Programmed cell death. Apoptose. (betyder at falde af på græsk) Lewin kap.12 side Gomperts Kap.14 side

Transkript

1 Programmed cell death. Apoptose (betyder at falde af på græsk) Lewin kap.12 side Gomperts Kap.14 side Introduction Programmeret celle død er en vigtig proces under udviklingen og for det meste foregår den ved den bestemte form for celledød der betegnes apoptose. Apoptose er også vigtig for: Normal homeostasis Hæmning af cancer Sygdomme som neurodegenerative sygdomme som f.eks Alzheimer 1

2 Apoptose Programmeret celledød eller apoptose er en central proces der styrer udviklingen af multicellulære organismer. Her ses hvordan apoptose styrer fjernelse af celler mellem fingrene på en mus. De lysegrønne celler er i apoptose Fig Celler går i apoptose enten fordi de mangler overlevelsesfaktorer trophic factors eller fordi de bliver udsat for killing signals Utrolig mange celler dør (ved apoptose) under udviklingen. Omkring halvdelen af alle nerveceller dør næsten med det samme. Nogle celler dør fordi de ikke længere skal bruges som f.eks haletudsens hale. I nervesystemet under udvikling er det for at tilpasse antallet af nerveceller til de celler der skal have nervekontakt. I den voksne organisme sørger apoptosen for at holde antallet af celler konstant (homeostase) så celledeling og apoptose matches præcist. Hvis ikke ville vævene vokse eller mindskes. Meget vigtig i immunforsvaret og i eliminering af kræftceller. 2

3 Denne programmerede celledød (PCD) har karakteristika af apoptose men ikke al programeret celledød kan karakteriseres som apoptose. Apoptose har specielle karakteristika Figure 12.01: Programmed cell death in developing mammalian limb. Celler kan blive skadet og dø af necrose. Necrotiske celler svulmer og springer og frigør deres indhold hvilket giver inflammatoriske reaktioner og immunreaktioner mod stoffer der normalt ikke findes uden for cellen. Omvendt dør apoptotiske celler uden at gå istykker og frigøre noget celleindhóld, derfor er cytosolen stadig tæt farvet. Der er fyldt med vescicler der vil blive frigjort som stadig har membran. 3

4 Her ses Nekrotiske celler der lyserer og som invaderes af fagocytotiske celler som giver inflamation Downloaded from: StudentConsult (on 8 October :42 PM) 2005 Elsevier Apoptotiske celler skrumper og membranen blebber, de afsnører derpå apoptotiske legemer, der spises af andre celler. Kernen fragmenterer og kromatinet kondenserer. Det vigtige ved apoptose er at celleindholdet ikke frigøres som det gør ved nekrose. 4

5 Figure 12.02: An apoptotic cell is destroyed from within. Her ses hvordan kernen fragmenterer Det ses her hvordan den apoptotiske celle skrumper og hvordan der dannes apototiske legemer. Det ses også at nabocellerne er upåvirkede Downloaded from: StudentConsult (on 8 October :42 PM) 2005 Elsevier 5

6 Figure 12.03: Apoptosis versus necrosis. Der er mange stimuli der starter apoptose Mangel på vækstfaktorer DNA skader fra γ stråling eller kemoterapeutiske stoffer Cytoskeletskader eller ER dysfunktion Varme, kulde og osmotiske stress Løsning fra underlaget (anoikis) Den apoptotiske celle: 1. Cellen skrumper, kromosom kondensering 2. Kernemembranen opløses og DNA brydes i stykker, kernen fragmenterer. 3. Der dannes blebs. 4. Der dannes vakuoler i cytoplasma. 5. Cellen opløses i apoptotiske legemer. 6. Phosphatidylserin redistribueres fra indersiden af membranen til ydersiden af membranen. Andre celler bruger det til at kende den døende celle 6

7 Figure 12.04: DNA is degraded during apoptosis. DNA nedbrydningen (fragmenteringen) ses som en stige ladder på en gel 12.2 Caspaser. Intracellulære proteiner der er involveret i apoptose Apoptose afhænger af en række cystein aspartatproteaser med cystein i deres aktive site (caspaser). De kløver proteinerne efter en asparaginsyre. 14 caspaser er blevet identificeret. Caspaser dannes som inaktive zymogener (procaspaser). Der findes Initiator Caspase og Effektor eller Executioner Caspaser i apoptosen Figure 12.05: Caspases. 7

8 Initiator caspaser og effektor caspaser. Initiator caspaser kløver andre procaspaser og effektor caspaser kløver andre proteiner. 8 og 9 er de kendte initiator caspaser og caspase 3 og 7 de kendteste effektor caspaser Executioner caspases are activated by cleavage, whereas initiator caspases are activated by dimerization Effektor Caspaserne eller execution Caspaserne findes som inaktive procaspaser der skal kløves (aktiveres) ved proteolytisk kløvning af initiator Caspaserne. Procaspasen findes som en dimer og den aktive caspase bliver så en tetramer. Figure 12.06: Executioner caspases are activated by cleavage. 8

9 Men hvordan aktiveres så initiator Caspaserne. Initiator Caspaserne findes som monomere med et prodomæne der indeholder protein bindende motiver som caspaserecruitment domænet (CARD) og death effector domænet (DED), fælles kaldes de death fold Figure 12.07: Initiator Caspaser aktiveres når et adaptorprotein binder deres prodomæne og bringer dem sammen som dimere. Den dimeriserede initiator procaspase aktiveres af proteolytisk kløvning to steder. Efter prodomænet og mellem store og lille subunit. Initiator Caspasen fortsat Husk den her sidder i et adoptorprotein som en dimer Det aktive caspase enzym består af to af disse dvs det er en tetramer 9

10 12.4 Some inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) block caspases Siden effektor caspaser aktiveres ved kløvning og siden disse Caspaser kan kløve og aktivere hinanden bliver den proteolytiske aktivitet hurtigt forstærket førende til celledød ved apoptose. Det er derfor klart at der må være en sikkerhedsmekanisme mod tilfældig aktivering som kan stoppe Caspaserne hvis cellen ikke er blevet programmeret til at dø. Det gør IAP s Some inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) block caspases Hæmmere af apoptose har forskellige funktioner nogle: Binder til og hæmmer Caspaserne Inducerer nedbrydning af Caspaserne i proteasomet Det er ret uklart hvordan de reguleres 10

11 12.6 To velkarakteriserede veje til apoptose er: 1. Døds receptorvejen også kaldet extrinsic eller den ydre vej. En ligang af TNF familien binder til en dødsreceptor 2. Mitochondrievejen også kaldet intrinsic eller den indre vej. 3. Der dannes en pore i mitochondriets ydre membran og Cytochrom C lægger ud. Dødsligand binder til dødsreceptor Figure 12.11: Overview of two apoptotic pathways The death receptor pathway of apoptosis transmits external signals Caspase aktivering og apoptose induceres i den ydre apoptose vej ved binding af en ligand af tumour necrosis faktor familien (TNF) til dens receptor (døds receptorer). Disse TNF er er af stor anticancer interesse især har TRAIL givet lovende resultater i at fremkalde apoptose i kræftceller 11

12 Extrinsic pathway- Ydre vej- dødsreceptorvejen Apoptoseprocessen kan startes udefra ved aktivering af døds receptorer som tilhører TNF receptorfamilien. Kendte dødsreceptorer er TNFR1, CD95 (også kaldet Fas eller Apo-1). Receptorerne sidder som trimere og clustrer når liganden binder. Dødsdomænerne (DD) binder så adaptorproteiner der binder procaspaser ( her procaspase 8) ved hjælp af Death effektor domæner (DED). Procaspaserne aktiverer så hinanden. Killer lymphocytes med FAS ligander har en vigtig rolle i at fjerne kræftceller. Visse kræftceller udskiller et protein der binder til Fas liganden på Killer Lymphocytten og undslipper derved destruktion Figure 12.08: Death folds. 12

13 Fas liganden er et trimert ekstracellulært protein der binder til receptoren Fas (også kaldet CD95 eller APO-1) der er en trimer receptor. Binding af Fas liganden ændrer Fas s konformation så den clustrer og kan rekrutere adaptor proteinet FADD ( Fas associeret dødsdomæne) via dødsdomænerne (DD). Adaptorproteiner binder så procaspaser ( her procaspase 8) ved hjælp af Death effektor domæner (DED). Procaspaserne aktiverer så hinanden. Mutationer i Fas receptoren i f.eks lymphocytter kan føre til at der opstår alt for mange lymphocytter med en lang række kliniske symptomer til følge. Ved den autoimune sygdom ALPS er der en dominant mutation i en Fas receptor subunit, det betyder at en heterocygot ALPS patient der har enten én eller to muterede subunit er syg mens kun en patient der har 3 ikke muterede subunit er rask. Da der er lige mange muterede og ikke muterede at tage af bliver chancen 1/8 for at udfaldet bliver at heterocygoten er rask Rmm rmr rrm rrr mrr mrm mmr mmm Dimeriseringen af procaspase- 8 aktiverer den ved kløvning efter prodomænet og mellem store og lille subunit. Aktiv Caspase 8 der er en tetramer kan så kløve effektorcaspaserne 3,6,7 så de bliver aktive og kan kløve en lang række proteiner som f.eks Caspase afhængig DNA se der degraderer DNA, Kinaser der nedbryder cytoskelettet etc. Figure 12.13: The death receptor pathway of apoptosis. 13

14 12.7. TNFR1 Kan både hæmme og fremme apoptose. TNFR1 binder ikke adaptorproteinet FADD som de andre gør. Den binder i stedet TRADD (TNF receptor associated death domain) og nogen andre proteiner bl. a. TRAFs ( TNF receptor associated factors) i et komplex I. Dette frigøres og binder derpå FADD som binder og dimeriserer Procaspase 8 på sædvanlig vis (Complex 2). Procaspase 8 bliver aktiveret o.s.v. TRAF kan aktivere NF-κB der kan blokere apoptose via FLIP FLIP ligner Caspase 8 og blokerer ved at sætte sig på den plads Caspase 8 skulle have siddet på. FLIP har ikke Caspase aktivitet. FLIP blokerer for alle døds receptorer Flip hæmning af apoptose synes at være noget celler har i specielle stadier, f.eks hos T lymphocyter de første dage efter aktivering og hos mange celler i udviklingen Figure 12.15: c-flip can block death receptor-induced apoptosis. 14

15 12.8 The mitochondrial pathway of apoptosis Den mest almindelige apoptose vej i pattedyrceller foregår som følger: Mitochondriets ydre membran bliver hullet og indholdet i intermembran rummet frigøres. Mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) er en nøgle begivenhed i dette Mitochondrielle pathway eller indre pathway Celler der er stressede eller beskadiget kan også selv starte den apoptotiske proces indefra ( begå selvmord). Denne proces starter med frigørelse af Cytochrom C fra mitochondrier. Cytochrom C binder til et adaptor protein (Apaf-1) som binder og dimeriserer og aggregerer procaspase 9 molekyler som aktiverer hinanden. initiatorcaspase 15

16 Figure 12.17: Cytochrome c frigørelsen fra et mitochondrie Proteiner af Bcl-2 familien er centrale i apoptosen. Der er proapoptotiske og antiapoptotiske medlemmer af familien. Bcl-2 (antiapoptotisk)er meget opreguleret i B-celle lymfekræft. En overførsel mellem kromosom 14 og kromosom 18 får Bcl-2 til at blive overudtrykt og da det er antiapoptotisk fører det til kræft. Bcl-2 binder til Apaf som er med til at aktivere procaspaserne 16

17 En oversigt over BCL-2 familiens antiapoptotiske (protectors) og proapoptotiske (killers) medlemmer Downloaded from: StudentConsult (on 8 October :42 PM) 2005 Elsevier Og her er en oversigt over deres struktur. De ligner hinanden meget Der er 4 Bcl- 2 homologi (BH) domæner Der er tre subfamilier: 1. De antiapoptotiske med alle domæner (Bcl-2) 2. De proapoptotiske BH1,2 og 3 proteiner (Bax og Bak) 3. De proapoptotiske BH-3 only proteiner (Bid, Bad, Bim) Figure 12.18: The Bcl-2 family proteins in mammals. 17

18 Oversigt over den apoptotiske signalvej i C elegans og i vertebrater. Bcl-2 blev oprindelig fundet som en homolog til Ced-9 hos C elegans. Hos ormen C elegans dør 131 celler af de 1090 der dannes under udviklingen af apoptose og man har brugt den meget til studiet af apoptose. CED-9 proteinet er fundet at stoppe apoptose mens CED3 og CED4 er proapoptotiske. De parallelle i pattedyr er Bcl-2 som er antiapoptotisk. Adaptorproteinet i pattedyr er Apaf-1 og derefter kommer effektor caspaserne C elegans Vertebrater De proapoptotiske: BAX og BAK aktiveres af BH3 only proteiner (Bid og Bim) Vis bl. a at Knock-out mus der mangler både Bax og Bak ikke kan undergå apoptose via indre mitochondrielle vej. Det betyder at mangel på vækstfaktorer ikke fører til apoptose i knock-out musene men kun i vild type musene Figure 12.20: Activation of Bak/Bax results in oligomerization and MOMP. 18

19 Bcl-2 er antiapoptotisk fordi det binder til aktivationsfaktoren Apaf så den ikke kan bringe procaspaserne sammen. Man kan så initiere apoptose ved at aktivere en hæmmer af Bcl-2, (Bad f.eks.) Altså Bcl-2 er antiapoptotisk Bad er proapoptotisk Bax og Bak som lavede mitochondrieporen er proapoptotiske Bim og Bid som aktiverer Bax og Bak er proapototiske f.eks. Bad Her ses mere detailleret hvordan de to proapoptoske BH3-only proteiner (Bim og Bad) og den antiapoptotiske Bcl-2 virker. 1. Bcl-2 binder Bim 2. Bad binder til Bcl-2 så den slipper Bim 3. Bim trigger Bak og Bax oligomeriseringen så poren i mitochondriet dannes Transkriptionsfaktoren p-53 øger transkriptionen af Bax men er også i stand til at aktivere Bak og Bax i cytosolen og at hæmme Bcl- 2 i cytosolen Figure 12.21: Proapoptotic functions of BH3-only Bcl-2 proteins. 19

20 12.12 Cytochrom C binder til apoptotic protease activating factor 1 (APAF- 1) som oligomeriserer og laver APOPTOSOMET der binder til Caspase recruitment domænet (CARD) domænet på Procaspase 9 som dimeriseres og aktiveres og derpå aktiverer aktivator caspaser Figure 12.22: The apoptosome Some proteins released upon MOMP block IAPs The mitochondrial intermembrane space proteins Smac and Omi antagonize the caspase-inhibitory activity of IAPs. Betydningen af dette er dårlig undersøgt 20

21 Men hvad kan så være opstrøms for de proapoptosiske proteiner? Det er et af hovedemnerne for forskningen i min gruppe. Celleskrumpning er et af de karakteristiske tegn på apoptose men er celleskrumpningen et signal til apoptose?? Hypotesen er : Skrumpning af cellen fungerer som initiator. Skrumpningen skyldes at cellen ikke længere kan holde sine K + og Cl - kanaler lukkede ved normalt cellevolumen Vi sammenligner f.eks. Multi Drug Resistente (MDR) kræftceller med ikke resistente kræftceller og giver dem et apoptose fremmende kemoterapeutisk stof Cisplatin. Cell volume ml water / g dry wt 4 Wt MDR 3 2 Post doc Kristian Poulsen hours after Cisplatin (5μM) 21

22 Vi kigger så på Induktion af Caspase 3 aktivitet 12 timer efter de har fået Cisplatin. Virker ikke når cellerne er resistente. Hvis man hæmmer den volumenfølsomme kloridkanal virker det heller ikke. Celler bliver bl.a resistente over for kemoterapi ved at nedregulere kloridkanalen Caspase 3 activity (% of control) EHR Wt EAT EHR/DAU Resistant EAT Specialeprojekt Emilie Cammilla Andersen 0 control 0 µm NS µm NS µm NS µm NS µm NS µm Cisplatin Celle skrumpning som signal for den apoptotiske vej. Vi har fundet to signalsekvenser der er involveret: 1. Rac-p38-p53- Bax- Cyto C- - Caspase 3- apoptotic stimuli Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts Friis et al. J. Physiol (2005). Vol.567.2, pp Inhibition of growth factor receptorshæmning af PKB/Akt Bcl-2 22

23 Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts Friis et al. J. Physiol (2005). Vol.567.2, pp P53 er en tumour supressor som inducerer apoptose i den syge celle. 50% af alle cancerceller har problemer med p53. Cancer involverer i høj grad fejl i kontrollen af apoptose. En del kendte carcinogener virker via at mutere p53. Det gælder f.eks. Benzopyrene som findes i cigaretrøg. Denne omsættes i leveren til et mutagent stof som fremkalder mutationer i p53. Et andet eksempel er aflatoxin som findes i muggent korn. Tumor fremkaldende virus virker ligeledes ofte ved at danne proteiner der hæmmer p53. 23

24 Hyperosmotic shock induces phosphorylation at Ser15 of the transcription factor p53 and translocation of pp53 to the nucleus P53 genomets vogter. P53 er en transkriptionsfaktor Den cellulære concentration af p53 stiger når der forekommer DNA skader, kontrollen er post-transkriptionel idet translationen af eksisterende mrna øges. Samtidig stabiliseres p53 også og holder længere. Ilt mangel kan også inducere p53 ligesom celleskrumpning kan P53 er en essentiel nødbremse i cellecyklus når DNA skader opstår, hvilket bevises af at p53 genet er muteret i op til halvdelen af alle kræfttilfælde Når det forhøjede p53 niveau har stoppet cellens cyklus får cellen tid til at rette skaderne, niveauet af p53 falder igen og cyklus fortsætter. Er skaderne for store startes apoptose (programmeret celledød bl a ved regulering af genekspression af Bcl-2 famillien) 24

25 De seks mest almindelige mutationer i p53, de gule er sidekæderne i disse Strukturen af p53 Hjertet af p53 Zn 2+ Arg 175 gly245 Arg 249 Arg 248 Arg 273 helix2 DNA Arg 282 Loop 1 Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts Friis et al. J. Physiol (2005). Vol.567.2, pp

26 Celle skrumpning som signal for den apoptotiske vej. Vi har fundet to signalsekvenser der er involveret: 1. Rac-p38-p53- Bax- Cyto C- - Caspase 3- apoptotic stimuli Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts Friis et al. J. Physiol (2005). Vol.567.2, pp Inhibition of growth factor receptors- PKB/Akt Bcl-2 Effects of osmotic stress on the activity of MAPKs and PDGFRβ mediated signal transduction in NIH-3T3 fibroblasts. Nielsen et al. Am J Physiol. 294: Cell shrinkage inhibits growth factor receptors and thus the antiapoptotic protein Bcl-2 Shrinkage Volume censor inhibited Growth factor receptors Ras PI3K Bcl-2 MEK Erk1/2 Akt/PKB 26

27 Cell shrinkage inhibits the sensitivity of the PDGFRβ dramatically Intensity, relative values Fosfo-PDGFRβ py857 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0, Time after Inkubationstider addition of PDGF-BB Isoton Sucrose Nielsen M-B, Christensen ST and Hoffmann EK. Am J. Physiol Cell shrinkage inhibits phophorylation of PKB (Akt) 1,2 1 p-akt relative scale 0,8 0,6 0,4 0,2 0 iso min (hyper) 27

28 Fra Vækstfaktorreceptoren over PI-3 kinasen og PKB (kaldet Akt) til hæmning af apoptose. PI-3 kinasen binder til phosphotyrosin på receptoren, den aktiveres og fosforylerer PI (4,5)P2 til PI(3,4,5)P3). Denne fungerer som docking site for en Phosphatidyl dependent kinase (PDK1) og for PKB som bliver aktiveret. PKB fosforylerer det proapoptotiske protein BAD som slipper de antiapoptotiske proteiner og derved virker antiapoptotisk og vækstfremmende Hvordan vækststimulering hæmmer apoptose 3 induktionsform for apoptose : manglen på overlevelsesfaktorer Ekstracellulære overlevelsesfaktorer hæmmer apoptose. Normalt hæmmer Bad Bcl-2. Når en overlevelsesfaktor sætter sig på receptoren stimuleres PI3 kinasen som stimulerer proteinkinase B(PKB). Den fosforylerer og inaktiverer Bad og Bcl-2 bliver aktiv og hæmmer apoptose 28

29 Naboceller konkurrerer om overlevelsesfaktorer. Dvs at ved stor celletæthed induceres apoptose Dette er vigtigt for at forhindre proliferation udover en ønsket tæthed, kaldes density-dependent inhibition of cell division. Target cellerne laver survival factors. Der er for mange nerveceller og de konkurerer hinanden ud med hensyn til survival facators. De der ikke får nok går i apoptose og derved tilpasses antallet at nerveceller til antallet af modtagerceller 29

30 12.14 The death receptor pathway of apoptosis can engage MOMP through the cleavage of the BH3- only protein Bid cross talk mellem indre og ydre vej Caspase-8, der er aktiveret via dødsreceptoren kan aktivere Bid. Bid aktiverer Bax og Bak to at lave mitochondrieporen MOMP, derved startes den mitochondrielle vej. Der er altså en vej fra den ydre apoptose vej, dødsreceptorvejen til den indre, mitochondrievejen over initiator caspase 8 til Bid Figure 12.24: Bid bridges the death receptor and mitochondrial pathways. 30

31 Mitochondrie ydre membran permeabilisering (MOMP) kan resultere også i Caspase uafhængig apoptose. Det skyldes, at der frigøres andre stoffer fra mitochondriet som DNase, og apoptose inducerende faktor (AIF) 12.16,12.17og bliver I ikke spurgt om Downloaded from: StudentConsult (on 10 October :31 AM) 2005 Elsevier Hvordan fjernes de apoptotiske celler? Fagocytose af makrofager el.a. Den apoptotiske celle nedregulerer nogle receptorer i overfladen der normalt signalerer spis mig ikke Den producerer lysophosphatidylcholin som gør at andre kan finde den, den dannes ved hjælp af en phospholipase. Den flipper phosphatidylserin fra den indre halvdel af membranen til den ydre halvdel 31

32 12.19 The clearance of apoptotic cells requires cellular interaction Fjernelsen af de apoptotiske celler. De spises af makrofager. Det vigstigste signal er at phosphatidyl serin der normalt findes i den indre halvdel af lipid dobbelt laget flipper ud til ydersiden og genkendes af makrofagerne.integriner på makrofagerne er involveret i denne genkendelse. Fospholipase A aktiveres under apoptose og laver lysophosphatidyl cholin som udskilles og tiltrækker makrofager En meget brugt apoptose test er, at det phosphatidylserin bindende protein Annexin V kobles til en fluorescerende probe, så man kan se, hvis der er phosphatidyl serin på ydersiden, der kan binde den fluorescerende probe Figure 12.29: Externalization of phosphatidylserine is an eat me signal 32

33 12.20 Apoptosis plays a role in diseases such as cancer I cancer er den apoptotiske proces blokeret. Den vigtige tumour supressor p53 er muteret i 50 % af alle cancerceller og er en vigtig inducer af apoptose. Mikkel og Christian lavede et spændende bachelorprojekt om p53 Ligeledes er Bcl-2 ofte opreguleret i cancerceller Transkriptionsfaktoren p-53 øger transkriptionen af Bax men er også i stand til at aktivere Bak og Bax i cytosolen og at hæmme Bcl-2 i cytosolen. 50% af alle cancerceller har fejl i p53. Feltet er et område hvor min gruppe kan tilbyde spændende specialer. 33

34 Virus infektioner og Cancer (12.21 spørges der ikke om) Visse virus laver antiapoptotiske proteiner af Bcl-2 familien. Nogle laver Caspase-8 blokere. Virus er parasitter og er derfor ikke interesseret i at værten dør. Cancer involverer i høj grad fejl i evnen til at gå i apoptose Når der mangler overlevelsesfaktorer og vækstfaktorer går celler normalt i apoptose, det forhindrer vævsudvidelse og cancervækst idet cellerne konkurrerer med naboen om væksfaktorerne Antiapoptotiske medlemmer af Bcl-2 familien er ofte opreguleret i cancer og hæmmere af Bcl-2 testes for anticancer effekter 34