(19) DANMARK (12) PATENTSKRIFT. Ch mix (11) DK B1. Patent- og Varemærkestyrelsen

Transkript

1 (19) DANMARK Ch mix (12) PATENTSKRIFT (11) DK B1 Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: A 61 K 39/108 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (83) Deponering af mikroorganismer. (30) Prioritet: NL (73) Patenthaver: Akzo N.V., Velperweg 76, 6824 BM Arnhem, Holland (72) Opfinder: Johannes Franciscus van den Bosch, Spoorstraat 9, 5831 CH Boxmeer, Holland (74) Fuldmægtig: Chas. Hude A/S, H.C. Andersens Boulevard 33, 1780 København V, Danmark (54) Benævnelse: Vaccine med E.coli septicaemia hos fjerkræ<b> (56) Fremdragne publikationer: Ingen (57) Sammendrag: Vaccine, som er effektive til beskyttelse af fjerkræ mod E.coli septicaemia, hvilken vaccine indeholder eller kan forårsage fremstillingen af fimbrier af F11-typen eller en immunogen sektion deraf, eller antistoffer mod disse.

2 1 Den foreliggende opfindelse angår en vaccine til beskyttelse af fjerkræ mod Escherichia coli (E.coli) septicaemia. 5 E.coli septicaemia eller colibacillosis er en sygdom, som generelt forekommer hos fjerkræ (såsom høns og kalkuner) og som er ansvarlig for betragtelige tab. Karakteristiske symptomer hos fugle med denne sygdom er luftsækbetændelse, pericarditis 10 og perihepatitis. De fleste undersøgelser inden for dette område viser, at mere end halvdelen af E.coli-stammerne, som der ses hos de syge fugle hører tir en af tre serotyper 01:K1, 02: K1 eller 078:K80. I USA ses serotypen 035 også hyppigt. Det antages generelt, at E.coli septicaemia er en sekundær infek- 15 tion, som kommer ind i legemet via åndedrætskanalen efter at den er blevet beskadet, f.eks. af vira, som forårsager åndedrætssygdomme eller af mycoplasmaer. Der kendes kun lidt til de virulensfaktorer, som spiller en 20 rolle ved pathogenesen af colibacillosis hos fjerkræ. E.colistammers virulensfaktorer, som spiller en rolle ved infektioner hos pattedyr, omfatter f.eks. vedhæftningsfimbrier, toksiner og jern-sekvestrerende mekanismer. 25 Der er blevet beskrevet mange forskellige vedhæftningsfimbrier, som generelt er meget værts-specifikke. Således er CFAfimbrier blevet mødt hos mennesker med "diarr e. K88-fimbrier hos smågrise med diarr, K99 hos får, kalve og smågrise med diarr og P-fimbrier (omfattende de af Fil-typen) hos menne- 30 sker med urinvejsinfektioner. Det har endvidere vist sig, at indgivelsen af visse typer vedhæftningsfimbrier i oprenset form som en vaccine, resulterede i en beskyttende immunreaktion hos den respektive dyretype. En lignende virulensfaktor har imidlertid ikke være identificeret for colibacillosis hos 35 fjerkræ. Der er nu blevet fundet en vaccine til beskyttelse af fjerkræ mod E.coli septicaemia, hvilken vaccine er som karakteriseret

3 2 ved, at den indeholder fimbrier af F11-typen eller en immunogen sektion deraf, eller organismer, hvori der er genetisk materiale, som koder for fremstillingen og eventuelt ekskretionen af fimbrierne eller en immunogen sektion deraf. Det har nærmere bestemt været muligt ved undersøgelser at vise, at E.coli-stammer, som er blevet isoleret fra colibacillosisangrebne hønsehjerter, fremstillede fimbrier, som var identiske med fimbrier af Fil-typen, som også forekommer i 10 E.coli-stammer, som forårsager urinvejsinfektioner hos mennesker. Det har været muligt serologisk at vise, at langt de fleste fugle med E.coli septicaemia er blevet inficeret med E.coli- 15 stammer, som indeholder fimbrier af Fil-typen. Sådanne fimbrier indeholder underenhedsproteiner med en tilsyneladende molekylvægt på 18,0 kd ifølge SOS-PAGE. 20 De kan fresmtilles af aviære vildtype-e.coli-stammer, som er blevet dyrket på faste agarmedier ved 37 C, men findes ikke hvis E.coli dyrkes i suppe. Optimal ekspression af 18 kd fimbrier finder sted, hvis bakterierne dyrkes på blodagarflader (base) (f.eks. fremstillet af Oxoid ). Medier som også er eg- 25 nede, er penassay-agarplader (Difcoe). Der dannes ikke nogen 18 kd fimbrier ved vækst ved 20 C: Allerede tidligere er F11-fimbrier blevet klonet ud fra en uropathogen vildtype-e.coli-stamme (de Ree, J.M. et al., FEMS 30 Microbiology Lett. 29, 91-97, 1985). Den fimbrie-frie E.coli K12-stamme AM1727 transformes af plasmidet ppil , som indeholder generne, der koder for F11-fimbrierne, og den transformerede stamme er i stand til at fremstille F11-fimbrier. F11-fimbrierne er nu blevet sammelignet med 18 kd fimbri- 35 erne, som er blevet oprenset ud fra E.coli-stamme CH4, der hører til 02:K1:H-serotypen, som hyppigt forekommer hos fugle med hensyn til de følgende parametre:

4 3 a. morfologi F11-fimbrierne og 18 kd-fimbrierne ser ud til at være identiske i elektronmikroskop: i begge tilfælde er fimbrierne ca. 1 gm' lange, og de har en diameter på ca. 7 nm, 5 b. molekylvægt. Der blev fundet en tilsyneladende molekylvægt på 18 ko for underenhederne af både F11- og 18 ko-fimbrierne ved hjælp af SDS-PAGE. c. immunokemisk specificitet. Ved en ELISA reagerer F11- og 18 kd-fimbrierne identisk med anti-fli-monoklone antistoffer, 10 som beskrevet af de Ree, J.M. et al., J.Clin.Microbiol. 24, , 1986 og ikke med monoklone antistoffer mod fimbrierne af typen F1A, F1C, F7, F72, F8, F9, F12 eller F13. d. aminosvresammensætning. Aminosyresammensætningen af 18 kel underenheden er i alt væsentligt identisk med sammensætnin- 15 gen af F11-underenheden (van Die, I. et al., i: D.L. Lark (udgiver), Proteincarbohydrate interactions in biological systems Academic press, London, side 39-46, 1986) (se tabel 1),

5 4 Tabel 1 Sammenligning af aminosvresammensætning af underenheder af F11- og 18 kd- fimbrierne 5 'Aminosyre F11 1 ) 18 kd 2 ) Asx 18 18,6 Thr 14 15,3 Ser 12 11,0 Glx 17 16,5 Gly 20 19,6 Ala 19 20,2 Val 13 12,2 Ile 6 5,8 Leu 10 10,3 Tyr 3 2,2 Phe 8 7,7 Lys 11 10,1 Arg 0 0,9 His 1 1,4 Met 1 Cys 2 Pro 6 6,6 Talt ) Beregnet på basis af sekvensen (se fig. 1) 2) Bestemt ved hjælp af SODIUM-systemet under anvendelse af en 25 ultrapac 8-søjle (LKB) efter hydrolyse i 6N Hdl. e. amino-terminalaminosyresekvens. Sekvensen af de første 17 aminosyrer i aminoenden af 18 kd-underenheden er identisk med den tilsvarende sekvens, som er kendt for Fil-underen- 30 heden (van Die, I. et al., 1986) - fig. 1 viser aminosyresekvensen af det samlede F11-underenhedsprotein. En faktisk molekylvægt på 16,4 kd kan beregnes ud fra sekvensen. Adhæsionsegenskaberne af P-fimbrier, ligesom F11, kan gøres 35 synlige ved mannoseresistent hæmagglutination af humane erythrocytter (MRHA). Denne MRHA kan vises ved blanding af E.colibakterier, som udtrykker nævnte P-fimbrier i tilstrækkelig mængder med humane erythrocytter ved tilstedeværelse af mannose.

6 5 Den minimale receptorstruktur, som var tilstrækkelig for adhærence af P.fimbrierne til de humane erythrocytter, blev identificeret som disaccharidet Galal -> 4Galp (Kållenius. G. et al. Lancet ii, 604-6, 1981). Kobling af dette disaccharid med 5 latexpartikler resulterer i et værktøj til specifikt at vise P-fimbrier på bakterier ved latexagglutination (de Man. P. et al., J.Clin.Microbiol. 25, 401-6, 1987). Det er på det sidste blevet vist, at F11-fimbrierne ikke i sig 10 selv, men specielle adhesiner (også kaldet "mindre komponenter") forbundet med fimbrierne er ansvarlige for adhæsionen (van Die, I. et al., Microbiol Pathogenesis 1, 51-56, 1986). Tabel 2 viser sammenhæng mellem ekspressionen af F11-fimbrier 15 og adhæsionskarakteristikaerne hos en uropathogen E.coli-stamme, en F11-fimbrie-producerende rekombinant klon og et antal E.coli-stammer, som er isoleret fra angrebne hjerter fra høns, som lider af colibacillosis, sammenlignes. Det kan ud fra tabellen konkluderes, at F11-fimbrierne hos E.coli, som er iso- 20 leret fra høns, genkender i det mindste den samme receptor som F11-fimbrierne hos human E.coli

7 6 Tabel 2 Ekspression af Fll-fimbrier, hæmaollutination oq P-receptor- genkendelse. Stammenumer (a) (Serotype) Ekspression af F11- fimbrier målt i Adhæsion målt i ELISA(b) Western(c) aftryk MRHAtest(d) P-receptor -teste) H291 (01:K1) > 4, AM AM1727/pPIL > 4, CH2 (078:K80) 3, CH4 (02:K1 > 4, CH5 (02:K1 2, CH6 (02:K1) > 4, CH7 (015:K14) - - _ - CH96 (078:K80) 3, CH139 (02:K1) < 4, (a) H291 er human E.coli, Fll-referencestamme C1976; AM1727/ ppil er en F11-fimbrieproducerende rekombinant klon fra den fimbrie-manglende K12-stamme AM1727, CH-numre er E.coli-stammer, som er isoleret fra høns, som lider af colibacillosis (b) Hel bakterie-elisa med anti-fil-serum, 10 log-titere defineret som den højste serumfortynding med en A540-værdi på i det mindste 2 gange baggrundsværdien. (c) Western-aftryk af ubehandlet fimbrie-præparat med anti- F11-serum. (d) Mannoseresistent hæaogglutination med humane erythorytter. (e) Agglutination af latexpartikler overtrukket med Galal -> 4Galp. Betydning af symboler: -: ingen reaktivitet i ovenfor nævnte test, + til ++++: stigende reaktivitetsgrader i ovenfor nævnte test. Vaccinen ifølge opfindelsen kan også sammen med eller i stedet for F11-fimbrier indeholde immunogene sketioner af F11-fimbri-

8 7 er. Sådanne immunogene sektioner kan, f.eks. forstås, at betyde 18 k0-underenheder, aggregater deraf eller fragmenter deraf eller adhesiner, som er karakteristiske for F11-fimbrier, eller aggregater eller fragment deraf. Et sådant fragment af en 5 18 kd-underenhed eller et F11-adhesin af den type, som der refereres til, kan være et polypeptid, som indeholder en eller flere epitoper, som er i stand til at stimulere beskyttende antistoffer imod E.coli af Fil-typen hos fjerkræ. 10 Egnede polypeptidfragmenter af 18 kd-underenheder eller F11- adhesiner kan f.eks. findes ved hjælp af teknikker, som er kendte per se. En sådan teknik er blevet beskrevet af T.P. Hopp og K.R. Woods (Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences; Proc.Natl.Acad.Sci. 78, , 1981) ved bestemmelse af den gennemsnitlige hydrofilicitet af på hinanden følgende segmenter af aminosyrekæden. Resultaterne fra en sådan bestemmelse er vist i fig. 2. I denne figur er hydrofilicitetsprofilen af F11-underenheden baseret på den kendte aminosyresekvens vist. Den optegnede profil der- 20 på viser en progressiv vægtet gennemsnitsværdi af hydrofiliciteten over hver 7 aminosyrer. Regionerne med den mest udtalte hydrofilicitet anses forat være de regioner, som sandsynligvis udgør antigene determinanter. I fig. 2 er disse regioner vist ved hjælp af sorte blokke, og de svarer til aminosyresegemen- 25 terne: Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Ala-Asp-Gln-Ser-Ile Ala-Gly-Gly-Thr-Ser-Lys-Pro-Met-Asp-Leu-Asp-Ile-Glu Lys-Gln-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Asn-Gly-Lys-Val-Gln Thr-Gly-Gln-Ala-Glu-Glu-Leu-Ala-Thr Pro-Leu-Lys-Asp-Gly-Asp-Asn-Val Leu-Val-Lys-Lys-Ala-Asn-Gly. Det må forventes, at de antigene determinanter hos 18 kd-un- 35 derenderne F11-fimbrierne også er lokaliseret i disse regioner. Der blev nået tilsvarende konklusioner af I. van Die, W. Hoekstra og H. Bergmans (Microbiol. Pathogenesis 3, , 1987) for F11-fimbrierne under anvendelse af den samme model.

9 Ell( B1 Egnede immunokemisk aktive polypeptidfragmenter af 18 ko-underenheder eller F11-adhesiner kan også findes ved hjælp af den i patentansøgningen WO 84/03506 beskrevne fremgangsmåde - den såkaldte pep-scanmetode, hvor en række delvis overlappende 5 polypeptider, som svarer til delvise sekvenser af proteinet som betragtes, syntetiseres og deres reaktivitet med antistoffer undersøges. For at forøge den immunogene natur, kan et sådant polypeptid- 10 fragment eventuelt være bundet til en bærer. F11-fimbrierne eller immunogene sektioner deraf kan fremstilles ved at separere fimbrierne på en kendt måde fra en vildtype-e.coli-stamme af Fil-typen eller et derivat deraf og even- 15 tuelt isolere en immunogen sektion deraf. F11-fimbrierne eller immunogene sektioner deraf kan også fremstilles ved at gå ud fra celler, som er blevet transformeret med rekombinant DNA som indeholder det genetiske materiale, 20 der koder for fremstillingen og eventuelt ekskretion af F11- fimbrierne eller immunogene sektioner deraf. Det er endvidere muligt, især i tilfældet med mindre polypeptidfragmenter, at fremstille dem fuldstændigt syntetisk ved 25 hjælp af f.eks. Merrifield-metoden, hvor der benyttes en fast fase. Vaccinen ifølge opfindelsen kan også indeholde en organisme, hvori der er genetisk materiale, som koder for fremstillingen 30 og/eller udskillelsen af F.fimbrier eller en immunogen sektion deraf. Dette vil fortrinsvis involvere apatogene organismer. 35 Disse organismer er ifølge deres natur i stand til at frem- stille antigent materiale eller indeholder rekombinant polynu- kleotid, som koder for det ønskede antigene materiale.

10 9 Der kan anvendes vira eller bakterier, inter alfa, som sådanne rekombinante organismer. De rekombinante organismer kan i sig selv være i stand til at fremstille det ønskede antigene materiele og eventuelt udskille det. 5 Vaccinen ifølge opfindelsen indgives fortrinsvis parenteralt, f.eks. subkutant eller intramuskulært. Vaccinen kan indgives på denne måde både til den aktive immunisering af de vaccineree fugle og til æglæggende fugle til den passive immunisering af 10 afkommet deraf. Hos immuniserede æglæggende fugle, vil de antistoffer, som er dannet i dem, selv sagt indføres i deres æg's blommer og dermed efterfølgende i de udklækkede kyllinger. 15 Vaccinen ifølge opfindelsen kan også indgives oralt, intranasalt eller ved inhalering af et aerosol - i dette tilfælde kan vaccinen fortrinsvis indeholde levende apatogene organismer, hvori der er genetisk materiale, som koder for fremstillingen og udskillelsen af F11-fimbrier eller immunogene sektioner 20 deraf. En vaccine ifølge opfindelsen kan fremstilles ved først at tilvejebringe proteiner eller polypeptider hidrørende derfra, eller fremstillingen af F11-fimbrier, eller mikroorganismer 25 indeholdende disse F11-fimbrier, proteiner eller polypeptider som ovenfor beskrevet. Det sidstnævnte tilfælde, hvor fimbrierne opnås ud fra E.coli er den mest foretrukne udførelsesform. Efter dyrkning af 30 E.coli med F11-fimbrier adskilles sidstnævnte generelt fra bakterierne, f.eks. ved mekanisk adskillelse (forskydning) og/ eller varme, og fjernelse af cellerne (ved centrifugering og/ eller (ultra)-filtrering). Derefter kan fimbrierne yderligere oprenses ved fjernelse af urenheder fra dyrkningsmediet og/ 35 eller bakteriemembranen, f.eks. ved ultrafiltrering, søjlekromatografi eller specifik præcipitation (under anvendelse af ammoniumsulfat eller andre salte, eller ved ændring af ph-værdien til fimbriernes isoelektriske punkt).

11 1 0 Til parenteral vaccination, indeholdes den aktive bestanddel generelt i en vandig opløsning eller suspension, ofte blandet med andre bestanddele for at forøge aktiviteten eller holdbarheden, såsom salte, formalin, ph-puffere, emulgeringsmidler og 5 hjælpestoffer til forbedring af immunreaktionen. Egnede hjælpestoffer er f.eks. mineralolier, muramyldipeptid, aluminiumhydroxid, saponin, polyanioner og amfipatiske stoffer. Både sammensætningen af vaccinen og vaccineringssystemet kan 10 varieres og afhænger af fugletypen, som skal beskyttes, alderen og vægten af fuglen, den ønskede beskyttelsesvarighed, administrationsmetoden og spørgsmålet om hvorvidt aktiv immunisering eller passiv immunisering ved hjælp af moderantistoffer ønskes. Den effektive mængde af den aktive komponent i vacci- 15 nen er ca pg pr. dosis til parenteral vaccination. Den ovenfor beskrevne aktive immunisering over for E.coli med F11-fimbrier vil primært anvendes som en beskyttende behandling af sunde fugle. Det er ikke nødvendigt at nævne, at fugle 20 allerede inficeret med E.coli med F11-fimbrier hensigtsmæssigt kan behandles med antistoffer rettet mod F11-fimbrier, eller sektioner eller aggregater deraf. Eksempel 1 Oprensning af fimbrier For at oprense fimbrier blev tre vildtype-e.coli-stammer dyrket en nat på blodagarbaseplader (Oxoid ) ved 37 C. Til dette formål blev der anvendt CH2(078:K80:H4)-, CH4(02:K1:H-)- og 30 CH6(01:Kl:H-)-E.coli-stammer, som var isoleret fra angrebne hjerter fra høns, som lider af colibacillosis. Fll-fimbrieklonen AM1727 ppil (De Ree et al., 1985) blev også dyrket i 16 timer i en Biostate-fermentor (Braun) i en "Brain Heart Infusion"-suppe indeholdende 50 µg/ml ampicilin ved en kon- 35 stans temperatur på 37 C, en ph-værdi på 7,4 og en oxygenmætning på ca. 40%. Bakterierne blev høstet i 10 mm Tris-HC1-puffer med en ph-værdi på 7,5.

12 1 1 Fimbrierne blev frigivet fra bakterierne ved enten at behandle. bakterierne 15 gange på hinanden følgende i 1 minut på is i en Sorval-Omnimixer, eller opvarmning af bakterierne i 15 minutter ved 65 C eller underkaste bakterierne en kombination af de 5 ovenfor nævnte behandlinger. Bakterien blev derefter fjernet ved centrifugering og filtrering, den ubehandlede fimbrieopløsning blev koncentreret og fimbrierne blev intensitivt vasket i en Amicon-clle udstyret 10 med YM 100 filter. Fimbrierne blev derefter oprenset, f.eks. ved hjælp af en i nogen grad modificeret metode, som beskrevet af Korhonen et al. (Infect. Immun. 27, , 1980), som består i at præci- 15 pitere fimbrierne med ammoniumsulfat, opløse dem med natriumdeoxycholat og centrifugere dem i en saccharosegradient. De på denne måde oprensede fimbriepræparater udviste identiske fimbriestrukturer på elektronmikroskop (som beskrevet af Van 20 den Bosch, J.F. et al., Infect, Immun. 29, , 1980). Alle fimbrie-præparater udviste et enkelt bånd ved 18 kd i SOS-PAGE (som beskrevet af Lugtenberg, B. et al., FEBS Lett. 58, , 1975) og ved Western-aftryk (som beskrevet af Muilerman, H.G. et al., Anal. Biochem. 120, 46-51, 1982) med al- 25 le antisera rejst mod de forskellige fimbrier. Eksempel 2 A. Der blev fremstillet en vaccine, som indeholder fimbrier 30 ifølge opfindelsen som en vand-i-olie-emulsion baseret på en minralolie (lav-viskositet-paraffin) med polysorbat 80 og sorbitanmonooleat som emulgeringsmidler. B. Der blev fremstillet en vaccine som i 2A, der indeholdt 50 P9/m1 F11-fimbrier oprenset ud fra vildtype-ch4(02:k1:h-)- 35 E.coli-stammen. C. Der blev fremstillet en vaccine som i 2A, der indeholdt 50 ug/m1 F11-fimbrier, som var oprenset ud fra klonen AM1727- ppil Prøver af denne klon blev deponeret hos Collec-

13 tion Nationale de Cultures de Microorganismes of the Pasteur Institute i Paris under nr den 19. oktober Eksempel 3 Aktiv immunisering Til forsøg med aktiv immunisering blev en vaccine, som var fremstillet som i eksempel 2, intramuskulært injiceret i fug- 10 tene, som blev undersøgt, og udviklingen af specifikke antifimbrieserumantistoftitere blev bestemt ved hjælp af en ELISA. A. ELISA Til ELISA-testen blev PVC-mikrotitereplader inkuberet i en 15 nat ved stuetemperatur med 100 Ml af en oprenset fimbrieopløsning, der var fremstillet som i eksempel 1, indeholdende 2,5 gg fimbrie pr. ml 0,04 M PBS (ph-værdi 7,2) i hver brønd. 20 Pladerne blev derefter behandlet ved at inkubere dem i 20 minutter ved 37 C med 200 Al af en 5% BSA-opløsning i PBS hver brønd, vask af dem med vand og tørring i luft. Anti-fimbriesera blev undersøgt ved inkubering af 100 gl af 25 rækkefortyndinger af serumet i en puffer (ph-værdi 7,4, 0,2 M Na2HPO4, 0,2 M NaC1, 0,1% BSA og 0,05% Tween 80) i hver brønd i 1 time ved 37 C. Efter vask blev pladerne inkuberet i 30 minutter med 100 gl 30 fortyndet konjugat (kanin anti-kylling IgG/P0 (H + 1), Nor- dic) i hver brønd og derefter vasket 1 gang til. Antistofaktiviteten blev bestemt kolorimetrisk ved til hver brønd at sætte 100 pl af en enzymsubstratopløsning (inde- 35 holdende 15 ml destilleret vand, 1,5 ml af en 0,14% urinstofperoxidopløsning i natriumacetat/citronsyrepuffer (phværdi 5,5) og 0,2 ml af en 0,6% TMB-opløsning i DMSO).

14 13 5 Den enzymatiske reaktion blev udført i mørke og standset 10 minutter efter ved at tilsætte 50 gl 4 N H2SO4 pr. brønd, og absorptionen blev derefter målt ved 450 nm (A450) i en Microelisa Reader (Organon Teknika). Den første serumfortynding var 1:50. Baggrunden blev målt ved hver plade ved inkorporering af serum, som var opnået før vaccinering og fortynding i for- 10 holdet 1:50 i det mindste i 8 brønde. Antistoftiterne blev defineret som den maksimale serumfortyding, som gav en A450 på mindst 1,15 gange den gennemsnitlige A450-baggrund. B. Vaccinationer af SPF-slaqtekvllinger 15 6-uger gamle SPF-slagtekyllinger (Gezondheidsdienst voor Pluimvee (Fjerkræsundhedsservice), Doorn, Holland) blev intramuskulært injiceret med 1 ml vaccine, som fremstillet i eksempel uger senere blev der indgivet en boosterinjektion under anvendelse af det samme materiale. Resulta- 20 terne er vist i tabel

15 DK B1 14 Tabel 3 Serumantistoffrem q efter vaccination af 6 uger gamle slagtekyllinger, logaritmer af ELISA-titere Uger efter første injektion Kyllingenr * h <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 C*) Cr) (.. «Ct d' CV CO Ni g:t Cr.. N. 4,4 4,4 >4,7 >4,7 >4,7 4,1 4,1 4,7 >4,7 >4,7 4,7 4,7 4,7 >4,7 >4,7 15 * Boosterinjektion C. Vaccination af slagtekyllingavlshøner To grupper, som hver bestod af 8 slagtekyllingavishoner, som var 20 uger gamle (Euribrid, Boxmeer, Holland) blev instramuskulært injiceret med 1 ml af vaccinen, som fremstil- 20 let i henholdsvis eksempel 2B og 2C. Seks uger efter den første injektion, blev der givet en boosterinjektion under anvendelse af de samme respektive vacciner. Som det ses i tabel 4, blev der fundet en høj antistofproduktion i serumet hos slagtekyllingavlhønerne ledsaget af overførslen af antistoffer til æggeblommer og serum hos udrugede kyllinger. Tabel 4 Antistofproduktion efter vaccination af 20 uger gamle slagtekyllingavishøner: gennemsnitlig logaritme af ELISA-titere (± S0) i serum hos avlshøner, æggeblomme og serum hos udrugede kyllinger.

16 15 Fimbrier oprenrenset fra stamme Serum fra slagtekyllingavishøner 1) Æggeblomme 2 ) Serum fra udrugede kyllinger 3 ) CH4(02:K1:H-) AM1727-pPIL ,58±0,50 5,48±0,21 5,29±0,39 5,14±0,47 3,98±0,27 4,16±0,39 1) Serumprøver udtaget 10 uger efter første injektion 2) Gennemsnit af 8 æg taget 11 uger efter første injektion 3) Gennemsnit af 5 uger gamle kyllinger udruget fra æg, som er taget 12 uger efter den første injektion. Der blev opnået identiske resultater for vaccination med F11- fimbrierne af CH4-stammen og af klonen AM1727-pPIL Fuldstændig krydsreaktion mellem de to præparater blev fundet ved et ELISA-forsøg. Eksempel 4 Beskyttelse af slagtekyllinger ved vaccination af avlshøner Slagtekyllingavishoner blev vaccineret med F11-fimbrier, som var oprenset ud fra klonen AM1727-pPIL (se eksempel 3C). Slagtekyllinger, som var udruget fra disse vaccinerede avlshøner og fra ikke-vaccinerede kontrolhøner, blev udfordret ved en alder på 3 uger ved injektion af 0,2 ml bakteriesuspensioner i den højre bageste brystluftsæk. De anvendte bakteriestammer var alle isoleret fra med colibacillosis angrebne hønsehjerter. Bakterier blev dyrket natten over på blodagarbaseplader (Oxoid ), suspenderet i PBS til den passende koncentration. Slagtekyllingerne blev anbragt i isolatorer med reduceret tryk med føde og vand ad libitum. Som vist i tabel 5, blev der overført god beskyttelse fra vac- cinerede avlshøner til de udrugede slagtekyllinger. Sammenlig- net med de ikke-vaccinerede kontroldyr var beskyttelseseffek-

17 tiviteten for alle stammer taget sammen ved vaccination med F11-fimbrier 85%. Det er slående, at beskyttelsen blev overført også over for 5 udfordring med stamme CH7, som tilsyneladende ikke udtrykker F11-fimbrier in vitro. Det kan være muligt, at denne stamme faktisk udtrykker F11-fimbrier in vivo, men at in vitroekspressionen er under de anvendte metoders påvisningsgrænse. 10 Tabel 5 Beskyttelse mod E.coli-udfordring af slagtekyllinger udruget fra avlshaner, som var vaccineret med F11-fimbrier. Udfordring med stamme 1) CH2 CH4 CH5 CH6 CH7 CH245 Vaccine 078:K80 02:K1 02:K1 01:K1 015:K14 035:K- Alle Fll + F11 + Fll + Fll + Fll - Fll + stem- (5x10 6 ) (2x10 6 ) ( ) (5x10 6 ) (10 6 ) (5x10 6) mer Fll 2/10 2 ) 2/10 1/10 0/10 0/10 1/10 6/10 3 ) Kontrol 6/10 6/10 10/10 5/10 7/10 5/10 39/60 3 ),.. 1) For hver stammeserostype er F11-ekspression og udfordringsdosis vist 2) Antal døde kyllinger i løbet af 7 dage efter udfordring/ ialt udfordret 3) Chi-square test: P < 0,0001 Eksempel 5 Beskyttelse af slagtekyllinger ved passiv immunisering Der blev fremstillet antisera ved at inpode kaniner med oprenset F11-fimbrier og derefter inaktivering i 30 minutter ved 56 C. 1 ml af dette ufortyndede Fil-antiserum blev injiceret intravenøst i 3 uger gamle slagtekyllinger (Euribrid, Boxmeer, Holland).

18 17 I løbet af 1 time efter intravenøs injektion med antiserum, blev kyllingerne inficeret ved injektion af 0,2 ml bakteriesuspension i den højre bageste brystluftsæk. Som en kontrol blev kyllinger, som ikke havde fået indgivet antiserum, infi- 5 ceret med den samme bakteriedosis. De anvendte bakteriestammer var alle isolerede fra med colibacillosis-angrebne kyllingehjerter. Bakterierne blev dyrket i 1 nat på blodagarbaseplader (Oxoidø), suspenderet i PBS og fortyndet til den passende koncentration. 1 0 Kyllingerne blev holdt i isolatorer med reduceret tryk med føde og vand ad libitum. Ud fra disse forsøg var det indlysende, at F11-fimbrieantise- 15 rum giver god beskyttelse for slagtekyllinger over for 5 af de 6 E.coli-stammer, som blev anvendt ved infektionen (tabel 6). Beskyttelsen over for infektion med CH6-stammen var forholdsvis lav, selv om denne stamme producerer F11-fimbrier. Denne stamme fremstiller muligvis ud over F11-fimbrier også en eller 20 flere andre kraftige virulensfaktorer, men det er også muligt at antistofniveauet simpelthen var for lavt til at tilvejebringe beskyttelse mod denne bakteriestamme. Et slående træk, er at der blev opnået betragtelig beskyttelse 25 mod infektion, selv med CH7-stammen, som ikke ser ud til at fremstille nogen F11-fimbrier selv. Denne stamme fremstiller muligvis faktisk F11-fimbrier in vivo, men F11-fimbrieproduktionen in vitro er for lav den anvendte påvisningsmetode

19 Tabel 6 Beskyttelse af slagtekyllinger mod E.coli-infektion ved passiv immunisering med Fil-fimbrieantiserum Infektion med stamme Nr. Serotype Antal kyllinger. Anti-F11 døde i løbet af Dosis antiserum 7 dage efter in- P<0,05* - indgivet fektion/ialt CH2 CH2 078:K80:H4:F11+ 5x10 6 2/17 5x /17 CH5 02:K1:H7:F /8 CH /9 CH6 CH6 01:K1 : H-:F / /29 CH7 CH7 015:K14:H10:F11-2x10 6 2x10 6 1/8 6/9 CH :K-:H?:F11+ 5x10 6 2/17 CH245 5x /19 * Chi-squaretest

20 19 P a t e n t k r a v. 1. Vaccine til beskyttelse af fjerkræ mod E.coli septicaemia, 5 kendetegnet ved, at vaccinen indeholder fimbrier af Fil-typen eller en immunogen sektion deraf, eller organismer, hvori der er genetisk materiale, som koder for fremstillingen og eventuelt ekskretionen af fimbrierne eller en immunogen sektion deraf Vaccine ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at vaccinen indeholder som den nævnte immunogene sektion et immunogent polypeptid med en aminosyresekvens, som svarer til en sektion af aminosyresekvensen af F11-fimbrie-underenhedspro- 15 teinet. 3. Vaccine ifølge kravleller 2, k e n d e t e g n e t ved, at vaccinen også indeholder et hjælpestof Middel til beskyttelse af fjerkræ mod E.coli septicaemia, kendetegnet ved, at vaccinen indeholder antistoffer mod fimbrier af F11-typen eller sektioner eller aggregater deraf Anvendelse af fimbrier af Fil-typen, eller en immunogen sektion deraf, eller organismer, hvori der er genetisk materiale som koder for fremstillingen og eventuelt ekskretion af fimbrierne eller en immonogen sektion deraf til fremstilling af en vaccine, som er effektiv til beskyttelse af fjerkræ mod 30 E.coli septicaemia. 35

21 Aminosyresekvens af F11-underenheder 1 Ala Pro Thr /le Pro Gin Giv Gln Gky Lys Val Thr Phe Asn Giv 16 Thr Val Val Asp Ala Pro Cys Ser Ile Ser Gin Lys Ser Ala Asp - 31 Gin Ser Ile Asp Phe Gly Gin Leu Ser Lys Ser Phe Leu Glu Ala 46 Gly. Gly Thr Ser Lys Pro Met Asp Leu Asp Ile Glu Leu Val Asn 61 Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Gin Gly Gln Ala Ala Lys Asn Gly 76 Lys Val 'Gin Leu Ser Phe Thr Gly Pro Glu Val Thr Gly Gin Ala. 91 Glu Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ile Val Val 106 Gin Ala Ala Gly Lys Asn Val Ser Phe Asp Gly Thr Ala Gly Asp 121 Ala Tyr Pro Leu Lys Asp Gly Asp Asn Val Leu His Tyr Thr Ala 136 Leu Val Lys Lys Ala Asn Gly Gly Thr Val Ser Glu Gly Ala Phe Ser Ala.Val Ala Thr Phe Asn Leu Ser Tyr Gin

22 DK B 1 FIGUR SP Aminosyreindex