antistoffer ved, at der dannes distinkte reaktionsmønstre for hvert enkelt antistof. Det er især vigtigt at de hyppigst forekommende antistoffer let kan skelnes fra hinanden. Reaktionsmønstre ses i panelets tilhørende antigram. Ved mere end et antistof, kan det være svært at skelne dem fra hinanden på baggrund af et panel. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at anvende supplerende paneler, eller paneler, hvor der er tilsat enzymer, fx papain eller ficin, der forstærker reaktionen hos nogle antistoffer og fjerner reaktionen for andre.(1,4,7) Når et antistof er identificeret ved en panelundersøgelse, udføres der efterfølgende en fænotypebestemmelse, hvor recipientens erytrocytter undersøges for det tilhørende antigen. Hvis antigenet findes på recipientens egne erytrocytter, er det ikke sandsynligt, at det er det korrekte antistof, der er identificeret. Fænotypebestemmelsen fungerer altså som en slags kontrol af antistofidentifikationen.(4,7) Panelundersøgelse på AutoVue Innova AutoVue Innova fra Ortho-Clinical Diagnostics er et fuldautomatisk apparatur til serologiske analyser. Det anvender søjleagglutination, som beskrevet herover, dog anvendes der ikke gelkort, men kassetter indeholdende meget små glaskugler og Coombs reagens. Glaskuglerne i søjlen ligger så tæt, at 1 3

15 Kapitel: Metode og materialer agglutinerede erytrocytter ikke kan trænge igennem søjlen, og derfor vil blive liggende øverst i søjlen efter centrifugering. Mindre agglutinater kan trænge delvist igennem, og vil derfor ses suspenderet i søjlen. Størrelsen af agglutinatet afhænger af, hvor mange antistoffer der er bundet til antigener på erytrocytterne, og dermed hvor mange erytrocytter, der er bundet sammen. Reaktionsstyrken vurderes ud fra, hvor i søjlen agglutinaterne befinder sig. Til antistofidentifikation anvendes Ortho BioVue Anti-Human Globulin Anti-IgG kassetter. AutoVue Innova tilsætter 50 µl testerytrocytter samt 40 µl patientplasma til hver søjle, hvorefter kassetten inkuberes i minutter ved 37 grader. Der centrifugeres efterfølgende i 5 min. Kassetten aflæses ved hjælp af et kamera, der tager billeder af både fronten og bagsiden. Billedet vises efterfølgende på den tilhørende skærm, og vurderes af den ansvarlige bioanalytiker.(7 10) Resolvigen 3 software til tolkning af reaktioner Resolvigen 3 er et softwareprogram udviklet af Ortho-Clinical Diagnostics, som skal gøre identifikationen af irregulære antistoffer lettere. Det sammenholder reaktionerne fra AutoVue med det tilhørende antigram, og på baggrund af reaktioner og reaktionsstyrker kommer det med et bud på hvilket eller hvilke antistoffer, der findes i prøven. Desuden oplyses det, hvor sikker Resolvigen 3 er på resultatet gennem en score og en error værdi. Både score og error er værdier mellem 0,0 og 1,0. Scoreværdien siger noget om, hvor hyppigt den pågældende antistofsammensætning ses. En kombination der ses ofte, fx kun et enkelt antistof eller to antistoffer der ofte optræder sammen, vil have en høj score, mens en kombination af antistoffer, der kun sjældent ses sammen får en lav score. Error fortæller, hvor godt identifikationen passer med reaktionsstyrkerne, idet hvert antistof forventes at give reaktioner af en bestemt styrke. Hvis alle reaktioner passer med det forventede, vil error være 0,0 eller meget tæt på. Hvis en reaktion til gengæld forventes at give 1+ men giver 2+ er dette en acceptabel afvigelse, mens 3+ vil være usandsynligt og 4+ uacceptabelt. Jo større afvigelse der er fra det forventede, jo højere vil errorværdien blive. Score og error værdiers tolkning kan ses i bilag 1, side 45. Metode og materialer Projektet blev udført som et kvantitativt studie, hvor prøvemateriale blev indsamlet med hjælp fra bioanalytikere på KIBA Kolding og KIBA Vejle. De indsamlede prøver blev analyseret på AutoVue Innova med paneler fra Ortho-Clinical Diagnostics, OUH og Bio-Rad over en periode på tre dage. Her gennemgås forberedelser til projektet; herunder indsamling af prøvemateriale, forberedelse af prøver, paneler og 1 4

16 Kapitel: Metode og materialer apparatur; samt gennemgang af selve projektets udførelse. Til slut gennemgås litteratursøgningen samt etiske overvejelser i forbindelse med projektet. Indsamling af prøvemateriale Der anvendes to typer prøvemateriale til projektet; dels patientprøver indsamlet af KIBA Kolding og KIBA Vejle i perioden til , og dels materiale til ekstern kvalitetskontrol, såkaldte NEQASprøver udsendt fra Public Health England. Personalet på KIBA blev bedt om at gemme alle patientprøver indeholdende irregulære antistoffer i ovenstående periode. Plasma fra prøverne blev afpippeteret og glasset blev mærket med rekvisitionsnummer eller CPR-nummer. Herefter blev prøverne placeret i fryser ved -18 grader indtil projektets start. Rekvisitions- og CPR-numre var nødvendige for, at vi kunne slå prøverne op i ProSang, blodbankens IT-system, og på den måde finde frem til hvilke antistoffer afdelingen havde identificeret. Dette resultat anvendes til sammenligning med de i projektet bestemte resultater, hvor afdelingens svar kaldes det sande svar, idet de er fremkommet ved en valideret metode. Alle prøver blev omnummereret, og antistofsvar fra ProSang blev noteret i Excelskema med de nye numre. CPR-numre og rekvisitionsnumre blev herefter fjernet fra glassene. NEQAS-prøver udsendes flere gange årligt fra Public Health England.(11) Dette er eksternt kvalitetsmateriale med et kendt indhold af antistoffer, og de var derfor gode at anvende til projektet, da der findes en facitliste for indholdet i prøverne. De medsendte rapporter og afdelingens svar på prøverne blev gennemgået, og relevante prøver indsamlet. Prøver, der ikke indeholdt irregulære antistoffer blev sorteret fra. NEQAS-prøver har været opbevaret i fryser ved -80 grader. Der blev indsamlet prøver fra 2009 til og med Prøverne blev omnummereret og afdelingens antistofsvar blev noteret i samme Excelskema som svarene på patientprøver. Da alle prøver skal analyseres med tre forskellige paneler, blev prøver der indeholdt mindre end 2 ml plasma sorteret fra. Forbehandling af prøvemateriale Der blev udført screentest på samtlige prøver, både patient og NEQAS. Til screentesten anvendtes tre suspensioner af testerytrocytter fra OUH, screen I, screen II og screen III, samt anti-igg gelkort fra Bio-Rad. Der afpippeteredes 50 µl testerytrocytter til hver brønd samt 25 µl plasma, hvorefter kortene blev inkuberet i 15 minutter i DiaMEd ID-incubator 37SI ved 37 grader. Efterfølgende centrifugeredes gelkortene 1 5

17 Kapitel: Metode og materialer i 10 minutter i DiaMed ID-centrifuge12SII.(12) Reaktionsstyrkerne blev vurderet på en skala fra 0 til 4, hvor 0 svarer til ingen reaktion og 4 svarer til at alle erytrocytter er agglutinerede og ligger øverst i brønden. Alle reaktioner noteres i Excelskema. De prøver, der var negative i screentesten, blev sorteret fra, bortset fra to negative patientkontroller, og to negative NEQASkontroller. Klargøring af paneler For at AutoVue kunne genkende panelerne fra OUH og Bio-Rad var det nødvendigt at fremstille nogle nye stregkoder til begge disse paneler. Da vi udover at teste panelerne på AutoVue også testede software til antistofidentifikation, skulle panelerne have hver deres profil, så AutoVue var i stand til at skelne imellem hvilket af de tre paneler der blev anvendt. Dette havde ikke været nødvendigt, hvis ikke softwaren skulle anvendes, da tolkningen af reaktioner så udføres manuelt, og det er derfor ligegyldigt for AutoVue hvilket panel der anvendes. Resolvigen skal kunne kode reaktioner sammen med et antigram, og derfor var det nødvendigt med forskellige profiler. Panelernes antigrammer ses i bilag 2, side 53. Stregkoder blev lavet efter vejledning af produktspecialist Kent Elkrog fra Ortho-Clinical Diagnostics. De blev fremstillet med programmet BarTender. Herunder i tabel 1 ses opbygningen af stregkoder for OUH og Bio-Rad panelerne. Orthos eget panel er allerede udstyret med stregkoder, som AutoVue kan læse, og yderligere behandling af dette panel var derfor ikke nødvendigt. Panelerne blev opbevaret på køl ved 4 grader, når de ikke anvendtes. Tabel 1. Opbygning af barcoder til paneler fra OUH og Bio-Rad OUH panel Dato, Juliens kalender Årstal Reagens-ID LOT-nummer Bio-Rad panel Dato Årstal Reagens-ID. LOT-nummer På AutoVue blev panelerne registreret som henholdsvis Panel A, B og C, se tabel 2. Ud fra disse navne kan det enkelte panel vælges til analyse. Opsætningen af panelerne på AutoVue blev foretaget af Kent Elkrog, Ortho-Clinical Diagnostics. Priserne, der oplyses i tabel 2 er listepriser oplyst af producenten. Det oplyses 1 6

18 Kapitel: Metode og materialer samtidig, at dette er en maxpris, og at den kan blive lavere, hvis der forefindes en fast aftale om levering af paneler. Mails med priser på panelerne fra Ortho og Bio-Rad ses i bilag 3, side 55. Tabel 2. Oplysninger om hvert enkelt panel. Der oplyses hverken pris eller LOT-nummer på panelet fra OUH. Der er ikke noteret LOT-nummer på paneler, der modtages fra OUH, der er blot noteret produktionsdato og udløbsdato. Det har ikke været muligt at få oplyst en pris på panelet fra OUH. Panel LOT-nummer Udløb Indhold Pris Ortho Panel A 8RA ml 851,51,- OUH Panel B ml? Bio-Rad Panel C ml 789,- Pilotprojekt Inden analysering af projektets prøver blev der udført et mindre pilotprojekt, dels for at vi kunne øve brugen af AutoVue og Resolvigen 3, og dels for at teste at alt fungerede som det skulle. Til pilotprojektet blev anvendt testerytrocytter fra OUH som panel og gamle patientprøver som prøvemateriale. Vi oplevede kun mindre problemer, såsom at AutoVue ikke kunne læse de stregkoder vi først havde fremstillet til prøvematerialet. Dette blev løst ved, at vi anvendte stregkoder fra afdelingens nødprocedure til prøverne. Prøverne fik således to numre i det endelige projekt, dels det trecifrede nummer vi havde givet dem, og dels det nye nummer fra stregkoderne. Desuden ønskede vi at afprøve, hvor mange prøver AutoVue kunne håndtere ad gangen; vi kom frem til at fem prøver ad gangen var passende, og analysering tog så ca. 40 minutter fra registrering af prøver, til AutoVue var færdig. Analyseredes der kun et enkelt panel, tog det ca. 26 minutter. Pilotprojektet førte ikke til større ændringer i projektprotokollen, se bilag 4, side 57. Projektets udførelse Dataindsamlingen blev udført over tre dage, hvor der blev analyseret med det samme panel en hel dag. Den samme AutoVue Innova blev anvendt til hele projektet, dels for at Resolvigen 3 kun skulle installeres på et apparatur, og dels for at genere analyseringen af rutineprøver mindst muligt. Prøvematerialet blev taget ud af fryseren dagen inden første analysering og placeret i kølerum ved 4 grader. Inden første analysering blev samtlige prøver centrifugeret i 5 minutter ved 1800 G, da der i især NEQAS-prøverne sås en del uklarheder i prøvematerialet. 1 7

19 Kapitel: Metode og materialer Inden hver dags analysering resuspenderes testerytrocytterne i deres beholdere inden de blev placeret i reagenskarusellen og sat på AutoVue. Til projektet anvendtes anti-igg kassetter fra Ortho-Clinical Diagnostics med LOT-nummer IGC005F. Alle IgG-kassetter på apparatet blev fjernet, og kassetter med det korrekte LOT-nummer påfyldt. Der blev påfyldt tre rækker kassetter ad gangen, og fyldt op efter behov. Desuden kontrolleredes mængden af Saline og destilleret vand på apparatet inden analysering blev påbegyndt. Analyserne bestiltes manuelt gennem Register/Load funktionen. Her registreredes hvilket panel, der skulle anvendes til analysering, at der er tale om plasma, samt prøvenummer. Prøvenummer anvendtes desuden som patientidentifikation, og prøven blev navngivet med det trecifrede prøvenummer, panelbogstav, samt om der var tale om patient eller NEQAS materiale; eksempelvis 01A patient. I dette eksempel er der tale om prøvenummer 101, der analyseres med panel A. Denne navngivning var nødvendig for, at prøverne let kunne findes i Resolvigen 3. Der blev bestilt fem analyseringer ad gangen. Efter registrering blev prøverne placeret på AutoVue i prøvekarusellen. Når analyseringen er færdig, sættes alle kassetter med positiv reaktion ud i CASUNCA på AutoVue. Her placeres alle kassetter, der skal vurderes manuelt. Reaktionsstyrkerne i kassetterne blev sammenholdt med de reaktionsstyrker, der sås på de billeder, som AutoVue havde taget af dem. Kun meget få gange er styrkerne blevet korrigeret, dette har hovedsageligt været tilfældet, hvis AutoVue meldte fejl på søjlen, fx FIB, hvilket betyder at AutoVue mener, at der er fibrinogen i prøven. Kassetterne kasseredes efterfølgende, og reaktionsmønstret blev printet. Reaktionsstyrkerne noteredes i Excelskema. Antistofsvaret fra Resolvigen 3 noteredes ligeledes i Excelskema. Ved flere bud på den korrekte kombination, noteredes de to første, samt den korrekte kombination, hvis denne ikke var en af de to første. Den korrekte kombination blev vedtaget at være den, der var identificeret ved manuel metode, som i øjeblikket anvendes på KIBA, da denne metode må antages at give korrekte resultater. For hver enkelt kombination noteredes desuden både score og error værdier. Afdelingen analyserer løbende kontroller på AutoVue. Inden hver dags analysering kontrolleredes det, at der var analyseret kontroller på apparatet. Der blev ikke foretaget yderligere kontrolanalyseringer. Kontrollen der foretages, er en kontrol af at apparatet fungerer som det skal, dvs. at inkubatoren varmer korrekt og centrifugen fungerer. Vi vurderede derfor, at yderligere kontroller ikke var nødvendigt. 1 8

20 Kapitel: Metode og materialer Titrering af prøvemateriale Efter analysering med alle paneler, titreredes udvalgte prøver, indeholdende klinisk relevante antistoffer. Der titreredes tre prøver indeholdende anti-k og tre prøver indeholdende anti-jk a. Alle seks prøver blev titreret med en udvalgt paneldonor fra hvert af de tre paneler. Den anvendte paneldonor blev udvalgt ud fra hvert panels antigram. De tre prøver indeholdende anti-k indeholdte ikke andre antistoffer, og derfor var eneste krav til paneldonoren her, at denne skulle være K-positiv. De tre prøver indeholdende anti-jk a indeholdte også anti-e, og derfor skulle paneldonoren til titrering være Jk a -positiv og E-negativ. Prøverne til titrering blev udvalgt efter følgende kriterier: alle tre paneler skulle have identificeret det antistof, der titreredes for; der skulle være nok plasma tilbage i prøven til, at denne kunne titreres tre gange; og det skulle være muligt at finde en paneldonor i alle tre antigrammer, som prøven kunne titreres med. Oprindeligt ønskede vi at titrere prøver indeholdende anti-k og anti-e, da disse er de hyppigst forekommende irregulære antistoffer udover anti-d.(4) Det var dog ikke muligt at finde prøver indeholdende anti-e, hvor der var nok materiale tilbage, og hvor anti-e optrådte i en kombination, det var muligt at titrere overfor alle panelerne, da de donorer der E-positive i et af panelerne også var positive overfor det andet antistof i kombinationen. Anti-Jk a blev derfor udvalgt i stedet, da dette også er et klinisk relevant antistof, der desuden er komplementaktiverende, og derfor kan give alvorlige transfusionskomplikationer. Til titrering blev en fortyndingsrække fremstillet, hvor første glas indeholdt ufortyndet plasma, i det næste blev plasma fortyndet med PBS 1:2, herefter 1:4 osv. op til fortynding 1:2000. To IgG LISS/Coombs gelkort fra Bio-Rad mærkedes med prøvenummer og brøndene blev nummereret 1 til µl testerytrocytter i 0,8 % suspension fra den udvalgte paneldonor afpippeteredes i hver brønd i de to gelkort. Herefter afpippeteredes 25 µl af hver fortynding i den tilhørende brønd. Kortene blev inkuberet 15 minutter i DiaMEd ID-incubator 37SI, hvorefter de blev centrifugeret 10 minutter i DiaMed ID-centrifuge12SII. Reaktionsstyrker noteredes i Excelskema, og titerværdien blev bestemt. Titerværdien er fortyndingsfaktoren på den sidste brønd, hvor der ses en reaktion. Titreringen er udført efter vejledningen til titrering i QualiWare, KIBA Kolding, se bilag 5, side 58. Databehandling Tre patientprøver blev ekskluderet fra alle tre paneler, da det ikke var muligt at finde et antistofsvar på dem i ProSang, og det derfor ikke var muligt at vurdere, om panelet havde givet det korrekte resultat. Derudover blev en patientprøve fjernet, da der i ProSang var skrevet en kommentar om, at prøven muligvis 1 9

21 Kapitel: Metode og materialer indeholdt et yderligere irregulært antistof, der ikke var identificeret. Det korrekte svar på denne prøve kendes således heller ikke, og den anvendes derfor ikke i beregninger. Der indgår således 46 prøver i den videre databehandling. For hvert enkelt panel inddeles resultater i kategorier på baggrund af deres overensstemmelse med resultatet fra ProSang: 100 % overensstemmelse, overensstemmelse plus identifikation af et yderligere antistof, ingen overensstemmelse og yderligere analyser nødvendigt. 100 % overensstemmelse deles desuden op efter om overensstemmelsen var første eller andet bud. Alle svar hvor det korrekte bud var det tredje, havde kommentar tilknyttet svaret, og er derfor talt med under yderligere analyse nødvendig. Ved hjælp af en χ 2 -test undersøges det, hvorvidt der er signifikant forskel på fordelingen af resultater for hvert panel. Der er ved sammenligningen med resultater fra ProSang kun taget højde for de antistoffer, der rent faktisk er identificeret, og ikke for eventuelle søgekrav, der også er indlagt på patienten. Efterfølgende er der lavet optællinger og beregninger på baggrund af NEQAS-prøver alene. Resultater er her sammenlignet med antistofsvar fra rapporter udsendt fra NEQAS, da disse svar må betragtes som prøvernes sande indhold. Resultater er opdelt i fire kategorier: overensstemmelse med NEQAS svar, overensstemmelse plus identifikation af et yderligere antistof, ikke overensstemmelse og yderligere analyse nødvendig. Der er igen udført χ 2 -test for at undersøge om der er signifikant forskel på fordelingen mellem panelerne. Der er fremstillet et histogram, der viser den procentvise mængde af overensstemmende svar, og svar med kommentar om yderligere analyse, når der er tale om henholdsvis et og to antistoffer i prøven. Ved hjælp af qq-plot er det undersøgt, om værdier for score og error er normalfordelte, hvilket ikke er tilfældet. Scoreværdier for alle paneler indsættes i punktdiagram, for at undersøge om der ses en systematisk forskel på panelerne. For at undersøge, om der er forskel på scoreværdier for de tre paneler, inddeles resultater på baggrund af deres score i fire grupper: overensstemmelse med score over 0,5, overensstemmelse med score under 0,5, ikke overensstemmelse med score over 0,5 og ikke overensstemmelse med score under 0,5. Der udregnes med χ 2 -test p-værdier for overensstemmelse og ikke overensstemmelse. På baggrund af titreringsprojektet er titerværdier bestemt for udvalgte prøver. Disse er indsat i tabel. 2 0

22 Kapitel: Resultater Litteratursøgning Relevante artikler er hovedsageligt søgt via PubMed, der er fundet en enkelt artikel via Google Scholar. Til den indledende søgning blev følgende søgeord anvendt: Blood transfusion, Antibody identification, automation, AutoVue. Denne søgning resulterede i syv anvendelige artikler. Efterfølgende er der udført søgninger på andre søgeord. En søgning i PubMed med ordet Resolvigen gav en brugbar artikel. Der er desuden søgt på AutoVue Innova, Blood bank automation, og antibody identification. Det har ikke været muligt at finde artikler omhandlende sammenligning af forskellige paneler. Der er i stedet udvalgt artikler, der omhandler automatisering, AutoVue Innova og Resolvigen. Etiske overvejelser Der er ingen etiske overvejelser omkring brugen af NEQAS-prøver i projektet, da dette ikke er patientmateriale. Ifølge Sundhedsloven kapitel 7 32 kan biologisk materiale, der er afgivet i forbindelse med en behandling anvendes til forskningsprojekter, såfremt patienten ikke har frabedt sig dette.(13) Forskningsprojektet skal være anmeldt til den Videnskabsetiske komite, men ifølge den Videnskabsetiske komite skal projekter hvor der anvendes anonymt materiale ikke anmeldes.(14) De patientprøver, der anvendes i dette projekt er anonymiserede efter antistofsvar er fundet i ProSang. Efter denne fase i projektet har det ikke længere været muligt at finde tilbage til den enkelte patient. Derfor er det ikke nødvendigt at anmelde det til den Videnskabsetiske komite. Projektet kan muligvis føre til opdagelsen af nye antistoffer hos den enkelte patient. Det skal derfor overvejes om eventuelle nye fund kan have betydning for patientens videre behandling. Men da der altid vil blive udført en forligelighedsundersøgelse inden transfusion hos en patient med irregulære antistoffer, vurderes det, at det ikke er af afgørende betydning for patienten, at eventuelle nye fund videregives til blodbanken. Hvis det skulle være muligt at underrette om nye fund, kunne patientmaterialet desuden ikke være anonymiseret. Resultater I det følgende afsnit præsenteres de resultater, der er indsamlet og beregnet gennem projektet. Resultater er delt op, således at der først ses en samlet præsentation hvor alle data medtages, både patientprøver og 2 1

23 Kapitel: Resultater NEQAS-prøver. Efterfølgende ses et afsnit, hvor der udelukkende arbejdes med NEQAS-prøver, hvor resultater fra Resolvigen 3 sammenholdes med rapporter fra NEQAS, hvor det sande indhold af antistof i den enkelte prøve er oplyst. Dette kan således betragtes som golden standard resultater. Til slut præsenteres de titerværdier, der er fundet ved titrering af udvalgte prøver fra projektet, samt titerværdier oplyst i rapporter fra NEQAS på udvalgte prøver. Rådata fra projektet kan ses i bilag 7, side 61. Resultater baseret på patient- og NEQAS-prøver I dette afsnit indgår alle 46 prøver i tabeller og beregninger. Resultater fra Resolvigen 3 holdes op mod de resultater, som KIBA, Kolding og KIBA, Vejle har fundet ved analysering af prøverne. I tabel 3 herunder ses en optælling af antistofsvarene fra Resolvigen, hvor de opdeles i kategorier efter deres overensstemmelse med afdelingens resultater. Overensstemmelse ved første bud indeholder alle de antistofsvar, hvor Resolvigen 3 som første bud har givet svar, hvor der er 100 % overensstemmelse med afdelingens svar. Overensstemmelse ved andet bud indeholder de svar, hvor Resolvigen 3 som bud nummer to har givet et svar som stemmer 100 % overens med afdelingens svar. Overensstemmelse plus et yderligere antistof indeholder de svar, hvor Resolvigen foreslår de antistoffer, som afdelingen har identificeret, men også foreslår et yderligere antistof i samme bud hvis prøven fx indeholder anti-d ifølge afdelingens svar, og Resolvigen 3 foreslår at prøven indeholder anti-d og anti-c, vil denne prøve blive indeholdt i denne kategori. Der er kun medtaget prøver i denne kategori, hvor det ekstra antistof foreslås i det første bud, og hvor der ikke opnås 100 % overensstemmelse i andet bud. Den sidste kategori indeholder det antal svar, hvor der ikke opnås overensstemmelse mellem afdelingens svar og Resolvigen 3. Tabel 3. Optælling af de opnåede antistofsvar, sorteret i kategorier. Svar, hvor der først er opnået overensstemmelse i tredje bud, er talt som ingen overensstemmelse, eftersom det ikke vurderes sandsynligt, at der kan laves en korrekt identifikation på baggrund af disse resultater. Overensstemmelse, 1. bud Overensstemmelse, 2. bud Overensstemmelse plus fund af et yderligere antistof i første bud Ingen overensstemmelse Ortho OUH Bio-Rad På baggrund af ovenstående optælling er der ved hjælp af en χ 2 -test udregnet en p-værdi for at undersøge, om der er signifikant forskel på panelernes fordeling af resultater. Med en p-værdi på 0,26 kan der ikke påvises en signifikant forskel. 2 2

24 Kapitel: Resultater Resolvigen 3 tilføjer i nogle tilfælde en kommentar til antistofsvaret om, at der skal udføres yderligere undersøgelser, for at forbedre sikkerheden af analysesvaret. Oftest er det et forslag om at udføre fænotypebestemmelse på patientens erytrocytter, eller at tilføje flere testerytrocytter. Denne besked er fremkommet både når Resolvigen 3 har opnået overensstemmelse med afdelingens svar, og når der ikke er overensstemmelse. Tages der højde for resultater, hvor Resolvigen 3 foreslår yderligere analyser fås fordelingen, der ses i tabel 4. Optællingen er sket på samme måde som ved tabel 3, blot er der her tilføjet en kategori, der indeholder de svar hvor der er tilknyttet en kommentar. For denne fordeling beregnes p-værdien til 0,13 ved en χ 2 -test. Tabel 4. Optælling af antistofsvar, sorteret i kategorier. Der tages her hensyn til, om Resolvigen 3 kommer med en kommentar om yderligere analyse nødvendig. Kommentar dækker over flere forskellige typer af kommentarer, alle dog med budskab om, at der skal uføres yderligere analyser for at identifikationen kan være sikker. Overensstemmelse 1. bud Overensstemmelse 2. bud Overensstemmelse plus fund af et yderligere antistof i 1. bud Ikke overensstemmelse Kommentar om yderligere analyse nødvendig Ortho OUH Bio-Rad Resultater baseret på NEQAS-prøver Tabeller og beregninger i dette afsnit er udelukkende baseret på analyseringer af NEQAS-prøver. Her anvendes oplysninger fra NEQAS som golden standard for indholdet af antistoffer i den enkelte prøve. Der indgår 28 prøver i beregningerne. I tabel 5 ses en oversigt over hvilket antistof eller antistoffer, der er fundet for den enkelte prøve med hvert panel. Svarene er blevet tildelt en farvekode, der viser om der er overensstemmelse med svar fra NEQAS eller ej. Grønne svar er i overensstemmelse med NEQAS svar, mens røde svar ikke stemmer overens. Ved orange svar foreslår Resolvigen 3 de korrekte antistoffer plus et eller flere yderligere antistoffer. Svar, der er markeret med stjerne indikerer, at der er tilknyttet en kommentar til svaret om, at yderligere analyser er nødvendige. 2 3

25 Kapitel: Resultater Tabel 5. De opnåede antistofsvar på NEQAS-prøver. Svar, hvor der er overensstemmelse med svaret fra NEQAS rapport, er farvet grønne, svar hvor der er overensstemmelse men også identificeret ekstra antistoffer er orange, mens svar hvor der ikke er overensstemmelse er røde. Svar, hvor der er kommentar på svaret, er markeret med en stjerne. Prøve numre NEQAS resultat Ortho OUH Bio-Rad 301 Neg Neg Neg Neg 302 K K K K 304 Neg Neg Neg Neg 307 Fya Fya Fya* Neg* 308 K K K K 309 K K K K 310 D D D D 311 D D D D 312 D,C Cw G G 313 Fya,E Fya,E Fya,E* E,Fya 314 D,K D,K D,K Jsa 315 K,Kpa K K,Kpa K,Kpa 316 E E E E 319 K,Jkb K,Jkb* K,Jkb Jsa 320 Fya,c c,fya* c,jsb* c,cw 322 Fya,E Jkb,s* D,E,Fya* E,Fya 323 D D D* D 324 D D D* D 325 D D,Cw D* D 326 K,Fya C,K,Fya Cw,K,Fya,S* K,Fya 327 D,C D,C D,C C,Jsa* 328 K,c c,fyb* E,c,K* c,k* 329 E,Fya E,Fya* E,Fya* E,Fya 332 D,K D,K D,K* Jsa 334 K K K K 335 C,e C,Fya,Jka* C,Lea C,e,Jka,S* 336 S S* S K,S* 338 Fya,c c,fya* c,jsb* c,cw* Antitstofsvarene fra tabel 5 er samlet i tabel 6 herunder. Denne giver et samlet overblik over, i hvor mange tilfælde der er overensstemmelse, overensstemmelse plus ekstra antistof, ikke overensstemmelse, samt yderligere analyser nødvendige. Der er igen anvendt en χ 2 -test, og der er udregnet en p-værdi på 0,

26 Kapitel: Resultater Procent Tabel 6. Optælling af antistofsvar fra tabel 5. Overensstemmelse med NEQAS svar Overensstemmelse plus fund af yderligere antistof Ikke overensstemmelse med NEQAS svar Kommentar om yderligere analyse nødvendig Ortho OUH BioRad Deles svarene op, efter om der er et eller to antistoffer i prøven ifølge NEQAS, fås fordelingen der ses i figur 5. Ved et enkelt antistof, er der for alle tre paneler enten overensstemmelse med NEQAS rapporter, eller kommentar om yderligere analyse nødvendig. For både et og to antistoffer gælder det, at svar med kommentarer er talt med som yderligere analyse nødvendig uanset om svaret fra Resolvigen 3 er korrekt eller forkert ifølge NEQAS rapporter. Overensstemmelse med NEQAS Ortho 1 antistof OUH 1 antistof Bio-Rad 1 antistof Ortho 2 OUH 2 Bio-Rad 2 antistoffer antistoffer antistoffer Yderligere analyse nødvendig Overensstemmelse 2. bud Overensstemmelse 1. bud Figur 5. Histogram, der viser andelen af svar med overensstemmelse med NEQAS, i henholdsvis første og andet bud. Desuden ses andelen af svar, hvor yderligere analyse er nødvendig. Svarene er opdelt efter, om der er et eller to antistoffer i prøven. Udover antistofsvar fås også en score og en error værdi fra Resolvigen 3. En forklaring på hvad disse værdier dækker over kan læses i teoriafsnittet under overskriften Resolvigen 3 software til tolkning af resultater. Ud fra disse scoreværdier er der fremstillet et diagram, se figur 6, der viser hvordan scoreværdier for hvert panel fordeler sig. Diagrammet skal illustrere, om der ses en systematisk forskel på panelernes scoreværdier, fx om et panel systematisk har højere scoreværdier end de andre. De scoreværdier, der ligger højere end 0,7 er alle værdier for prøver, der kun indeholder et enkelt antistof. Ved kombinationer af antistoffer er der ikke set scoreværdier over 0,

27 Kapitel: Resultater Scoreværdi 1 Scoreværdier for NEQAS-prøver 0,8 0,6 0,4 OUH Bio-Rad Ortho 0, Prøvenummer Figur 6. Viser fordelingen af scoreværdier for NEQAS-prøver. Figuren skal afsløre om der ses et mønster i fordelingen af scoreværdier. Det er desuden undersøgt, om scoreværdier er normalfordelt ved hjælp af qq-plot; data er ikke normalfordelt, og derfor foretages der ikke yderligere beregninger på baggrund af disse værdier. Da der ikke kan laves beregninger med scoreværdier, er de i stedet inddelt i grupper. Overordnet er der lavet tre grupper: overensstemmelse med NEQAS, ikke overensstemmelse med NEQAS, og kræver yderligere analyse. I hver af disse grupper inddeles svar yderligere i to undergrupper på baggrund af deres scoreværdi: score over 0,5 og score under 0,5. Årsagen til at der kun dannes to undergrupper med så brede intervaller er, at scoreværdier for alle prøver enten er på 0,75 og derover, eller på 0,17 og derunder. Derfor vurderes det, at det ikke vil give mening at foretage yderligere opdeling. Fordelingen i disse grupper foretages for at undersøge, om der er forskel på hvor mange svar hvert panel har i den enkelte gruppe. Resultatet af fordelingen ses i tabel 7. Tabel 7. Inddeling af resultater på baggrund af scoreværdi. Svar er desuden delt op efter, om der er overensstemmelse, ikke overensstemmelse, eller om yderligere analyse er nødvendig. Der inddeles ikke i smallere intervaller, eftersom scoreværdier enten har været på 0,75 eller derover, eller på 0,17 eller derunder. Overensstemmelse Ikke overensstemmelse Yderligere analyse Score over 0,5 Score under 0,5 Score over 0,5 Score under 0,5 Score over 0,5 Score under 0,5 Ortho OUH Bio-Rad

28 Kapitel: Resultater Med en p-værdi på 0,43 kan der ikke påvises en forskel på panelerne, men det ses dog, at panelet fra Ortho som det eneste har scoreværdier over 0,5 hvor der ikke er overensstemmelse med NEQAS. Titerværdier på udvalgte prøver Som nævnt under afsnittet Databehandling, blev seks prøver efter analysering titreret for at undersøge hvor store koncentrationer af antistoffer disse indeholdt. Titerværdien er et udtryk for hvor meget prøven kan fortyndes mens der stadig ses en reaktion mellem antistof og det tilsvarende antigen. Jo højere titerværdien er, jo større er koncentrationen af antistof i prøven. Titreringsprojektet blev udført for at undersøge, om panelerne både er i stand til at identificere antistoffer ved høje og lave koncentrationer. I tabel 8 ses hvilken prøvenumre der er titreret, samt den fundne titer. Tabel 8. Titerværdier for udvalgte titrerede prøver. Anti-K Anti-Jka Prøve 109 Prøve 113 Prøve 309 Prøve 114 Prøve 115 Prøve 116 Ortho OUH Bio-Rad Eftersom der kun blev titreret et lille udsnit af prøver, er der desuden fundet titerværdier for en række NEQAS-prøver. I de rapporter NEQAS udsender som opfølgning oplyses både det korrekte antistof indeholdt i hver prøve samt en titerværdi. Disse værdier ses i tabel 9. Tabel 9. Titerværdier for prøver, oplyst i NEQAS rapporter. Anti-K Anti-D Anti-E Anti-Fya Prøvenummer Titer Prøvenummer Titer Prøvenummer Titer Prøvenummer Titer >

29 Kapitel: Diskussion Diskussion Herunder diskuteres projektets udførelse samt de opnåede resultater. Desuden indeholder afsnittet en generel diskussion omkring automatisering frem for manuel antistofidentifikation. Anvendeligheden af Resolvigen 3 diskuteres dels ud fra de opnåede resultater og dels ud fra en artikel omhandlende Resolvigen 3. Der afsluttes med en diskussion af, hvilken betydning det vil have for KIBA, Kolding, at implementere automatisk antistofidentifikation, samt hvilket panel der bedst vil opfylde afdelingens behov. Herunder indgår ligeledes en diskussion af, hvorvidt afdelingen vil få glæde af, også at implementere Resolvigen 3. Projektets udførelse Der blev anvendt nedfrossent plasma fra patienter og NEQAS-prøver som prøvemateriale. Det havde været mere optimalt at anvende friske blodprøver til projektet, da nedfrysning kan få antistoffer til at forsvinde. Dette kan have påvirket de opnåede resultater, og være en forklaring på, hvorfor der i nogle tilfælde ses falsk negative resultater ved analysering af patientprøverne. En anden fordel ved friske prøver havde været, at vi så også ville have patientens erytrocytter, og dermed havde haft mulighed for at bestemme patientens fænotype, samt medtage patientens egne erytrocytter ved panelundersøgelse, for at undersøge for autoantistoffer. Det var dog ikke muligt, at anvende friske blodprøver med den tidsramme vi havde for udførelse af projektet, da vi dermed ikke kunne være sikre på at få ret mange blodprøver med irregulære antistoffer. På trods af, at vi har anvendt nedfrosne og optøede prøver, har vi dog i langt de fleste tilfælde fået reaktioner ved antistofidentifikationen. Fordelen ved at anvende NEQAS-prøver er, at der for disse prøver findes en sand værdi for, hvilket eller hvilke antistoffer de indeholder. Dermed kan vi være sikre på, om det resultat Resolvigen 3 kommer med også er det rigtige, og dette er baggrunden for, at lave resultater baseret på NEQAS-prøver alene. Samtidig undgås alle etiske problemstillinger, idet der ikke anvendes patientmateriale. Antistofsvar på patientprøver sammenholdes i projektet med de resultater, som afdelingen har fået ved at udføre manuelle paneler. Den manuelle identifikation er udført med panelet fra OUH, da det er dette panel, der i øjeblikket anvendes på KIBA, Kolding. Dette kan give OUH panelet en fordel ved sammenligning, idet der sammenlignes med resultater opnået med samme panel. Det er dog ikke et problem ved NEQASprøverne, da disse sammenlignes med svar fra NEQAS. Der blev ikke udført yderligere analyser på prøverne, når Resolvigen 3 foreslog dette, eller hvis antistofsvaret bestod af en lang række mulige kombinationer. Dette kunne med fordel have været gjort, dels for at undersøge, om Resolvigen 3 i så fald ville kunne identificere det eller de korrekte antistoffer, og 2 8

30 Kapitel: Diskussion dels for at undersøge, hvor mange ekstra analyser der i så fald ville være nødvendige. Men da vi kun havde en begrænset mængde af hver enkelt prøve til rådighed, ville det ikke være muligt at udføre dette ved ret mange af prøverne. En stor del af prøverne var fuldstændig opbrugt efter analysering med alle tre paneler. Det blev derfor prioriteret at analysere prøverne med alle panelerne, i stedet for at udføre yderligere analyser. Det havde dog været interessant at undersøge, om Resolvigen 3 ville kunne identificere de korrekte antistoffer, hvis reaktionsmønstre fra to paneler blev koblet sammen, således at softwaren vurderede antistofindholdet på baggrund af to paneler. Diskussion af titreringsprojektet Formålet med at titrere udvalgte prøver var, at undersøge om panelerne kunne identificere antistoffer, både når de fandtes i høje og lave koncentrationer. Dette delprojekt gik dog ikke som forventet. Vi havde forestillet os at titrere prøver indeholdende anti-k og anti-e. Mange af prøverne indeholdende disse antistoffer var dog brugt fuldstændigt op, og det kunne derfor ikke lade sig gøre at anvende dem. Vi havde kun prøvemateriale til rådighed, der indeholdte anti-e i kombination med anti-jk a. Disse prøver kunne ikke titreres overfor en donor fra Bio-Rads panel, da de to donorer der var E-positive samtidig også var Jk a - positive. Derfor blev det fravalgt at titrere anti-e, og anti-jk a blev valgt i stedet, da dette også er et klinisk relevant antistof, der kan forårsage transfusionskomplikationer. Udover problemet omkring manglende prøvemateriale, havde vi ikke gelkort nok til rådighed, til at vi kunne titrere det antal prøver vi først havde planlagt. Dette må tilskrives mangelfuld planlægning. Titreringsprojektet blev udført manuelt ud fra afdelingens vejledning, se bilag 5 side 58, og derfor blev der anvendt gelkort og ikke kassetter. AutoVue Innova kan ikke udføre titreringer, men det havde været en mulighed selv at fremstille fortyndingerne, mærke disse med stregkoder, og derefter få AutoVue til at udføre afpippetering, inkubering og centrifugering. Dette ville højst sandsynligt også give mere korrekte resultater i forhold til dette projekt, eftersom selve antistofidentifikationen blev udført i AutoVues kassetter, og det dermed havde været lettere at sammenligne reaktioner. Eftersom der ved flere titreringer af anti-jk a slet ikke sås nogen reaktion, se tabel 8, kunne det tyde på, at kassetterne har større følsomhed overfor lave koncentrationer. Det har dog været muligt at finde titerværdier for NEQAS-prøverne, idet disse oplyses i rapporterne fra NEQAS (tabel 9). Derfor er det stadig muligt at vurdere panelernes evne til at identificere antistoffer i forskellige koncentrationer. Ud fra disse titerværdier ses det, at alle panelerne er i stand til at identificere de udvalgte antistoffer i både høje og lave koncentrationer. For anti-k er det faktisk prøven indeholdende 2 9

31 Kapitel: Diskussion den højeste antistofkoncentration, der har voldt problemer for to af panelerne; prøve 328 indeholder ifølge NEQAS rapporten anti-k og anti-c. Orthos panel har ikke fundet et anti-k, OUH s panel har fundet anti-k og anti-c samt et anti-e, mens Bio-Rad korrekt har fundet anti-k og anti-c. Det burde være prøver med lav koncentration, der var svære at bestemme indholdet af, da reaktioner kan blive svagere, men her forholder det sig altså omvendt for Orthos panel. Diskussion af projektets resultater Der er ikke et af panelerne, der har vist sig markant bedre end de andre, og der har ikke vist sig en statistisk signifikant forskel på dem. Betragtes tabel 3 ses det, at Ortho og OUH s paneler har stort set lige mange svar, hvor der er overensstemmelse med ProSang i første bud (henholdsvis 33 og 32), mens Bio-Rad kun har 27. Derimod har Bio-Rad seks svar med overensstemmelse i andet bud. Det må dog klart være at foretrække at det rigtige bud er det første, eftersom der normalt ikke vil være en tidligere analyse at sammenligne resultatet med. Ses der på svar uden overensstemmelse, er Ortho en anelse bedre end de øvrige, men denne forskel er lille. Tages der hensyn til de kommentarer Resolvigen 3 kommer med, ændrer billedet sig dog, og der er ikke længere så stor forskel på panelernes resultater. Der bør tages hensyn til disse kommentarer, eftersom de betyder, at Resolvigen 3 ikke kan lave en sikker identifikation baseret på de oplysninger programmet har til rådighed. Det må derfor være en fordel, at Resolvigen 3 gør opmærksom på, at yderligere analyse er nødvendig, frem for blot at komme med sit bedste bud. Ud fra tabel 4 ses det, at fordelingen ændres noget, når der tages hensyn til disse kommentarer, da panelerne får færre korrekte bud, mens forskellen i antallet af korrekte bud delvist udlignes. Det giver et mere korrekt billede, kun at betragte resultater baseret på NEQAS-prøver, da det sande indhold af disse prøver kendes. Tabel 5 viser hvilket svar Resolvigen 3 har givet for hver enkelt prøve, og i tabel 6 er disse resultater opsummeret. Her klarer Bio-Rad sig umiddelbart bedst med 17 overensstemmende svar, men det er desuden også det panel, der har flest forkerte svar. OUH panelet har mange svar, hvor yderligere analyse er nødvendig, dette kunne tyde på at panelet ikke er distinkt nok i sine reaktionsmønstre. Ingen af panelerne kan dog hverken udråbes til bedst eller dårligst på baggrund af denne fordeling. Fordeles resultaterne efter, om der er tale om prøver indeholdende enten et eller to antistoffer, se figur 5, viser panelerne samme mønster. Er der kun et enkelt antistof i prøven, har Resolvigen 3 i 100 % af tilfældene været i stand til enten at identificere det korrekte antistof, eller er kommet med kommentar om yderligere analyse nødvendigt. Det tyder altså på, at Resolvigen 3 uden problemer kan anvendes til 3 0

32 Kapitel: Diskussion identifikation, når prøven kun indeholder et antistof. Resultatet bliver lidt ringere, når prøven indeholder to antistoffer, men igen ses en nogenlunde ens fordeling panelerne imellem, med en lille fordel til OUH s panel. Fordele og ulemper ved panelerne Panelet fra OUH havde kommentarer på ni svar, hvor der ellers var overensstemmelse med ProSang, mens de andre paneler kun havde kommentarer på halvt så mange korrekte svar. Dette kunne tyde på, at der vil være flere ekstra analyser, der skal udføres, hvis panelet fra OUH anvendes som det primære panel. Overordnet set var det også panelet fra OUH, der havde flest kommentarer tilknyttet svarene, hvilket muligvis indikerer, at dette panel ikke er helt så distinkt i sine reaktionsmønstre som de andre, eftersom det så ofte er nødvendigt at foretage ekstra analyser. Ifølge Transfusionsmedicinske Standarder, TMS, skal et panel have distinkte reaktionsmønstre for de mest hyppige antistoffer, ligesom det skal være muligt at identificere antistoffer, der ofte optræder i kombination, som eksempel nævnes anti-k og anti-d.(3) Panelet fra OUH har et problem med distinkte reaktioner, idet der ved identifikation af anti-d kan være underliggende anti-c w og anti-kp a, der ikke kan udelukkes. Anti-C w er dog underliggende ved anti-d i alle de undersøgte paneler. Det er meget svært at undgå at der findes underliggende antistoffer, men det er ikke optimalt at have underliggende antistoffer under så hyppigt et antistof som anti-d. Der har dog ikke været kommentarer ved samtlige identifikationer af anti-d, dette må skyldes Resolvigen 3 s måde at vurdere reaktioner på, idet der ikke kun kigges på reaktionsmønstre men også på reaktionsstyrker. OUH panelet har desuden den fordel, at der ud for hvert enkelt antistof oplyses, hvilke eventuelle underliggende antistoffer, der kan være. Dette oplyses ikke ved de andre paneler, og her kræver det således kendskab til panelet for at vide, hvilke underliggende antistoffer der kan være. Panelet fra Bio-Rad har 12 gange identificeret anti-js a i prøven. Anti-Js a skal kun give en reaktion med donor otte, og når der kun skal ses reaktion med en enkelt paneldonor, bliver det svært at udelukke dette antistof. Fx giver anti-d også reaktion med donor 8, og hver gang der identificeres et anti-d kan der således være et underliggende anti-js a. Det er dog ikke hver gang der er reaktion i brønd otte, at Resolvigen 3 foreslår et anti-js a. Antistoffet er identificeret med reaktionsstyrker fra 0,5 og op til 4, og det kan derfor ikke skyldes, at der enten skal være en svag reaktion eller en meget kraftig reaktion, for at anti-js a kan identificeres. Resolvigen 3 er således nødvendig for at kunne identificere antistoffet i kombination med andre. Spørgsmålet er så, hvor relevant anti-js a egentlig er, set ud fra et klinisk synspunkt. Det nævnes ikke i TMS som et af de klinisk relevante antistoffer, der skal være repræsenteret i et panel, og der skal heller ikke tages hensyn til det, når der udleveres blod til en patient.(3) Js a antigenet hører til Kell-familien og ses stort 3 1

33 Kapitel: Diskussion set ikke hos kaukasiere.(15) Det kan undre, at Bio-Rad vælger at medtage antistoffet i deres panel, især eftersom de resterende donorerytrocytter ikke er undersøgt for Js a, se bilag 2. Årsagen kan være, at panelet sælges i store dele af verden, og at antistoffet er mere hyppigt forekommende andre steder. Det forklarer dog stadig ikke, hvorfor kun en enkelt paneldonor er fænotypebestemt for Js a. Panelet fra Ortho har ligeledes antistoffet med i panelet, men samtlige testerytrocytter er fænotypebestemt til at være Js b - positive, mens der ikke er undersøgt for Js a. OUH panelet har slet ikke medtaget hverken Js a eller Js b. Det giver en del støj på Bio-Rads panel, at der kommer så mange svar med anti-js a, og anvendes dette panel til antistofidentifikation ved samtidig brug af Resolvigen 3, kunne det overvejes helt at fjerne dette antistof fra antigrammet for at undgå disse bud. Hvis anti-js a fjernes fra de resultater, der er fundet i dette projekt opnår Bio-Rads panel 19 svar med overensstemmelse med NEQAS, 6 prøver kræver yderligere analyse, og 3 svar er ikke overensstemmende. Sammenlignet med resultaterne fra tabel 6, vil dette forbedre antallet af korrekte svar fra 60,7 % til 68,9 %. Panelet fra Ortho kan ikke identificere anti-kp a, eftersom samtlige testerytrocytter er Kp a -negative. Dette er en klar ulempe for dette panel, da anti-kp a er nævnt som et af de antistoffer et panel bør kunne identificere i TMS.(3) I projektet har der kun indgået en enkelt prøve indeholdende anti-kp a, og Orthos panel var ikke i stand til at give et svar i overensstemmelse med resultatet fra NEQAS. Havde der indgået flere prøver med anti-kp a, ville antallet af prøver med overensstemmende svar have været lavere for Ortho. Bio-Rad panelet har godt nok også kun en enkelt donor, der er Kp a -positiv, men dette panel har været i stand til korrekt at identificere anti-kp a i prøve 315, se tabel 5. Det står klart, at der er fordele og ulemper ved alle tre paneler. OUH har problemet med de mange kommentarer, Bio-Rad identificerer ofte anti-js a på trods af at det ikke er til stede i prøven, og Ortho kan ikke identificere anti-kp a. Spørgsmålet er så hvilke af disse ulemper, der vejer tungest. Ortho panelets fejl bør veje tungest, idet der er en klar mangel ud fra TMS s forskrift.(3) Hvis en patient kun har anti-kp a i plasma, vil antistofidentifikationen fremstå negativ, og der kan udleveres blod til patienten alene på en BAC-test, hvor der ikke laves forligelighedsundersøgelse mellem donor og patient. Dette kan føre til transfusionskomplikationer for patienten, som netop er det, der forsøges undgået med en antistofidentifikation. Så på trods af, at Orthos panel ellers ser ud til at være på samme niveau som de to andre paneler, må det alligevel vurderes at være det dårligste. Der er stor forskel på måden, panelerne fremstilles på. Panelerne fra Ortho og Bio-Rad er kommercielt fremstillede paneler, der kan ændre sig fra LOT-nummer til LOT-nummer alt efter hvilken 3 2

34 Kapitel: Diskussion donorsammensætning, der anvendes. OUH s panel bliver derimod fremstillet ved brug af de samme 11 donorer hver eneste gang, indtil en donor falder fra af den ene eller den anden årsag. Dette er både en fordel og en ulempe for OUH s panel. Det giver et stort kendskab til antigrammet, at det er det samme fra gang til gang, og det kan lette identificeringen for bioanalytikere, der arbejder meget med det. Det er dog også en svaghed at det er baseret på de samme donorer, da det kan være meget svært at finde en ny donor, hvis en falder fra. Der skal enten findes en donor, der har nøjagtigt samme fænotype, eller der skal ændres på hele antigrammet. Hvis en donor fx falder fra pga. dødsfald, kan OUH skulle sammensætte et nyt panel på forholdsvis kort tid. Her er de kommercielle paneler bedre dækket ind, idet de bygger på flere donorer, og de er dermed mindre sårbare. Eftersom panelerne fra Ortho og Bio-Rad er kommercielle paneler, er det muligt, at de ser anderledes ud med andre LOT-numre. Panelet fra Ortho er dermed muligvis bedre med et andet LOT-nummer, men det panel, der her er undersøgt må vurderes som det dårligste af de tre paneler, pga. den manglende evne til at identificere et klinisk relevant antistof. Der er ikke stor forskel på panelerne fra Bio-Rad og OUH, og de vil begge kunne anvendes til antistofidentifikation på KIBA, Kolding. Der er en tendens til at Bio-Rad har lidt flere korrekte svar, mens OUH har flere der kræver ekstra analyse, men færre forkerte svar. Det er muligt at det optimale vil være en kombination af de to paneler, hvor det ene vælges som det primære, mens det andet anvendes som sekundært panel ved tvivlsspørgsmål. Score og Errors anvendelighed ved tolkning af antistofsvar Resolvigen 3 beregner som nævnt en score og error værdi for hver enkelt prøve, men det kan ikke på baggrund af disse værdier vurderes, hvilket panel der har klaret sig bedst i projektet. Ud fra figur 6 ses der ikke noget mønster, hvor et panel konsekvent får højere score værdier. Deles prøver op i grupper på baggrund af deres scoreværdi, tabel 7, ses der ikke den store forskel på fordelingen. Panelet fra Ortho er dog det eneste panel, der har prøver med score højere end 0,5, hvor der ikke er overensstemmelse med svaret fra NEQAS. Det er tvivlsomt, hvor meget score og error værdier reelt kan bruges til at vurdere rigtigheden af den fundne antistofkombination. Fx har en kombination af to antistoffer på intet tidspunkt opnået en score højere end 0,13. En høj score kan ikke nødvendigvis forbindes med et korrekt svar, ligesom en lav score ikke nødvendigvis betyder, at svaret er forkert. Det må derfor kræve et indgående kendskab til disse værdiers betydning, for at de kan bruges til noget i tolkningen. Der bør i stedet sigtes efter at udføre ekstra analyser, når der fremkommer flere bud på mulige antistofkombinationer, frem for at vælge ud fra score og error. 3 3

35 Kapitel: Diskussion Automatisering frem for manuel antistofidentifikation Et af de vigtigste ord, man som bioanalytiker skal kende, er kvalitetssikring. Dette skal altid være i fokus, når en analyse udføres, og har stor betydning når en ny metode overvejes implementeret. Automatisering af antistofidentifikationen vil have nogle klare kvalitetsmæssige fordele, idet det vil mindske risikoen for menneskelige fejl. Ved at opsætte antistofidentifikation til at blive analyseret på AutoVue, vil der være væsentligt færre trin, der udføres af en bioanalytiker. Undersøgelser har vist, at langt størstedelen af de fejl der sker i blodbanken skyldes menneskelige fejl.(16) Hvert år udgives Serious Hazards of Transfusion, forkortet SHOT, og ifølge denne rapport fra 2009 opstod 75 % af de fejl, der blev begået i forbindelse med AB0-identifikation, ved brug af manuelle metoder. SHOT-rapporten fra 2014 angiver lignende tal.(17) I et studie af South et. al. sammenlignes forskellige manuelle metoder med to automatiserede, hvoraf AutoVue Innova er den ene.(16) Der anvendes et specielt system kaldet FMEA til at udregne, hvor stor risikoen for fejl er ved den enkelte metode, og det konkluderes ud fra studiet at skift til automatiseret metode kan reducere risikoen for fejl med helt op til %. Selvom studiet er foretaget med fokus på AB0- blodtypebestemmelse og screentest, bør resultatet blive det samme, hvis der fokuseres på antistofidentifikation, idet analyseprincippet her er det samme som ved screentest. Også et studie af Cheng et. al. når frem til, at automatisering vil forbedre analysekvaliteten og mindske risikoen for fejl.(18) I dette studie sammenlignes udførelse af hovedsageligt AB0-blodtype og screentest, men også antistofidentifikation. Der opnås overensstemmelse mellem antistofidentifikation udført i gelkort fra Bio-Rad og på AutoVue Innova, bortset fra et tilfælde, hvor AutoVue finder et yderligere antistof. Det nævnes ikke, om der er anvendt software til antistofidentifikationen. Konklusionen på dette studie er ligeledes, at automatisering øger kvaliteten, og mindsker risikoen for fejl, samt at det frigiver tid, som bioanalytikeren kan bruge på andre opgaver. Samtidig kan svartiden forkortes væsentligt ved automatisering. Ifølge Cheng et. al. tager det mindst en time at lave en manuel antistofidentifikation, mens den kan laves på 22 minutter på AutoVue Innova. Dette må også siges at være en klar fordel, eftersom der hurtigere kan laves en forligelighedsundersøgelse og udleveres blod til patienten. Oftest vil patienter, der er kendt med antistoffer dog udredes i god tid inden en blodtransfusion er nødvendig, men der kan opstå situationer, hvor der er akut behov for blod, og her vil den nedsatte svartid få betydning. Ved at anvende AutoVue til at udføre panelundersøgelser, kan der sikres en bedre dokumentation af resultater. AutoVue tager billeder af samtlige kassetter både forfra og bagfra, og alle disse billeder lagres.(10) Det betyder, at det til enhver tid er muligt, at finde billederne frem og betragte reaktionsmønstrene, hvis der er behov for det. Ved manuel identifikation indtastes reaktionsstyrker i 3 4

36 Kapitel: Diskussion ProSang, men gelkort fotograferes eller gemmes ikke. Den forbedrede mulighed for dokumentation omtales også som et argument for automatisering frem for manuel identifikation i artiklen af Cheng et. al.(18) Samtidig bliver der en mere ensartet vurdering af reaktionsstyrker. Ved manuel identifikation er det op til den enkelte bioanalytiker at vurdere reaktionsstyrken, og den kan vurderes forskelligt fra person til person, hvilket vi også har oplevet under dette projekt. Men når AutoVue foretager vurderingen, undgås denne personlige vurdering. Den reaktionsstyrke, som AutoVue har bestemt, skal dog kontrolleres af en bioanalytiker, for at sikre at den er korrekt. Det har ikke været nødvendigt at korrigere reaktionsstyrker i dette projekt, udover de gange AutoVue har meldt fejl, fx ved fibrinogen i prøven. Men kontrollen bør stadig udføres, for at sikre at der ikke registreres forkerte reaktionsstyrker. Ved at lade AutoVue varetage afpippetering, inkubering og centrifugering kan bioanalytikeren varetage andre opgaver i mellemtiden. Dermed får bioanalytikeren mere tid til at vurdere resultatet af panelundersøgelsen. Hvis Resolvigen 3 ligeledes anvendes, kan programmet identificere antistoffer i størstedelen af prøverne, mens bioanalytikeren kan fokusere på de vanskelige cases. Samtidig vil det være muligt også at foretage antistofidentifikation i aften- og nattevagter, eftersom arbejdsbyrden for bioanalytikeren bliver væsentligt mindre. Flere artikler påpeger også fordelen ved, at apparatet varetager disse processer, da bioanalytikere så kan bruge mere tid på at tolke resultater eller varetage andre opgaver, samtidig med at selve panelundersøgelsen bliver udført mere ensartet.(8,16,18) Et studie af Shin et. al. har desuden undersøgt de økonomiske konsekvenser ved at automatisere analyser i blodbanken.(19) I studiet regnes alle udgifter forbundet med analysen med, herunder også arbejdsløn. Eftersom apparaturet allerede fandtes på afdelingen, medregnes indkøb af dette dog ikke. Resultatet viste, at der særligt ved automatisering af screentest var besparelser at hente, eftersom denne analyse er tidskrævende manuelt, og ved automatisering kan denne tid bruges mere rentabelt. Studiet undersøger ikke de økonomiske aspekter omkring automatisering af antistofidentifikation, men det må formodes at der også her kan opnås en besparelse, eftersom analyseprincippet er det samme som ved screentest. Dette er blot endnu et argument for, at automatisering er vejen frem på klinisk immunologiske afdelinger. Implementering af Resolvigen 3 Resolvigen 3 har vist sig brugbart til antistofidentifikation i dette projekt. Er der kun et antistof tilstede i plasma, har Resolvigen 3 opnået overensstemmelse med NEQAS svar eller haft behov for yderligere analyse i 100 % af tilfældene. Ved to antistoffer, har Resolvigen sværere ved at komme med det rigtige svar, men for ca. 80 % af prøverne, har der enten været overensstemmelse eller behov for yderligere analyse. Det 3 5

37 Kapitel: Diskussion letter bioanalytikerens arbejde betydeligt, at antistofidentifikationen ikke foretages manuelt ud fra panelets antigram, da dette til tider kan være en svær og langvarig proces. Dog bør det ikke overlades 100 % til Resolvigen 3 at vurdere resultatet af en panelundersøgelse, et vist kendskab til panelets antigram må stadig betragtes som nødvendigt, idet projektet har vist, at Resolvigen 3 også tager fejl i ca. 20 % af identifikationerne. Resolvigen 3 bør snarere ses som en hjælp og en rettesnor. Der bør i alle tilfælde stadig udføres en fænotypebestemmelse efter enhver antistofidentifikation, som en kontrol af om det identificerede antistof er et sandsynligt bud. Selvom Resolvigen 3 er et godt program, og en stor hjælp i identifikationen, har det dog også visse ulemper. For det første kan det være yderst vanskeligt at vurdere hvilket antistofsvar, der er det korrekte når Resolvigen 3 fremkommer med en lang liste af antistofkombinationer. Dog foreslår Resolvigen 3 i sådanne tilfælde alternative teknikker og undersøgelser, der med fordel kan udføres for at lette identificeringen. Resultatet af disse undersøgelser kan efterfølgende registreres i programmet, der så vil tage dem med i sine beregninger af, hvilket antistof der er tale om. Det er også muligt at finde en liste over stort set alle kendte metoder indenfor serologi i programmet. Denne er meget omfattende, og det kan være svært at overskue den, og finde frem til noget brugbart. En anden ulempe ved Resolvigen 3 er, at der ved en antistofidentifikation kommer mange informationer frem, der ikke er nødvendige for at foretage selve identificeringen, og det kan således være en udfordring at sortere i alt denne information, særligt for nye brugere af programmet. Det er muligvis ikke et problem for bioanalytikere, der har arbejdet med programmet længe. Det blev lettere for os i takt med at projektet skred frem, men for at få det fulde udbytte af programmet, bør bioanalytikerne igennem en grundig oplæring. Ved hvert bud på en antistofidentifikation kommer Resolvigen 3 med en score og en error værdi, der skal fortælle hvor sikker identificeringen er. Det er dog set flere gange i vores projekt, at Resolvigen kommer med to bud på et antistof, fx et D og et E ikke i kombination med hinanden, men enkelte antistoffer og score og error har for begge antistoffer været henholdsvis 1,0 og 0,0. Dermed kan score og error altså ikke anvendes til at udvælge det korrekte antistof, men fortæller blot hvor sandsynligt det er, at det pågældende antistof findes i prøven. I disse tilfælde har det korrekte antistof dog være listet først, men det er stadig nødvendigt at lave fænotypebestemmelse for begge antigener. Generelt er score og error svære størrelser at arbejde med, da det ikke kan forventes at den højeste score nødvendigvis er det rigtige bud. De to værdier skal ses afhængigt af hinanden, og det kræver et stort kendskab til softwaren, at tolke sig frem til det rette antistofsvar baseret på disse værdier hvis det overhovedet er muligt. 3 6

38 Kapitel: Diskussion En klar fordel ved Resolvigen 3 er, at alle tidligere oplysninger fra en patient anvendes til at gøre identifikationen af antistoffer sikrere. Det vil sige, at hvis der tidligere er udført en screentest og antistofidentifikation på patienten medtages disse resultater i vurderingen af den nye antistofidentifikation. Samtidig kan der indtastes fænotyper for patienten, hvilket yderligere letter identificeringen. Anvender afdelingen to paneler til antistofidentifikationen, et primært og et sekundært, vil Resolvigen 3 også være i stand til at foretage en identifikation på baggrund af en kombination af de to paneler. Resolvigen 3 kan foretage denne vurdering væsentligt hurtigere end en bioanalytiker vil kunne, og det vil derfor være muligt at finde forligeligt blod til patienten hurtigere. I et studie af Tiwari et. al. undersøges det, hvor anvendeligt Resolvigen 3 er til antistof-identifikation.(20) Studiet foretages retrospektivt, hvor antistoffer i 238 patientprøver tidligere er bestemt manuelt, og nu reanalyseres hvor Resolvigen 3 anvendes til identifikation. Der fokuseres både på programmets evne til at identificere antistoffer korrekt samt på dets brugervenlighed, hvilket undersøges gennem spørgeskema til de 41 personer, der varetager analyseringen. Resultatet af studiet viser, at når der er tale om et enkelt antistof er der overensstemmelse mellem manuel metode og Resolvigen 3 i 98,6 % af tilfældene, mens der ved to antistoffer opnås overensstemmelse i 65 % af tilfældene. Ved tre eller flere antistoffer ses ingen overensstemmelse. Det vurderes, at dette skyldes, at der ikke var ret mange prøver i denne kategori. Samtlige teknikere, der har deltaget i studiet, bedømmer Resolvigen 3 til at være let at anvende, og vurderer at det vil lette deres arbejde. Kun på et område får programmet en lidt lavere vurdering, nemlig klarhed. Resultaterne fra dette studie stemmer godt overens med resultaterne fra vores projekt, der også viser størst overensstemmelse ved enkelte antistoffer, og lavere for to antistoffer, se figur 5. Det nævnes dog ikke i artiklen, hvordan prøvesvar med kommentarer behandles. Ligeledes stemmer teknikernes vurdering af programmet fint med vores. Grunden til at Resolvigen 3 får lavere vurdering af programmets klarhed, kan skyldes at der kommer så mange informationer ved hver identificering, som også er årsagen til, at vi indimellem havde svært ved at tolke, hvor meget der skal tages hensyn til, når det vurderes om svaret er sandsynligt. Studiet af Tiwari et. at. underbygger altså både vores resultater samt vores vurdering af Resolvigen 3 s anvendelighed. 3 7

39 Kapitel: Diskussion Antistofidentifikation ved brug af AutoVue Innova på KIBA, Kolding Sygehus Det bør ikke være nødvendigt med yderligere oplæring af bioanalytikerne på afdelingen, eftersom de allerede er vant til at betjene AutoVue Innova, og selve betjeningen er den samme som ved de analyser, der allerede analyseres på apparatet. Skal analysen opsættes på AutoVue, kan apparatet ikke udføre blodtypebestemmelse og screentest samtidig, da det ikke er muligt at placere så mange flasker med testerytrocytter i reagenskarusellen. Dermed skal et apparat udelukkende anvendes til antistofidentifikation, når denne analyse udføres. Det bør dog ikke være noget problem, eftersom afdelingen har to AutoVue Innova, og et apparat kan varetage blodtypebestemmelse og screentest mens det andet bruges til antistofidentifikation. Skal der kun analyseres et enkelt panel ad gangen tager dette ca. 26 minutter ifølge vores projekt, hvorefter apparatet igen kan anvendes til øvrige analyser, hvis der er behov for dette. Det bør ikke være nødvendigt at have et apparat reserveret fuldstændigt til antistofidentifikation, men dette er selvfølgelig en mulighed, hvis det fungerer bedst for afdelingen. Som beskrevet tidligere, vil implementeringen af panelundersøgelser på AutoVue betyde mindre manuelt arbejde til afdelingens bioanalytikere. Dette nedsætter både risikoen for menneskelige fejl, og giver samtidig tid til, at der kan fokuseres på andre opgaver på afdelingen. Resolvigen 3 har vist sig som et godt værktøj til antistofidentifikation, og letter arbejdet med at tolke reaktionsmønstre. Dette bør også kunne lette afdelingens daglige arbejde, særligt ved identifikation af flere antistoffer. Det er oftest ikke noget problem at identificere et enkelt antistof som anti-d eller anti-k, men ved kombinationer af to eller flere antistoffer bliver det mere besværligt at finde frem til det rigtige. Her er Resolvigen 3 en stor hjælp, også hvis det ikke er muligt for softwaren at identificere det korrekte antistof i første forsøg, da det kan guide bioanalytikeren i den rigtige retning. Dog bør den enkelte bioanalytiker stadig have et vist kendskab til det anvendte panels antigram, da det bør kunne hjælpe med at afdække eventuelle fejl fra Resolvigen 3. Om det kan betale sig for KIBA, Kolding at investere i softwaren, bør holdes op imod hvor mange panelundersøgelser afdelingen laver. Ifølge Kent Elkrog, produktspecialist hos Ortho Clinical Diagnostics, koster Resolvigen ,- hvilket inkluderer selve softwaren, opsætning på apparaturet samt oplæring i brugen af det. Det bør overvejes om Resolvigen 3 er så stor en hjælp, at det retfærdiggør en investering på ,- på et laboratorium af denne størrelse. Der blev i 2014 udført 234 panelundersøgelser på KIBA, Vejle, se bilag 6 side 60. Analysen er i år flyttet til laboratoriet i Kolding, og det må formodes at antallet af 3 8

40 Kapitel: Diskussion analyser bliver nogenlunde det samme. Der udføres dermed ca. et panel om dagen på hverdage. Selvom Resolvigen er et godt værktøj, er det usikkert om prøvemængden retfærdiggør indkøbet af softwaren, da den trods alt ikke er i stand til at lave flere korrekte identifikationer af antistoffer, når der er to antistoffer til stede i en prøve. Hvilket panel, der skal anvendes til antistofidentifikation på KIBA, Kolding, afhænger både af kvaliteten og af prisen. Eftersom panelerne viser så forholdsvist ens resultater, kan prisen blive afgørende for, hvilket eller hvilke paneler, der skal anvendes på afdelingen. Panelet fra Ortho er med en pris på 851,51,- klart det dyreste. Da dette panel kun indeholder 3 ml testerytrocytter per flaske, koster det 283,84,- per ml. Til sammenligning koster panelet fra Bio-Rad 789,- og hver flaske indeholder her 4 ml testerytrocytter, hvilket giver en pris per ml på 197,25,-. Eftersom det er nødvendigt med en vis mængde dødvolumen i flasken, for at AutoVue er i stand til at afpippetere, vil der være et vist spild i hver flaske. Vi fandt, at vi kunne analysere ca. 45 paneler med et kit fra Ortho, mens et kit fra Bio-Rad ikke blev brugt op under projektet. Det må formodes at der vil være et større spild forbundet med Orthos panel pga. den mindre mængde i hver flaske, da de dermed oftere skal skiftes, og der vil være et dødvolumen tilbage hver gang. Dermed bliver Orthos panel endnu dyrere i brug. De oplyste priser er dog listepriser, og begge paneler vil muligvis blive billigere, hvis der laves en fast aftale om levering, særligt hvis flere sygehuse i regionen deltager i en sådan aftale. Det har ikke været muligt at fremskaffe en pris på, hvad det koster at fremstille panelet fra OUH. Det er dog oplyst af KIBA, Kolding, at afdelingen ikke betaler noget for at modtage panelet. Panelet fremstilles til hele Region Syddanmark, og fordeles til en række sygehuse. Udgiften til fremstilling bør således deles op efter antallet af sygehuse, der modtager det. Da det ikke er muligt at finde en fast pris på dette panel, kan denne kun vurderes ud fra de omkostninger der er forbundet med fremstillingen, såsom betaling til donorer og arbejdsløn til bioanalytikere. Jeg vil dog ikke komme med noget konkret bud på en pris, da det ikke kan lade sig gøre at komme med et kvalificeret bud på baggrund af de oplysninger, der er til rådighed. Det havde dog været interessant at kunne sammenligne fremstillingsprisen med prisen for de kommercielle paneler og undersøge, om det muligvis er dyrere for regionen at fremstille panelet selv, frem for at lave en fælles aftale om levering af et kommercielt panel til hele regionen. Eftersom panelet fra OUH ikke er så markant bedre, at det alene retfærdiggør at OUH vælger at fremstille eget panel, er det muligt, at regionen kan spare penge ved at lave en aftale om levering af et kommercielt fremstillet panel, uden at dette påvirker kvaliteten af panelundersøgelserne. 3 9

41 Kapitel: Konklusion Der kan dog ikke være nogen tvivl om, at panelet fra OUH er det billigste at anvende for KIBA, Kolding i øjeblikket. Om det også er det billigste for Region Syddanmark må stå hen i det uvisse. Eftersom der ikke er større forskel på panelerne, og Orthos panel har vist sig at være det dyreste samtidig med, at det ikke er i stand til at identificere et klinisk relevant antistof, bør det ikke anvendes af KIBA, Kolding. Derimod kan det være en fordel for afdelingen at have både panelet fra Bio-Rad og OUH til rådighed. I de tilfælde, hvor det er nødvendigt med yderligere analyse ifølge Resolvigen 3, kan panelerne supplere hinanden. OUH panelet kan med fordel vælges som det primære panel, på trods af, at der i flere tilfælde vil være behov for, at udføre yderligere analyser. Men eftersom dette panel ikke koster noget for afdelingen, kan der muligvis være en besparelse ved at anvende dette panel som det primære, på trods af at der i så fald skal udføres flere analyser. Konklusion Der kan ikke påvises signifikant forskel på panelerne fra Ortho, OUH og Bio-Rad på baggrund af resultaterne af dette projekt. Men det er stadig muligt at vurdere, hvilke paneler, der bedst kan anvendes til antistofidentifikation på KIBA, Kolding. Eftersom panelet fra Ortho ikke er i stand til at identificere et klinisk relevant antistof, som et panel ifølge TMS bør kunne identificere, og det samtidig er det dyreste, bør det ikke anvendes på KIBA, Kolding. Anvendes panelet fra Bio-Rad samtidig med at Resolvigen anvendes til tolkning af reaktionsmønstre, bør Js a fjernes fra antigrammet, for at dette ikke forstyrrer identificeringen, idet antistoffet må betegnes som ikke klinisk relevant. Dette panel ville i så fald kunne anvendes til antistofidentifikation med gode resultater. Bedst resultat opnås højst sandsynligt, ved at anvende en kombination af Bio-Rads og OUH s paneler, hvor et panel anvendes som primært, og det andet som supplerende. Hvilket der skal anvendes som det primære, er svært at afgøre på baggrund af dette projekt, da resultaterne er så ens. Derfor kan økonomi blive den afgørende faktor, og da OUH panelet er gratis for afdelingen, taler det for at dette panel anvendes som det primære, da det vil være forbundet med færrest omkostninger for KIBA, Kolding. Bio- Rads panel kan dermed anvendes som supplerende panel, når der ikke kan fastslås en sikker identifikation på baggrund af OUH s panel alene. Automatisering af analysen vil have flere fordele for afdelingen. Dels vil det kunne minimere risikoen for menneskelige fejl, da AutoVue i så fald vil stå for selve udførelsen af analysen, mens bioanalytikeren kan fokusere på resultattolkning. Samtidig vil det sikre en ensartethed i afpippetering og inkubationstid, og der 4 0

42 Kapitel: Perspektivering kan foretages en række panelundersøgelser på en gang, uden at det øger risikoen for forbytning. Der vil også blive en større ensartethed i tolkning af reaktionsstyrker, eftersom AutoVue vil aflæse reaktionsstyrker, og de små forskelle der kan være i aflæsningen fra bioanalytiker til bioanalytiker undgås. Derudover frigives en del tid for bioanalytikeren, der kan bruges på andre opgaver. Samtlige studier, der er fundet om emnet, peger desuden på at automatisering er vejen frem. Resolvigen 3 har desuden vist sig som et brugbart materiale i tolkningen af analysesvar, og særligt for en uerfaren bioanalytiker er dette en stor fordel. Både dette projekt og studiet af Tiwari et. al. peger på at Resolvigen 3 letter arbejdet med identificering. I de tilfælde, hvor programmet ikke er i stand til at komme med det korrekte bud, kan det lede bioanalytikeren på rette vej, ved at foreslå øvrige teknikker. Dog skal man ikke stole blindt på Resolvigens svar, det er stadig nødvendigt med et vist kendskab til panelets antigram, og vanskelige cases vil stadig kræve en del tolkningsarbejde af bioanalytikeren. Perspektivering Resolvigen 3 har vist sig som et brugbart værktøj til antistofidentifikation, men har samtidig nogle begrænsninger og ulemper. Ortho Clinical Diagnostics har udviklet en ny udgave af Resolvigen, Resolvigen 4, der efter sigende bliver tilgængelig i I denne nye udgave er der udviklet en ny brugerflade, der skulle gøre programmet lettere at anvende, og samtidig er forklaringen af resultater blevet optimeret, så de tydeligere kan tolkes.(21) Det kunne være meget interessant at undersøge, hvordan dette program kan fungere som hjælpemiddel ved antistofidentifikation på KIBA, Kolding. Særligt den forbedrede forklaring på tolkning af resultater er interessant, eftersom der i Resolvigen 3 er så meget ekstra information, der er svær at tolke på. Det kunne derfor være en god ide for afdelingen, at afprøve denne nye version. Samtidig betyder den nye version også, at det vil være det mest fornuftige at vente med at investere i software til den nye version er tilgængelig, for at få det nyeste og forhåbentligt bedste program. Der var en række prøver, der ikke kunne identificeres sikkert ved brug af Resolvigen 3, hvor programmet foreslog yderligere analyser. Det kunne derfor være interessant at undersøge, hvorvidt Resolvigen enten version 3 eller 4 ville kunne identificere antistofferne i disse prøver, hvis der anvendes to paneler i kombination. Dette ville øge brugbarheden af programmet markant, da det så vil være muligt at identificere antistofindholdet i langt flere prøver korrekt. En bioanalytiker kan naturligvis også lave denne vurdering på baggrund af to paneler, men ved brug af Resolvigen vil svaret kunne findes hurtigere, og dermed kan blod også udleveres til patienten hurtigere, samtidig med at bioanalytikeren kan bruge tid på andre opgaver. 4 1

43 Kapitel: Perspektivering Det kunne være interessant at undersøge, hvad Region Syddanmark rent faktisk sparer, ved selv at fremstille det panel, der anvendes på regionens laboratorier hvis der overhovedet spares noget. Økonomien i Sundhedsvæsenet er hårdt presset i disse år, hvor medicinudgifter og øvrige udgifter til behandlinger stiger, samtidig med at der skal spares på budgetterne.(22,23) Selvom det muligvis vil være en lille besparelse at overgå til et kommercielt panel, er det dog værd at se på, om der kan spares noget. Hvis det viser sig, at udgiften til fremstillingen af panelet er den samme eller endog højere end udgiften til et kommercielt panel, bør det overvejes at få lavet en god aftale for hele Region Syddanmark, hvorved der i så fald kan spares et mindre beløb, uden at kvaliteten af analysen påvirkes. 4 2

44 Kapitel: Litteraturliste Litteraturliste 1. Taaning, ørgaard, laas H, Dansk Sygeplejeråd. Immunologi og transfusionsmedicin. Kbh.: Dansk Sygeplejeråd : yt ordisk Forlag; Aagaard B, Sørensen B, Larsen R, Lustrup F. DART Hæmovigliiance Rapport Dansk Selskab for Klinisk Immunologi; 3. Georgsen, Jørgen, Hansen, Morten Bagge, Sørensen, Betina. Transfusionsmedicinske Standarder. Dansk Selskab for Klinisk Immunologi; Report No.: 3,5. Tilgængelig fra: 4. Agger R. Immunologi. Kbh.: Munksgaard Danmark; Jensen, Helene Henriette Bundgaard. Transfusionskomplikationer. Infonet Region Syddanmark. Sidst redigeret 2015 Apr 27. Tilgængelig fra: 6. Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged S, Nissen PH. Lyngbyes Laboratoriemedicin. 2. udgave. København: Nyt nordisk forlag; 7. Jensen, Tina Bjørg. Erytrocytserologiske teknikker og metode Dada A, Beck D, Schmitz G. Automation and Data Processing in Blood Banking Using the Ortho AutoVue Innova System. Transfusion medicine and Hemotherapy. September Tilgængelig fra: 9. Ortho Clinical Diagnostics. Ortho Workstation, Ortho BioVue System Handbook. Ortho Clinical Diagnostics; 10. Ortho-Clinical Diagnostics. Uddannelses- og brugervejledning Ortho AutoVue Innova. Ortho-Clinical Diagnostics Inc; 11. UK NEQAS. UK NEQAS haematology and Transfusion. UK NEQAS. Set 2015 Nov 15. Tilgængelig fra: DiaMed GmbH. Direct and indirect antiglobulin test. DiaMed GmbH; Set 2015 Oct 30. Tilgængelig fra: Ministeriet for Sundhed og Forebyggelse. Sundhedsloven. November Tilgængelig fra: Den Nationale Videnskabsetiske Komite. Anonymt eller Anonymiseret Materiale. Den Nationale Videnskabsetiske Komite. Sidst redigeret 19. August Tilgængelig fra: Dean L. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information (US);

45 Kapitel: Illustrationer 16. South SF, Casina TS, Li L. Exponential error reduction in pretransfusion testing with automation. Transfusion (Paris). August Tilgængelig fra: Dafydd T, Shubha A, Mark B. Annual SHOT report Serious Hazards of Transfusion; Juni Tilgængelig fra: Edition.pdf 18. Cheng YW, Wilkinson JM. An experience of the introduction of a blood bank automation system (Ortho AutoVue Innova) in a regional acute hospital. Transfusion and Apheresis Science: Official Journal of the World Apheresis Association: Official Journal of the European Society for Haemapheresis. 16. Marts Tilgængelig fra: Shin K-H, Kim HH, Chang CL, Lee EY. Economic and workflow analysis of a blood bank automated system. Annals of Laboratory Medicine. Juli Tilgængelig fra: Tiwari AK, Dara RC, Arora D, Aggarwal G, Rawat G, Mitra S, et al. Allo-antibody identification: a software approach! Transfusion and Apheresis Science: Official Journal of the World Apheresis Association: Official Journal of the European Society for Haemapheresis. Oktober Tilgængelig fra: Ortho-Clinical Diagnostics. Ortho Resolvigen 4. Ortho Clinical Diagnostics. Set 30. November Tilgængelig fra: Herning, Lars. Større udgifter til sygehusmedicin end i Danske Regioner. Sidst redigeret 06. November Tilgængelig fra: Herning, Lars. Behov for flere hænder i sundhedsvæsenet. Danske Regioner. Sidst redigeret 27. Oktober Tilgængelig fra: v%c3%a6senet Illustrationer Forsidebillede: Figur 1-4: Agger R. Immunologi. Kbh.: Munksgaard Danmark; Tilladelse til at bruge figurerne er givet fra Munksgaard Danmark og illustrator Jakob Strandberg. Øvrige figurer er fremstillet af Vivi Helleshøj Skøtt 4 4

46 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error Bilag 1 tolkning af score og error Det følgende materiale er modtaget fra produktspecialist Kent Elkrog fra Ortho Clinical Diagnostics. Det forklarer hvordan score og error værdier skal forstås og tolkes i forhold til antistofsvar fra Resolvigen

47 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 4 6

48 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 4 7

49 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 4 8

50 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 4 9

51 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 5 0

52 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 5 1

53 Kapitel: Bilag 1 tolkning af score og error 5 2

54 Kapitel: Bilag 2 antigrammer Bilag 2 antigrammer Antigram fra Ortho Clinical Diagnostics: Antigram fra Bio-Rad: 5 3

55 Kapitel: Bilag 2 antigrammer Antigram fra OUH: 5 4

56 Kapitel: Bilag 3 dokumentation af oplyste priser Bilag 3 dokumentation af oplyste priser 5 5

57 Kapitel: Bilag 3 dokumentation af oplyste priser 5 6

58 Kapitel: Bilag 4 Projektprotokol Bilag 4 Projektprotokol Prøver tages ud af fryser søndag eftermiddag, og placeres i kølerum. Mandag: OUH panel (Panel B) Tirsdag: Ortho panel (Panel A) Onsdag: Bio-Rad panel (Panel C) Prøver mærkes med de rigtige numre mandag morgen. Der analyseres 5 prøver ad gangen. De første prøver der analyseres, skal være nogle af dem med meget materiale, og de analyseres med OUH panelet. Fremgangsmåde: På AutoVue: Vælg Samples, Register and load Flueben i Patientinformation Vælg det aktuelle panel Vælg plasma Scan stregkode på prøven Scan stregkode igen (under patient ID) Indtast navn på prøven: Patient1a (1. patientprøve, analyseres med panel a) Neqas1a Tag færdige kort ud (åben main cover) Vælg prøven på skærmen Vurder om reaktionsstyrker stemmer overens mellem kort og AutoVue, ret hvis nødvendigt o Hvis fejlmeldinger (fx FIB), vurder kort og indtast manuelt Accepter resultat I Resolvigen: Vælg Tools Vælg Configure -Vælg fanen Instrument Klik OK Vælg File Vælg Instrument AutoVue De kørte prøver ses nu under Test Vælg den prøve der skal ses Vælg cancel så patient ikke linkes med andre Klik OK til at panelet ikke er valideret Vælg diagnosis for at se antistofsvar Vælg xplain for at se scoreværdi 5 7

59 Kapitel: Bilag 5 Titreringsvejledning Bilag 5 Titreringsvejledning 5 8

60 Kapitel: Bilag 5 Titreringsvejledning 5 9