Fremstilling rekombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor i. Escherichiu coli. NMR spektroskopiske N-terminalt modificerede varianter af proteinet.

Størrelse: px
Starte visningen fra side:

Download "Fremstilling rekombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor i. Escherichiu coli. NMR spektroskopiske N-terminalt modificerede varianter af proteinet."

Transkript

1 Fremstilling af rekombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor i Escherichiu coli. NMR spektroskopiske studier af N-terminalt modificerede varianter af proteinet. CONNI LAURITZEN Roskilde! Universitetscenter hstitnt for og Kemi

2 Denne afhandling er et led i opfyldelsen af kravene ti1 at opnå den Naturvidenskabelige Ph.D grad. Projektets eksperimentelle arbejde. er udfort ved Institut for Biologi og Kemi ved Roskilde Universitetscenter under vejledning af lektor Ole Skovgaard, lektor Poul Erik Hansen og lektor Erik Tiichsen. Det har vaxet en stor udfordring med dette tvsxfaglige projekt, at vsere med ti1 at opdyrke grznsefladen mellem to af instituttets fagområder, molekylarbiologi og proteinkemi. Det har givet mig et bredt og meget praktisk orienteret kendskab ti1 mange discipliner, hvilket er en stor fordel for mig i min nuvzrende stilling ved Unizyme Laboratories. Jeg vi1 gerne takke alle kollegaer og studerende jeg har.-varet i kontakt med i studietiden. En saxlig tak skal rettes ti1 Ole, Erik og Poul Erik for kompetent og inspirerende vejledning. Ph.D studiet blev stottet af et stipendium fra Roskilde Universitetscenter samt af forbrugsmidler fra Carlsberg Fondet. December, 1995 Conni Lauritzen

3 Indhold Summary side DEL1 Kapitel 1. Introduktion og sammendrag Bovine pancreatic trypsin inhibitor Rekombinant protein Målsztning E. coli ekspressionssystemer Sammendrag DEL 2. Aktuelle studier Kapitel 2. Ekspression af BPTI i T7 RNA polymerase/promoter system og A P, system... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... Vektorer og bakteriestammer... Mutagenese og DNA analyse... Konstruktion af BPTI ekspressionsplasmider... Ekspression og celleekstrakter... Protein analyser... Resultater... Ekspression af BPTI i T7 RNA polymeraselpromoter systemet... Ekspression af BPTI i T7 system... Diskussion... Mutagenese

4 Ekspression i T7 system... Ekspression i h P, system... Kapitel 3. Ekspression af BPTI i MBP fusions system... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... Plasmidkonstruktioner... Ekspression og oprensning af MBP-BPTI fusionsprotein... Protein analyser... Resultater... Plasmidkonstruktioner for MBP-BPTI fusion... Ekspression af MBP-BPTI... Diskussion... Udbytte af MBP-BPTI... Amylose affinitetskromatografi... Andre BPTI ekspressionssystemer... Kapitel 4. Faktor X, kloning af MBP-BPTI og cathepsin C trimming af N-terminalt forlznget BPTI... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... FX, khning... N-terminal trimning... Protein analyser og proteinaprensning... NMR analyser... Resultater... FX, kloning af MBP-BPTI fra pruc FX, khning af MBP-BPTI fra pruc

5 Cathepsin C trimning af N-terminalt forhenget BPTI... Oprensning og udbytte... Diskussion... Faktor X,... Cathepsin C... Kapitel 5. Karakterisering af N-terminalt modiftcerede BPTI specier ved NMR spektroskopi... Abstract... Introduktion... Materialer og metoder... Protein... NMR analyser... Hydrogen udvekslingshastigheder... Titrering... Kalorimetri... Resultater... Stabiliteten af N-terminalt modificerede varianter af BPTI.. Saltbro mellem C- og N-terminal... Struktur af N-terminalt modificeret BPTI... Diskussion... Saltbro og stabilitet... Hydrogen udveksling... Struktur... REFERENCER DEL 3 Publikationer i relation til afhandling

6 snmmary The present thesis entitled Generation of recombinant Bovine Pancreatic Trypsin Inbibitor in Escherichia coli. NMR spectroscopic investigations of N- terminally modified analogues of the protein. 1s submitted to Roskilde University in preparation for obtaining the Ph.D degree. All experiments were carried out at Institute of Life Sciences and Chemistry at Roskilde University under supervision of the associate professors, Ole Skovgaard, Erik Tilchsen, and Poul Erik Hansen. The first part of the thesis is a short introduction to the bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI). BPTI is a small, globular protein consisting of 58 amino acid residues in one polypeptide chain. The exceptionally high stabilhy, high solubility and tractable size of BPTI makes it a convenient model system for various struttural and physicochemical studies. The aim of this project was to extend and impröve the use of BPTI as a model protein for NMR spectroscopy. If BPTI could be produced as a recombinant protein in a heterologous expression system, it would be possible to engineer BPTI variants, and generate isotopically labeled or enrithed BPTI. For these reasons 1 started the development of a suitable expression system for BPTI. Moreover, the first part covers the general considerations connected to the development of an expression system for BPTI. From experience, it was obvious to choose E. coli as the host organisme. However, many problems can arise when using systems based on this organisme, which includes misfolding, unstability, insolubility, incorrect N-terminal sequence ett (reviewed by Gold, 1990). The summary of the thesis in danish is also placed in the first part. The setond part, with chapters 2-5, covers the experimental work. Chapter 2 describes the preliminary experiments with the direct expression of the BPTI gene for accumulation of the product in the E. coli cytoplasm. A methionine start codan and a sequence for a short N-terminal extension peptide was added to the BPTI gene. Methionine and the extension peptide was planned to be removed from the protein product by the exopeptidase, cathepsin C (Dalboge et al., 1987). BPTI, itself, is 5

7 protected against cathepsin C digestion by its N-terminal sequence. The gene construction was placed under the control of a strong, regulated T7 RNA polymerase/promoter system (Tabor and Richardson, 1985). In subsequent experiments, a sequence encoding the OmpA signal peptide was added to the gene construction in order to get the product secreted to the periplasm. In a further attempt, the OmpA-BPTI construction was placed under the control of another strong promoter, X P,. The best results was obtained with the last mentioned construction. In expression experiments, up to mg BPTUliter of culture was measured in the total cell extratts. However, this was not satisfactory. For NMR studies of BPTI variants, lo-100 mg of the protein should be available, conveniently produced with standard laboratory facilities. Much better results were obtained with the expression system that were finally put together as described in chapter 3. Here, a vector carrying a strong hybrid promoter, P,,, regulated by the lat operator/repressor system, was used for the expression of BPTI fused to the C-terminal of an E. coli protein - the maltose-binding protein (MBP) (GUI et al., 1988; Maina et al., 1988). The fusion protein was secreted to the periplasm by the MBP signalpeptide, and here the product became fully stable. The MBP part could be used for purification of MBP-BPTI by affhrity chromatography on an amylose matrix. The yield of active BPTI fused to MBP was up to 10 mg/liter of culture. Separation of the fusion partners was prepared by insertion of the target sequence for the specific endopeptidase, factor X, (FXa) (Nagai and Thogersen, 1987) in the linking sequence and with the site of cleavage directly fused to the BPTI N-terminal arginine residue. In practice, the cleavage site had limited accessibility for FX,, and afterwards, results from NMR investigations suggested that this was due to ion-dipole interactions between the BPTI C-terminal carboxyl group and groups on the target sequence. Instead, the treatment of this MBP-BPTI fusion construction with FX, led to off-target cleavage at a somewhat homologous sequence that, by coincidence, was placed 6 residues upstream of the correct site, and so the major products was BPTI N- terminally extended with 5 or 6 residues. Experiments with cathepsin C treatment of these forms confirmed that cathepsin C is perfect for removal of N-terminal extensions 6

8 from BPTI. Treatment with FX, and cathepsin C is described in chapter 4. Finally, a new construction was created with the FX, target sequence separated from BPTI s Arg1 by a short spacing sequence designed for removal by cathepsin C. The resulting MBP-BPTI fusion protein was effectively cleaved by FX, with strongly reduced amounts of peptidase. Likewise, cathepsin C trimming was effectively carried out with small amounts of enzyme. > 98 % pure BPTI with WT-BPTI sequence could be obtained from this system in yields of 3-6 mg/liter of culture. Through the development of the expression system and the experiments with FX, and cathepsin C treatment, a whole series of N-terminally extended variants of BPTI was obtained. These variants were found very interesting. Previously, a salt bridge interaction between the chain termini had been found by Brown et al. (1978), and comparative studies of a chemically transaminated form of BPTI and the WT-BPTI had been used to determine the influence of the salt bridge on structure and stabilhy. N- terminal extension was an other way to alter or prohibit the salt bridge interaction between the BPTI N- and C-terminal, and the contribution of the salt bridge to the stability could be reinvestigated. The N-terminally extended forms of BPTI were studied by NMR spectroscopy, and the results are described in chapter 5. As a supplement, studies on a series of N-terminally mmcated forms, created by a team from Novo Nordisk, were carried out in collaboration with this team. Some of the results from experiments done by me is included in chapter 5. The extended forms were BPTI N-terminally extended with l-, 4-, S- and 6 residues. The truncated forms lack Arg1 and Pro2 and have different amino acid substitutions in addition. Effects on the structure of the variants compared to WT-BPTI were judged from changes in chemical shifts in 1D and 2D H NMR spectra. The stability of the variants were examined by amide proton exchange rates and Differential Scanning Calorimetry. Furthermore, ph titration effects on the C-terminal Ala 58 H8 chemical shift were used to indicate salt bridge interactions between the N- and C- terminal when present. NMR spectra showed a presesved overall structure of the BPTI parent protein in the extended and truncated species. Changes were lotal and in the region of the termini.

9 An important and remarkeble result was obtained for l-bpti (BPTI extended with one arginine). A salt bridge clearly is fornred in l-bpti at neutral ph, and the two tonformations have indistingueshable stabilities and dynamits. Results for the remaining extended forms and the truncated forms showed structures without salt bridge interactions, and with slightly or highly decreased stabilhy compared to WT-BPTI. The energy contribution from the salt bridge interaction was previously estimated as kcabmol from amide proton exchange data and titration data (Brown et al., 1978). Based on the present data for the extended and truncated forms, it is most likely, that the corresponding estimate for 4-BPTI represents the salt bridge, and the value was here 0.6 kcallmol. This disagreement is discussed in chapter 5. The stabilhy of the truncated forms are considerably reduced compared to WT- BPTI (3-4 kcabmol). In chapter 5, this result is compared to the reported effects of different point mutations in BPTI. The third part of the thesis brings my publications based on the Ph.D work. 8

10 DEL 1

11 Kapitel 1 Introauktion og sammendrag. Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor (BPTI) er et lille protein med en molekylvsegt på 6.5 kda bestående af 58 aminosyrer i en peptidkzde. Den tredimensionale struktur af BPTI er bestemt med stor oplsselighed i tre forskellige krystalformer ved rentgen krystallografi og neutron diffraction (Deisenhofer and Steigemann, 1975; Wlodawer et al., 1984; Wlodawer et al., 1987). Det er et globulaxt protein med regulzre sekundaxe strukturelementer, som bestar af en 3,,-helix (resteme 3 ti1 7), en fi-hairpin (resteme 18-35), en tredje antiparallel fl-streng (rest 43 ti1 45) samt en cy-helix ved C-terminalen (resteme 47-56) (se figur 1.1). Strukturen indeholder desuden tre di&idbroer (555,30-51 og 14-38). Alle aminosyrer på mer tryptofan og histidin er reprmsenteret. Der findes ikke post-translationelle modifikationer såsom glycosylering eller fosforylering. Proteinet er resistent overfor ekstreme variationer i ph og temperatur, samt overfor mange peptidaser. Desuden har BPTI en stor vandoploselighed. BPTI inhiberer trypsin og en lang rsekke andre peptidaser gennem dannelse af stabile komplekser med enzymeme. Denne inhibitor aktivitet lader sig måle i simple assays. Også strukturen af komplekset mellem BPTI og trypsin er undersogt ved krystalstruktur analyse (Rilhlmann et al., 1973). Endelig skal det nzvnes at BPTI er tilgaxrgeligt i relativt store mangder. Alle disse egenskaber ger BPTI til et ideelt modelprotein for test af nye teoretiske og eksperimentelle metoder, og som sådant har det vaxet anvendt i flere åttier. BPTI har vaxet model for et stort antal studier af statiske og dynamiske aspekter af proteiners konformation og proteiners foldning. Her skal fokuseres på dets rolle som modelprotein i forbindelse med NMR spektroskopi. Studier på BPTI har vsxet centrale i forbindelse med udvikling af metoder ti1 tilordning af protein NMR spektre, både hvad angår H kemiske skift (f.eks. Snyder et al., 10

12 Figur 1.1 Skematisk tegting af BFTI s struktur. N- og C-terminal samt hovedkzde forleb og sekundme stmkturelemen- ter er aqivet (efter Richardson, 1985). Se desuden figur 5.1 for hydrofobe kemer og disulfidbrom 1975; Wagner et al., 1981; Wagner and Wilthrich, 1982a; Tüchsen and Woodward, 1987), 13C kemiske skift (f.eks. Tiichsen and Hansen, 1988) og 15N kemiske skift (f.eks. Glushka and Cowburn, 1987). BPTI s lille molekylstorrelse resulterer i relativt simple spektre med relativt skarpe resonanser. BI TI s egenskaber har vseret nyttige ved tilordninger, idet stabiliteten overfor variationer i ph og temperatur har muliggjort mange manipulationer med proteinoplosningerne, og der igennem tilordninger baseret på f.eks. ph titreringer, hydrogen udvekslingskinetik og isotopeffekter. Den store aploselighed har gjort det muligt at arbejde med meget koncentrerede proteinoplosninger og dermed med naturligt forekommende 13C. Også i forbindelse med det banebrydende arbejde indenfor strukturopklaring af proteiner i oplosning ved hjzlp af NMR spektroskopi har BFTI vaxet den foretrukne model (Wagner et al., 1987a). Der foreligger nu en hojt oplost NMR struktur for BF TI i 11

13 oplosning og detaljerede sammenligninger med krystalstruktureme (Berndt et al., 1992). NMR spektroskopi på BPTI har yderligere vseret vigtig for udviklingen af målemetoder og tolkning af data for dynamiske fanomener som hydrogen udveksling (f.eks. Richarz et al., 1979; Hilton and Woodward, 1979; Woodward et al., 1982, Wagner and Wüthrich, 1982b; Roder et al., 1985; Tiichsen and Woodward, 1985; Tiichsen et al., 1987) og aromatiske ringflip for proteiner (f.eks. Wiithrich and Wagner, 1975; Wagner et al, 1987b). På baggrund af den store msengde eksperimentelle NMR data for BPTI s struktur og dynamik, er BPTI efterhånden også blevet en meget anvendt model inden for udviklingen af computer behandling af store data sa% (f.eks. Schiffer et al., 1994; Brunne et al., 1995). Rekombmant protein De seneste årtiers udvikling inden for molekylmr biologien har gjort det muligt at producerer eukaryote proteiner i heterologe organismer som Leks. E. di, og har yderligere muliggjort design og fremstilling af rekombinante proteiner med specifikke amdringer i aminosyresekvens. Ved at foretage små veldefinerede andringer i et protein blev det muligt at undersege eksempelvis enkelte aminosyreresters rolle i interaktioner med andre molekyler eller betydning for et proteins stabilitet. For BPTI s vedkommende havde man lange sagt svar på forskellige sporgsmål - såsom enkelte aminosyreresters indflydelse på stabilitet eller inhibitor aktivitet og specificitet - gennem arbejde med kemiske metoder ti1 sendring af proteinet; f.eks. oxidering af methionin (Kassell, 1964) transaminering (Brown et al., 1978) eller aminosyre substitution ved peptidsyntese (Beckmann et al., 1988). Med kemisk modifikation eller kemisk mutagenese er det imidlertid kun muligt at foretage visse typer af mndringer, og kun på bestemte aminosyrerester eller i bestemte områder i proteinet. Med de nye rekombinante teknikker, som i princippet muliggor alle u-enkelige aminosyre substitutioner, deletioner og indssettelser, var der udsigt ti1 at kunne foretage et spring i studiet af BPTI varianter. Kunne det lykkes at fremstille modificeret BPTI protein gennem ekspression i en heterolog organisme, ville eksempelvis detaljer om forskellige elementers bidrag ti1 BPTI s ussedvanlig hoje stabilitet, dvs. disulfidbroernes bidrag, elektrostatiske inter- 12

14 aktioners bidrag eller hydrogenbindingers bidrag kunne underseges. 1 forbindelse med NMR spektroskopi var det oplagt også at tamke på muligheden for at sendre på proteinets isotopsammensartnin gennem rekombinant produktion. Målet for mervaxende projekt var således at skabe nye muligheder for anvendelsen af BPTI som model for NMR studier. Der skulle udvikles et ekspressionssystem for BFTI, der var velegnet ti1 fremstilling af modificerede former af proteinet, dvs. et system, der var tilstrazkkeligt simpelt til, at der nemt kunne frembringes nye DNA konstruktioner og dermed protein med nye sekvenszndringer. Dyrkninger til fremstilling af mangder i storrelsesordenen lo-100 mg skulle kunne foregå med almindelige laboratorie faciliteter i kulturflasker. Sekundaert skulle det specifikke udbytte soges bragt så hojt op at der kunne fremstilles beriget eller isotopmaxket protein. Endvidere var målsztningen at udnytte de muligheder der måtte opstå for NMR studier på det frembragte protein. Interessen for de nye teknikker og muligheder var stor og udbredt. Som det beskrives i kapitel 2, blev der kort for og omkring dette projekts start publiceret de forste arbejder med fremstilling af rekombinant BPTI (Marks et al., 1986; von Wilcken-Bergmann et al., 1986; Auerswald et al., 1987; Goldenberg, 1988). Ingen af disse forsag levede dog op ti1 ovennaevnte målsmetning. At interessen for fremstilling af rekombinant BIT har vaxet endnu storre, end det da fremgik, illustreres af den serie af arbejder med varianter af BFTI, som senere er publiceret som resultat af flere forskellige laboratoriers bestrabelser på at fremstille BPTI rekombinant (f.eks. Eigenbrot et al., 1990; Housset et al., 1991; Altman et al., 1991; Danishefsky et al., 1993; Berndt et al., 1993; Otting et al., 1993; Schulman and Kim, 1994; Yu et al., 1995; Darby et al., 1995; Denisov et al., 1995). Disse arbejder bliver kommenteret i kapitel 3 og 5. E. coli ekspressionssystemer E. coli har traditionelt vaxet den foretrukne organisme inden for mikrobiologi og genetik, og på baggrund af det deraf folgende kendskab ti1 mekanismer, der styrer translation og transskription, blev det fra starten også den foretrukne organisme inden for 13

15 genteknologi og rekombinant teknik. Derfor var det naturligt at vaelge denne vaxtsorganis- me ti1 ekspression af BPTI. Der er imidlertid en rzkke aspekter der skal overvejes, og en raekke problemer der kan opstå, når man forseger at fremstille eukaryote proteiner i E. coli. Det fremgår dels af dette arbejdes resultater, dels af mange samtidige arbejder med fremstilling af andre eukaryote proteiner (Gold, 1990). E. coli er ligesom andre bakterier ikke i stand ti1 at udfore hovedparten af de post- translationelle modifikationer, som eukaryote proteiner ofte har, og E. coli kan ikke formidle den korrekte foldning af mange eukaryote proteiner. Disse to forhold blev vurderet som mindre vzsentlige for BPTI, der ikke er modificeret, og som kan folde spontant in vitro. Rent praktisk skal man som det forste skaffe den kodende sekvens (svarende ti1 genet) for det enskede protein. Genet for BPTI blev stillet ti1 radighed for dette projekt af T.E. Creighton, således at et ellers stort arbejde med isolering eller syntese blev undgået. Den kodende sekvens skal anbringes i en vektor med alle nodvendige regulatoriske elementer, for at henholdsvis transskription og translation kan initieres og termineres. Hvis det skal vaere arbejdsmaessigt fremkommeligt at fremstille det rekombinante protein, skal ekspressionsniveauet bringes op så det overstiger 1% af total proteinet. Erfaringer viser at det afgorende er, at det eukaryote gen anbringes under kontro1 af en stark og gerne regulerbar promoter, og med en optimal ribosombindende sekvens passende placeret for genet (f.eks. review af Balbas and Bolivar, 1990). Et forhold der altid må overvejes, er hvordan den korrekte N-terminal kan opnås. Peptidsyntesen i E. coli starter med formyl-methionin på den N-terminale plads, og codan for denne må derfor anbringes for den kodende sekvens. Formyl-methionin processeres ti1 methionin eller fjernes helt fra en varierende fraktion af proteinet, atltzngigt af typen af den efterfolgende aminosyrerest. Er den efterfolgende aminosyrer arginin, som er BPTI s N-terminal, bliver methionin bibeholdt 100% (Dalboge et al., 1990). Et problem, der ofte opstår, er at det rekombinante protein viser sig at vaxe ustabilt idet det nedbrydes af E. coli proteaser i cytoplasma, og det kan helt eller delvist odelzgge udbyttet. Dette viste sig at vare et stort problem for BPTI s vedkommende. Endelig kan det betyde meget for ekspressionsniveauet og for aploseligheden af et 14

16 protein, hvordan de forskellige parametre som temperatur, mediesammensmtning osv. varieres i forbindelse med selve dyrkningen af bakteriekulturen. Ligeledes ligger der et udviklingsarbejde i at finde en effektiv måde til oprensning af produktet. Rundt omkring i verden er der for, under og efter nwvzrende projekts udforelse arbejdet intenst med E. coli ekspressionssystemer med henblik på at optimere ekspressions- niveauer, imodegå ustabilitet, lette oprensning, finde metoder ti1 opnåelse af en korrekt N- terminal, ett. 1 det konkrete arbejde med at finde et velegnet ekspressionssystem for BPTI, blev der afprovet forskellige af de foreliggende muligheder. Det lykkedes at sammensztte en god metode, hvor flere elementer kombineres. Samurendrag Projektets eksperimentelle arbejde er beskrevet i fire kapitler i afhandlingens Del 2. De tire kapitler er opbygget som artikler med hver sit abstract, introduktion osv. De kilder der er kommenteret i introduktionen ti1 de enkelte kapitler, er demdei lå ti1 grund for selve arbejdet på det pågzldende tidspunkt. Nyere kilder, der berorer relevante emner er kun medtaget i de efterfolgende diskussions afsnit. 1 Del 3 findes vedlagt de publikationer, som arbejdet har resulteret i. 1 den indledende fase blev de mest merliggende muligheder for at udttykke BPTI genet afprovet. Dette er beskrevet i kapitel 2. Forst blev den BPTI kodende sekvens forsegt udtrykt direkte ved indforsel af en starmodon foran genet med forventet akkumulering af produktet i cytoplasma. En losning på problemet med at opnå den korrekte N-terminal var forberedt ved at anbringe en ganske kort forsekvens mellem starmodon og BPTI sekvens. Den resulterende N-terminale forlanrgelse skulle fjemes fra produktet med exopeptidasen, cathepsin C. BPTI er i kraft af sin aminosyresekvens beskyttet mod nedbrydning med cathepsin C. Ti1 ekspression af denne konstruktion blev anvendt et starkt og regulerbart T7 RNA polymerase/promoter system. 1 et meste trin blev konstruktionen udvidet med OmpA signalsekvensen for sekretion af produktet ti1 periplasma. Endelig blev konstruk- tionen med OmpA signalsekvensen også anbragt under kontro1 af en anden stserk, regulerbar promoter, h P,. Af denne serie konstruktioner gav sidstnaevnte det bedste resultat med et udbytte på mg BPTUI kultur for oprensning. Dette var imidlertid 15

17 ikke tilfredsstillende i forhold ti1 målsaetningen. Alt pegede på at det nysyntetiserede BPTI var ustabilt og blev nedbrudt i cytoplasma. Et langt bedre resultat blev opnået med det endelige ekspressionssystem som er beskrevet i kapitel 3. 1 dette system anvendes en stserk hybridpromoter, P,, som reguleres via et lat operatorirepressor system. BPTI molekylet stabiliseres delvist ved en fusion ti1 et E. coli protein; det maltose-bindende protein (MBP). Fusionsproteinet secemeres ti1 peri- plasma ved MBP-signalpeptidet, og her er produktet helt stabilt. MBP delen udnyttes ti1 at oprense fusionsproteinet ved affinitetskromatografi på en amylose matrix. Aktivt BIT1 fusioneret ti1 MBP kunne således oprenses i et udbytte på op mod 10 mg/1 kultur. En frigorelse af BIT1 fra MBP var forberedt ved at indsaette målsekvensen for den specifikke endopeptidase factor X, (FX3 i overgangen mellem de to fusionspartnere, således at den proteolytiske klovning ville ske urniddelbart for BPTI s N-terminal. Dette kunne dog ikke anvendes i praksis, som det er beskrevet i kapitel 4. FX, målsekvensen viste sig at have en meget lav tilgangelighed, når den var direkte fusioneret ti1 BPTI s Argl. NMR undersogelser viste senere, at det forntentlig skyldes interaktioner mellem BPTI s C-terminale carboxylsyregruppe og grupper i målsekvensen. FX, behandling af denne fusionskonstruktion gav i stedet off-target klovning ved en delvis homolog sekvens, der helt utilsigtet var placeret seks aminosyrerester for den korrekte malsekvens og resulta- tet var BPTI med en N-terminal forlamgelse på 6 eller 5 aminosyrer. Eksperimenter med catbepsin C behandling af disse produkter bekrzeftede at cathepsin C trimning er ideel ti1 fjemelse af forsekvenser fra BPTI. Derfor sammensattes ti1 sidst en konstruktion, hvor FX, malsekvensen var adskilt fra BPTI s Arg1 af en kort linkersekvens. Resultatet var et MBP- BPTI fusionsprotein, som effektivt lod sig spalte af FX, med et meget begrrenset peptidase forbrug. Den efterfolgende cathepsin C trimning forlob ligeledes effektivt med lavt enzym forbrug. 98 % rent BPTI med WT sekvens kunne oprenses i et udbytte på 3-6 mg/l kultur. Hermed var det lykkedes at udvikle et ekspressionssystem for BPTI, der var nemt at arbejde med, som gav et godt udbytte, og som resulterede i protein med korrekt N- terminal- og intern sekvens. MBP-BPTI systemet opfyldte målsztningen for velegnethed i forhold ti1 fremstilling af mutant protein, men var desvmrre ikke brugbart ti1 fremstilling af murket eller beriget protein. Som det beskrives i kapitel 2 og 3, var MBP-BPTI 16

18 systemet ved sammenligning med de tidligt publicerede systemer for ekspression af BIT1 langt bedre. Andre tilsvarende gode eller bedre ekspressionssystemer for BPTI er senere publiceret. Blandt disse findes der systemer med eukaryote vzettsorganismer, der er velegnede ti1 isotopmaerkning af proteinet. For hovedparten af de studier af varianter af BPTI, der siden er publiceret, er proteinet dog fremstillet ved systemer med lave udbytter, systemer der indebzrer brug af toksiske kemikalier, og som resulterer i indbyggede mndringer i N-terminal- og intern sekvens (uddybes i kapitel 3). Udviklingen af ekspressionssystemet og eksperimenteme med FX, og cathepsin C behandling resulterede i, at der kunne oprenses en serie af N-terminalt forlamgede BPTI varianter. Disse varianter blev furidet ganske interessante. Brown et al. (1978) havde vist, at der for BPTI i oplosning findes en saltbro mellem den N-terminale amino gruppe på Arg1 og den C-terminale carboxylsyre gruppe på Ala i det neutrale ph område. Stabili- seringsbidraget fra denne saltbro var blevet bestemt ud fra sammenlignende studier af en variant, hvor saltbroen var fjemet ved kemisk transaminering. Hos de forlamgede BPTI varianter er den N-terminale aminogruppe flyttet ud på ekstensionspeptidet. Det krzever en ny geometri for - eller forhindrer fuldstzndig dannelsen af en saltbro interaktion, og det gav en ny mulighed for at studere det stabiliseringsbidrag der er forbundet med saltbroen. Valget faldt derfor på at koncentrere den anden del af Ph.D projektet om disse varianter. 1 en naturlig forlamgelse af arbejdet med ekstenderede former af BPTI kom et samarbejde med en gruppe fra Novo Nordisk, som gennem udviklingen af et gzr ekspressionssystem for BPTI havde fremstillet N-terminalt forkortede varianter af proteinet. Karakteriseringen af de forskellige varianter ved NMR spektroskopi er beskrevet i kapitel 5. Serien af forlazngede varianter bestod af BPTI N-terminalt forlamget med 1,4,.5 eller 6 aminosyrerester. De to forkortede varianter manglede begge Arg1 og Pro2, og desuden havde den ene en aminosyresubstitution (R42S). Stabiliteten af BPTI varianteme blev undersegt ved amidproton isotop udvekslingshastigheder og microkalorimetri. 1 ovrigt blev ph titreringseffekter brugt ti1 at foretage en undersogelse af eksistensen af en saltbro mellem N- og C-terminal. Strukturandringer for varianteme i forhold ti1 WT-BPTI blev bedomt ud fra kemiske skift i 1D og 2D H NMR spektre. Den overordnede struktur af varianteme adskilte sig ikke fra WT-BPTI s struktur. 17

19 Strukturandringeme var lokale og var koncentreret omkring terminaleme. Et vmsentligt og overraskende resultat sås for l-bit1 (BIT1 forlamget med en arginin). l-bfti danner en struktur, der har fuldstamdig samme stabilitet som WT-BPTI, og l-bit har ligesom denne en saltbro interaktion mellem C- og N-terminal i det neutrale ph område. Arbejdet med de ovrige forhengede og forkortede former afslorede strukturer uden saltbro, og viste i varierende grad nedsat stabilitet i forhold ti1 WT-BFTI. Studiet af transamineret BIT1 havde fort ti1 et estimat af saltbro interaktionens stabili- seringsbidrag på kcahmol (Brown et al., 1978). Det tilsvarende estimat baseret på hydrogen udvekslingshastigheder for de forhengede og forkortede former var ikke i overensstemmelse hemred. Dette diskuteres i kapitel 5. Det vurderes at resultatet for 4- BPTI er mermest på at reprsesentere det rene saltbro bidrag, og her er estimatet på ca 0.6 kcahmol. De forkortede varianter var meget destabiliserede (3-4 kcahmol). 1 kapitel 5 sammenholdes dette resultat med effekten af andre kendte mutationer i BPTI. 18

20 DEL 2

Danmarks Tekniske Universitet

Danmarks Tekniske Universitet Side 1 of 17 Danmarks Tekniske Universitet Skriftlig prøve, den 21/1-2013 Kursus navn: Kursus nr. 27633 Introduktion til Bioinformatik Tilladte hjælpemidler: Alle "Vægtning" Angivet ved de individuelle

Læs mere

Bilag. Resume. Side 1 af 12

Bilag. Resume. Side 1 af 12 Bilag Resume I denne opgave, lægges der fokus på unge og ensomhed gennem sociale medier. Vi har i denne opgave valgt at benytte Facebook som det sociale medie vi ligger fokus på, da det er det største

Læs mere

Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS).

Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS). Teori til elevforløb på Institut for Biokemi og Molekylærbiologi på Syddansk Universitet: Protein identifikation ved hjælp af Matrix- Assisted Laser Desorption Masse Spektrometri (MALDI-MS). Peter Windfeldt

Læs mere

Bakterier Venner eller fjender?

Bakterier Venner eller fjender? Akademiet for Talentfulde Unge 2013: Bakterier Venner eller fjender? Ole Skovgaard olesk@ruc.dk Ole Skovgaard, 2013 Bakterier: Er en ur-gammel livsform! Indeholder langt større variationer end de store

Læs mere

BIOZYMER ØVELSE 2 OPRENSNING AF PROTEINER

BIOZYMER ØVELSE 2 OPRENSNING AF PROTEINER BIOZYMER ØVELSE 2 OPRENSNING AF PROTEINER FAGLIG BAGGRUND Det forudsættes, at den grundlæggende teori bag rekombinant protein ekspression og proteinopresning er bekendt. For dette henvises til undervisningsmateriale

Læs mere

PERSPECTIVES ON MARKETING OF GREEN ELECTRICITY:

PERSPECTIVES ON MARKETING OF GREEN ELECTRICITY: PERSPECTIVES ON MARKETING OF GREEN ELECTRICITY: MODELING CONSUMER ADOPTION, CHOICE BEHAVIOR AND CONSUMER SWITCHING By Yingkui Yang THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE

Læs mere

Terese B. Thomsen 1.semester Formidling, projektarbejde og webdesign ITU DMD d. 02/11-2012

Terese B. Thomsen 1.semester Formidling, projektarbejde og webdesign ITU DMD d. 02/11-2012 Server side Programming Wedesign Forelæsning #8 Recap PHP 1. Development Concept Design Coding Testing 2. Social Media Sharing, Images, Videos, Location etc Integrates with your websites 3. Widgets extend

Læs mere

Side 1 af 13. Eksamen: Bioinformatik It og Sundhed 27 Jan 2011 kl 9-13

Side 1 af 13. Eksamen: Bioinformatik It og Sundhed 27 Jan 2011 kl 9-13 Side1af13 Eksamen: Bioinformatik It og Sundhed 27 Jan 2011 kl 9-13 Navn: Studie nummer: Dette eksamenssæt vil også kunne ses som en pdf fil nederst på kursus-hjemmesiden udfor den sidste dag d. 27 Jan

Læs mere

Bioteknologi A. Studentereksamen. Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares. Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares.

Bioteknologi A. Studentereksamen. Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares. Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares. Bioteknologi A Studentereksamen Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares. Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares. frs111-btk/a-31052011 Tirsdag den 31. maj 2011 kl. 9.00-14.00

Læs mere

Struktur og funktion af gener

Struktur og funktion af gener Molekylærbiologi og genetik S4, F2008 f Malene Munk Jørgensen Emne: Struktur og funktion af gener Link: undervisningsplanen for S4-molekylærbiologi og genetik MMJ, VI niversity ollege Bioanalytikeruddannelsen

Læs mere

Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab En baglæns besked gemt i HD-genet?

Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab En baglæns besked gemt i HD-genet? Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab En baglæns besked gemt i HD-genet? Lyn dine gener op! En baglæns besked, gemt i 'backup-dna'et'

Læs mere

Bookingmuligheder for professionelle brugere i Dansehallerne 2015-16

Bookingmuligheder for professionelle brugere i Dansehallerne 2015-16 Bookingmuligheder for professionelle brugere i Dansehallerne 2015-16 Modtager man økonomisk støtte til et danseprojekt, har en premieredato og er professionel bruger af Dansehallerne har man mulighed for

Læs mere

RentCalC V2.0. 2012 Soft-Solutions

RentCalC V2.0. 2012 Soft-Solutions Udlejnings software Vores udvikling er ikke stoppet!! by Soft-Solutions RentCalC, som er danmarks ubetinget bedste udlejnings software, kan hjælpe dig med på en hurtigt og simple måde, at holde styr på

Læs mere

27611 Eksamen Sommer 2007

27611 Eksamen Sommer 2007 - Side 1 af 10-27611 Eksamen Sommer 2007 Dette sæt indeholder 4 opgaver. En online version af opgavesættet vil være tilgængeligt fra kursets lektionsplan, under selve eksamen (25. Maj 2007 klokken 9:00

Læs mere

Nr 1. Fra gen til protein

Nr 1. Fra gen til protein Nr 1 Fra gen til protein Med udgangspunkt i vedlagte illustrationer bedes du besvare følgende: Hvordan er sammenhængen mellem DNA ets nukleotider og proteinets aminosyrer? Beskriv hvad der sker ved henholdsvis

Læs mere

(Text with EEA relevance)

(Text with EEA relevance) 24.4.2015 EN Official Journal of the European Union L 106/79 COMMISSION IMPLEMENTING DECISION (EU) 2015/646 of 23 April 2015 pursuant to Article 3(3) of Regulation (EU) No 528/2012 of the European Parliament

Læs mere

Biotechnology Explorer

Biotechnology Explorer Biotechnology Explorer Oprensning af genomisk DNA fra plantemateriale Manual Katalog nr. 166-5005EDU explorer.bio-rad.com Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen, Nærum Gymnasium, februar 2009

Læs mere

Hvor er mine runde hjørner?

Hvor er mine runde hjørner? Hvor er mine runde hjørner? Ofte møder vi fortvivlelse blandt kunder, når de ser deres nye flotte site i deres browser og indser, at det ser anderledes ud, i forhold til det design, de godkendte i starten

Læs mere

Userguide. NN Markedsdata. for. Microsoft Dynamics CRM 2011. v. 1.0

Userguide. NN Markedsdata. for. Microsoft Dynamics CRM 2011. v. 1.0 Userguide NN Markedsdata for Microsoft Dynamics CRM 2011 v. 1.0 NN Markedsdata www. Introduction Navne & Numre Web Services for Microsoft Dynamics CRM hereafter termed NN-DynCRM enable integration to Microsoft

Læs mere

Isolering af DNA fra løg

Isolering af DNA fra løg Isolering af DNA fra løg Formål: At afprøve en metode til isolering af DNA fra et levende væv. At anvende enzymer.. Indledning: Isolering af DNA fra celler er første trin i mange molekylærbiologiske undersøgelser.

Læs mere

how to save excel as pdf

how to save excel as pdf 1 how to save excel as pdf This guide will show you how to save your Excel workbook as PDF files. Before you do so, you may want to copy several sheets from several documents into one document. To do so,

Læs mere

Tag dine gener om halsen. Isoler dit eget DNA, og lav et halssmykke ud af det.

Tag dine gener om halsen. Isoler dit eget DNA, og lav et halssmykke ud af det. Samarbejde mellem gymnasier og Aarhus Universitet Bioteknologiske eksperimenter Tag dine gener om halsen. Isoler dit eget DNA, og lav et halssmykke ud af det. Denne øvelse er baseret på øvelseskittet:

Læs mere

Lord Rayleigh (1842-1919, born John William Strutt) Density of Nitrogen

Lord Rayleigh (1842-1919, born John William Strutt) Density of Nitrogen Lord Rayleigh (1842-1919, born John William Strutt) Density of Nitrogen Nature 46, 512 (1892) I am much puzzled by some recent results as to the density of nitrogen, and shall be obliged if any of your

Læs mere

KEA The sky is the limit 20. November 2013

KEA The sky is the limit 20. November 2013 KEA The sky is the limit 20. November 2013 Agenda Kort om Dansk Standard og standarder Dansk Standard er den nationale standardiseringsorganisation i Danmark Omsætning DKK 194 mio.kr. 160 medarbejdere

Læs mere

LANDSCAPE SPRAWL. Marie Markman, billedkunstner, cand.hort.arch., ph.d.

LANDSCAPE SPRAWL. Marie Markman, billedkunstner, cand.hort.arch., ph.d. LANDSCAPE SPRAWL Marie Markman, billedkunstner, cand.hort.arch., ph.d. LANDSKABSSPREDNING Marie Markman, billedkunstner, cand.hort.arch., ph.d. I Center for Strategisk Byforskning har vi de sidste 10 år

Læs mere

User guide - For testing SFTP and HTTP/S data communication

User guide - For testing SFTP and HTTP/S data communication User guide - For testing SFTP and HTTP/S data communication with Nets Danmark A/S P. 1-9 Index General information... 3 Introduction... 3 Rights... 3 Limitations... 3 Prerequisites... 3 Preparations...

Læs mere

Fotosyntetisk produktion af hydrogen med genmodificerede mikroorganismer

Fotosyntetisk produktion af hydrogen med genmodificerede mikroorganismer Fotosyntetisk produktion af hydrogen med genmodificerede mikroorganismer Forskerspirer 2009 Hovedområde: NAT Niels Christian Sanden ncsanden@hotmail.com Forskerkontakt: Poul Erik Jensen Værtsinstitution:

Læs mere

Ilisimatusarfik HD Dimittender 2011

Ilisimatusarfik HD Dimittender 2011 HD dimittender 2011 Louise Langholz lol@ral.gl Forandringsledelse Fra forståelse til handling en planlagt organisationsforandring En undersøgelse af hvordan Royal Arctic Line A/S gennemfører etablering

Læs mere

ÅRSREGNSKAB 2009. Pressemøde. Peter Straarup. Ordførende direktør. Tonny Thierry Andersen. Koncernøkonomidirektør. 4. februar 2010

ÅRSREGNSKAB 2009. Pressemøde. Peter Straarup. Ordførende direktør. Tonny Thierry Andersen. Koncernøkonomidirektør. 4. februar 2010 ÅRSREGNSKAB 2009 Pressemøde 4. februar 2010 Peter Straarup Ordførende direktør Tonny Thierry Andersen Koncernøkonomidirektør Årets resultat 2009: Overskud trods den største realøkonomiske tilbagegang i

Læs mere

Hvordan måles sociale relationer ved surveymetode? Erfaringer fra danske kohortestudier

Hvordan måles sociale relationer ved surveymetode? Erfaringer fra danske kohortestudier Afdeling for Social Medicin, Institut for Folkesundhedsvidenskab Hvordan måles sociale relationer ved surveymetode? Erfaringer fra danske kohortestudier Lektor cand.med., ph.d. Rikke Lund Afdeling for

Læs mere

Undervisningsbeskrivelse for STX 2m Kemi B

Undervisningsbeskrivelse for STX 2m Kemi B Undervisningsbeskrivelse for STX 2m Kemi B Termin Afslutning i juni skoleår 13/14 Institution Marie Kruses Skole Uddannelse Fag og niveau Lærer(e) Hold STX Kemi A valgfag Hasse Bonde Rasmussen 3gKE Denne

Læs mere

Da beskrivelserne i danzig Profile Specification ikke er fuldt færdige, foreslås:

Da beskrivelserne i danzig Profile Specification ikke er fuldt færdige, foreslås: NOTAT 6. juni 2007 J.nr.: 331-3 LEA Bilag A danzig-møde 15.6.2007 Opdatering af DAN-1 og danzig Profile Specification Forslag til opdatering af Z39.50 specifikationerne efter udgivelse af Praksisregler

Læs mere

Testet i udlandet. Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 11-11-2013. Forfatter: Janus Vang, Ph.D.

Testet i udlandet. Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 11-11-2013. Forfatter: Janus Vang, Ph.D. 11-11-2013 Testet i udlandet Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 Forfatter: Janus Vang, Ph.D. ANSVARLIG: REGIN W. DALSGAARD, BESTYRELSESFORMAND FOR VINNUFRAMI INTRODUKTION Færøernes

Læs mere

Kortlægning af interaktion mellem IFN λ3 og IL- 10R2

Kortlægning af interaktion mellem IFN λ3 og IL- 10R2 Kortlægning af interaktion mellem IFN λ3 og IL- 10R2 Et eksperimentelt bachelor projekt i molekylærbiologi Af Sanne Ea Jørgensen 20084660 Ved associated professor Rune Hartmann Molekylærbiologisk institut

Læs mere

Trolling Master Bornholm 2013

Trolling Master Bornholm 2013 Trolling Master Bornholm 2013 (English version further down) Tilmeldingerne til 2013 I dag nåede vi op på 77 tilmeldte både. Det er lidt lavere end samme tidspunkt sidste år. Til gengæld er det glædeligt,

Læs mere

Kapitalstruktur i Danmark. M. Borberg og J. Motzfeldt

Kapitalstruktur i Danmark. M. Borberg og J. Motzfeldt Kapitalstruktur i Danmark M. Borberg og J. Motzfeldt KORT OM ANALYSEN Omfattende studie i samarbejde med Økonomisk Ugebrev Indblik i ledelsens motiver for valg af kapitalstruktur Er der en optimal kapitalstruktur

Læs mere

2013 SP1. Konfiguration af koncernindblik. Configuration Guide

2013 SP1. Konfiguration af koncernindblik. Configuration Guide 2013 SP1 Konfiguration af koncernindblik Configuration Guide Intellectual Property Rights This document is the property of ScanJour. The data contained herein, in whole or in part, may not be duplicated,

Læs mere

Afbestillingsforsikring

Afbestillingsforsikring Afbestillingsforsikring Sygdomsafbestillingsforsikring ved akut sygdom, ulykke. Da afbestilling på grund af akut sygdom, ulykke m.m. ikke fritager deltagerne for betaling, kan det anbefales, at der tegnes

Læs mere

Application form - au pair (please use block capial letters when filling in the form)

Application form - au pair (please use block capial letters when filling in the form) Application form - au pair (please use block capial letters when filling in the form) Au Pairs International Sixtusvej 15, DK-2300 Copenhagen S Tel: +45 3284 1002, Fax: +45 3284 3102 www.aupairsinternational.com,

Læs mere

EVENT DESCRIPTION RES-e Regions

EVENT DESCRIPTION RES-e Regions EVENT DESCRIPTION RES-e Regions Title: Visions for Solar Energy & Sustainable Energy Systems for Cities Date & location: 18 April 2007, Copenhagen Organizer: SolarCity Copenhagen and DTI Number of Participants:

Læs mere

Case studie. Fodringsforsøg. Skravad Mølle Dambrug

Case studie. Fodringsforsøg. Skravad Mølle Dambrug Case studie Fodringsforsøg på Skravad Mølle Dambrug Vækst og foderudnyttelse hos økologiske regnbueørreder fodret med 2 typer fiskefoder til økologisk opdræt af Alfred Jokumsen og Villy Juul Larsen 0 Summary

Læs mere

Syv transmembrane receptorer

Syv transmembrane receptorer Syv transmembrane receptorer Receptoren som kommunikationscentral Cellemembranen definerer grænsen mellem en celles indre og ydre miljø, der er meget forskelligt. Det er essentielt for cellens funktion

Læs mere

The New Line Copenhagen-Ringsted. Bentleyusers.dk 14 November 2011

The New Line Copenhagen-Ringsted. Bentleyusers.dk 14 November 2011 The New Line Copenhagen-Ringsted Bentleyusers.dk 14 November 2011 Rail transport in Denmark The history of rail transport in Denmark began in 1847 with the opening of a railway line between Copenhagen

Læs mere

Evalueringsformer i HCI Design & evaluering Design og evaluering integrerede aktiviteter (studér kundernes arbejde - designe - evaluér - iterér)

Evalueringsformer i HCI Design & evaluering Design og evaluering integrerede aktiviteter (studér kundernes arbejde - designe - evaluér - iterér) Evalueringsformer i HCI Design & evaluering Design og evaluering integrerede aktiviteter (studér kundernes arbejde - designe - evaluér - iterér) Teknikker til design omfatter: Opgave/arbejdsanalyser Brugerinddragelse,

Læs mere

Sunlite pakke 2004 Standard (EC) (SUN SL512EC)

Sunlite pakke 2004 Standard (EC) (SUN SL512EC) Sunlite pakke 2004 Standard (EC) (SUN SL512EC) - Gruppering af chasere igen bag efter. På den måde kan laves cirkelbevægelser og det kan 2,787.00 DKK Side 1 Sunlite pakke 2006 Standard (EC) LAN (SUN SL512EC

Læs mere

Genomics og big data sikrer ny indsigt i sygdom og nye muligheder for sundhedsvæsenet

Genomics og big data sikrer ny indsigt i sygdom og nye muligheder for sundhedsvæsenet Genomics og big data sikrer ny indsigt i sygdom og nye muligheder for sundhedsvæsenet Exiqons cloud-løsning hjælper forskere med at analysere og forstå genomics og big data Hvad er genomics? Genomics er

Læs mere

Godkendelse produktionslokale genetisk modificerede Escherichia coli

Godkendelse produktionslokale genetisk modificerede Escherichia coli Immunitrack ApS Københavns Biocenter Ole Maaløes Vej 5 2200 København N Pesticider og Genteknologi J.nr. MST-6840-00021 Ref. johpe Den 04. august 2015 Godkendelse af produktionslokale og genetisk modificerede

Læs mere

Vind Seminar Fredericia 4. april 2013 JOB2SEA

Vind Seminar Fredericia 4. april 2013 JOB2SEA Vind Seminar Fredericia 4. april 2013 JOB2SEA Rekrutteringsstrategi i et svært marked. Helle Drachmann Baggrund Job- & CV database Outplacement & transition management Koncern HR Selvstændig virksomhed

Læs mere

Fra DNA til protein - lærerens tekst

Fra DNA til protein - lærerens tekst Fra DNA til protein - lærerens tekst Af sidsel sangild Denne øvelse handler om proteinsyntese og proteiners foldning. Den giver mulighed for at danne nogle andre billeder af fænomenet, end man får ved

Læs mere

From Human Factors to Human Actors - The Role of Psychology and Human-Computer Interaction Studies in System Design

From Human Factors to Human Actors - The Role of Psychology and Human-Computer Interaction Studies in System Design ? VAD From Human Factors to Human Actors - The Role of Psychology and Human-Computer Interaction Studies in System Design? VEM Skrevet af Liam J. Bannon Director of the IDC and Professor of Computer Science,

Læs mere

BILAG 8.1.B TIL VEDTÆGTER FOR EXHIBIT 8.1.B TO THE ARTICLES OF ASSOCIATION FOR

BILAG 8.1.B TIL VEDTÆGTER FOR EXHIBIT 8.1.B TO THE ARTICLES OF ASSOCIATION FOR BILAG 8.1.B TIL VEDTÆGTER FOR ZEALAND PHARMA A/S EXHIBIT 8.1.B TO THE ARTICLES OF ASSOCIATION FOR ZEALAND PHARMA A/S INDHOLDSFORTEGNELSE/TABLE OF CONTENTS 1 FORMÅL... 3 1 PURPOSE... 3 2 TILDELING AF WARRANTS...

Læs mere

To set new standards of lifting and transportation equipment for wind turbine components. Our product groups

To set new standards of lifting and transportation equipment for wind turbine components. Our product groups To set new standards of lifting and transportation equipment for wind turbine components. Our product groups Embracing the full life cycle of the wind turbine Liftra develops and supplies services to

Læs mere

Baltic Development Forum

Baltic Development Forum Baltic Development Forum 1 Intelligent Water Management in Cities and Companies developing and implementing innovative solutions to help achieve this objective. Hans-Martin Friis Møller Market and Development

Læs mere

Trolling Master Bornholm 2013

Trolling Master Bornholm 2013 Trolling Master Bornholm 2013 (English version further down) Tilmeldingerne til 2013 I dag nåede vi op på 85 tilmeldte både. Det er stadig lidt lavere end samme tidspunkt sidste år. Tilmeldingen er åben

Læs mere

Bilag 2 og 3 og værktøjer

Bilag 2 og 3 og værktøjer Bilag 2 og 3 og værktøjer Lars Erik Storgaard Geodatastyrelsen, laers@gst.dk Program for workshop Geodatastyrelsen Formål hvorfor workshop? Kvalificering af listen over myndigheder Temakammerater Opmærksomhed

Læs mere

Modulationer i trådløs kommunikation

Modulationer i trådløs kommunikation Modulationer i trådløs kommunikation Valg af modulationstype er et af de vigtigste valg, når man vil lave trådløs kommunikation. Den rigtige modulationstype kan afgøre, om du kan fordoble din rækkevidde

Læs mere

Kresten Cæsar Torp Supplerende materiale til Biokemibogen liv, funktion, molekyle

Kresten Cæsar Torp Supplerende materiale til Biokemibogen liv, funktion, molekyle BIOINFORMATIK Kresten Cæsar Torp Supplerende materiale til Biokemibogen liv, funktion, molekyle indhold DNA 2 Hvilke databaser skal man vælge? 2 Søgning på en nukleotidsekvens 2 Proteiner 4 Søgning på

Læs mere

Danish Technology Center Denmark

Danish Technology Center Denmark Danish Technology Center Denmark INDUSTRIAL Wastewater Treatment Systems A B C FiltraCon Filtration Systems FiltraSep Separation Filtration Systems FiltraFlo Filtration Flotation Systems APPLICATION

Læs mere

Idekatalog. Så vidt jeg husker fremgik det ret tydeligt hvad der skulle være i ansøgningen. Der var bare virkelig mange informationer der skulle med.

Idekatalog. Så vidt jeg husker fremgik det ret tydeligt hvad der skulle være i ansøgningen. Der var bare virkelig mange informationer der skulle med. Ansøgning Yderligere bemærkninger til ansøgningen Det var fedt at rammerne var så åbne, som jeg så det var der kun to krav til projektet: Det skulle være open source og det skulle have det offentliges

Læs mere

Coalitions and policy coordination

Coalitions and policy coordination Coalitions and policy coordination This page intentionally left blank Mikkel Mailand Coalitions and policy coordination Revision and impact of the European Employment Strategy DJØF Publishing Copenhagen

Læs mere

Trolling Master Bornholm 2013

Trolling Master Bornholm 2013 Trolling Master Bornholm 2013 (English version further down) Tilmeldingen åbner om to uger Mandag den 3. december kl. 8.00 åbner tilmeldingen til Trolling Master Bornholm 2013. Vi har flere tilmeldinger

Læs mere

Matematikken former morgendagens satellitter

Matematikken former morgendagens satellitter Matematikken former morgendagens satellitter Michael Lumholt Adm. Direktør ml@ticra.com "Fremtidens matematik" Maj 2014, KU/DTU Page 1 Agenda Kort introduktion til TICRA Eksempler på hvordan vi arbejder

Læs mere

NDRG2 s Interaction with Api5

NDRG2 s Interaction with Api5 Naturvidenskabeligt Basisstudium Roskilde Universitet 2. semesterprojekt Juni 2012 Hus 13.1 NDRG2 s Interaction with Api5 NDRG2 s interaktion med Api5 Gruppe 12: Freya Armstrong Annaleigh Ohrt Fehler Cecilie

Læs mere

Markup - Why? How? Espen S. Ore University of Oslo

Markup - Why? How? Espen S. Ore University of Oslo Markup - Why? How? Espen S. Ore University of Oslo What is markup? (My working definition/description) Markup is what is done so that a part of a document (a text, an image, a sound file etc.) can be identified,

Læs mere

What s Love Got to Do With It?

What s Love Got to Do With It? What s Love Got to Do With It? Gram Grid Present Continuous Vi sætter verberne i ing-form, når vi vil beskrive at noget er i gang. Der er fire hovedkategorier af ing-form: 1 Den almindelige form (common

Læs mere

Lykken er så lunefuld Om måling af lykke og tilfredshed med livet, med fokus på sprogets betydning

Lykken er så lunefuld Om måling af lykke og tilfredshed med livet, med fokus på sprogets betydning Lykken er så lunefuld Om måling af lykke og tilfredshed med livet, med fokus på sprogets betydning Jørgen Goul Andersen (email: goul@ps.au.dk) & Henrik Lolle (email: lolle@dps.aau.dk) Måling af lykke eksploderer!

Læs mere

Den gode User Experience. Michelle Andreassen ITAddiction Blogs: QED.dk

Den gode User Experience. Michelle Andreassen ITAddiction Blogs: QED.dk Den gode User Experience Mathilde Hoeg mathildehoeg Michelle Andreassen ITAddiction Blogs: QED.dk Agenda Hvad er brugeroplevelse (UX)? Hvad er en user experience designer? Hvad er brugervenlighed(usability)?

Læs mere

Get Instant Access to ebook Udleveret PDF at Our Huge Library UDLEVERET PDF. ==> Download: UDLEVERET PDF

Get Instant Access to ebook Udleveret PDF at Our Huge Library UDLEVERET PDF. ==> Download: UDLEVERET PDF UDLEVERET PDF ==> Download: UDLEVERET PDF UDLEVERET PDF - Are you searching for Udleveret Books? Now, you will be happy that at this time Udleveret PDF is available at our online library. With our complete

Læs mere

Use and users of Complementary and Alternative Medicine among people with Multiple Sclerosis in Denmark

Use and users of Complementary and Alternative Medicine among people with Multiple Sclerosis in Denmark F A C U L T Y O F H E A L T H A N D M E D I C A L S C I E N C E S U N I V E R S I T Y O F C O P E N H A G E N PhD thesis Lasse Skovgaard Use and users of Complementary and Alternative Medicine among people

Læs mere

BILAG 8.1.F TIL VEDTÆGTER FOR EXHIBIT 8.1.F TO THE ARTICLES OF ASSOCIATION FOR

BILAG 8.1.F TIL VEDTÆGTER FOR EXHIBIT 8.1.F TO THE ARTICLES OF ASSOCIATION FOR BILAG 8.1.F TIL VEDTÆGTER FOR ZEALAND PHARMA A/S EXHIBIT 8.1.F TO THE ARTICLES OF ASSOCIATION FOR ZEALAND PHARMA A/S INDHOLDSFORTEGNELSE/TABLE OF CONTENTS 1 FORMÅL... 3 1 PURPOSE... 3 2 TILDELING AF WARRANTS...

Læs mere

- Få mest muligt ud af opgaveskrivningen!

- Få mest muligt ud af opgaveskrivningen! - Få mest muligt ud af opgaveskrivningen! En eksamensopgave Forarbejdet Opgaveformuleringen Disposition og layout Dokumentation Selvstændighed Abstract Vurderingskriterier Alle regler står i pjecen om

Læs mere

Ovl. Hans Mørch Jensen Prof. L. V. Kessing. Prof. Ø. Lidegaard Prof. P. K. Andersen PhD, MD, L. H. Pedersen Biostatistiker Randi Grøn

Ovl. Hans Mørch Jensen Prof. L. V. Kessing. Prof. Ø. Lidegaard Prof. P. K. Andersen PhD, MD, L. H. Pedersen Biostatistiker Randi Grøn Ovl. Hans Mørch Jensen Prof. L. V. Kessing. Prof. Ø. Lidegaard Prof. P. K. Andersen PhD, MD, L. H. Pedersen Biostatistiker Randi Grøn Disposition: Flere fødselskomplikationer hos kvinder der har anvendt

Læs mere

PSO-F&U 3629 Forskning og udvikling af 2. generations PEC solceller

PSO-F&U 3629 Forskning og udvikling af 2. generations PEC solceller PSO-F&U 3629 Forskning og udvikling af 2. generations PEC solceller Indsatsområde: Solceller Tidsplan PSO omkostninger Projektorganisation: Teknologisk Institut sep. 2001 til sep. 2003 4.4 mio. kr. PSO

Læs mere

Rentemarkedet. Markedskommentarer og prognose. Kilde, afdækning Dato 12. august 2014

Rentemarkedet. Markedskommentarer og prognose. Kilde, afdækning Dato 12. august 2014 Rentemarkedet Markedskommentarer og prognose Kilde, afdækning Dato 12. august 2014 Rentemarkedet DKK siden august og fremover 2.5 2 1.5 1 0.5 August 2013 NU Vores forventning til renteniveauet om 1 år

Læs mere

Teknisk rapport 06-02 Dansk vejr siden 1874 - måned for måned med temperatur, nedbør og soltimer samt beskrivelser af vejret with English translations

Teknisk rapport 06-02 Dansk vejr siden 1874 - måned for måned med temperatur, nedbør og soltimer samt beskrivelser af vejret with English translations Dansk vejr siden 1874 - måned for måned med temperatur, nedbør og soltimer samt beskrivelser af vejret with English translations John Cappelen og Bent Vraae Jørgensen København 2006 www.dmi.dk/dmi/tr06-02

Læs mere

Hvilke typer koder findes der?

Hvilke typer koder findes der? Introduktion Hvilke typer koder findes der? Responsmekanismer og benchmark ifht. sms. Øg din ROI på din medieinvestering Hvad er det der bygger bro efter din kunde har scannet kode Payment / Salg Promotion

Læs mere

Biotest Aps er en privat, forskningsbaseret virksomhed inden for mikrobiologi, bioraffinering og fermentering.

Biotest Aps er en privat, forskningsbaseret virksomhed inden for mikrobiologi, bioraffinering og fermentering. Biotest Aps Biotest Aps er en privat, forskningsbaseret virksomhed inden for mikrobiologi, bioraffinering og fermentering. Biotest s speciale er udviklingsarbejde i laboratorie- og pilotskala samt rådgivning

Læs mere

QUICK START Updated: 18. Febr. 2014

QUICK START Updated: 18. Febr. 2014 QUICK START Updated: 18. Febr. 2014 For at komme hurtigt og godt igang med dine nye Webstech produkter, anbefales at du downloader den senest opdaterede QuickStart fra vores hjemmeside: In order to get

Læs mere

Blomsten er rød (af Harry Chapin, oversat af Niels Hausgaard)

Blomsten er rød (af Harry Chapin, oversat af Niels Hausgaard) Blomsten er rød (af Harry Chapin, oversat af Niels Hausgaard) På den allerførste skoledag fik de farver og papir. Den lille dreng farved arket fuldt. Han ku bare ik la vær. Og lærerinden sagde: Hvad er

Læs mere

Havefrø. Specialiseret frøproduktion en niche i dansk fødevarenetværk. Specialized seed production a niche in the danish food network

Havefrø. Specialiseret frøproduktion en niche i dansk fødevarenetværk. Specialized seed production a niche in the danish food network Specialiseret frøproduktion en niche i dansk fødevarenetværk Specialized seed production a niche in the danish food network Lise C. Deleuran Institut for Agroøkologi Aarhus Universitet Havefrø Research

Læs mere

Nyhedsbrev 15 Februar 2008

Nyhedsbrev 15 Februar 2008 Nyhedsbrev 15 Februar 2008 FTU Boghandel Halmstadgade 6, 8200 Århus N Tlf: 86 10 03 38 / Mail:ftu@ats.dk / Inet: www.ftu.dk Hvem er FTU Boghandel? FTU Boghandel er en specialboghandel indenfor teknik,

Læs mere

Virk.dk. A one-stop-shop for businesses. Peter Bay Kirkegaard, pbk@eogs.dk Special Advisor Danish Commerce and Companies Agency

Virk.dk. A one-stop-shop for businesses. Peter Bay Kirkegaard, pbk@eogs.dk Special Advisor Danish Commerce and Companies Agency Virk.dk A one-stop-shop for businesses Peter Bay Kirkegaard, pbk@eogs.dk Special Advisor Danish Commerce and Companies Agency Agenda Background Status Future 16-10-2007 2 Virk.dk 16-10-2007 3 Vision Political

Læs mere

Umiddelbare kommentarer til Erhvervsministerens redegørelse vedr. CIBOR 27/9-2012 Krull, Lars

Umiddelbare kommentarer til Erhvervsministerens redegørelse vedr. CIBOR 27/9-2012 Krull, Lars Aalborg Universitet Umiddelbare kommentarer til Erhvervsministerens redegørelse vedr. CIBOR 27/9-2012 Krull, Lars Publication date: 2012 Document Version Pre-print (ofte en tidlig version) Link to publication

Læs mere

En temperaturmåling på dansk biotek. Martin Bonde Formand for Dansk Biotek

En temperaturmåling på dansk biotek. Martin Bonde Formand for Dansk Biotek En temperaturmåling på dansk biotek Martin Bonde Formand for Dansk Biotek Agenda Introduktion En status Udfordringer mod 2020 Konklusioner Dansk Biotek organisation for danske biotekvirksomheder Startet

Læs mere

To modeller af NDRG2 proteinet: RCSB Protein Data Bank

To modeller af NDRG2 proteinet: RCSB Protein Data Bank 2009 Roskilde Universitet Naturvidenskabelige Basisstudium 4. Semesters Projekt To modeller af NDRG2 proteinet: RCSB Protein Data Bank Bassam Tawfik Florian Malte Hermann Kenneth Ege Jørgensen Lena de

Læs mere

Temperaturer på varme overflader, det er sandsynligt man kan komme til at berøre Vejledning til Tekniske Komitéer og fabrikanter

Temperaturer på varme overflader, det er sandsynligt man kan komme til at berøre Vejledning til Tekniske Komitéer og fabrikanter DS-information DS/CLC Guide 29 1. udgave 2007-07-12 Temperaturer på varme overflader, det er sandsynligt man kan komme til at berøre Vejledning til Tekniske Komitéer og fabrikanter Temperatures of hot

Læs mere

Klavs Thormod og Tina Haahr Andersen

Klavs Thormod og Tina Haahr Andersen Undervisningsbeskrivelse Stamoplysninger til brug ved prøver til gymnasiale uddannelser Termin juni 2013 Institution Uddannelse Fag og niveau Lærer(e) Hold VUF - Voksenuddannelsescenter Frederiksberg gsk

Læs mere

Pulver - fremtidens mad?

Pulver - fremtidens mad? Pulver - fremtidens mad? Martin Sohn, Indhold Introduktion Menneskets krav Havregryn vs pulvermad Fordele og ulemper Videoklip DIY Pulvermad Smagsprøver Diskussion Indhold Hvad er pulvermad? Indeholder

Læs mere

Modtagelse af svært tilskadekomne.

Modtagelse af svært tilskadekomne. Modtagelse af svært tilskadekomne. Siden 1996 har vi på Odense Universitetshospital haft en særlig registrering af svært tilskadekomne, både fra trafikuheld og fra øvrige ulykker. Disse registreringer

Læs mere

Industriell Symbios Att vinna på att Återvinna

Industriell Symbios Att vinna på att Återvinna Dansk SymbioseCenter Industriell Symbios Att vinna på att Återvinna Torsdag den 12. marts 2015 Søren Birksø Sørensen Soren.Sorensen@kalundborg.dk Dansk SymbioseCenter Fra rest til ressource A short introduction

Læs mere

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA sekvens,

Læs mere

Facilitering af Kreativitet & Innovation i VELUX Gruppen. Line Louise Overgaard Concepts & Innovation Support

Facilitering af Kreativitet & Innovation i VELUX Gruppen. Line Louise Overgaard Concepts & Innovation Support Facilitering af Kreativitet & Innovation i VELUX Gruppen Line Louise Overgaard Concepts & Innovation Support Fordi lys skaber liv VELUX Gruppen Etableret i 1941 Mere end 10.000 ansatte globalt heraf 2.600

Læs mere

Aalborg Universitet. Banker i Danmark pr. 22/3-2012 Krull, Lars. Publication date: 2012. Document Version Pre-print (ofte en tidlig version)

Aalborg Universitet. Banker i Danmark pr. 22/3-2012 Krull, Lars. Publication date: 2012. Document Version Pre-print (ofte en tidlig version) Aalborg Universitet Banker i Danmark pr. 22/3-2012 Krull, Lars Publication date: 2012 Document Version Pre-print (ofte en tidlig version) Link to publication from Aalborg University Citation for published

Læs mere

Video Projector Controller. Brugermanual

Video Projector Controller. Brugermanual Jægergårdsgade 152/05A DK-8000 Aarhus C DENMARK WWW.WAHLBERG.DK l Video Projector Controller Brugermanual WWW.WAHLBERG.DK TELEPHONE +45 86 18 14 20 CELL PHONE +45 40 52 20 88 EMAIL: mads@wahlberg.dk Feb

Læs mere

Det lyder enkelt, men for at forstå hvilket ærinde forskerne er ude i, er det nødvendigt med et indblik i, hvordan celler udvikles og specialiseres.

Det lyder enkelt, men for at forstå hvilket ærinde forskerne er ude i, er det nødvendigt med et indblik i, hvordan celler udvikles og specialiseres. Epigenetik Men hvad er så epigenetik? Ordet epi er af græsk oprindelse og betyder egentlig ved siden af. Genetik handler om arvelighed, og hvordan vores gener videreføres fra generation til generation.

Læs mere

Masters Thesis - registration form Kandidatafhandling registreringsformular

Masters Thesis - registration form Kandidatafhandling registreringsformular Masters Thesis - registration form Kandidatafhandling registreringsformular Godkendelse af emne for hovedopgave af vejleder og undervisningskoordinator. Læs venligst retningslinjerne sidst i dette dokument

Læs mere

Subject to terms and conditions. WEEK Type Price EUR WEEK Type Price EUR WEEK Type Price EUR WEEK Type Price EUR

Subject to terms and conditions. WEEK Type Price EUR WEEK Type Price EUR WEEK Type Price EUR WEEK Type Price EUR ITSO SERVICE OFFICE Weeks for Sale 31/05/2015 m: +34 636 277 307 w: clublasanta-timeshare.com e: roger@clublasanta.com See colour key sheet news: rogercls.blogspot.com Subject to terms and conditions THURSDAY

Læs mere