Fremstilling rekombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor i. Escherichiu coli. NMR spektroskopiske N-terminalt modificerede varianter af proteinet.

Størrelse: px
Starte visningen fra side:

Download "Fremstilling rekombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor i. Escherichiu coli. NMR spektroskopiske N-terminalt modificerede varianter af proteinet."

Transkript

1 Fremstilling af rekombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor i Escherichiu coli. NMR spektroskopiske studier af N-terminalt modificerede varianter af proteinet. CONNI LAURITZEN Roskilde! Universitetscenter hstitnt for og Kemi

2 Denne afhandling er et led i opfyldelsen af kravene ti1 at opnå den Naturvidenskabelige Ph.D grad. Projektets eksperimentelle arbejde. er udfort ved Institut for Biologi og Kemi ved Roskilde Universitetscenter under vejledning af lektor Ole Skovgaard, lektor Poul Erik Hansen og lektor Erik Tiichsen. Det har vaxet en stor udfordring med dette tvsxfaglige projekt, at vsere med ti1 at opdyrke grznsefladen mellem to af instituttets fagområder, molekylarbiologi og proteinkemi. Det har givet mig et bredt og meget praktisk orienteret kendskab ti1 mange discipliner, hvilket er en stor fordel for mig i min nuvzrende stilling ved Unizyme Laboratories. Jeg vi1 gerne takke alle kollegaer og studerende jeg har.-varet i kontakt med i studietiden. En saxlig tak skal rettes ti1 Ole, Erik og Poul Erik for kompetent og inspirerende vejledning. Ph.D studiet blev stottet af et stipendium fra Roskilde Universitetscenter samt af forbrugsmidler fra Carlsberg Fondet. December, 1995 Conni Lauritzen

3 Indhold Summary side DEL1 Kapitel 1. Introduktion og sammendrag Bovine pancreatic trypsin inhibitor Rekombinant protein Målsztning E. coli ekspressionssystemer Sammendrag DEL 2. Aktuelle studier Kapitel 2. Ekspression af BPTI i T7 RNA polymerase/promoter system og A P, system... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... Vektorer og bakteriestammer... Mutagenese og DNA analyse... Konstruktion af BPTI ekspressionsplasmider... Ekspression og celleekstrakter... Protein analyser... Resultater... Ekspression af BPTI i T7 RNA polymeraselpromoter systemet... Ekspression af BPTI i T7 system... Diskussion... Mutagenese

4 Ekspression i T7 system... Ekspression i h P, system... Kapitel 3. Ekspression af BPTI i MBP fusions system... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... Plasmidkonstruktioner... Ekspression og oprensning af MBP-BPTI fusionsprotein... Protein analyser... Resultater... Plasmidkonstruktioner for MBP-BPTI fusion... Ekspression af MBP-BPTI... Diskussion... Udbytte af MBP-BPTI... Amylose affinitetskromatografi... Andre BPTI ekspressionssystemer... Kapitel 4. Faktor X, kloning af MBP-BPTI og cathepsin C trimming af N-terminalt forlznget BPTI... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... FX, khning... N-terminal trimning... Protein analyser og proteinaprensning... NMR analyser... Resultater... FX, kloning af MBP-BPTI fra pruc FX, khning af MBP-BPTI fra pruc

5 Cathepsin C trimning af N-terminalt forhenget BPTI... Oprensning og udbytte... Diskussion... Faktor X,... Cathepsin C... Kapitel 5. Karakterisering af N-terminalt modiftcerede BPTI specier ved NMR spektroskopi... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... Protein... NMR analyser... Hydrogen udvekslingshastigheder... Titrering... Kalorimetri... Resultater... Stabiliteten af N-terminalt modificerede varianter af BPTI.. Saltbro mellem C- og N-terminal... Struktur af N-terminalt modificeret BPTI... Diskussion... Saltbro og stabilitet... Hydrogen udveksling... Struktur... REFERENCER DEL 3 Publikationer i relation til afhandling

6 snmmary The present thesis entitled Generation of recombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inbibitor in Escherichia coli. NMR spectroscopic investigations of N- terminally modified analogues of the protein. 1s submitted to Roskilde University in preparation for obtaining the Ph.D degree. All experiments were carried out at Institute of Life Sciences and Chemistry at Roskilde University under supervision of the associate professors, Ole Skovgaard, Erik Tilchsen, and Poul Erik Hansen. The first part of the thesis is a short introduction to the bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). BPTI is a small, globular protein consisting of 58 amino acid residues in one polypeptide chain. The exceptionally high stabilhy, high solubility and tractable size of BPTI makes it a convenient model system for various struttural and physicochemical studies. The aim of this project was to extend and impröve the use of BPTI as a model protein for NMR spectroscopy. If BPTI could be produced as a recombinant protein in a heterologous expression system, it would be possible to engineer BPTI variants, and generate isotopically labeled or enrithed BPTI. For these reasons 1 started the development of a suitable expression system for BPTI. Moreover, the first part covers the general considerations connected to the development of an expression system for BPTI. From experience, it was obvious to choose E. coli as the host organisme. However, many problems can arise when using systems based on this organisme, which includes misfolding, unstability, insolubility, incorrect N-terminal sequence ett (reviewed by Gold, 1990). The summary of the thesis in danish is also placed in the first part. The setond part, with chapters 2-5, covers the experimental work. Chapter 2 describes the preliminary experiments with the direct expression of the BPTI gene for accumulation of the product in the E. coli cytoplasm. A methionine start codan and a sequence for a short N-terminal extension peptide was added to the BPTI gene. Methionine and the extension peptide was planned to be removed from the protein product by the exopeptidase, cathepsin C (Dalboge et al., 1987). BPTI, itself, is 5

7 protected against cathepsin C digestion by its N-terminal sequence. The gene construction was placed under the control of a strong, regulated T7 RNA polymerase/promoter system (Tabor and Richardson, 1985). In subsequent experiments, a sequence encoding the OmpA signal peptide was added to the gene construction in order to get the product secreted to the periplasm. In a further attempt, the OmpA-BPTI construction was placed under the control of another strong promoter, X P,. The best results was obtained with the last mentioned construction. In expression experiments, up to mg BPTUliter of culture was measured in the total cell extratts. However, this was not satisfactory. For NMR studies of BPTI variants, lo-100 mg of the protein should be available, conveniently produced with standard laboratory facilities. Much better results were obtained with the expression system that were finally put together as described in chapter 3. Here, a vector carrying a strong hybrid promoter, P,,, regulated by the lat operator/repressor system, was used for the expression of BPTI fused to the C-terminal of an E. coli protein - the maltose-binding protein (MBP) (GUI et al., 1988; Maina et al., 1988). The fusion protein was secreted to the periplasm by the MBP signalpeptide, and here the product became fully stable. The MBP part could be used for purification of MBP-BPTI by affhrity chromatography on an amylose matrix. The yield of active BPTI fused to MBP was up to 10 mg/liter of culture. Separation of the fusion partners was prepared by insertion of the target sequence for the specific endopeptidase, factor X, (FXa) (Nagai and Thogersen, 1987) in the linking sequence and with the site of cleavage directly fused to the BPTI N-terminal arginine residue. In practice, the cleavage site had limited accessibility for FX,, and afterwards, results from NMR investigations suggested that this was due to ion-dipole interactions between the BPTI C-terminal carboxyl group and groups on the target sequence. Instead, the treatment of this MBP-BPTI fusion construction with FX, led to off-target cleavage at a somewhat homologous sequence that, by coincidence, was placed 6 residues upstream of the correct site, and so the major products was BPTI N- terminally extended with 5 or 6 residues. Experiments with cathepsin C treatment of these forms confirmed that cathepsin C is perfect for removal of N-terminal extensions 6

8 from BPTI. Treatment with FX, and cathepsin C is described in chapter 4. Finally, a new construction was created with the FX, target sequence separated from BPTI s Arg1 by a short spacing sequence designed for removal by cathepsin C. The resulting MBP-BPTI fusion protein was effectively cleaved by FX, with strongly reduced amounts of peptidase. Likewise, cathepsin C trimming was effectively carried out with small amounts of enzyme. > 98 % pure BPTI with WT-BPTI sequence could be obtained from this system in yields of 3-6 mg/liter of culture. Through the development of the expression system and the experiments with FX, and cathepsin C treatment, a whole series of N-terminally extended variants of BPTI was obtained. These variants were found very interesting. Previously, a salt bridge interaction between the chain termini had been found by Brown et al. (1978), and comparative studies of a chemically transaminated form of BPTI and the WT-BPTI had been used to determine the influence of the salt bridge on structure and stabilhy. N- terminal extension was an other way to alter or prohibit the salt bridge interaction between the BPTI N- and C-terminal, and the contribution of the salt bridge to the stability could be reinvestigated. The N-terminally extended forms of BPTI were studied by NMR spectroscopy, and the results are described in chapter 5. As a supplement, studies on a series of N-terminally mmcated forms, created by a team from Novo Nordisk, were carried out in collaboration with this team. Some of the results from experiments done by me is included in chapter 5. The extended forms were BPTI N-terminally extended with l-, 4-, S- and 6 residues. The truncated forms lack Arg1 and Pro2 and have different amino acid substitutions in addition. Effects on the structure of the variants compared to WT-BPTI were judged from changes in chemical shifts in 1D and 2D H NMR spectra. The stability of the variants were examined by amide proton exchange rates and Differential Scanning Calorimetry. Furthermore, ph titration effects on the C-terminal Ala 58 H8 chemical shift were used to indicate salt bridge interactions between the N- and C- terminal when present. NMR spectra showed a presesved overall structure of the BPTI parent protein in the extended and truncated species. Changes were lotal and in the region of the termini.

9 An important and remarkeble result was obtained for l-bpti (BPTI extended with one arginine). A salt bridge clearly is fornred in l-bpti at neutral ph, and the two tonformations have indistingueshable stabilities and dynamits. Results for the remaining extended forms and the truncated forms showed structures without salt bridge interactions, and with slightly or highly decreased stabilhy compared to WT-BPTI. The energy contribution from the salt bridge interaction was previously estimated as kcabmol from amide proton exchange data and titration data (Brown et al., 1978). Based on the present data for the extended and truncated forms, it is most likely, that the corresponding estimate for 4-BPTI represents the salt bridge, and the value was here 0.6 kcallmol. This disagreement is discussed in chapter 5. The stabilhy of the truncated forms are considerably reduced compared to WT- BPTI (3-4 kcabmol). In chapter 5, this result is compared to the reported effects of different point mutations in BPTI. The third part of the thesis brings my publications based on the Ph.D work. 8

10 DEL 1

11 Kapitel 1 Introauktion og sammendrag. Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor (BPTI) er et lille protein med en molekylvsegt på 6.5 kda bestående af 58 aminosyrer i en peptidkzde. Den tredimensionale struktur af BPTI er bestemt med stor oplsselighed i tre forskellige krystalformer ved rentgen krystallografi og neutron diffraction (Deisenhofer and Steigemann, 1975; Wlodawer et al., 1984; Wlodawer et al., 1987). Det er et globulaxt protein med regulzre sekundaxe strukturelementer, som bestar af en 3,,-helix (resteme 3 ti1 7), en fi-hairpin (resteme 18-35), en tredje antiparallel fl-streng (rest 43 ti1 45) samt en cy-helix ved C-terminalen (resteme 47-56) (se figur 1.1). Strukturen indeholder desuden tre di&idbroer (555,30-51 og 14-38). Alle aminosyrer på mer tryptofan og histidin er reprmsenteret. Der findes ikke post-translationelle modifikationer såsom glycosylering eller fosforylering. Proteinet er resistent overfor ekstreme variationer i ph og temperatur, samt overfor mange peptidaser. Desuden har BPTI en stor vandoploselighed. BPTI inhiberer trypsin og en lang rsekke andre peptidaser gennem dannelse af stabile komplekser med enzymeme. Denne inhibitor aktivitet lader sig måle i simple assays. Også strukturen af komplekset mellem BPTI og trypsin er undersogt ved krystalstruktur analyse (Rilhlmann et al., 1973). Endelig skal det nzvnes at BPTI er tilgaxrgeligt i relativt store mangder. Alle disse egenskaber ger BPTI til et ideelt modelprotein for test af nye teoretiske og eksperimentelle metoder, og som sådant har det vaxet anvendt i flere åttier. BPTI har vaxet model for et stort antal studier af statiske og dynamiske aspekter af proteiners konformation og proteiners foldning. Her skal fokuseres på dets rolle som modelprotein i forbindelse med NMR spektroskopi. Studier på BPTI har vsxet centrale i forbindelse med udvikling af metoder ti1 tilordning af protein NMR spektre, både hvad angår H kemiske skift (f.eks. Snyder et al., 10

12 Figur 1.1 Skematisk tegting af BFTI s struktur. N- og C-terminal samt hovedkzde forleb og sekundme stmkturelemen- ter er aqivet (efter Richardson, 1985). Se desuden figur 5.1 for hydrofobe kemer og disulfidbrom 1975; Wagner et al., 1981; Wagner and Wilthrich, 1982a; Tüchsen and Woodward, 1987), 13C kemiske skift (f.eks. Tiichsen and Hansen, 1988) og 15N kemiske skift (f.eks. Glushka and Cowburn, 1987). BPTI s lille molekylstorrelse resulterer i relativt simple spektre med relativt skarpe resonanser. BI TI s egenskaber har vseret nyttige ved tilordninger, idet stabiliteten overfor variationer i ph og temperatur har muliggjort mange manipulationer med proteinoplosningerne, og der igennem tilordninger baseret på f.eks. ph titreringer, hydrogen udvekslingskinetik og isotopeffekter. Den store aploselighed har gjort det muligt at arbejde med meget koncentrerede proteinoplosninger og dermed med naturligt forekommende 13C. Også i forbindelse med det banebrydende arbejde indenfor strukturopklaring af proteiner i oplosning ved hjzlp af NMR spektroskopi har BFTI vaxet den foretrukne model (Wagner et al., 1987a). Der foreligger nu en hojt oplost NMR struktur for BF TI i 11

13 oplosning og detaljerede sammenligninger med krystalstruktureme (Berndt et al., 1992). NMR spektroskopi på BPTI har yderligere vseret vigtig for udviklingen af målemetoder og tolkning af data for dynamiske fanomener som hydrogen udveksling (f.eks. Richarz et al., 1979; Hilton and Woodward, 1979; Woodward et al., 1982, Wagner and Wüthrich, 1982b; Roder et al., 1985; Tiichsen and Woodward, 1985; Tiichsen et al., 1987) og aromatiske ringflip for proteiner (f.eks. Wiithrich and Wagner, 1975; Wagner et al, 1987b). På baggrund af den store msengde eksperimentelle NMR data for BPTI s struktur og dynamik, er BPTI efterhånden også blevet en meget anvendt model inden for udviklingen af computer behandling af store data sa% (f.eks. Schiffer et al., 1994; Brunne et al., 1995). Rekombmant protein De seneste årtiers udvikling inden for molekylmr biologien har gjort det muligt at producerer eukaryote proteiner i heterologe organismer som Leks. E. di, og har yderligere muliggjort design og fremstilling af rekombinante proteiner med specifikke amdringer i aminosyresekvens. Ved at foretage små veldefinerede andringer i et protein blev det muligt at undersege eksempelvis enkelte aminosyreresters rolle i interaktioner med andre molekyler eller betydning for et proteins stabilitet. For BPTI s vedkommende havde man lange sagt svar på forskellige sporgsmål - såsom enkelte aminosyreresters indflydelse på stabilitet eller inhibitor aktivitet og specificitet - gennem arbejde med kemiske metoder ti1 sendring af proteinet; f.eks. oxidering af methionin (Kassell, 1964) transaminering (Brown et al., 1978) eller aminosyre substitution ved peptidsyntese (Beckmann et al., 1988). Med kemisk modifikation eller kemisk mutagenese er det imidlertid kun muligt at foretage visse typer af mndringer, og kun på bestemte aminosyrerester eller i bestemte områder i proteinet. Med de nye rekombinante teknikker, som i princippet muliggor alle u-enkelige aminosyre substitutioner, deletioner og indssettelser, var der udsigt ti1 at kunne foretage et spring i studiet af BPTI varianter. Kunne det lykkes at fremstille modificeret BPTI protein gennem ekspression i en heterolog organisme, ville eksempelvis detaljer om forskellige elementers bidrag ti1 BPTI s ussedvanlig hoje stabilitet, dvs. disulfidbroernes bidrag, elektrostatiske inter- 12

14 aktioners bidrag eller hydrogenbindingers bidrag kunne underseges. 1 forbindelse med NMR spektroskopi var det oplagt også at tamke på muligheden for at sendre på proteinets isotopsammensartnin gennem rekombinant produktion. Målet for mervaxende projekt var således at skabe nye muligheder for anvendelsen af BPTI som model for NMR studier. Der skulle udvikles et ekspressionssystem for BFTI, der var velegnet ti1 fremstilling af modificerede former af proteinet, dvs. et system, der var tilstrazkkeligt simpelt til, at der nemt kunne frembringes nye DNA konstruktioner og dermed protein med nye sekvenszndringer. Dyrkninger til fremstilling af mangder i storrelsesordenen lo-100 mg skulle kunne foregå med almindelige laboratorie faciliteter i kulturflasker. Sekundaert skulle det specifikke udbytte soges bragt så hojt op at der kunne fremstilles beriget eller isotopmaxket protein. Endvidere var målsztningen at udnytte de muligheder der måtte opstå for NMR studier på det frembragte protein. Interessen for de nye teknikker og muligheder var stor og udbredt. Som det beskrives i kapitel 2, blev der kort for og omkring dette projekts start publiceret de forste arbejder med fremstilling af rekombinant BPTI (Marks et al., 1986; von Wilcken-Bergmann et al., 1986; Auerswald et al., 1987; Goldenberg, 1988). Ingen af disse forsag levede dog op ti1 ovennaevnte målsmetning. At interessen for fremstilling af rekombinant BIT har vaxet endnu storre, end det da fremgik, illustreres af den serie af arbejder med varianter af BFTI, som senere er publiceret som resultat af flere forskellige laboratoriers bestrabelser på at fremstille BPTI rekombinant (f.eks. Eigenbrot et al., 1990; Housset et al., 1991; Altman et al., 1991; Danishefsky et al., 1993; Berndt et al., 1993; Otting et al., 1993; Schulman and Kim, 1994; Yu et al., 1995; Darby et al., 1995; Denisov et al., 1995). Disse arbejder bliver kommenteret i kapitel 3 og 5. E. coli ekspressionssystemer E. coli har traditionelt vaxet den foretrukne organisme inden for mikrobiologi og genetik, og på baggrund af det deraf folgende kendskab ti1 mekanismer, der styrer translation og transskription, blev det fra starten også den foretrukne organisme inden for 13

15 genteknologi og rekombinant teknik. Derfor var det naturligt at vaelge denne vaxtsorganis- me ti1 ekspression af BPTI. Der er imidlertid en rzkke aspekter der skal overvejes, og en raekke problemer der kan opstå, når man forseger at fremstille eukaryote proteiner i E. coli. Det fremgår dels af dette arbejdes resultater, dels af mange samtidige arbejder med fremstilling af andre eukaryote proteiner (Gold, 1990). E. coli er ligesom andre bakterier ikke i stand ti1 at udfore hovedparten af de post- translationelle modifikationer, som eukaryote proteiner ofte har, og E. coli kan ikke formidle den korrekte foldning af mange eukaryote proteiner. Disse to forhold blev vurderet som mindre vzsentlige for BPTI, der ikke er modificeret, og som kan folde spontant in vitro. Rent praktisk skal man som det forste skaffe den kodende sekvens (svarende ti1 genet) for det enskede protein. Genet for BPTI blev stillet ti1 radighed for dette projekt af T.E. Creighton, således at et ellers stort arbejde med isolering eller syntese blev undgået. Den kodende sekvens skal anbringes i en vektor med alle nodvendige regulatoriske elementer, for at henholdsvis transskription og translation kan initieres og termineres. Hvis det skal vaere arbejdsmaessigt fremkommeligt at fremstille det rekombinante protein, skal ekspressionsniveauet bringes op så det overstiger 1% af total proteinet. Erfaringer viser at det afgorende er, at det eukaryote gen anbringes under kontro1 af en stark og gerne regulerbar promoter, og med en optimal ribosombindende sekvens passende placeret for genet (f.eks. review af Balbas and Bolivar, 1990). Et forhold der altid må overvejes, er hvordan den korrekte N-terminal kan opnås. Peptidsyntesen i E. coli starter med formyl-methionin på den N-terminale plads, og codan for denne må derfor anbringes for den kodende sekvens. Formyl-methionin processeres ti1 methionin eller fjernes helt fra en varierende fraktion af proteinet, atltzngigt af typen af den efterfolgende aminosyrerest. Er den efterfolgende aminosyrer arginin, som er BPTI s N-terminal, bliver methionin bibeholdt 100% (Dalboge et al., 1990). Et problem, der ofte opstår, er at det rekombinante protein viser sig at vaxe ustabilt idet det nedbrydes af E. coli proteaser i cytoplasma, og det kan helt eller delvist odelzgge udbyttet. Dette viste sig at vare et stort problem for BPTI s vedkommende. Endelig kan det betyde meget for ekspressionsniveauet og for aploseligheden af et 14

16 protein, hvordan de forskellige parametre som temperatur, mediesammensmtning osv. varieres i forbindelse med selve dyrkningen af bakteriekulturen. Ligeledes ligger der et udviklingsarbejde i at finde en effektiv måde til oprensning af produktet. Rundt omkring i verden er der for, under og efter nwvzrende projekts udforelse arbejdet intenst med E. coli ekspressionssystemer med henblik på at optimere ekspressions- niveauer, imodegå ustabilitet, lette oprensning, finde metoder ti1 opnåelse af en korrekt N- terminal, ett. 1 det konkrete arbejde med at finde et velegnet ekspressionssystem for BPTI, blev der afprovet forskellige af de foreliggende muligheder. Det lykkedes at sammensztte en god metode, hvor flere elementer kombineres. Samurendrag Projektets eksperimentelle arbejde er beskrevet i fire kapitler i afhandlingens Del 2. De tire kapitler er opbygget som artikler med hver sit abstract, introduktion osv. De kilder der er kommenteret i introduktionen ti1 de enkelte kapitler, er demdei lå ti1 grund for selve arbejdet på det pågzldende tidspunkt. Nyere kilder, der berorer relevante emner er kun medtaget i de efterfolgende diskussions afsnit. 1 Del 3 findes vedlagt de publikationer, som arbejdet har resulteret i. 1 den indledende fase blev de mest merliggende muligheder for at udttykke BPTI genet afprovet. Dette er beskrevet i kapitel 2. Forst blev den BPTI kodende sekvens forsegt udtrykt direkte ved indforsel af en starmodon foran genet med forventet akkumulering af produktet i cytoplasma. En losning på problemet med at opnå den korrekte N-terminal var forberedt ved at anbringe en ganske kort forsekvens mellem starmodon og BPTI sekvens. Den resulterende N-terminale forlanrgelse skulle fjemes fra produktet med exopeptidasen, cathepsin C. BPTI er i kraft af sin aminosyresekvens beskyttet mod nedbrydning med cathepsin C. Ti1 ekspression af denne konstruktion blev anvendt et starkt og regulerbart T7 RNA polymerase/promoter system. 1 et meste trin blev konstruktionen udvidet med OmpA signalsekvensen for sekretion af produktet ti1 periplasma. Endelig blev konstruk- tionen med OmpA signalsekvensen også anbragt under kontro1 af en anden stserk, regulerbar promoter, h P,. Af denne serie konstruktioner gav sidstnaevnte det bedste resultat med et udbytte på mg BPTUI kultur for oprensning. Dette var imidlertid 15

17 ikke tilfredsstillende i forhold ti1 målsaetningen. Alt pegede på at det nysyntetiserede BPTI var ustabilt og blev nedbrudt i cytoplasma. Et langt bedre resultat blev opnået med det endelige ekspressionssystem som er beskrevet i kapitel 3. 1 dette system anvendes en stserk hybridpromoter, P,, som reguleres via et lat operatorirepressor system. BPTI molekylet stabiliseres delvist ved en fusion ti1 et E. coli protein; det maltose-bindende protein (MBP). Fusionsproteinet secemeres ti1 peri- plasma ved MBP-signalpeptidet, og her er produktet helt stabilt. MBP delen udnyttes ti1 at oprense fusionsproteinet ved affinitetskromatografi på en amylose matrix. Aktivt BIT1 fusioneret ti1 MBP kunne således oprenses i et udbytte på op mod 10 mg/1 kultur. En frigorelse af BIT1 fra MBP var forberedt ved at indsaette målsekvensen for den specifikke endopeptidase factor X, (FX3 i overgangen mellem de to fusionspartnere, således at den proteolytiske klovning ville ske urniddelbart for BPTI s N-terminal. Dette kunne dog ikke anvendes i praksis, som det er beskrevet i kapitel 4. FX, målsekvensen viste sig at have en meget lav tilgangelighed, når den var direkte fusioneret ti1 BPTI s Argl. NMR undersogelser viste senere, at det forntentlig skyldes interaktioner mellem BPTI s C-terminale carboxylsyregruppe og grupper i målsekvensen. FX, behandling af denne fusionskonstruktion gav i stedet off-target klovning ved en delvis homolog sekvens, der helt utilsigtet var placeret seks aminosyrerester for den korrekte malsekvens og resulta- tet var BPTI med en N-terminal forlamgelse på 6 eller 5 aminosyrer. Eksperimenter med catbepsin C behandling af disse produkter bekrzeftede at cathepsin C trimning er ideel ti1 fjemelse af forsekvenser fra BPTI. Derfor sammensattes ti1 sidst en konstruktion, hvor FX, malsekvensen var adskilt fra BPTI s Arg1 af en kort linkersekvens. Resultatet var et MBP- BPTI fusionsprotein, som effektivt lod sig spalte af FX, med et meget begrrenset peptidase forbrug. Den efterfolgende cathepsin C trimning forlob ligeledes effektivt med lavt enzym forbrug. 98 % rent BPTI med WT sekvens kunne oprenses i et udbytte på 3-6 mg/l kultur. Hermed var det lykkedes at udvikle et ekspressionssystem for BPTI, der var nemt at arbejde med, som gav et godt udbytte, og som resulterede i protein med korrekt N- terminal- og intern sekvens. MBP-BPTI systemet opfyldte målsztningen for velegnethed i forhold ti1 fremstilling af mutant protein, men var desvmrre ikke brugbart ti1 fremstilling af murket eller beriget protein. Som det beskrives i kapitel 2 og 3, var MBP-BPTI 16

18 systemet ved sammenligning med de tidligt publicerede systemer for ekspression af BIT1 langt bedre. Andre tilsvarende gode eller bedre ekspressionssystemer for BPTI er senere publiceret. Blandt disse findes der systemer med eukaryote vzettsorganismer, der er velegnede ti1 isotopmaerkning af proteinet. For hovedparten af de studier af varianter af BPTI, der siden er publiceret, er proteinet dog fremstillet ved systemer med lave udbytter, systemer der indebzrer brug af toksiske kemikalier, og som resulterer i indbyggede mndringer i N-terminal- og intern sekvens (uddybes i kapitel 3). Udviklingen af ekspressionssystemet og eksperimenteme med FX, og cathepsin C behandling resulterede i, at der kunne oprenses en serie af N-terminalt forlamgede BPTI varianter. Disse varianter blev furidet ganske interessante. Brown et al. (1978) havde vist, at der for BPTI i oplosning findes en saltbro mellem den N-terminale amino gruppe på Arg1 og den C-terminale carboxylsyre gruppe på Ala i det neutrale ph område. Stabili- seringsbidraget fra denne saltbro var blevet bestemt ud fra sammenlignende studier af en variant, hvor saltbroen var fjemet ved kemisk transaminering. Hos de forlamgede BPTI varianter er den N-terminale aminogruppe flyttet ud på ekstensionspeptidet. Det krzever en ny geometri for - eller forhindrer fuldstzndig dannelsen af en saltbro interaktion, og det gav en ny mulighed for at studere det stabiliseringsbidrag der er forbundet med saltbroen. Valget faldt derfor på at koncentrere den anden del af Ph.D projektet om disse varianter. 1 en naturlig forlamgelse af arbejdet med ekstenderede former af BPTI kom et samarbejde med en gruppe fra Novo Nordisk, som gennem udviklingen af et gzr ekspressionssystem for BPTI havde fremstillet N-terminalt forkortede varianter af proteinet. Karakteriseringen af de forskellige varianter ved NMR spektroskopi er beskrevet i kapitel 5. Serien af forlazngede varianter bestod af BPTI N-terminalt forlamget med 1,4,.5 eller 6 aminosyrerester. De to forkortede varianter manglede begge Arg1 og Pro2, og desuden havde den ene en aminosyresubstitution (R42S). Stabiliteten af BPTI varianteme blev undersegt ved amidproton isotop udvekslingshastigheder og microkalorimetri. 1 ovrigt blev ph titreringseffekter brugt ti1 at foretage en undersogelse af eksistensen af en saltbro mellem N- og C-terminal. Strukturandringer for varianteme i forhold ti1 WT-BPTI blev bedomt ud fra kemiske skift i 1D og 2D H NMR spektre. Den overordnede struktur af varianteme adskilte sig ikke fra WT-BPTI s struktur. 17

19 Strukturandringeme var lokale og var koncentreret omkring terminaleme. Et vmsentligt og overraskende resultat sås for l-bit1 (BIT1 forlamget med en arginin). l-bfti danner en struktur, der har fuldstamdig samme stabilitet som WT-BPTI, og l-bit har ligesom denne en saltbro interaktion mellem C- og N-terminal i det neutrale ph område. Arbejdet med de ovrige forhengede og forkortede former afslorede strukturer uden saltbro, og viste i varierende grad nedsat stabilitet i forhold ti1 WT-BFTI. Studiet af transamineret BIT1 havde fort ti1 et estimat af saltbro interaktionens stabili- seringsbidrag på kcahmol (Brown et al., 1978). Det tilsvarende estimat baseret på hydrogen udvekslingshastigheder for de forhengede og forkortede former var ikke i overensstemmelse hemred. Dette diskuteres i kapitel 5. Det vurderes at resultatet for 4- BPTI er mermest på at reprsesentere det rene saltbro bidrag, og her er estimatet på ca 0.6 kcahmol. De forkortede varianter var meget destabiliserede (3-4 kcahmol). 1 kapitel 5 sammenholdes dette resultat med effekten af andre kendte mutationer i BPTI. 18

20 DEL 2

Studienummer: MeDIS Exam 2015. Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen

Studienummer: MeDIS Exam 2015. Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen MeDIS Exam 2015 Titel på kursus: Uddannelse: Semester: Videregående biokemi og medicinudvikling Bachelor i Medis 5. semester Eksamensdato: 26-01-2015 Tid: kl. 09.00-11.00 Bedømmelsesform 7-trin Vigtige

Læs mere

En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et:

En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: F2011-Opgave 1. En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: Forward primer: 5 CC ATG GGT ATG AAG CTT TGC AGC CTT

Læs mere

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU STUDENTEREKSAMEN 2007 2007-BT-1 BITEKNLGI HØJT NIVEAU Torsdag den 31. maj 2007 kl. 9.00 14.00 Sættet består af 1 stor og 2 små opgaver samt 1 bilag i 2 eksemplarer. Det ene eksemplar af bilaget afleveres

Læs mere

Engelsk. Niveau D. De Merkantile Erhvervsuddannelser September Casebaseret eksamen. og

Engelsk. Niveau D. De Merkantile Erhvervsuddannelser September Casebaseret eksamen.  og 052431_EngelskD 08/09/05 13:29 Side 1 De Merkantile Erhvervsuddannelser September 2005 Side 1 af 4 sider Casebaseret eksamen Engelsk Niveau D www.jysk.dk og www.jysk.com Indhold: Opgave 1 Presentation

Læs mere

Engelsk. Niveau C. De Merkantile Erhvervsuddannelser September 2005. Casebaseret eksamen. www.jysk.dk og www.jysk.com.

Engelsk. Niveau C. De Merkantile Erhvervsuddannelser September 2005. Casebaseret eksamen. www.jysk.dk og www.jysk.com. 052430_EngelskC 08/09/05 13:29 Side 1 De Merkantile Erhvervsuddannelser September 2005 Side 1 af 4 sider Casebaseret eksamen Engelsk Niveau C www.jysk.dk og www.jysk.com Indhold: Opgave 1 Presentation

Læs mere

DK - Quick Text Translation. HEYYER Net Promoter System Magento extension

DK - Quick Text Translation. HEYYER Net Promoter System Magento extension DK - Quick Text Translation HEYYER Net Promoter System Magento extension Version 1.0 15-11-2013 HEYYER / Email Templates Invitation Email Template Invitation Email English Dansk Title Invitation Email

Læs mere

ATEX direktivet. Vedligeholdelse af ATEX certifikater mv. Steen Christensen stec@teknologisk.dk www.atexdirektivet.

ATEX direktivet. Vedligeholdelse af ATEX certifikater mv. Steen Christensen stec@teknologisk.dk www.atexdirektivet. ATEX direktivet Vedligeholdelse af ATEX certifikater mv. Steen Christensen stec@teknologisk.dk www.atexdirektivet.dk tlf: 7220 2693 Vedligeholdelse af Certifikater / tekniske dossier / overensstemmelseserklæringen.

Læs mere

1 s01 - Jeg har generelt været tilfreds med praktikopholdet

1 s01 - Jeg har generelt været tilfreds med praktikopholdet Praktikevaluering Studerende (Internship evaluation Student) Husk at trykke "Send (Submit)" nederst (Remember to click "Send (Submit)" below - The questions are translated into English below each of the

Læs mere

Bedømmelse af klinisk retningslinje foretaget af Enhed for Sygeplejeforskning og Evidensbasering Titel (forfatter)

Bedømmelse af klinisk retningslinje foretaget af Enhed for Sygeplejeforskning og Evidensbasering Titel (forfatter) Bedømmelse af klinisk retningslinje foretaget af Enhed for Sygeplejeforskning og Evidensbasering Titel (forfatter) Link til retningslinjen Resumé Formål Fagmålgruppe Anbefalinger Patientmålgruppe Implementering

Læs mere

Side 1 af 14. Eksamen: Bioinformatik It og Sundhed 27 Jan 2011 kl 9-13

Side 1 af 14. Eksamen: Bioinformatik It og Sundhed 27 Jan 2011 kl 9-13 Side 1 af 14 Eksamen: Bioinformatik It og Sundhed 27 Jan 2011 kl 9-13 Navn: Studie nummer: Dette eksamenssæt vil også kunne ses som en pdf fil nederst på kursus-hjemmesiden udfor den sidste dag d. 27 Jan

Læs mere

datp, dctp, dgtp, dttp, [α 32 P]-dCTP urinstofholdig polyacrylamid gel røntgen film

datp, dctp, dgtp, dttp, [α 32 P]-dCTP urinstofholdig polyacrylamid gel røntgen film Opgave 1 Denne opgave omhandler osteoblast differentiering. Osteoblast celler er involveret i opbygning af knoglevæv. Osteoblast celler dannes ud fra såkaldte calvarial celler. For at forstå det molekylære

Læs mere

Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia.

Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia. Transformation af E.coli K 12 Version 3. marts 2009 (C) Claudia Girnth-Diamba og Bjørn Fahnøe Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages

Læs mere

Biocide resistance in Salmonella Typhimurium

Biocide resistance in Salmonella Typhimurium FACULTY OF HEALTH AND MEDICAL SCIENCES UNIVERSITY OF COPENHAGEN PhD thesis Mette Rørbæk Gantzhorn Biocide resistance in Salmonella Typhimurium Academic advisor: Line Elnif Thomsen This thesis has been

Læs mere

Danmarks Tekniske Universitet

Danmarks Tekniske Universitet Side 1 of 14 Danmarks Tekniske Universitet Skriftlig prøve, den 21/1-2013 Kursus navn: Kursus nr. 27633 Introduktion til Bioinformatik Tilladte hjælpemidler: Alle "Vægtning" Angivet ved de individuelle

Læs mere

Bilag. Resume. Side 1 af 12

Bilag. Resume. Side 1 af 12 Bilag Resume I denne opgave, lægges der fokus på unge og ensomhed gennem sociale medier. Vi har i denne opgave valgt at benytte Facebook som det sociale medie vi ligger fokus på, da det er det største

Læs mere

Small Autonomous Devices in civil Engineering. Uses and requirements. By Peter H. Møller Rambøll

Small Autonomous Devices in civil Engineering. Uses and requirements. By Peter H. Møller Rambøll Small Autonomous Devices in civil Engineering Uses and requirements By Peter H. Møller Rambøll BACKGROUND My Background 20+ years within evaluation of condition and renovation of concrete structures Last

Læs mere

Alfa-1-antitrysin mangel hos børn. Elisabeth Stenbøg, Afd.læge, PhD Børneafd. A, AUH

Alfa-1-antitrysin mangel hos børn. Elisabeth Stenbøg, Afd.læge, PhD Børneafd. A, AUH Alfa-1-antitrysin mangel hos børn Elisabeth Stenbøg, Afd.læge, PhD Børneafd. A, AUH Hvad er det? Alfa-1-antitrypsin Proteinstof Produceres i leveren Fungerer i lungerne Regulerer neutrofil elastase balancen

Læs mere

CYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm)

CYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm) Opgave 1 Leveren spiller en central rolle i lipid metabolismen og i opretholdelse af lipid homeostasen i hele kroppen. Lipidmetabolismen er fejlreguleret hos blandt andet svært overvægtige personer samt

Læs mere

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Sebastian, Louise og Ana

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Sebastian, Louise og Ana Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Sebastian, Louise og Ana Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Dagens program 9:00 10:00 Introduktion

Læs mere

Brug sømbrættet til at lave sjove figurer. Lav fx: Få de andre til at gætte, hvad du har lavet. Use the nail board to make funny shapes.

Brug sømbrættet til at lave sjove figurer. Lav fx: Få de andre til at gætte, hvad du har lavet. Use the nail board to make funny shapes. Brug sømbrættet til at lave sjove figurer. Lav f: Et dannebrogsflag Et hus med tag, vinduer og dør En fugl En bil En blomst Få de andre til at gætte, hvad du har lavet. Use the nail board to make funn

Læs mere

Dendrokronologisk Laboratorium

Dendrokronologisk Laboratorium Dendrokronologisk Laboratorium NNU rapport 14, 2001 ROAGER KIRKE, TØNDER AMT Nationalmuseet og Den Antikvariske Samling i Ribe. Undersøgt af Orla Hylleberg Eriksen. NNU j.nr. A5712 Foto: P. Kristiansen,

Læs mere

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere:

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin,

Læs mere

Bioteknologi A. Gymnasiale uddannelser. Vejledende opgavesæt 1. Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40. 5 timers skriftlig prøve

Bioteknologi A. Gymnasiale uddannelser. Vejledende opgavesæt 1. Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40. 5 timers skriftlig prøve Vejledende opgavesæt 1 Bioteknologi A Gymnasiale uddannelser 5 timers skriftlig prøve Vejledende opgavesæt 1 Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40 Side 1 af 8 sider pgave 1. Genmodificeret ris Vitamin

Læs mere

Vores mange brugere på musskema.dk er rigtig gode til at komme med kvalificerede ønsker og behov.

Vores mange brugere på musskema.dk er rigtig gode til at komme med kvalificerede ønsker og behov. På dansk/in Danish: Aarhus d. 10. januar 2013/ the 10 th of January 2013 Kære alle Chefer i MUS-regi! Vores mange brugere på musskema.dk er rigtig gode til at komme med kvalificerede ønsker og behov. Og

Læs mere

Dansk resumé for begyndere

Dansk resumé for begyndere Dansk resumé for begyndere Dansk resumé for begyndere Dette afsnit introducerer bakteriel genregulation for enhver uden forudgående kendskab til dette emne. Alle nødvendige, videnskabelige betegnelser

Læs mere

Proteiner. Proteiner er molekyler der er opbygget af "aminosyrer",nogle er sammensat af få aminosyrer medens andre er opbygget af mange tusinde

Proteiner. Proteiner er molekyler der er opbygget af aminosyrer,nogle er sammensat af få aminosyrer medens andre er opbygget af mange tusinde Proteiner Proteiner er molekyler der er opbygget af "aminosyrer",nogle er sammensat af få aminosyrer medens andre er opbygget af mange tusinde Der findes ca. 20 aminosyrer i menneskets organisme. Nogle

Læs mere

PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA

PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA PCR til at opkopiere bestemte DNA-sekvenser i en prøve er nu en af genteknologiens absolut vigtigste værktøjer. Peter Rugbjerg, Biotech Academy PCR (Polymerase

Læs mere

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU STUDETEREKSAME 2006 2006-BT-2 BIOTEKOLOGI HØJT IVEAU Onsdag den 16. august 2006 kl. 9.00 14.00 Sættet består af 1 stor og 2 små opgaver. Alle hjælpemidler tilladt. STOR OPGAVE 1. Myoglobin A. Den røde

Læs mere

Sustainable use of pesticides on Danish golf courses

Sustainable use of pesticides on Danish golf courses Indsæt nyt billede: Sustainable use of pesticides on Danish golf courses Anita Fjelsted - Danish EPA Ministry of the Environment 27 May 2015 - STERF The Danish Environmental Protection Agency 450 employees

Læs mere

Brugsvejledning for 7827.10 dialyseslange

Brugsvejledning for 7827.10 dialyseslange Brugsvejledning for 7827.10 dialyseslange 14.06.07 Aa 7827.10 1. Præsentation Dialyseslangen er 10 m lang og skal klippes i passende stykker og blødgøres med vand for at udføre forsøgene med osmose og

Læs mere

PATENT 109646 Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6

PATENT 109646 Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6 PATENT 109646 Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6 Ansøgning nr. 26 43 /65 Indleveret den 25.ma j 19 65 Fremlagt den 18. d e c emb er 19 6 7 DANMARK DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET KØBENHAVN Patentbeskrivelsen

Læs mere

Brug af logbog i undervisning. Karen Lauterbach Center for Afrikastudier Adjunktpædagogikum 19. Juni 2013

Brug af logbog i undervisning. Karen Lauterbach Center for Afrikastudier Adjunktpædagogikum 19. Juni 2013 Brug af logbog i undervisning Karen Lauterbach Center for Afrikastudier Adjunktpædagogikum 19. Juni 2013 Motivation og projektidé Modsætning mellem undervisningsideal (deltagende og reflekterende studerende

Læs mere

Datablad: Nature Impact Roof modul

Datablad: Nature Impact Roof modul 1 Datablad: Nature Impact Roof modul Modul: Modulmål: 535 X 405 mm. Højde grundmodul: 40 mm. Højde vækstlag: ca. 6 cm. Total byggehøjde: ca. 6 cm + planter Vægt fuld vandmættet: 45 kg./m 2. Vandtilbageholdelse:

Læs mere

Proteiner: en introduktion. Modul 1; F13 Rolf Andersen, 18/2-2013

Proteiner: en introduktion. Modul 1; F13 Rolf Andersen, 18/2-2013 Proteiner: en introduktion Modul 1; F13 Rolf Andersen, 18/2-2013 4 facts om proteiner Proteiner udgør én af de vigtigste stofgrupper i vores organisme; de varetager en lang række forskellige funktioner.

Læs mere

Undervisningsbeskrivelse

Undervisningsbeskrivelse Undervisningsbeskrivelse Stamoplysninger til brug ved prøver til gymnasiale uddannelser Termin Institution Uddannelse Fag og niveau Lærer(e) Termin hvori undervisningen afsluttes: maj-juni, 2012 Skive

Læs mere

Danmarks Tekniske Universitet

Danmarks Tekniske Universitet Side 1 of 17 Danmarks Tekniske Universitet Skriftlig prøve, den 21/1-2013 Kursus navn: Kursus nr. 27633 Introduktion til Bioinformatik Tilladte hjælpemidler: Alle "Vægtning" Angivet ved de individuelle

Læs mere

Boligsøgning / Search for accommodation!

Boligsøgning / Search for accommodation! Boligsøgning / Search for accommodation! For at guide dig frem til den rigtige vejledning, skal du lige svare på et par spørgsmål: To make sure you are using the correct guide for applying you must answer

Læs mere

Strategic Capital ApS has requested Danionics A/S to make the following announcement prior to the annual general meeting on 23 April 2013:

Strategic Capital ApS has requested Danionics A/S to make the following announcement prior to the annual general meeting on 23 April 2013: Copenhagen, 23 April 2013 Announcement No. 9/2013 Danionics A/S Dr. Tværgade 9, 1. DK 1302 Copenhagen K, Denmark Tel: +45 88 91 98 70 Fax: +45 88 91 98 01 E-mail: investor@danionics.dk Website: www.danionics.dk

Læs mere

Besvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Spm. B:

Besvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Spm. B: Besvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Vi må lave et genomisk bibliotek i en lambdafag, cosmid, BAC eller YAC plasmid. Til dette vil vi skære det genomiske DNA partielt med Sau3A, så vi får stykker

Læs mere

Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' DNA, RNA og protein

Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' DNA, RNA og protein Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' Forskere kan lave præcise ændringer

Læs mere

AT-1. Oktober 09 + December 10 + November 11. CL+JW. Stenhus. side 1/5

AT-1. Oktober 09 + December 10 + November 11. CL+JW. Stenhus. side 1/5 AT-1. Oktober 09 + December 10 + November 11. CL+JW. Stenhus. side 1/5 1. 2. 3. 4. AT-1. Metodemæssig baggrund. Oktober 09. (NB: Til inspiration da disse papirer har været anvendt i gamle AT-forløb med

Læs mere

Undervisningsbeskrivelse fra august 2014

Undervisningsbeskrivelse fra august 2014 Undervisningsbeskrivelse fra august 2014 Stamoplysninger til brug ved prøver til gymnasiale uddannelser Termin Oktober 2015 Institution Hansenberg Gymnasium Uddannelse Fag og niveau Lærer(e) Hold HTX Bioteknologi

Læs mere

Aktivering af Survey funktionalitet

Aktivering af Survey funktionalitet Surveys i REDCap REDCap gør det muligt at eksponere ét eller flere instrumenter som et survey (spørgeskema) som derefter kan udfyldes direkte af patienten eller forsøgspersonen over internettet. Dette

Læs mere

Afsætning af sprøjtevæske gennem fiberdug

Afsætning af sprøjtevæske gennem fiberdug Afsætning af sprøjtevæske gennem fiberdug Projekt: udvikling af nye teknikker i behandling af havebrugskulturer English summery Title: Deposition on small plants when spraying through fleece with conventional

Læs mere

SOFTWARE PROCESSES. Dorte, Ida, Janne, Nikolaj, Alexander og Erla

SOFTWARE PROCESSES. Dorte, Ida, Janne, Nikolaj, Alexander og Erla SOFTWARE PROCESSES Dorte, Ida, Janne, Nikolaj, Alexander og Erla Hvad er en software proces? Et struktureret sæt af AKTIVITETER, hvis mål er udvikling af software. En software proces model er en abstrakt

Læs mere

GAPDH PCR modul Manual

GAPDH PCR modul Manual GAPDH PCR modul Manual Katalog nr. 166-5010EDU explorer.bio-rad.com Kopiering kun tilladt til undervisningsbrug Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende

Læs mere

Cisgen byg med bedre fosfatudnyttelse

Cisgen byg med bedre fosfatudnyttelse Cisgen byg med bedre fosfatudnyttelse Seniorforsker Inger Bæksted Holme Aarhus Universitet, Science and Technology, Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Afgrødegenetik og Bioteknologi Hypotese Det

Læs mere

Protein syntese. return

Protein syntese. return Protein syntese. I artiklen redegøres for principperne i, hvordan octapeptidet SCHTFGDI kan syntetiseres. Som yderligere illustration heraf kan peptidet opbygges og visualiseres i Chem3D-Pro. Herved kan

Læs mere

Unitel EDI MT940 June 2010. Based on: SWIFT Standards - Category 9 MT940 Customer Statement Message (January 2004)

Unitel EDI MT940 June 2010. Based on: SWIFT Standards - Category 9 MT940 Customer Statement Message (January 2004) Unitel EDI MT940 June 2010 Based on: SWIFT Standards - Category 9 MT940 Customer Statement Message (January 2004) Contents 1. Introduction...3 2. General...3 3. Description of the MT940 message...3 3.1.

Læs mere

Bakterier Venner eller fjender?

Bakterier Venner eller fjender? Akademiet for Talentfulde Unge 2013: Bakterier Venner eller fjender? Ole Skovgaard olesk@ruc.dk Ole Skovgaard, 2013 Bakterier: Er en ur-gammel livsform! Indeholder langt større variationer end de store

Læs mere

Trolling Master Bornholm 2014

Trolling Master Bornholm 2014 Trolling Master Bornholm 2014 (English version further down) Den ny havn i Tejn Havn Bornholms Regionskommune er gået i gang med at udvide Tejn Havn, og det er med til at gøre det muligt, at vi kan være

Læs mere

Kapitel 1 Genteknologi (1/6)

Kapitel 1 Genteknologi (1/6) Kapitel 1 Genteknologi (1/6) Transformation FOTO: SØREN LUNDBERG FORMÅL At isolere plasmider fra plasmidbærende bakterier og overføre dem til andre bakterier. TEORI Transformation er den teknik, hvor generne

Læs mere

Sport for the elderly

Sport for the elderly Sport for the elderly - Teenagers of the future Play the Game 2013 Aarhus, 29 October 2013 Ditte Toft Danish Institute for Sports Studies +45 3266 1037 ditte.toft@idan.dk A growing group in the population

Læs mere

Bilag. Indhold. Resumé

Bilag. Indhold. Resumé Bilag Indhold Resumé... 1 Abstract... 2 Indgang og ventetid... 3 Resumé Dette projekt forklarer, hvilke værdier samfundet er udviklet igennem, og hvordan disse har haft en effekt på individet. For at gøre

Læs mere

Sikkerhed & Revision 2013

Sikkerhed & Revision 2013 Sikkerhed & Revision 2013 Samarbejde mellem intern revisor og ekstern revisor - og ISA 610 v/ Dorthe Tolborg Regional Chief Auditor, Codan Group og formand for IIA DK RSA REPRESENTATION WORLD WIDE 300

Læs mere

US AARH. Generelle oplysninger. Studie på Aarhus Universitet: MA Cognitive Semiotics. Navn på universitet i udlandet: Tartu University.

US AARH. Generelle oplysninger. Studie på Aarhus Universitet: MA Cognitive Semiotics. Navn på universitet i udlandet: Tartu University. US AARH Generelle oplysninger Studie på Aarhus Universitet: MA Cognitive Semiotics Navn på universitet i udlandet: Tartu University Land: Estonia Periode: Fra: 02.2012 Til: 06.2012 Udvekslingsprogram:

Læs mere

Naturvidenskab og teknologi som makkerpar

Naturvidenskab og teknologi som makkerpar THOMAS RASMUSSEN Naturvidenskab og teknologi som makkerpar Et styrket samarbejde mellem gymnasier, virksomheder og universiteter er en væsentlig faktor, når man skal vise, hvad basisviden kan bruges til

Læs mere

DNA origami øvelse 2013. DNA origami øvelse

DNA origami øvelse 2013. DNA origami øvelse DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der

Læs mere

Videreudvikling af LDV til on-sitemåling

Videreudvikling af LDV til on-sitemåling Videreudvikling af LDV til on-sitemåling Sammenligning mellem LDV og gasnormal i naturgasanlæg 19-21. maj 2010 Rapportforfattere: Matthew Adams, Teknologisk Institut Kurt Rasmussen, Force Technology LDV

Læs mere

Opgave 1 Listeria. mørkviolette bakteriekolonier, se figur 1a. og b. 1. Angiv reaktionstypen for reaktion. 1 vist i figur 1b.

Opgave 1 Listeria. mørkviolette bakteriekolonier, se figur 1a. og b. 1. Angiv reaktionstypen for reaktion. 1 vist i figur 1b. Opgave 1 Listeria Bakterien Listeria monocytogenes kan være sygdomsfremkaldende for personer, der i forvejen er svækkede. For at identificere Listeria kan man anvende indikative agarplader. Her udnyttes

Læs mere

Enzymkemi H. C. Ørsted Ungdomslaboratorium Kemisk Institut Københavns Universitet august 2001

Enzymkemi H. C. Ørsted Ungdomslaboratorium Kemisk Institut Københavns Universitet august 2001 Enzymkemi H.. Ørsted Ungdomslaboratorium Kemisk Institut Københavns Universitet august 2001 2 Indholdsfortegnelse Enzymkinetik Indledning...2 Teori:...2 Mekanismen...2 Reaktionshastigheden:...5 Fremgangsmåde:...7

Læs mere

Dendrokronologisk Laboratorium

Dendrokronologisk Laboratorium Dendrokronologisk Laboratorium NNU rapport 5, 1997 STRANDGADE 3A, KØBENHAVN Nationalmuseets Marinarkæologiske Undersøgelser. Indsendt af Christian Lemée. Undersøgt af Aoife Daly og Niels Bonde. NNU j.nr.

Læs mere

Afprøvning af InVentilate Ventilationssystem

Afprøvning af InVentilate Ventilationssystem Afprøvning af InVentilate Ventilationssystem P. Heiselberg Udarbejdet for: InVentilate A/S DCE Contract Report No. 108 Department of Civil Engineering Aalborg University Department of Civil Engineering

Læs mere

Øjnene, der ser. - sanseintegration eller ADHD. Professionshøjskolen UCC, Psykomotorikuddannelsen

Øjnene, der ser. - sanseintegration eller ADHD. Professionshøjskolen UCC, Psykomotorikuddannelsen Øjnene, der ser - sanseintegration eller ADHD Professionshøjskolen UCC, Psykomotorikuddannelsen Professionsbachelorprojekt i afspændingspædagogik og psykomotorik af: Anne Marie Thureby Horn Sfp o623 Vejleder:

Læs mere

applies equally to HRT and tibolone this should be made clear by replacing HRT with HRT or tibolone in the tibolone SmPC.

applies equally to HRT and tibolone this should be made clear by replacing HRT with HRT or tibolone in the tibolone SmPC. Annex I English wording to be implemented SmPC The texts of the 3 rd revision of the Core SPC for HRT products, as published on the CMD(h) website, should be included in the SmPC. Where a statement in

Læs mere

HVAD GØR RØGEN VED KROPPEN?

HVAD GØR RØGEN VED KROPPEN? 42 www.op-i-røg.dk GÅ OP I RØG Kræftens Bekæmpelse KAPITEL 5: HVAD GØR RØGEN VED KROPPEN? www.op-i-røg.dk 43 Kapitel 5: Indhold Dette kapitel tager udgangspunkt i, hvad der sker med røgen i kroppen på

Læs mere

FB-R Staldmåtte i rulle

FB-R Staldmåtte i rulle FB-R Staldmåtte i rulle FB-R staldmåtte i rulle er den optimale løsning som toplag på staldmadrasser med skumunderlag og til en række andre applikationer. FB-R staldmåtten er fremstillet i højkvalitets

Læs mere

Løsninger til opgaverne den Opgave 2 januar 2003 Spm. 1:

Løsninger til opgaverne den Opgave 2 januar 2003 Spm. 1: Løsninger til opgaverne den 6-9-06 Opgave 2 januar 2003 Spm. 1: Fidusen er her at vi kender den primære struktur af glukoamylasen fra tre forskellige svampe, en ascomycet, en basidiomycet og en zygomycet.

Læs mere

Measuring the Impact of Bicycle Marketing Messages. Thomas Krag Mobility Advice Trafikdage i Aalborg, 27.08.2013

Measuring the Impact of Bicycle Marketing Messages. Thomas Krag Mobility Advice Trafikdage i Aalborg, 27.08.2013 Measuring the Impact of Bicycle Marketing Messages Thomas Krag Mobility Advice Trafikdage i Aalborg, 27.08.2013 The challenge Compare The pilot pictures The choice The survey technique Only one picture

Læs mere

Design til digitale kommunikationsplatforme-f2013

Design til digitale kommunikationsplatforme-f2013 E-travellbook Design til digitale kommunikationsplatforme-f2013 ITU 22.05.2013 Dreamers Lana Grunwald - svetlana.grunwald@gmail.com Iya Murash-Millo - iyam@itu.dk Hiwa Mansurbeg - hiwm@itu.dk Jørgen K.

Læs mere

DONG-område Resten af landet

DONG-område Resten af landet TDC A/S regulering@tdc.dk Fremsendes alene via mail Tillægsafgørelse vedrørende fastsættelse af priser for BSA leveret via TDC s fibernet 1 Indledning traf fredag den 15. april 2011 LRAIC-prisafgørelse

Læs mere

Help / Hjælp

Help / Hjælp Home page Lisa & Petur www.lisapetur.dk Help / Hjælp Help / Hjælp General The purpose of our Homepage is to allow external access to pictures and videos taken/made by the Gunnarsson family. The Association

Læs mere

Improving data services by creating a question database. Nanna Floor Clausen Danish Data Archives

Improving data services by creating a question database. Nanna Floor Clausen Danish Data Archives Improving data services by creating a question database Nanna Floor Clausen Danish Data Archives Background Pressure on the students Decrease in response rates The users want more Why a question database?

Læs mere

Kemi A. Studentereksamen

Kemi A. Studentereksamen Kemi A Studentereksamen 1stx111-KEM/A-18052011 nsdag den 18. maj 2011 kl. 9.00-14.00 pgavesættet består af 4 opgaver med i alt 18 spørgsmål samt 3 bilag i 2 eksemplarer. Svarene på de stillede spørgsmål

Læs mere

YNKB TEMA 6. Adventure Playgrounds Copenhagen 2003

YNKB TEMA 6. Adventure Playgrounds Copenhagen 2003 YNKB TEMA 6 YNKB TEMA 6-2003 Baldersgade 70 st tv DK 2200 N tlf +45 35851037 fax +45 35851837 www.ynkb.dk ISSN 1602-2815 Adventure Playgrounds Copenhagen 2003 The idea for adventure playgrounds originated

Læs mere

Skriftlig Eksamen Kombinatorik, Sandsynlighed og Randomiserede Algoritmer (DM528)

Skriftlig Eksamen Kombinatorik, Sandsynlighed og Randomiserede Algoritmer (DM528) Skriftlig Eksamen Kombinatorik, Sandsynlighed og Randomiserede Algoritmer (DM58) Institut for Matematik og Datalogi Syddansk Universitet, Odense Torsdag den 1. januar 01 kl. 9 13 Alle sædvanlige hjælpemidler

Læs mere

The X Factor. Målgruppe. Læringsmål. Introduktion til læreren klasse & ungdomsuddannelser Engelskundervisningen

The X Factor. Målgruppe. Læringsmål. Introduktion til læreren klasse & ungdomsuddannelser Engelskundervisningen The X Factor Målgruppe 7-10 klasse & ungdomsuddannelser Engelskundervisningen Læringsmål Eleven kan give sammenhængende fremstillinger på basis af indhentede informationer Eleven har viden om at søge og

Læs mere

GUIDE TIL BREVSKRIVNING

GUIDE TIL BREVSKRIVNING GUIDE TIL BREVSKRIVNING APPELBREVE Formålet med at skrive et appelbrev er at få modtageren til at overholde menneskerettighederne. Det er en god idé at lægge vægt på modtagerens forpligtelser over for

Læs mere

Praktikevaluering Studerende (Internship evaluation Student)

Praktikevaluering Studerende (Internship evaluation Student) Praktikevaluering Studerende (Internship evaluation Student) Husk at trykke "Send (Submit)" nederst (Remember to click "Send (Submit)" below - The questions are translated into English below each of the

Læs mere

KALK- OG TEGLVÆRKSFORENINGEN. CPR Sustainable Construction

KALK- OG TEGLVÆRKSFORENINGEN. CPR Sustainable Construction CPR Sustainable Construction 1 Tommy Bisgaard - Direktør i Kalk- og Teglværksforeningen - Formand for DS 417 (CEN TC350 & 351) - Formand for miljøkomiteen i TBE & CU (keramiske industrier i Europa) - Medlem

Læs mere

Hvad er matematik? C, i-bog ISBN 978 87 7066 499 8. 2011 L&R Uddannelse A/S Vognmagergade 11 DK-1148 København K Tlf: 43503030 Email: info@lru.

Hvad er matematik? C, i-bog ISBN 978 87 7066 499 8. 2011 L&R Uddannelse A/S Vognmagergade 11 DK-1148 København K Tlf: 43503030 Email: info@lru. 1.1 Introduktion: Euklids algoritme er berømt af mange årsager: Det er en af de første effektive algoritmer man kender i matematikhistorien og den er uløseligt forbundet med problemerne omkring de inkommensurable

Læs mere

PERSPECTIVES ON MARKETING OF GREEN ELECTRICITY:

PERSPECTIVES ON MARKETING OF GREEN ELECTRICITY: PERSPECTIVES ON MARKETING OF GREEN ELECTRICITY: MODELING CONSUMER ADOPTION, CHOICE BEHAVIOR AND CONSUMER SWITCHING By Yingkui Yang THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE

Læs mere

BIOZYMER ØVELSE 2 OPRENSNING AF PROTEINER

BIOZYMER ØVELSE 2 OPRENSNING AF PROTEINER BIOZYMER ØVELSE 2 OPRENSNING AF PROTEINER FAGLIG BAGGRUND Det forudsættes, at den grundlæggende teori bag rekombinant protein ekspression og proteinopresning er bekendt. For dette henvises til undervisningsmateriale

Læs mere

Synopsis 1. Semester Casper Daa Jørgensen

Synopsis 1. Semester Casper Daa Jørgensen Introduktion Denne synopsis er udviklet med henblik på at give et overblik over, hvad jeg har arbejdet med i løbet af det af det første semester på e-konceptudvikling, hvilke udfordringer jeg har mødt

Læs mere

Struktur og funktion af gener

Struktur og funktion af gener Molekylærbiologi og genetik S4, F2008 f Malene Munk Jørgensen Emne: Struktur og funktion af gener Link: undervisningsplanen for S4-molekylærbiologi og genetik MMJ, VI niversity ollege Bioanalytikeruddannelsen

Læs mere

Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS).

Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS). Teori til elevforløb på Institut for Biokemi og Molekylærbiologi på Syddansk Universitet: Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS). Peter Windfeldt

Læs mere

To the reader: Information regarding this document

To the reader: Information regarding this document To the reader: Information regarding this document All text to be shown to respondents in this study is going to be in Danish. The Danish version of the text (the one, respondents are going to see) appears

Læs mere

Hvor er mine runde hjørner?

Hvor er mine runde hjørner? Hvor er mine runde hjørner? Ofte møder vi fortvivlelse blandt kunder, når de ser deres nye flotte site i deres browser og indser, at det ser anderledes ud, i forhold til det design, de godkendte i starten

Læs mere

Gågade på vej i 1974-kvarteret

Gågade på vej i 1974-kvarteret Gågade på vej i 1974-kvarteret Berit Guldmann Andersen Gågaderne blev almindelige i begyndelsen af 1970 erne, og i 1974 havde de fleste købstæder af en vis størrelse mindst en gågade. Det er baggrunden

Læs mere

Er der flere farver i sort?

Er der flere farver i sort? Er der flere farver i sort? Hvad er kromatografi? Kromatografi benyttes inden for mange forskellige felter og forskningsområder og er en anvendelig og meget benyttet analytisk teknik. Kromatografi bruges

Læs mere

Terese B. Thomsen 1.semester Formidling, projektarbejde og webdesign ITU DMD d. 02/11-2012

Terese B. Thomsen 1.semester Formidling, projektarbejde og webdesign ITU DMD d. 02/11-2012 Server side Programming Wedesign Forelæsning #8 Recap PHP 1. Development Concept Design Coding Testing 2. Social Media Sharing, Images, Videos, Location etc Integrates with your websites 3. Widgets extend

Læs mere

USERTEC USER PRACTICES, TECHNOLOGIES AND RESIDENTIAL ENERGY CONSUMPTION

USERTEC USER PRACTICES, TECHNOLOGIES AND RESIDENTIAL ENERGY CONSUMPTION USERTEC USER PRACTICES, TECHNOLOGIES AND RESIDENTIAL ENERGY CONSUMPTION P E R H E I S E L BERG I N S T I T U T F OR BYGGERI OG A N L Æ G BEREGNEDE OG FAKTISKE FORBRUG I BOLIGER Fra SBi rapport 2016:09

Læs mere

Statistik for MPH: 7

Statistik for MPH: 7 Statistik for MPH: 7 3. november 2011 www.biostat.ku.dk/~pka/mph11 Attributable risk, bestemmelse af stikprøvestørrelse (Silva: 333-365, 381-383) Per Kragh Andersen 1 Fra den 6. uges statistikundervisning:

Læs mere

Dansk Standard DS/EN 61595-3 1. udgave. COPYRIGHT Danish Standards. NOT FOR COMMERCIAL USE OR REPRODUCTION. DS/EN 61595-3:2001

Dansk Standard DS/EN 61595-3 1. udgave. COPYRIGHT Danish Standards. NOT FOR COMMERCIAL USE OR REPRODUCTION. DS/EN 61595-3:2001 Dansk Standard DS/EN 61595-3 1. udgave Godkendt:2001-05-18 Digitalt lydbåndoptagersystem med flere kanaler (DATR), spoletil-spolesystem, til professionelt brug Del 3: 24-bits funktion til 16-bits medier

Læs mere

Organisk Kemi for Biologer

Organisk Kemi for Biologer rganisk Kemi for Biologer Supplerende noter Kemisk Institut Aarhus Universitet Forår 2010 Steen Uttrup Pedersen Indholdsfortegnelse Bindingsforhold.3 eduktion med NaB 4 og LiAl 4.3 versigt over Grignard

Læs mere

Patientinddragelse i forskning. Lars Henrik Jensen Overlæge, ph.d., lektor

Patientinddragelse i forskning. Lars Henrik Jensen Overlæge, ph.d., lektor Patientinddragelse i forskning Lars Henrik Jensen Overlæge, ph.d., lektor BMC Health Services Research 2014, 14:89 142 studies that described a spectrum of engagement Engagement was feasible in most settings

Læs mere

Anvendelse af DNA markører i planteforædlingen

Anvendelse af DNA markører i planteforædlingen Anvendelse af DNA markører i planteforædlingen Forsker Gunter Backes, Afdeling for Planteforskning, Forskningscentret Risø DNA-markører på kontaktfladen mellem molekylær genetik og klassisk planteforædling

Læs mere

Nr 1. Fra gen til protein

Nr 1. Fra gen til protein Nr 1 Fra gen til protein Med udgangspunkt i vedlagte illustrationer bedes du besvare følgende: Hvordan er sammenhængen mellem DNA ets nukleotider og proteinets aminosyrer? Beskriv hvad der sker ved henholdsvis

Læs mere