Gensekventering. - og de etiske overvejelser. Naturvidenskabelig Bachelor Hus Vejleder: Jesper Olsen

Transkript

1 Gensekventering - og de etiske overvejelser Camilla Hansen, Kiwi Kjøller, Nina Haxgart, Julie Schnipper, Victoria Fagerholt og Sandra Bredgaard Gruppe 2 Naturvidenskabelig Bachelor Hus 14.1 Vejleder: Jesper Olsen Roskilde Universitet Efterår

2 Abstract Next Generation Sequencing (NGS) is used in the diagnostics of patients who are genetically predisposed to diseases. Comprehensive sequencing of exomes may result in the identification of incidental findings. A number of ethical issues that challenges the patient's autonomy is raised by the identification of incidental findings. In Denmark, an attempt to circumvent these ethical issues has been made by the development of a consent form. However, the consent form does not solve the ethical considerations followed by the sequencing of exomes, but merely places the liability of the consequences on the patient. The current theoretical basis for the understanding of genetic information limits the use of NGS in the diagnosis and treatment of diseases. Furthermore, regardless of the consent form, a subjective feeling of illness may arise with the sequencing of ones exome, which may cause a reduced quality of life for the patient. Incidental findings could affect the family members as their right to "no-knowledge" can be violated by information on susceptibility to inherited diseases. In order to limit the subjective feeling of disease a triviality limit of which incidental findings patients should be informed should be decided upon. This is because information about lowrisk factors may cause an unnecessary subjective feeling of disease. 2

3 Resumé Next Generation Sequencing (NGS) anvendes til prædiagnosticering af patienter, der kan være arveligt disponeret for sygdomme. Omfattende exomsekventering kan resultere i identificering af tilfældighedsfund. Tilfældighedsfund rejser en række etiske problemstillinger, som udfordrer patientens autonomi. I Danmark har man forsøgt at omgå de etiske problemstillinger ved at udforme en samtykkeerklæring. Samtykkeerklæringen imødekommer dog ikke de etiske overvejelser, som exomsekventering medfører, men pålægger blot patienten ansvaret for konsekvenserne. Det nuværende teoretiske grundlag for forståelsen af genetiske informationer, begrænser anvendelsen af NGS til diagnosticering og behandling af sygdomme. Endvidere kan der, uafhængigt af samtykkeerklæringen, opstå subjektiv sygdomsfølelse ved exomsekventering, hvilket kan medføre forringet livskvalitet for patienten. Tilfældighedsfund kan ligeledes påvirke familiemedlemmer, da deres ret til ikke-viden kan krænkes ved information om disponering for arvelige sygdomme. For at begrænse sygdomsfølelsen, bør der opstilles en bagatelgrænse for, hvilke tilfældighedsfund patienter bør informeres om. Dette skyldes, at oplysninger om lav-risiko faktorer kan påvirke sygdomsfølelsen unødigt. 3

4 Indholdsfortegnelse INDLEDNING... 5 PROBLEMFORMULERING... 6 MÅLGRUPPE... 6 AFGRÆNSNING... 6 SEMESTERBINDING... 6 GENETISKE VARIATIONER... 7 SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORFISM... 7 COPY NUMBER VARIATION... 8 NEDARVELIGE MUTATIONER... 9 GAMETISKE MUTATIONER DE NOVO MUTATIONER VARIATIONERS FÆNOTYPISKE UDTRYK PENETRANS NEXT GENERATION SEQUENCING GENSEKVENTERING I DAG DE ETISKE DILEMMAER VED BRUGEN AF NGS UTILITARISME OG DEONTOLOGI AUTONOMI OG PATERNALISME SYGDOMSFØLELSE DEN MEKANISTISKE SYGDOMSMODEL NORMALITETSBEGREBET PATIENTENS SAMTYKKE INFORMATIONSGRUNDLAGET PATIENTENS FRAVALG AF VIDEN FUND MED MULIGHED FOR FOREBYGGELSE PATIENTENS TILVALG AF VIDEN SENERE TILBAGEMELDING OM TILFÆLDIGHEDSFUND FORSKNINGSPERSPEKTIVET KRITIK AF SAMTYKKEERKLÆRINGEN FORUDSÆTNINGEN FOR SAMTYKKEERKLÆRINGEN BAGATELGRÆNSEN FAMILIENS RET TIL IKKE-VIDEN KONKLUSION PERSPEKTIVERING LITTERATUR APPENDIX

5 Indledning I år 1990 påbegyndtes The Human Genome Project, som havde til formål at kortlægge hele det humane genom for første gang (Lander et al., 2001). Projektet var et led i bestræbelsen på den fulde forståelse af sammenhængen mellem genotype og fænotype. Efter 13 år lykkedes The Human Genome Project, og siden er der sket en radikal udvikling af sekventeringsteknologien. I dag er man ved hjælp af Next Generation Sequencing (NGS) i stand til at udføre exom- og genomsekventering på ganske kort tid og til en overkommelig pris (Hertz, 2014). Mange troede, at udviklingen af sekventeringsteknologien ville føre til behandling af de sygdomme, som nu kunne diagnosticeres, og at genetisk diagnosticering ville implementeres i sundhedsvæsenet (Svendsen and Koch, 2006). Sammenhængen mellem genotype og fænotype viste sig dog at være mere kompleks end først antaget, og en implementering i sundhedsvæsenet dannede hos nogle grundlag for at adskille genetisk data fra anden medicinsk information (Stempsey, 2006). Anvendelsen af NGS giver helt nye muligheder i den kliniske diagnostik af genetiske sygdomme. I dag tilbydes patienter en genetisk udredning, hvis der er mistanke om arvelig disponering. Tidligere omfattede den genetiske analyse kun få gener. Med udviklingen af sekventeringsteknologien bliver exomsekventering billigere (Gerdes and Vogel, 2014), og brugen af denne metode formodes derfor at blive mere almindelig ved genetisk diagnosticering. Når en patient får sekventeret hele sit exom, er der risiko for tilfældighedsfund, som kan få en fænotypisk konsekvens senere i patientens liv. Sådanne fund kan være livsreddende, men kan også betyde indsigt i sygdomme, som der ikke findes behandling for. Det kan på baggrund af den opdagede variation være vanskeligt at estimere, hvor stor risikoen for en given sygdom er. Exomsekventering er derfor ikke uden etiske konsekvenser, da resultaterne overvejende er risikoestimater forbundet med en varierende og til tider stor usikkerhed. I dette projekt diskuteres de etiske dilemmaer, som opstår i forbindelse med tilfældighedsfund. De etiske dilemmaer diskuteres i forhold til patient-autonomi, paternalisme og subjektiv sygdomsfølelse. 5

6 Problemformulering Hvilke etiske overvejelser bør foretages i forbindelse med identificeringen af tilfældighedsfund ved exomsekventering? Målgruppe Dette projekt henvender sig hovedsageligt til studerende, som har en interesse i de etiske dilemmaer, der kan opstå ved gensekventering. En baggrundsviden inden for molekylær- og medicinalbiologi vil være en fordel for forståelsen. Derudover vil videnskabsteoretisk baggrundsviden også være en fordel for forståelsen af diskussionen. Afgrænsning Dette projekt indeholder en teoridel, som er afgrænset til den baggrundsviden, som vi finder nødvendig for læseren i forhold til forståelsen af gensekventering, samt de resultater, der uddrages herfra. Diskussionens fokus ligger på de etiske dilemmaer, som opstår ved gensekventering. Denne del er afgrænset til at have fokus på tilfældighedsfund ved gensekventering. Derudover diskuteres også normalitets- samt sygdomsbegrebet i forhold til gensekventering. Semesterbinding Formålet med projektet er, at den studerende gennem arbejdet med et repræsentativt eksempel får erfaring med videnskabsteoretisk analyse af naturvidenskab som historisk, kulturelt og samfundsmæssigt fænomen. Projektet beskæftiger sig med exomsekventering, som beskrives ud fra et molekylærbiologisk perspektiv. Projektet vil med afsæt i videnskabsteoretiske anskuelser diskutere de etiske dilemmaer, der opstår ved analysen af exomet, hvorved de etiske aspekter af naturvidenskab belyses. 6

7 Genetiske variationer En variation er en strukturel ændring i en DNA-sekvens (Brooker, 2012). Strukturelle variationer, der er opstået over flere generationer, har været afgørende i vores evolutionære tilpasning, mens andre variationer har været sygdomsfremkaldende. Ofte skelnes der mellem sygdomsfremkaldende variationer kaldet mutationer, og ikke-sygdomsfremkaldende variationer betegnet polymorfismer - dog defineres polymorfismer også som variationer med en frekvens på 1% eller mere i en population (den Dunnen and Antonarakis, 2001). De første genetiske ændringer observeret var hovedsageligt sjældne ændringer i strukturen af kromosomer, som kunne identificeres ved brugen af et mikroskop. Med udviklingen af sekventeringsteknologien blev det muligt at observere mindre og hyppigere ændringer i genmaterialet. Eksempler på sådanne variationer er Single Nucleotide Polymorphism (SNP) og Copy Number Variation (CNV) (Feuk et al., 2006; Redon et al., 2006). Det formodes, at disse variationer udgør størstedelen af den genetiske varians. Det humane genom udgør ca. 3 milliarder basepar. Det er estimeret, at der i hvert genom er ca. 10 millioner SNP er, hvilket svarer til, at der i gennemsnit er en SNP pr. 300 nukleotider (Consortium, 2003). En interessant observation fra analyser af det humane genom, er ligheden af DNA-sekvensen blandt personer fra hele verden. To vilkårlige personers genom menes at være ca. 99,9% identiske (Feuk et al., 2006; Redon et al., 2006). Den fænotypiske variation og disponering af sygdom mellem individer, forventes dermed at findes i de resterende 0,1% (Feuk et al., 2006). Strukturel varians har i nogle regioner i genomet ikke nogen umiddelbar fænotypisk konsekvens, mens det i andre tilfælde for eksempel kan påvirke mængden af genprodukt eller funktionen heraf (Feuk et al., 2006). En ændring i genproduktet er forårsaget af en ændring i antallet af kopier af et givent gen, hvilket eksempelvis kan ses ved duplikation (Zhang and Chang, 2008). En ændring i mængden af genproduktet kan forårsage sygdom, enten alene eller i kombination med andre genetiske faktorer eller miljøfaktorer (Feuk et al., 2006). Single Nucleotide Polymorfism SNP er en substitution af et enkelt nukleotid, hvilket er den mest simple form for variation. Ca. 50% af SNP er sker i den ikke-kodende del af genomet og 50% i den kodende del (exomet). I exomet forekommer der ca. 25% non-synonymous SNP er og 25% synonymous SNP er. Synonymous SNP er 7

8 ændrer ikke aminosyrekæden, da et kodon bliver skiftet ud med et andet kodon, som koder for den samme aminosyre. Non-synonymous SNP er kan derimod ændre enkelte aminosyrer eller skabe et stop kodon som bryder aminosyrekæden, hvilket kan have en betydning for den fænotypiske ekspression af genet (Dudley and Karczewski, 2013). Copy Number Variation SNP er mentes tidligere at være den dominante form for genetisk variation i det humane genom, som forårsagede de fleste fænotypiske variationer. Denne opfattelse ændrede sig i 2004, da to forskningsgrupper sekventerede genomer af raske personer uden relation til hinanden. De fandt, at CNV er giver flere fænotypiske variationer end SNP er, da disse variationer forårsager ændringer i DNA-sekvensen fra enkelte kilobaser (kb) til megabaser (Mb) (Freeman et al., 2006). CNV er defineres ofte som DNA fragmenter på 1 kb eller større og det er estimeret, at et individ gennemsnitligt har 12 CNV er (Feuk et al., 2006; Reid-Lombardo and Petersen, 2010). Det er desuden estimeret, at over halvdelen af alle CNV er forårsager ændringer i exomet. Derudover kan nogle CNV er interagere med hinanden eller påvirkes af miljøfaktorer, som kan forårsage sygdomme (Reid-Lombardo and Petersen, 2010). CNV er påvirker genekspressionen samt fænotypiske variationer ved at ødelægge gener og ved at ændre antallet af gener. CNV er kan ligeledes føre til udviklingen af monogene sygdomme eller medvirke til udviklingen af komplekse sygdomme (Redon et al., 2006). CNV er inkluderer variationer af typerne deletioner, insertioner, duplikationer, amplifikationer, translokationer og inversioner (Tabel 1) (Feuk et al., 2006; Reid-Lombardo and Petersen, 2010). Deletion er en variation, hvor en sektion af nukleotider fjernes fra den normale DNA-sekvens, mens insertion er en addition af nukleotider til sekvensen. Disse genetiske variationer kan involvere få eller mange basepar og kaldes for indel polymorfismer. Slettes eller indsættes et antal nukleotider, som ikke er deleligt med tre, vil læserammen forskydes, hvilket kaldes frameshift mutation (Reid- Lombardo and Petersen, 2010). Duplikationer forekommer, når en DNA-sekvens kopieres og optræder flere gange end normalt i kromosomet. Duplikationer resulterer derfor i ekstra genmateriale (Emanuel and Shaikh, 2001). Duplikationer, som er større end 5 Mb, kaldes amplifikationer (Myllykangas and Knuutila, 2006). Translokationer er en ændring i kromosomet, hvor en DNA-sekvens ændrer position til et andet sted på samme kromosom, eller til en lokation på et andet kromosom (Feuk et al., 2006). Inversioner er mutationer, hvor et afbrækket kromosomfragment vender 180 grader og genindsættes på samme 8

9 lokation. Ofte kommer inversioner ikke fænotypisk til udtryk, medmindre afbrækket sker i et gen (Griffiths et al., 2000). Tabel 1. Typer af Copy Number Variations. Type af CNV Konsekvens Deletion Insertion Duplikation Amplifikation Translokation Inversion Sekvens af nukleotider fjernes Sekvens af nukleotider tilføjes Sekvens af nukleotider kopieres og optræder flere gange end normalt Sekvens af nukleotider kopieres (større end 5 Mb) og optræder flere gange end normalt Sekvens af nukleotider ændrer position på samme kromosom eller til et nyt Afbrækket sekvens af nukleotider vender 180 grader og genindsættes på samme lokation Nedarvelige mutationer Genetisk nedarvelige sygdomme kan opstå på baggrund af mono- eller polygene mutationer (Badano and Katsanis, 2002). Monogene mutationer forekommer i et enkelt gen, på enten et kromosom eller på begge kromosomer i et autosomalt kromosompar. Mutationen er kønsbunden, hvis den forekommer på X eller Y kromosomet. Stamtræer over større dele af en familie kan give et overblik over hvorvidt, et monogent sygdomsfremkaldende gen er autosomalt eller kønsbundet, og hvorvidt det kan blive nedarvet dominant eller recessivt (Strachan and Read, 2010). Polygene mutationer betegner mutationer, som forekommer i flere gener og hvor miljøfaktorer har stor indflydelse (Lander and Schork, 1994). Ved autosomale arvegange tales der om recessive eller dominante sygdomme. Ved autosomal recessiv nedarvning, vil et afkom arve et muteret sygdomsfremkaldende gen fra minimum én 9

10 forælder. Den recessive sygdom kommer kun til udtryk hos individer, der er homozygote (Figur 1) (Strachan and Read, 2010). Figur 1. Autosomal recessiv nedarvning. Ved recessiv nedarvning skal afkommet arve to sygdomsgener, for at sygdommen kommer til udtryk (U.S. National Library of Medicine et al., 2012). Ved autosomal recessiv arvegang, der kommer fænotypisk til udtryk, må begge forældre være bærere af et sygdomsfremkaldende gen. Dette vil statistisk resultere i, at 25% af deres afkom vil udtrykke sygdomsgenet fænotypisk (Strachan and Read, 2010). Ved dominante arvegange er hovedreglen, at en syg person som minimum vil have én syg forælder, og ligeledes vil fremtidigt afkom have 50% risiko for at få sygdommen. Det vil sige, at dominante sygdomme vil komme fænotypisk til udtryk, blot man er bærer af genet på det ene allel (Figur 2) (Strachan and Read, 2010). 10

11 Figur 2. Autosomal dominant nedarvning Ved dominant nedarvning skal afkommet arve ét sygdomsgen, for at sygdommen kommer til udtryk (U.S. National Library of Medicine et al., 2012). Ved kønsbundne mutationer ses både recessiv og dominant nedarvning. Ved X-bunden recessiv nedarvning er kvinder ofte heterozygote bærere af et sygdomsfremkaldende gen. Dog udtrykker de ikke det sygdomsfremkaldende gen fænotypisk, da kvinder er bærere af to X-kromosomer (Strachan and Read, 2010). Tidligt i embryogenesen hos kvinder vil ét X-kromosom blive inaktivt, som ofte vil være det sygdomsfremkaldende. Da mænd kun er bærere af ét X-kromosom, vil dette altid blive udtrykt. Mænd kan ikke videregive X-bundne sygdomme til deres sønner, da de får et Y-kromosom fra faderen (Brooker, 2012). Y-bundne sygdomme vil kun blive nedarvet fra fader til søn og vil altid blive udtrykt. Derfor skelnes der ikke mellem dominant og recessiv nedarvning (Strachan and Read, 2010). Gametiske mutationer Nedarvelige mutationer opstår i gameterne og kaldes gametiske mutationer (Drost and Lee, 1998). DNA-replikationen og den meiotiske celledeling i gameterne sker hos kvinder i fosterstadiet, og hos mænd hver 16. dag efter de er kommet i puberteten (Ketterling et al., 1999). Miljøfaktorer kan indvirke på DNA-replikationen og den meiotiske celledeling, hvilket forøger risikoen for mutationer i sædcellerne. Derfor vil der være en større risiko for, at en fader videregiver en mutation til sit afkom (Ketterling et al., 1999). 11

12 De novo mutationer De novo mutationer er nyopståede mutationer hos et individ og kan derfor ikke spores hos forældrene. De novo mutationer kan opstå i gameterne og i de somatiske celler. Opstår mutationen i gameterne, vil den videregives til kommende generationer, hvor den hos disse generationer vil kunne spores i alle celler (Veltman and Brunner, 2012). Somatiske mutationer kan forekomme i alle celler hele livet igennem. Hvis den somatiske mutation forekommer tidligt i embryostadiet, vil mutationen kunne spores i forskellige typer af celler, men ikke i alle celler. Dette kaldes mosaik (Poduri et al., 2013). Det antages derfor, at somatiske mutationer ikke altid kan ses ved gensekventering (Poduri et al., 2013). Variationers fænotypiske udtryk Strukturelle variationer kan føre til fænotypisk variation eller sygdom på forskellig vis. I de simpleste tilfælde kan strukturelle variationer påvirke genproduktet direkte, eller indirekte ændre genekspression gennem en ændring i genets lokation i genomet - ofte ved translokation. Denne mekanisme kaldes position effect. Ligesom disse potentielt sygdomsfremkaldende ændringer i genekspressionen, kan tilstedeværelsen af en strukturel variation prædisponere til potentielt skadelige strukturelle ændringer (Feuk et al., 2006). Det er ofte svært at skelne mellem, hvornår en variation er sygdomsfremkaldende, og hvornår den ikke er. Dette kan være et udfordrende dilemma for molekylære genetikere, særligt ved prædiagnosticering, da patienten ikke allerede har den eventuelle sygdom - og måske aldrig får den (Feuk et al., 2006). I takt med den øgede mulighed for at opdage genetiske variationer, øges kravene ligeledes til at kunne differentiere mellem ikke-sygdomsrelaterede og sygdomsrelaterede variationer. Selvom nogle store variationer umiddelbart ikke er sygdomsfremkaldende, kan de i kombination med andre genetiske faktorer og miljøfaktorer have en fænotypisk konsekvens. Der er eksempler, hvor tilstedeværelsen af en strukturel variation hænger direkte sammen med sygdom, såsom mange deletioner og duplikationer, som forårsager genomic disorders. Genomic disorders er en gruppe af humane sygdomme, som skyldes genomiske ændringer af ustabile genomiske regioner. Disse ustabile regioner i genomet kan bevirke en ændring i mængden af genprodukt, som påvirker fænotypiske udtryk. Store populationsstudier og referencedatabaser er den bedste kilde til information om variationers frekvens og tilbøjelighed til at forårsage en fænotypisk effekt (Feuk et al., 2006). 12

13 Penetrans Hvordan en mutation kommer til udtryk kan beskrives ved penetrans og ekspressivitet. Penetrans er et udtryk for, hvor ofte et sygdomsfremkaldende gen kommer fænotypisk til udtryk i en generation (Zlotogora, 2003). Penetrans kan beskrives ved fuld penetrans eller ved nedsat penetrans. Ved fuld penetrans kommer genet fænotypisk til udtryk hos alle, der er bærere af genet. Et gen med nedsat penetrans vil ikke altid komme til udtryk i en generation, uanset om den er dominant eller recessivt nedarvet. Hvis et muteret gen kommer fænotypisk til udtryk hos halvdelen af de individer, der bærer genet, siges der at være 50% penetrans (Strachan and Read, 2010). Nogle sygdomme vil først komme til udtryk i en bestemt alder. Dette kaldes aldersrelateret penetrans (Strachan and Read, 2010). Ved for eksempel Huntingtons sygdom ses aldersrelateret penetrans, da sygdommen ofte først indtræffer i års alderen (Kaptein et al., 2007). Ekspressivitet er et udtryk for, i hvor høj grad sygdommen påvirker det enkelte individ. Ekspressiviteten kan variere fra individ til individ, selvom de er bærere af samme gen. Nogle kan have milde symptomer på en sygdom, mens andre oplever livstruende komplikationer. Ekspressiviteten kan påvirkes af andre genetiske faktorer og miljøfaktorer (Kaptein et al., 2007). 13

14 Next Generation Sequencing Ønsket om at blive klogere på koblingen mellem genotype og fænotype har ført til udviklingen af NGS (Janitz, 2008). Ved hjælp af højt avancerede maskiner er det blevet muligt at kortlægge hele det humane genom og dermed få en indsigt i de genetiske variationer, der forekommer (Zhang et al., 2011). Det første store gennembrud inden for gensekventering kom i år 1977, da det lykkedes Frederik Sanger og hans kollegaer at sekventere bakterien phixi174 s genom på ca baser (Sanger et al., 1977). Dette ved hjælp af metoden, der i dag kaldes Sanger-metoden, som de senere modtog en Nobelpris for (Walker, 2014). Metoden var ny og involverede brugen af terminators: 2,3 dideoxyribonukleotider (ddntp er), som mangler 3 -hydroxyl gruppen i forhold til de normale deoxyribonukleotider (dntp er) (Figur 3) (Sanger et al. 1977). Figur 3. Forskellen mellem ddntp og dntp. Til venstre ses et dideoxynukleotid (ddntp). Til højre ses et deoxynukleotid (dntp) (Look For Diagnosis, 2014). Det stykke DNA, der skal sekventeres, denatureres til enkeltstrenge og blandes med de nødvendige komponenter for at initiere DNA syntese: en primer, polymerase, samt en blanding af de fire dntp er (hvor en af dem er mærket) og en ddntp som terminator. Der udføres fire parallelle PCR-reaktioner for hvert nukleotid med en korresponderende terminator. Syntesen af hver ny streng fra template starter ved 3 -enden og fortsætter indtil en ddntp bliver integreret i kæden i stedet for den normale dntp. Syntesen termineres, idet ddntp ikke indeholder en 3 hydroxyl-gruppe, hvorfor den nye DNA-sekvens ikke kan forlænges yderligere. Man opnår på den måde en blanding af DNA-strenge, hvor der ved hver position af en N base i template tilhører et produkt med en integreret ddntp i 3 - enden (Figur 4 (a)). 14

15 Figur 4. Sanger-sekventering. (a) En mærket primer anvendes til at initiere DNA-syntese. DNA-syntesen termineres ved inkoperering af et dideoxynukleotid. (b) DNA fragmenterne separeres ved en parallel polyacrylamid gelelektroforese. Den udledte sekvens ses til højre. (c) Gel efter autoradiografi (Griffiths et al., 2000). De mærkede strenge i de fire prøver separeres ved en parallel polyacrylamid gelelektroforese, hvor de mindste strenge kommer hurtigst igennem. De forskellige bånd viser fordelingen af dntp er i den syntetiserede DNA-streng. Er ddntp erne radioaktivt mærkede tydeliggøres disse ved en autoradiografi. Ved hjælp af basepar-reglerne i DNA-syntesen, kan den oprindelige DNA-streng bestemmes (Figur 4 (b), (c)) (Sanger et al., 1977). Sanger-metoden benyttes stadig i dag og betragtes som golden standard til gensekventering (Walker, 2014). Siden Sanger-metoden er der sket en betydelig optimering af sekventeringsteknologien - blandt andet udviklingen af automatiserede sekventeringsmaskiner. For at kunne sekventere en større mængde DNA blev en ny metode udviklet, Shotgun Sequencing, som et sideløbende projekt til The Human Genome Project (Zhang et al., 2011). I starten af år 2000 kom nye teknikker på markedet, som både 15

16 var billigere og kunne sekventere langt mere DNA på kortere tid i forhold til Sanger-sekventering (Pareek et al., 2011). Disse teknikker kom til at hedde NGS og udsprang af Shotgun-metoden (Zhang et al., 2011). Med NGS-teknologien har man fundet et redskab til at se de genetiske variationer, der kan forekomme i det humane genom. NGS-teknologien anvendes blandt andet til Whole-Genome-Sequencing (WGS) og Whole-Exome-Sequencing (WES). Ved WES sekventeres exomet (Salam et al., 2014), som udgør mindre end 2% af det humane genom (Bamshad et al., 2011). WES genererer omkring varianter (Singleton, 2011) sammenlignet med WGS, der genererer 2-4 millioner varianter pr. genom (Moore et al., 2011). Dog opstår 85% af sygdomsfremkaldende mutationer i exomet (Liu et al., 2012), og WES kan derfor anses som en anvendelig metode til at opdage disse (Salam et al., 2014). I år 2004 lancerede 454 Life Sciences den første NGS-maskine, som kunne generere mere end DNA-sekvenser, svarende til millioner basepar. I år 2006 lanceredes anden generation af maskinen, Roche Genome Sequencer FLX (Roche GS FLX), som kunne generere flere hundrede millioner basepar (Janitz, 2008). Roche GS FLX metoden er delt op i tre trin: DNA library preparation, emulsion PCR og PicoTiterPlate sequencing. I første trin bliver DNA fragmenteret, så hvert fragment består af basepar (Janitz, 2008). Specifikke adaptorer påsættes i hver ende af de enkeltstrengede DNA fragmenter (Figur 5 (a)) (Siqueira et al., 2012). I trin to, emulsion PCR, bliver der tilsat beads til DNA fragmenterne. Disse beads har til deres overflade bundet en primer, som er komplementær til adaptorerne på fragmenterne. Fragmenterne binder sig derfor specifikt til beads, så der for hvert bead er bundet ét fragment (Figur 5 (b)) (Siqueira et al., 2012). Der tilsættes en olieret væske og PCRreagenter. Væsken gør, at hver bead bliver indkapslet, så der forekommer en vand-i-olie emulsion (Figur 5 (c)). Den vandige del af emulsionen består af beads, PCR-primerne, nukleotider og DNA polymerase. PCR-reaktionen, hvor fragmenterne kopieres, kan nu forløbe. For hver bead bliver der dannet flere millioner fragmenter (Figur 5 (d), (e)) (Mardis, 2008). 16

17 Figur 5: Roche GS FLX metoden. (a) DNA fragmenteres, og adaptorer påsættes i hver ende af fragmenterne. (b) Der tilsættes beads, som fragmenterne binder sig til. (c og d) Disse beads bliver dernæst indkapslet i en olieret væske, så der forekommer en vand-i-olie emulsion. (e) PCR reaktionen kan nu forløbe, så fragmenterne kopieres. (f) Beads med tilhørende DNA isoleres (Paillier, 2011). I trin tre brydes emulsionen og DNA et denatureres. De beads, som bærer enkeltstrenget DNA, isoleres (Figur 5 (f)), og overføres til brøndene i PicoTiterPlate. Der tilføres et enkelt bead til hver af de flere hundrede tusinde brønde i pladen (Siqueira et al., 2012). Til brøndene bliver der yderligere tilført beads indeholdende enzymerne sulfurylase, luciferase og apyrase, samt to substrater adenosin 5 fosfosulfat (APS) og luciferin (Figur 6 (a)). Opløsningen i hver brønd består således af enkelstrenget DNA, primer, DNA-polymerase, enzymer og de to substrater. (Siqueira et al., 2012). En af de fire nukleotider tilføres til reaktionen. DNA-polymerasen katalyserer inkorporeringen af nukleotider til DNA-strengen i tilfælde af, at nukleotidet er komplementær til nukleotidet på DNAstrengen. Når der dannes fosfordiesterbinding mellem nukleotiderne, bliver der frigjort pyrofosfat (PPi), i en mængde tilsvarende mængden af nukleotider. Pyrofosfat omdannes til ATP ved hjælp af enzymet sulfurylase under tilstedeværelse af APS. ATP bruges til at omdanne luciferin til oxiluciferin under aktivitet af enzymet luciferase (Siqueira et al., 2012). Som resultat bliver der genereret lys (fotoner) (Ahmadian et al., 2006). Lysintensiteten er proportional med antallet af inkorporeret nukleotider (Figur 6 (b)) (Mardis, 2008). Apyrase nedbryder nukleotiderne, der ikke er blevet inkorporeret. Dernæst tilføres næste nukleotid, så additionen af nukleotider sker en af gangen (Siqueira et al., 2012). Ud fra et flowdiagram kan antallet og rækkefølgen af nuklotiderne ses. Dobbeltpeaks indikerer en gentagelse af det pågældende nukleotid (Janitz, 2008; Mardis, 2008). 17

18 Figur 6. Roche GS FLX metoden. (a) Nukleotider inkorporeres i DNA-strengen ved hjælp af DNA-polymerasen under frigivelse af pyrofosfat (PPi). PPi omdannes til ATP, ved tilstedeværelse af sulfurylase. Ved hjælp af enzymet luciferase omdannes luciferin til oxiluciferin ved brug af ATP og der bliver genereret lys. (b) Ud fra et flowdiagram ses antallet og rækkefølgen af nukleotider (Griffiths et al., 2000). Rådata fra Roche GS FLX sekventeringen behandles i et computerprogram, Newbler Software, og sekvenser af meget dårlig kvalitet, mixede sekvenser (hvis der var mere end et DNA fragment til en bead), eller sekvenser, der ikke indeholder startsekvensen TCGA (primeren), filtreres fra (Mardis, 2008). Længden af læserammen for hver template er kortere hos NGS i forhold til Sanger-sekventering. NGS generer kun sammenhængende basepair-reads sammenlignet med fra Sanger. Resultaterne af sekvensen defineres derfor som short-reads (Zhang et al., 2011). Dækningsgraden er essentiel, og estimeres ud fra det antal af short-reads, der overlapper hinanden inden for et specifik gen. Hvis hvert nukleotid i et gen er repræsenteret efter 30 short-reads, er dækningsgraden 30 (Zhang et al., 2011). Der er sammenhæng mellem dækningsgraden og den præcise påvisning af variationer. Som led i et større eksperiment testede en forskningsgruppe først, hvor godt resultaterne fra en Sanger-sekventering og en NGS-sekventering stemte overens. De sekventerede derfor generne BRCA1 og BRCA2 hos to mammacancer-patienter. De fandt, at overensstemmelsesraten var 100% (Guan et al., 2014). De ønskede at se, hvor meget data, der var 18

19 nødvendigt for at kunne se variationer. Resultatet var, at når dækningsgraden nåede 200, var de påviste SNP er på sit maksimum (Guan et al., 2014). Ligeledes er det blevet påvist, at en dækningsgrad på 30, ikke er nok (Ajay et al., 2011). Med udvklingen af NGS-teknologien er udfordringen ikke længere at sekventere det enkelte individs genom, men at fortolke data. Sekvenser fra NGS-sekventering sammenholdes med et eller flere reference-genomer. Short-reads, der kan matches med en reference-sekvens kaldes mappable reads. Der er mange sekvenser fra short-reads, der ikke kan tolkes i forhold til referencen. Dette skyldes, at de er for korte, og kan matche flere forskellige regioner af genomet (Zhang et al., 2011). På grund af disse short-reads er der mange udfordringer ved at analysere NGS-data (Teo et al., 2012). Gensekventering i dag På Klinisk Genetisk Klinik (KGK) på Rigshospitalet tilbydes en genetisk udredning, såfremt man er i risiko for en arvelig sygdom eller har en medfødt misdannelse. Der udføres forskellige analyser afhængigt af, hvilke sygdomsgener, man kigger efter. Prøverne analyseres som oftest vha. PCR, NGS og opfølgende Sanger-sekventering af exons (Klinisk Genetisk Klinik, 2013). I enkelte tilfælde udføres WES, og målet er, at der til efteråret 2015 skal udføres WES på ca. 200 prøver årligt (Diness, 2014). Der er fordele ved WES i den kliniske diagnostik og KGK har i flere tilfælde erfaret, at WES har bidraget til fastlæggelsen af en diagnose, som der ikke var mistanke om i klinikken (Gerdes and Vogel, 2014). Hvis en patient eksempelvis er arveligt disponeret for mammacancer tilbydes patienten en mammacancer-genpakke. Genpakken består af BRCA1, BRCA2, RAD51C, TP53, PTEN, CDH1, da mutationer i et af dem kan øge risikoen for mammacancer. Tidligere tilbød KGK kun analyse af BRCA1 og BRCA2, men tilbuddet er senere blevet udvidet. I dag er det patienten selv, der vælger, hvilke gener i genpakken, der skal analyseres. Variationer i TP53, PTEN, CDH1 er nemlig også involveret i andre sygdomme og kan give let øget risiko for andre typer cancer end mammacancer. Risikoen for en given sygdom estimeres som en helhedsvurdering, hvor de genetiske rådgivere på KGK også kigger på, hvor tæt beslægtet man er med en cancerpatient og forekomsten af cancer i familien (Klinisk Genetisk Klinik, 2014). Identificeres der mutationer i BRCA1 eller BRCA2 er livstidsrisikoen for at udvikle mammacancer eller ovariecancer henholdsvis 50-90% og 10-60%. Findes der derimod ingen mutationer, er livstidsrisikoen som befolkningen: 12-13% for mammacancer og 1-2% for ovariecancer (Det Etiske Råd, 2012). I tilfælde af, at der påvises en 19

20 mutation i et af generne i prøven, tilbydes øvrige familiemedlemmer en prædiktiv genetisk test for den påviste mutation. 20

21 De etiske dilemmaer ved brugen af NGS I takt med at WES bliver mere almindeligt, vil der rejse sig en række etiske overvejelser. Ved WES tilvejebringes store mængder usikker information om patientens mulige disponering for sygdomme, og sandsynligheden for tilfældighedsfund stiger (Det Etiske Råd, 2012). Tilfældighedsfund er variationer, som opdages ved et tilfælde, hvor specifikke variationer søges (Clarke, 2014). Hvorvidt disse tilfældigt fundne variationer er sygdomsfremkaldende, afhænger blandt andet af variationstypen. Det er subjektivt, hvorvidt patienten ønsker information, og der opstår et dilemma i at respektere retten til viden og retten til ikke-viden. Genetiske diagnoser anses af nogle som værende noget helt specielt, der skal separeres fra traditionelle medicinske diagnoser (Stempsey, 2006). Med udgangspunkt i dette omtales begrebet genetisk exceptionalisme. Dette begreb dækker over den etiske forskel mellem genetiske informationer og andre medicinske informationer (Sulmasy, 2014). Tilhængere af begrebet genetisk exceptionalisme finder det nødvendigt med nye etiske retningslinjer for, hvordan genetisk information behandles og formidles til patienten. Utilitarisme og deontologi Behandlingen og formidlingen af tilfældighedsfund ved gensekventering kan diskuteres ud fra et deontologisk eller utilitaristisk syn, hvilket er to modstridende systemer inden for normativ etik. Formålet med normativ etik er, at give anvisninger for moralsk korrekte handlinger (Wulff et al., 1999). Utilitarisme hævder, at blandt de mulige alternativer er den moralske rigtige handling den, der giver den største samlede nytte. Nytte kan forstås som personers lykke eller velvære. En handlings værdi måles ud fra resultater og konsekvenser, og hvor nyttige disse er. I princippet kan utilitarismen levere et svar på ethvert etisk problem; uanset problemstillingen, er det etisk korrekt at gøre det, der i situationen vil give den største samlede sum af nytte (Kappel, 1996). Der findes tre former for utilitarisme; etisk egoisme, etisk uegennyttighed og handlingsutilitarisme, alt efter hvem der får den størst mulige sum af nytte (Tabel 2) (Fieser, 2009). Ved etisk egoisme er en handling moralsk korrekt, hvis konsekvenserne er til størst nytte, for den, der udfører handlingen. Ved etisk uegennyttighed er handlingen moralsk korrekt, hvis konsekvenserne er til størst nytte for alle andre end den, der selv udfører handlingen. Ved handlingsutilitarisme er en handling moralsk korrekt, hvis konsekvenserne er til størst nytte for alle (Fieser, 2009). Jeremy Bentham ( ) og John Stuart Mill (

22 1873) var teoretikere inden for handlingsutilitarisme. De mente, at handlingen skulle sikre størst mulig lykke, til det størst mulige antal (Rendtorff, 2003). Utilitarismen hævder, at resultater opnået ved uærlighed og snyd kan retfærdiggøres, hvis det har et højere videnskabeligt eller samfundsmæssigt formål (Rendtorff, 2003). Set fra et medicinsk perspektiv kan der argumenteres for, at der findes en fjerde form for utilitarisme, patient-orienteret utilitarisme. I patient-orienteret utilitarisme har lægen en forpligtelse over for sin patient til at vælge den behandling, der sikrer størst mulig nytte for patienten (Wulff et al., 1999). Tabel 2. Oversigt over typer af utilitarisme. Typer af utilitarisme Om en handlingen er moralsk korrekt vurderes ud fra: Etisk egoisme Etisk uegennyttighed Handlingsutilitarisme Patient-orienteret utilitarisme summen af nytte for personen, der udfører handlingen summen af nytte for alle andre end personen, der udfører handlingen summen af nytte for alle summen af nytte for patienten Deontologien hævder, at det etisk korrekte ikke kun kan fastlægges ved at se på, hvad der giver mest samlet nytte. Der er også andre forhold, der må tages i betragtning (Kappel, 1996). Deontologi omfatter moralske principper, hvor vurderingen af en handling træffes ud fra pligten i den givne situation. Hvis en forsker står i et dilemma mellem at fortælle sandheden og mere ønskværdige resultater end umiddelbart opnået, har forskeren pligt til at respektere sandheden og være ærlig om sine resultater (Rendtorff, 2003). Immanuel Kant ( ) var en tysk oplysningsfilosof, der anså mennesket som autonomt og individualistisk. Mennesket er bundet af egen fri vilje, som dog skal underlægges moralloven (det kategoriske imperativ). Det kategoriske imperativ omfatter, at mennesket i sig selv har en værdi og aldrig må anses som et middel til at opnå målet (Wulff et al., 1999). 22

23 Autonomi og paternalisme De etiske problemstillinger, som følger med gensekventering, strækker sig yderligere end blot klinikerens anskuelse af deontologi og utilitarisme. Klinikeren skal tage stilling til patientens autonomi, som er et centralt begreb i den medicinsk-etiske tradition (Det Etiske Råd, 2012). Patientens autonomi er defineret som patientens ret til selvbestemmelse, og er en afgørende forudsætning for tillids- og fortrolighedsforholdet mellem patient og læge (Wulff et al., 1999). Paternalisme, hvor klinikeren træffer beslutninger på patientens vegne med det formål at gavne patienten, er en modsætning til patientens autonomi (Wulff et al., 1999). Der argumenteres for tre forskellige former for paternalisme; genuin, uønsket og ønsket (Tabel 3) (Wulff et al., 1999). Ved genuin paternalisme tages beslutninger på patientens vegne, i de tilfælde hvor patienten ikke selv er fysisk eller psykisk i stand til det. Ved uønsket paternalisme tages beslutninger, der modstrider patientens autonomi. I modsætning hertil står ønsket paternalisme, hvor patienten frivilligt fravælger sin autonomi og lader klinikeren træffe beslutninger på sine vegne. Tabel 3. Oversigt over typer af paternalisme. Typer af paternalisme Beslutninger vedtages på patientens vegne når: Genuin Uønsket Ønsket patienten ikke er fysisk eller psykisk i stand til at tage beslutninger beslutningerne modstrider patientens autonomi patienten fravælger sin autonomi frivilligt Forholdet mellem autonomi og paternalisme afhænger af patientens evne til at tænke rationelt og forskydes i takt med, at patienten bliver mindre rationelt tænkende (Komrad, 1983). Sygdom kan repræsentere en tilstand af irrationel tænkning og dermed mindsket autonomi. Det forudsættes, at autonomien øges i takt med, at patientens helbred forbedres (Komrad, 1983). Den amerikanske filosof, John Rawls ( ), skriver: Paternalistiske beslutninger bør guides af individets egne præferencer og interesser, såfremt de ikke er irrationelt tænkende (Rawls, 1999). Det fremgår, at den lægelige paternalisme træder i kraft, når sygdom påvirker patientens dømmekraft. Det kan diskuteres, hvorvidt paternalistiske beslutninger taget på patientens vegne, påskønnes af patienten 23

24 selv. Patienten vil muligvis ikke være enig i den paternalistiske beslutning, selvom denne er taget med patientens bedste for øje (Wulff et al., 1999). Autonomi kan anskues ud fra et deontologisk og utilitaristisk perspektiv. Ifølge deontologien er autonomi et individs frihed (Wulff et al., 1999), hvor friheden forskydes, når individet er irrationelt tænkende (Komrad, 1983). Utilitarismen definerer autonomi som ét af mange goder, der bør fremmes så meget som muligt (Wulff et al., 1999). Derfor vil en autonom beslutning udføres med det formål at fremme friheden. Sygdomsfølelse Et essentielt dilemma ved anvendelsen af gensekventering, er den subjektive sygdomsfølelse, som patienten kan stå tilbage med efter sekventeringen. Dette dilemma lægger op til spørgsmål vedrørende de medicinsk-filosofiske begreber; sygdomsbegrebet og normalitetsbegrebet, der sammen definerer grænsen mellem syg og rask. Gensekventering kan i medicinsk perspektiv anvendes til at forebygge eller helbrede sygdomme (Berg et al., 2011). Under anvendelse af denne metode, skal sygdomsbegrebet dog tages til eftertanke, da information om potentielle risici ved tilfældighedsfund kan føre til subjektiv sygdomsfølelse for det enkelte individ (Wulff et al., 1999). Den mekanistiske sygdomsmodel Sygdomsbegrebet anskues oftest reduktionistisk i den medicinske verden (Wulff et al., 1999). Denne måde at anskue sygdom på, defineres som den mekanistiske sygdomsmodel. Den mekanistiske sygdomsmodel, også omtalt som det biologiske sygdomsbegreb, kan associeres med ordet apparatfejl. Modellen danner grundlag for den medicinske anskuelse af sygdom, med fokus på forebyggelse og/eller helbredelse (Wulff et al., 1999). Ud fra denne anskuelse defineres en sygdom som værende en afvigelse fra det biologiske design. Definitionen er opstået ud fra den antagelse, at det er et traditionelt axiom i den medicinske verden, at sundhed kan defineres som fravær af sygdom (Boorse, 1977). Det må dermed antages, at den mekanistiske sygdomsmodel diagnosticerer ud fra kliniske symptomer, der afviger fra den normale funktion af kroppen. Dette argument understreges ved at separere begreberne fysisk sundhed og mental sundhed, da det menes, at den psykologiske anvendelse af ordet sundhed er kontroversiel (Boorse, 1977). Forståelsen af den mekanistiske sygdomsmodel kan betegnes som objektiv (Wulff et al., 1999), hvormed det implicit kan forstås, at der ikke primært tages hensyn til individets subjektive sygdomsfølelse. 24

25 Den mekanistiske sygdomsmodel er blevet anklaget for at være utilstrækkelig (Lippman, 1991). Kritikken lyder på, at den biologiske reduktionist reducerer mennesket til en biologisk organisme. (Wulff et al., 1999). Kritikere af den mekanistiske sygdomsmodel mener, at definitionen af sygdom også bør tage hensyn til individets følelser, frem for at se mennesket som et biologisk apparat, der kan repareres ud fra en protokol, der endnu ikke er fuldt forstået (Wulff et al., 1999). Under sekventering søger man variationer i DNA et, som enten forårsager eller kan forårsage sygdom. Da variationerne forekommer tilfældigt i DNA et, kan det ikke altid med sikkerhed konkluderes, at variationen vil komme fænotypisk til udtryk (Feuk et al., 2006). Ifølge den mekanistiske sygdomsmodel, er et individ først syg, når der forekommer en funktionsfejl i apparatet (Wulff et al., 1999). På trods af en variation i genomet, må man altså antage, at et individ ikke anses som værende syg, før funktionsfejlen kommer til udtryk. Med udgangspunkt i kritikken af den mekanistiske sygdomsmodel kan det diskuteres, hvorvidt sygdomsbegrebet derfor bør udvides inden for gensekventering, fordi viden om informationerne i DNA et hos et individ kan medføre subjektiv sygdomsfølelse. Dette argument understøttes af den genetiske exceptionalisme, der mener, at molekylære genetiske diagnoser varierer etisk fra de traditionelle medicinske diagnoser (Stempsey, 2006). Almene medicinske diagnoser anvendes til at finde den korrekte behandling af patienter. Dette menes ikke at gøre sig gældende for genetiske diagnoser, da springet mellem genetisk diagnose og nødvendigheden af behandling er meget stort (Stempsey, 2006). Normalitetsbegrebet Da definitionen af sygdomsbegrebet er omdiskuteret, kan det anses som værende unuanceret, når det relateres til gensekventering. For at uddybe begrebet, kan man igen tage udgangspunkt i den mekanistiske sygdomsmodel, og undersøge normalitetsbegrebet i forhold til tærskelværdien mellem sund og rask. Sundhed defineres som normal functioning, hvor normal skal forstås statistisk og functioning skal forstås biologisk (Boorse, 1977). Normalområdet betegnes traditionelt som værende 95% af de resultater, der observeres hos en population af sunde og raske individer (Wulff et al.). Dette fører til den unuancerede grænse mellem syg og rask, da 5% af en rask population vil falde uden for det statistiske normalbegreb. Det er muligt, at størstedelen af en population har en genetisk variation, der resulterer i en sygdom. Hvis dette er tilfældet, hvordan definerer man så sygdom, hvis sygdom er en afvigelse fra normalen, og normalen er syg? Definition af sygdom leder til definitionen af normalområdet, hvor sygdom skal forstås som en afvigelse fra normalen af det oprindelige 25

26 biologiske design (Boorse, 1977). Det må antages, at det inden for den mekanistiske model anses som et axiom, at den statistiske overvægt i en population følger det oprindelige biologiske design. Perspektiverer man det biologiske design til variationer i DNA et, kan det tænkes umuligt, at bare et enkelt individ følger det oprindelige biologiske design. Mutationer opstår konstant i DNA et, hvilket fører til afvigelser fra normalområdet. Sygdomsbegrebet inden for den mekanistiske model kan ikke åbenlyst anvendes inden for gensekventering. Sygdomsfølelsen fra individets perspektiv og sygdomsdefinitionen fra det medicinske perspektiv er to forskellige begreber, der ikke separeres i den mekanistiske model. Her kan man i stedet tale om primær og sekundær prioritering, hvor individets subjektive sygdomsfølelse bliver anset som sekundær (Wulff et al.). Denne opfattelse bør genovervejes, da en subjektiv sygdomsfølelse kan opstå som følge af gensekventering, uden der nødvendigvis senere opstår fænotypiske symptomer (Stempsey, 2006). 26

27 Patientens samtykke Ved gensekventering er patientens autonomi essentiel (Det Etiske Råd, 2012). Det anbefales at indhente et informeret samtykke forud for gensekventering, for at undgå at forulempe patientens autonomi (Det Etiske Råd, 2012). Dansk Selskab for Medicinsk Genetik har udformet en samtykkeerklæring til målrettet sekventering og/eller exomsekventering (Figur 7) (Gerdes and Vogel, 2014). Vi mener, at denne samtykkeerklæring anerkender, at der er grundlag for genetisk exceptionalisme. Hvorvidt patientens autonomi skal overholdes, kan diskuteres ud fra to anskuelser af deontologien; om klinikeren har pligt til at informere om fund med helbredsmæssig relevans, eller om klinikeren har pligt til at respektere patientens valg. Ved patientens underskrivelse af samtykkeerklæringen, må det formodes at klinikeren underlægges deontologiske retningslinjer, hvor patientens valg respekteres. I følgende afsnit analyseres punkterne i samtykkeerklæringen. 27

28 Figur 7. Samtykkeerklæring til målrettet sekventering og/eller exomsekventering. (Gerdes and Vogel, 2014) 28