Videnskab På Journalistisk Formel

Transkript

1 1

2

3 Videnskab På Journalistisk Formel En undersøgelse af kravene til god videnskabsjournalistik samt formidling af et molekylærbiologisk forskningsprojekt Molekylærbiologi: Translæsion syntese og mitokondriel dysfunktion i S. cerevisiae Journalistik: Optimering af videnskabsjournalistik og formidling af forskning i mitokondrier Roskilde Universitet, januar 2011 Integreret specialeafhandling af Anne Lykke I samarbejde med Københavns Universitet, Center for Sund Aldring Vejledere: Journalistik: Leif Becker Jensen (intern vejleder, Roskilde Universitet) Molekylærbiologi: Claus Desler (ekstern vejleder, Københavns Universitet) samt Birgitte Munch-Petersen (intern vejleder, Roskilde Universitet) ECTS: Molekylærbiologi: Speciale = 25 ECTS (+ 5 ECTS point i kurser) Journalistisk: Speciale = 30 ECTS Specialet udgør anslag (inklusiv indstik), hvilket svarer til 99,6 normalsider a anslag 3

4 Abstract This master thesis combines Molecular Biology with Journalism in order to investigate how complex science can be reported to a broader public in the most comprehensive way. The aim in Molecular Biology is to investigate how dysfunctional mitochondria and lack of a functional translesion polymerase zeta (pol zeta) influence the survival of yeast cells (S. cerevisiae) when exposed to different doses of the DNA-damaging agent methyl methanesulfonate (MMS). The experiments show that cells with dysfunctional mitochondria (rho 0 ) and wildtype (WT) cells survive equally well after exposure to MMS, suggesting that mitochondrial dysfunction does not influence survival in S. cerevisiae. Furthermore, the survival frequencies of rho 0 and WT with knock out of the active subunit of pol zeta are equally and significantly reduced compared to the parental strains, suggesting that pol zeta is essential for survival in both WT and rho 0 after exposure to MMS. In order to investigate the mutational pattern of pol zeta, CAN1 mutants exposed to MMS are sequenced. These experiments indicate that rho 0 cells reduce the error prone use of pol zeta compared to WT cells when exposed to MMS. Together with preliminary mutation frequency experiments done by Desler this suggests that rho 0 cells use a more error free way to replicate across lesions than WT cells do, when DNA damage from MMS has occurred. The biological experiments are then reported on journalistically. Because this piece of science is very basic and not yet applied, four other scientific stories were identified within the topic of mitochondrial research in order to investigate if they differed from the first story. The five produced articles are then analyzed using certain ideal requirements, which are a set of standards that science stories should encompass, identified in a theoretical review of literature on Science Journalism. Three distinct types of ideal requirements were identified and two of these were used in the analysis: 1) A set of journalistic ideal requirements that call for the story to be timely, substantial, fascinating and the topic or sources to be identifiable to the reader. Also the story should address a big audience, it must preferably have the potential to set the media agenda, be critical in its approach, and have a low complexity. 2) A set of scientific ideal requirements, articulated primarily by scientists. These requirements call for the story to encompass information about the method and any bias of experimental data, the data to be peer reviewed and for the journalists to make certain reservations about the results. Furthermore, according to the scientific requirements, the science in question must be explained to the reader. The analysis shows that compared to the other articles, the article dealing with my experiments is very scientific. This is probably partly because I try to protect my integrity as a scientist. Furthermore, the analysis reveals that some of the journalistic and scientific ideal requirements are directly contradictory. This makes it extremely difficult to honour all of the demands in one article. Consequently, the journalist experiences a dilemma between being loyal to the science or to the reader. It is recommended that science stories both encompass requirements derived from the world of journalism and requirements from the world of science in order to be adequate, comprehensive and entertaining. If both types of ideal requirements are met, the story is more likely to have most scientific journalistic potential or capital, which refers to the story s potential to make the headlines and at the same time to inform its audience. 4

5 Resumé Denne specialeafhandling integrerer Molekylærbiologi og Journalistik for at undersøge, hvordan kompleks videnskab kan formidles journalistisk til en bred læserskare på den mest fyldestgørende måde. I Molekylærbiologi undersøges det, hvordan dysfunktionelle mitokondrier samt mangel på translæsion polymerase zeta (pol zeta) influerer på overlevelsen i gæren S. cerevisiae, når gærcellerne udsættes for forskellige doser af det DNA-skadende stof methyl metan sulfonat (MMS). Forsøgene viser, at celler med dysfunktionelle mitokondrier (rho 0 ) og wildtype (WT) overlever lige godt efter udsættelse for MMS, hvilket indikerer, at mitokondriel dysfunktion ikke påvirker overlevelsen i S. cerevisiae. Yderligere viser forsøgene, at overlevelsesfrekvensen for rho 0 og WT med knockout af den aktive subunit af pol zeta reduceres signifikant og i lige høj grad i forhold til de parentiale stammer, hvilket indikerer, at pol zeta er essentiel for overlevelsen i både WT og rho 0 efter udsættelse for MMS. For at undersøge mutationsspektrummet for pol zeta, sekventeres en række CAN1-mutanter udsat for MMS. Disse forsøg indikerer, at rho 0 celler reducerer antallet af mutationer introduceret af pol zeta sammenlignet med WT-celler. Når disse resultater sammenholdes med præliminære mutationsfrekvens-forsøg udført af Desler, tyder det på, at rho 0 -celler anvender en mere fejlfri måde at bypasse DNA-læsioner end WT efter DNAskade. De molekylærbiologiske eksperimenter formidles derefter journalistisk i en videnskabsartikel. Idet forskningen stadig er meget grundvidenskabelig og endnu ikke anvendt, identificeres fire andre historier inden for feltet mitokondrieforskning for at undersøge, om disse skiller sig betydeligt ud fra den første historie. De fem producerede artikler analyseres via såkaldte idealkrav et sæt krav til videnskabsjournalistiske historier der er identificeret i et teoretisk litteraturstudie af videnskabsjournalistik. Tre forskellige idealkrav blev identificeret, og to af disse anvendes i analysen: 1) Den første type kaldes de journalistiske idealkrav, der fordrer, at den videnskabsjournalistiske artikel skal være aktuel, væsentlig, fascinerende og skabe identifikation hos læseren. Yderligere skal historiens forventede publikum være stort, og historien skal være dagsordensættende, kritisk og have en lav kompleksitet. 2) Den anden type idealkrav kaldes de videnskabelige idealkrav og er primært italesat af videnskabsmænd. Disse idealkrav fordrer, at historien indeholder metodebeskrivelser af forsøgene, som historien omhandler, og nævner eventuelle bias i forsøgsopstillingen og resultaterne. Resultaterne bør være kollegialt bedømte (peer reviewed), og historien bør omtale væsentlige forbehold om resultaternes validitet. Endvidere skal videnskaben, der omtales, også forklares til læseren. Analysen viser, at sammenlignet med de andre artikler, er artiklen om mine forsøg meget videnskabelig, formentligt fordi jeg forsøger at beskytte min integritet som videnskabsmand. Endvidere viser analysen, at nogle af de journalistiske og videnskabelige idealkrav direkte strider mod hinanden. Derfor er det meget svært at opfylde alle idealkravene i samme artikel. Konsekvensen er, at journalisten oplever et dilemma mellem at skulle være loyal over for videnskaben eller over for læseren. Det anbefales, at videnskabshistorier både opfylder så mange af de videnskabelige- og journalistiske idealkrav som muligt, for at historien bliver både korrekt, fyldestgørende og underholdende. Hvis begge typer idealkrav opfyldes, vil historien have mest videnskabsjournalistisk potentiale eller kapital, hvilket refererer til en histories potentiale for at historien skaber overskrifter, samtidig med at den informerer sit publikum. 5

6 Indhold Abstract... 4 Resumé... 5 Læsevejledning... 9 Ordforklaringsliste Indledning Journalistisk problemformulering: Molekylærbiologisk problemformulering: Molekylærbiologi Teori DNA reparation og translæsion syntese TLS-polymerasernes funktion TLS involverer enten én eller to TLS-polymeraser Hvornår i cellecyklus sker TLS? Template switching PCNA rekrutterer TLS-polymeraser til læsioner TLS-polymeraser i S. cerevisiae TLS-polymeraser med overlappende funktionalitet TLS og dntp ubalance Mitokondrier og dntp Teoretisk introduktion til mutationsspektrum-forsøg Materialer og Metoder Cellestammer og medium Fremstilling af rho Dapi-farvning Overlevelsesforsøg CAN1 mutationsspektrum-forsøg Resultater Verificering af rho 0 ved YPG og DAPI-farvning Overlevelsesforsøg med MMS Overlevelsesforsøg med Hydroxyurea CAN1 mutationsspektrum

7 2.4 Diskussion Konklusion Perspektivering Populærvidenskabelig opsummering af molekylærbiologien Journalistik Afgrænsning og begrebsafklaringer Teori og meninger om videnskabsjournalistik Hvad er videnskabsjournalistik? Genrer Hvordan udvælges videnskabshistorier? Hvordan forholder medierne sig til videnskab? Udfordringer i journalistens behandling af videnskabelige resultater Opstilling af idealkravene Journalistisk produktion Metode til analysen Analyse Anvender kræftceller sjuskede kopimaskiner til at overleve bedre? Spis mindre lev længere? Når motion er den eneste medicin Sygdommene lægerne ikke opdager Er to genetiske mødre én for meget? Tabel over idealkrav opfyldt i historierne Diskussion Idealkravene strider mod hinanden Kapital og nyhedsværdi Hvad sker der, når journalisten også er forskeren? Hvad kræver det at flytte x er? Faktabokse kan opfylde flere idealkrav Genrer: Videnskabsjournalistik i ny indpakning? Idealkravene til diskussion Hvordan forenes videnskab og journalistik? Konklusion

8 5. Litteratur Molekylærbiologi Journalistik Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag

9 Læsevejledning Alle kan læse indledningen og journalistikafsnittene. De molekylærbiologiske afsnit er primært skrevet til fagkyndige inden for molekylærbiologi, hvorfor det kan være særdeles vanskeligt for andre at læse, da sproget og indholdet er meget fagspecifikt. Det anbefales dog, at ufagkyndige skimmer molekylærbiologiafsnittene for at få en ide om indholdet. Som hjælp til ufagkyndige findes en populær opsummering af de biologiske forsøg og resultater lige efter biologi-afsnittene. Dette gør, at læseren uden særlig molekylærbiologisk indsigt også kan få et overblik over molekylærbiologien. Yderligere er specifikke ord i teksten forklaret i en ordforklaringsliste. Disse ord er skrevet med fed+kursiv, første gang de optræder, og her er det muligt at slå betydningen op i listen. Engelske ord, der ikke er oversat i teksten, er skrevet i kursiv. God fornøjelse med læsningen! 9

10 Ordforklaringsliste Journalistik: Gatekeeping: Refererer til mediernes filter, som bestemmer, hvilke informationer, der kommer ud til offentligheden. Gatekeeping udøves både af journalister og redaktører, og resultatet er meget forskelligt fra medie til medie. For eksempel er den information, der slipper igennem filteret på magasinet ALT for damerne, meget forskellig fra Politiken, fordi målgrupperne er forskellige. Grundforskning: Originale undersøgelser uden et egentligt mål om praktisk anvendelse, men hvis hovedformål er at opnå ny videnskabelig viden og forståelse. Anvendt forskning er derimod viden, der har fået en praktisk, og ofte kommerciel, anvendelse. Metatekst: Henviser i denne sammenhæng til teksten uden om et budskab, det vil sige budskabets indpakning. Mikrofonholderi: Et slangudtryk om ukritisk journalistik; tegner et billede af en ukritisk journalist, der holder mikrofonen for en kilde, som uden modspørgsmål fra journalisten kan levere sine holdninger til en sag. Omnibuspressen: Betyder en presse, der er til for alle. Omnibusaviser behandler samtlige emner, der betragtes som interessante for offentligheden. Paradigme: Den fælles viden og fælles baggrund som videnskabsmænd inden for en given videnskab tillægger sig og arbejder ud fra. En videnskabsmand, der opdrages i et paradigme, optager undervejs en gennemprøvet og gruppeautoriseret måde at se verden på, som er ubevidst og automatisk [Brier 1997: ]. Forskning, der foregår inden for et givent paradigme, er ikke mere sand end anden forskning, men blot mere objektiv, idet den foretages systematisk. Peer review: Betyder kollegial bedømmelse, og peer reviewed betyder kollegialt bedømt, hvor bedømmerne oftest er artiklens forfattere ubekendte. Rubrik: Overskriften på en journalistisk historie kaldes i fagsprog rubrikken. Molekylærbiologi: 4-NQO: 4-nitroquinoline-N-oxide eller 4-nitroquinoline-N-oxide, DNA-skadende stof, der giver store skader, for eksempel fotodimerer og 8-hydroxyguanin [Friedberg et al. 1995]. ADP: Adenosin difosfat AP-sites: Sites uden baser i DNA et. ATP: Adenosin trifosfat Benzo[a]pyrene: DNA-skadende stof, der blandt andet forårsager store adduktioner på guanin [Friedberg et al. 1995]. Bypasse: Betyder omføring eller omkørsel og refererer til TLS-polymerasernes evne til at omgå DNA-skader. CDP: Cytidin difosfat 10

11 da: deoxyadenosin datp: deoxyadenosin trifosfat dctp: deoxycytidin trifosfat dc: deoxycytidin dg: deoxyguanosin dgtp: deoxyguanosin trifosfat dntp: deoxyribonukleosidtrifosfat dt: deoxythymidin dttp: deoxythymidin trifosfat E. coli: Escherichia coli EMS: Ethyl metan sulfonat ETC: elektrontransportkæden Frameshift: Skift i læserammen i forbindelse med replikation GDP: Guanosin difosfat K m -værdi: Beskriver den koncentration af substrat, der skal til for at opnå halvdelen af enzymets maksimale hastighed. Minor groove: DNA-helixens to strenge er ikke placeret præcis overfor hinanden, og derfor fremkommer der to forskellige fordybninger i længderetningen, som kaldes den store fordybning (major groove) og en mere snæver fordybning (minor groove). MMS: Methyl metan sulfonat mtdna: mitokondrielt DNA ndna: nukleart DNA OD: Optical density PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen. PCNA er den eukaryote klemme, der loader og fastholder polymeraser til DNA-strengen under replikationen. Rho 0 : Celler uden mitokondrielt DNA. RNR: Ribonukleotid reduktase S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae, bagegær ssdna: Enkeltstrenget DNA TLS: Translæsion syntese Template switching: Fejlfri omgåelse af DNA-skader ved brug af en uskadet DNA-template. T^T: Thymin-thymin cyclobutan pyrimidin dimer UDP: Uridin difosfat WT: Wildtype YPD: Yeast extract peptone-dextrose YPG: Yeast extract peptone glycerol Nomenklatur: Gener angives i kursiv og proteiner med stort begyndelsesbogstav. 11

12 1. Indledning I løbet af de sidste tre århundreder er forskere langsomt blevet mere og mere autonome og differentierede i forhold til samfundet og den almene befolkning [Bucchi: 1998: 1]. Dette har skabt et videnshul imellem forskere og ikke-forskere, som dagspressen og magasiner forsøger at udfylde ved at formidle naturvidenskabelig og teknologisk viden til befolkningen på en populariseret måde [Bucchi: 1998: 1-2]. Men medierne formår ifølge kritikerne ikke at levere sober videnskabsjournalistik. Journalister forsimpler forskningen unødig meget [MVTU 2004: 29], og mange kritiserer den nuværende videnskabsjournalistik for at være for overfladisk, ensidig og unuanceret. Steen Gammeltoft, professor dr. med. og redaktør for Biokemisk Forenings medlemsblad BioZoom, mener, at videnskabsjournalister generelt ved for lidt om videnskab og ikke har overblik over, hvad der rører sig internationalt i forskningsverdenen, hvilket efterlader den danske borger uoplyst [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 154f]. Gammeltoft kritiserer danske videnskabsjournalister for at skrive artikler, der mangler faglige detaljer samt aktualitet og kontinuitet. Videnskabsjournalister kritiserer han for at komme og gå, for at være overfladiske og ukritiske overfor deres kilder og for at glemme at undersøge kildernes videnskabelige kvalifikationer [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 154f]. Udenlandske medieforskere kan ligeledes konstatere, at videnskabelige artikler er ukomplette: Der mangler kildereaktioner, metodebeskrivelser og historierne generaliserer specifikke resultater [Stocking i Friedman et al. 1999, Pellechia 1997]. De fleste mennesker har hverken erfaring eller uddannelsesmæssig baggrund i videnskaberne, hvilket betyder, at deres forståelse tager udgangspunkt i den virkelighed, som medierne præsenterer [Nelkin 1995: 2]. Nyhedsmedierne anses efter skoleårene som den primære kilde til information om videnskab [ Science and Society i Allan 2002: 71] og om sundhed [Voss 2003]. Derfor kan dårlig videnskabsjournalistik svække befolkningens demokratiske magt [Nelkin 1995: 2]. Et fungerende demokrati 1 forudsætter således et publikum (vælgere), der har adgang til viden, og på baggrund af dette kan træffe velinformerede valg [Nelkin 1995: 2, Hornmoen 1999: 15, Burkett 1973: 39]. I dag er nyhedsmedierne og internettet de vigtigste kilder til information i offentligheden, og derfor kan dårlig dækning af videnskab ultimativt føre til, at patienter får falske forhåbninger om nye medicinske fremskridt, prøver udokumenterede og potentielt farlige behandlingsformer eller til unødvendig frygt i befolkningen [Gammeltoft i Kjærgaard 2006: 154f, Voss 2003]. Hvis vi antager, at videnskabsjournalistikken er af så ringe kvalitet, som kritikerne påstår, er spørgsmålet: Kan man skrive journalistik om videnskab på en mere hensigtsmæssig måde? Ud fra litteraturen på området vil jeg identificere en række punkter, hvor videnskabsjournalistikken ifølge kritikerne fejler, altså hvor publikum fejlinformeres eller 1 Jeg afgrænser mig fra at gå ind i en dybere redegørelse af, hvad demokrati egentlig er, men her anskues det som et folkestyre, hvor alle har lige ret og mulighed for at udfolde sine evner. 12

13 misinformeres. Ud fra disse kritikpunkter opstilles en række idealer for god videnskabsjournalistik, og ud fra disse vil jeg formidle min egen forskning i molekylærbiologi. Min biologiske forskning omhandler i grove træk kroppens energifabrikker (mitokondrierne), der befinder sig inde i alle kroppens celler. Basalt set har jeg observeret, hvordan gærceller med og uden funktionelle mitokondrier overlever, når cellerne udsættes for et kræftfremkaldende stof (MMS). Yderligere har jeg observeret, hvad der sker, hvis deres evne til at overkomme skader på deres DNA forringes. Forskning i mitokondrier er relativt ung. Først i 1950 kunne mitokondrier observeres med elektronmikroskopi, og i 1963 fandt Nass og Nass ud af, at mitokondrier indeholder deres eget DNA [Nass og Nass 1963]. Denne opdagelse var meget overraskende, da man ellers kun kendte til DNA i cellens kerne. Mitokondrierne er dermed de eneste selvstændige dele af cellen, der indeholder DNA ud over cellekernen 2. Forskning i mitokondrier er i dag et voksende felt, fordi dårlige mitokondrier er blevet sammenkædet med aldring, arvelige energisygdomme (mitokondriesygdomme) samt nogle typer kræft og diabetes. Der er dog skrevet forsvindende lidt om mitokondrier i de danske medier, selv om emnet gemmer på flere journalistiske historier efter min mening. En Infomedia-søgning med søgeordet mitokondrier de sidste 10 år gav cirka 150 hits 3, hvoraf mange historier var gengangere, det vil sige, at originalartiklen var citeret af andre medier, og ofte var videnskaben ikke i fokus. Jeg vil således skrive nogle journalistiske historier om et relativt ukendt og svært biologisk emne ud fra en række videnskabsjournalistiske idealkrav, der opstilles i journalistik-teoriafsnittet. 2 Klorofyl i planteceller indeholder også deres eget DNA. 3 Undersøgelsen er ikke videnskabelig, men skal blot give et indtryk af omfanget af mediedækningen. 13

14 1.1 Journalistisk problemformulering: Hvordan kan man formidle en kompleks videnskabelig problemstilling i gode journalistiske historier, der opfylder de opstillede videnskabsjournalistiske idealkrav? For at besvare problemformuleringen vil jeg på baggrund af den teoretiske ramme selv formidle den biologiske viden, jeg har indsamlet igennem et halvt års forløb i laboratoriet, hvor arbejdet udførtes ud fra følgende problemformulering: 1.2 Molekylærbiologisk problemformulering: Hvordan overlever wildtype (WT) gær i forhold til gær med dysfunktionelle mitokondrier (rho 0 )? Benytter rho 0 -gærceller pol zeta og i så fald hvor meget i forhold til WT? Ud fra journalistikteorien vil det blive diskuteret, hvordan den biologiske tekst-masse i nærværende speciale kan formidles journalistisk. Specialet er derfor et såkaldt produktionsspeciale som defineret på Journalistik på RUC s hjemmeside [RUC]. 14

15 2. Molekylærbiologi 2.1 Teori Integriteten af arvemassen kan trues af DNA-skadende påvirkninger som UV-lys, biprodukter af metabolisme og udefrakommende DNA-skadende stoffer [Friedberg et al. 1995]. DNAlæsioner, der ikke er blevet repareret af cellens reparationsmekanismer, blokerer replikationsgaflen [McGregor 1999, Woodgate 1999], idet de replikative polymeraser går i stå ved læsionen. Standsede replikationsgafler er meget toksiske for cellen, og kan lede til dobbeltstrengede brud på DNA-strengen, kromosomal ustabilitet og død [reviewed i Branzei og Foiani 2007]. For at afvikle de standsede gafler så replikationen kan fuldføres, kan cellen aktivere nogle specialiserede polymeraser kaldet translæsion syntese polymeraser (TLSpolymeraser), som udfører DNA-syntese forbi ureparerede læsioner [Woodgate 1999, Friedberg et al. 2000]. TLS-polymeraserne erstatter den replikative polymerase og omgår (eller bypasser) læsionerne, så replikationen kan fortsætte [reviewed i Prakash et al. 2005, reviewed i Rattray og Strathern 2003]. En TLS-event introducerer ofte en mutation, idet det skadede DNA anvendes direkte som template [Friedberg et al. 2005b], og fordi TLS-polymeraser har lav fidelitet og processivitet [Washington et al. 1999, Ogi et al. 1999, Matsuda et al. 2000, Ohashi et al. 2000, Dominguez et al. 2000, Trincao et al. 2001, Ling et al. 2001, Silvian et al. 2001]. De syntetiserer derfor med meget højere fejlrater end de replikative polymeraser både i syntesen af beskadiget og ubeskadiget DNA [Lee og Pfeifer 2008, reviewed i Goodman 2002, reviewed i Kunkel 2003a og 2004b]. En TLS-event siges at være fejlfri, hvis TLS-polymerasen indsætter den korrekte nukleotid overfor læsionen og dermed bypasser læsionen uden at introducere fejl i den nye streng. Omvendt siges TLS-eventen at være fejlagtig, hvis der indsættes en forkert nukleotid overfor den skadede base, så der introduceres en mutation [reviewed i Prakash et al. 2005, reviewed i Rattray og Strathern 2003]. Men overordnet set vil TLS-polymeraser introducere flere fejl til genomet end de replikative DNA-polymeraser, idet TLS-polymeraser mangler 3-5 exonuklease aktivitet [reviewed i Kunkel et al. 2003b]. Det betyder, at TLS-polymeraser, i modsætning til de replikative polymeraser, ikke kan korrekturlæse og rette de fejl, den begår (proofreading). Det er vist, at TLS-polymeraser ofte er signifikant overudtrykt i tumorer fra forskellige væv, blandt andet livmoder-, ovarie-, prostata- og mavecancer [Albertella et al. 2005]. Hvis TLSpolymeraserne ikke reguleres nøje af cellen, kan det føre til øget mutagenese [reviewed i Waters et al. 2009]. TLS-polymerase-generne kan derfor anses som oncogener, hvis de er overudtrykte [Albertella et al. 2005]. Sammenhængen mellem overekspression af TLSpolymeraserne og tumorgenese anses for at være et resultat af øget og ureguleret TLS, der 15

16 øger mutationsfrekvensen i genomet, hvilket i sidste ende kan føre til udviklingen af ondartede cancerceller [Albertella et al. 2005]. Yderligere kan TLS-polymeraseaktivitet sammenkobles med resistens overfor det kemoterapeutiske stof cisplatin samt andre kemoterapeutiske stoffer [Lin et al. 2006a, Lin et al. 2006b, Albertella et al. 2005, Levine et al ; Chen et al.., 2006]. Det er blevet foreslået, at TLS-polymeraserne fremmer celleoverlevelse ved at sikre, at replikationen kan gennemføres over et stort antal skader i genomet fra de kemoterapeutiske stoffer, hvilket resulterer i øget resistens overfor de kemoterapeutiske stoffer [Albertella et al. 2005]. For nyligt er der fundet indikationer på, at byggestenene til DNA, deoxyribonukleosidtrifosfat (dntp), kan spille en rolle i reguleringen af TLS-responset [Chabes et al. 2003]. I wildtype (WT) S. cerevisiae øges dntp-poolen 6-8 gange i S-fasen efter vedvarende DNA-skader fra 4-nitroquinoline-N-oxide (4-NQO), MMS og UV-lys [Chabes et al. 2003]. Denne markante stigning i dntp-poolen øger chancen for overlevelse efter DNA-skade, men giver samtidig en øget mutationsfrekvens [Chabes et al. 2003]. Dette menes at være et resultat af reduceret fidelitet fra de replikative polymeraser og/eller mere TLS-aktivitet ved forhøjede dntp pools [Chabes et al. 2003, Lis et al. 2008]. Endvidere er det vist, at TLS-polymeraserne in vitro kræver op til 10 gange højere dntp-pools for effektivt at indsætte et nukleotid overfor forskellige læsioner i forhold til at indsætte et nukleotid overfor uskadet DNA [Shimizu et al. 2002, Minko et al. 2002, Haracska et al. 2000, Haracska et al. 2001b]. På baggrund af denne sammenhæng foreslår Chabes et al. (2003), at forskellige TLS polymeraser har deres optimale aktivitet ved bestemte dntp-niveauer, hvor optimummet er forskelligt for hver enkelt TLS-polymerase [Chabes et al. 2003]. Der er derfor stærke indikationer på, at dntp-poolen spiller en regulatorisk rolle under et TLS-respons, og at størrelsen af dntp-poolen har betydning for effektiviteten af TLS. Mitokondriel dysfunktion kan føre til uregulerede dntp-niveauer. Löffler et al. (1997) har foreslået et direkte link mellem mitokondriel dysfunktion og reguleringen af nukleotid-poolen i mammale celler via det mitokondrie-bundne enzym dihydroorotate ubiquinone oxidoreductase, som udgør et uundværligt trin i de novo pyrimidin-syntesen [Löffler et al. 1997]. Hypotesen om, at dysfunktionelle mitokondrier per se fører til ubalancerede dntppools i cellen, understøttes af, at humane celler uden funktionelle mitokondrier (rho 0 ) har lavere dntp-pools end WT efter DNA-skader [Desler et al. 2007]. Yderligere er det vist, at humane rho 0 -cellers dntp-pools er ubalancerede, det vil sige at koncentrationerne af de fire dntp er er ændrede i rho 0 -celler i forhold til koncentrationerne i de parentiale celler [Desler et al. 2007]. Endvidere udviser rho 0 -gærceller forhøjede mutationsfrekvenser i det nukleare genom i forhold til WT [Rasmussen et al. 2003]. Sammenhængen mellem dysfunktionelle mitokondrier og øgede mutationsfrekvenser i ndna er endnu relativt ukendt, men Rasmussen 16

17 et al. (2003) foreslår, at deletion af mtdna i rho 0 genererer ubalancerede nukleotid-pools samt flere DNA-skader, der omdannes til nukleare mutationer af TLS-polymeraserne [Rasmussen et al. 2003]. I tråd med dette er det vist, at mutator-fænotypen i rho 0 -gærs nukleare genom kan undertrykkes ved at inaktivere to TLS polymeraser (Rev1 og polymerase zeta) [Rasmussen et al. 2003]. Dette indikerer, at rho 0 -gær i høj grad anvender TLS til at bypasse læsioner [Rasmussen et al. 2003]. Rasmussen et al. (2003) antager som sagt, at der er en sammenhæng mellem mitokondriel dysfunktion og TLS-responset, og Chabes et al. (2003) har foreslået, at TLS-responset til dels reguleres af dntp-niveauet. Det er dog endnu ikke vist, om der findes en egentlig sammenhæng mellem de tre størrelser; altså om mitokondriel dysfunktion og de medfølgende uregulerede dntp-pools er direkte indvirkende på TLS-responset. Nærværende speciale ønsker at kaste lys over denne mulige sammenhæng ved at undersøge TLS s indflydelse i gærceller med dysfunktionelle mitokondrier, og hvordan dysfunktionelle mitokondrier påvirker overlevelsesfrekvensen. Det kan tænkes, at celler med dysfunktionelle mitokondrier udviser et ændret TLS-respons som følge af deres manglende evne til at syntetisere dntp, hvilket ifølge Chabes et al. (2003) forringer chancen for overlevelse. Derfor er det muligt, at gærceller med dysfunktionelle mitokondrier bliver tvunget til at anvende TLS-responset på en anderledes måde end utransformerede celler. TLS-polymerase zeta (pol zeta) udfører langt de fleste mutagene events i gær [Lawrence og Maher 2001] og spiller også en meget vigtig rolle for overlevelsen og for mutagenesen i højere eukaryoter [Wittschieben et al. 2000, reviewed i Gan et al. 2008]. Forsøgene fokuserer derfor på pol zetas funktion i gæren S. cerevisiae. Der anvendes methyl metan sulfonat (MMS) som DNA-skadende stof i forsøgene. MMS methylere baserne i DNA, specielt adenin på N-3 positionen (3meA) og guanin på N-7 positionen (7meG) [Beranek et al. 1980, Lawley et al. 1975]. Disse skader blokerer effektivt DNA-replikationen via de replikative polymeraser og aktiverer TLS-responset. MMS-inducerede skader er yderligere et kendt substrat for pol zeta [Wittschieben et al. 2006] DNA reparation og translæsion syntese I mammale celler genereres der cirka spontane DNA-læsioner i døgnet [Lindahl og Barnes 2000]. De største kilder til spontane DNA-skader er reaktive oxygen molekyler, base deamineringer (specielt cytosin til uracil) samt depurinering og depyrimidinering [Lindahl og Barnes 2000, Friedberg et al. 2005a]. Yderligere kan mange miljømæssige faktorer forårsage DNA-skader, såsom UV-stråling og kemiske stoffer som MMS, cisplatin, og benzo[a]pyrene [Friedberg et al. 2005a]. Disse stoffer kan forårsage base-modifikationer, store uoverkommelige læsioner, der skaber forstyrrelser i dobbelthelixen (bulky adducts) og brud på sukker-fosfat rygraden i DNA et. 17

18 Skader på DNA et repareres af cellens DNA reparationssystemer, som består af følgende overordnede systemer: nucleotide exision repair (NER), base exision repair (BER), direct reversal (DR), mismatch repair (MMR) og reparation af dobbeltstrengede brud, der enten repareres ved homolog rekombination eller via uhomolog sammenkædning af enderne (nonhomolog end-joining, NHEJ). DR, NER og BER skanner konstant DNA et, mens MMR er et post-replikativt system, som under S-fasen scanner strengen lige efter den replikative polymerase og retter fejl begået af denne [reviewed i Larsen et al. 2005]. Nogle skader repareres dog ikke, og de bevirker, at den replikative polymerase går i stå (staller), fordi den ikke er i stand til at replikere forbi skaden [Branzei og Foiani 2005]. Replikative polymeraser har et meget stringent aktivt site, hvis høje selektivitet favoriserer korrekt nukleotid-inkorporation over for template, og en beskadiget base vil derfor ikke passe ind i det aktive site [Baker og Bell 1998, Friedberg et al. 2005a, Kool 2002]. TLSpolymeraser er derimod i stand til at syntetisere forbi en beskadiget base på templatestrengen, idet deres aktive sites er mindre specifikke end de replikative polymerasers, hvilket øger risikoen for indsættelse af forkerte baser [reviewed i Prakash et al. 2005] TLS-polymerasernes funktion TLS-polymeraser er næsten alle medlem af Y-familien af polymeraser, dog med undtagelse af pol zeta, der er medlem af B-familien. TLS-polymeraser misinkorporerer gennemsnitligt nukleotider pr nukleotider syntetiseret, hvorimod de replikative polymeraser gennemsnitligt inkorporerer 1 forkert pr nukleotider (se Tabel 1) [Lee og Pfeifer 2008, Matsuda et al. 2001, Ohashi et al. 2000, Zhong et al. 2006, Kunkel et al. 1989, Shcherbakova et al. 2003, Fortune et al. 2005, reviewed i Goodman 2002, reviewed i McCulloch og Kunkel 2008]. Dog er der meget stor forskel på fejlraten af de forskellige TLS-polymeraser, hvilket tydeligt ses i tabellen. Nogle TLS-polymeraser syntetiserer over en specifik type læsion med stor præcision, hvorfor læsionen kaldes TLS-polymerasens kognate læsion, og her betegnes TLS-polymerasen som fejlfri [reviewed i Waters et al. 2009]. For eksempel syntetiserer TLSpolymerase eta (pol eta) over T^T dimerer fejlfrit både i gær og humane celler, mens den bypasser andre læsioner meget fejlagtigt, hvorfor fejlraten overordnet set er stor [Washington et al. 1999, McCulloch et al. 2007, McCulloch et al. 2004b, Matsuda et al. 2001]. 18

19 DNA polymerase Familie Fejlrate ( 10 5 ) Reference Substitution Indel TLS hpol eta (η) pol Y Matsuda et al TLS hpol kappa (κ) pol Y Ohashi et al TLS ypol eta (η) pol Y McCulloch et al TLS ypol zeta (ζ) pol B 130 4,4 Zhong et al Rep. ypol alpha (α) pol B 9,6 3,1 Kunkel et al. 1989, Shcherbakova et al Rep. ypol delta (δ) pol B 1,3 1,3 Fortune et al Rep. ypol epsilon ( ) pol B 2 0,05 Shcherbakova et al Tabel 1: Viser enkelt-base fejlrater for udvalgte TLS-polymeraser (TLS) og replikative polymeraser (rep.). hpol henviser til humane polymeraser, og ypol henviser til polymeraser fundet i gær. Indel: Indersion/deletion. Polymerasernes fejlrate findes blandt andet ud fra antallet af en given type mutation i forhold til det totale antal mutanter samt mutationsfrekvensen. For flere detaljer om udregning af fejlrater, se Zhong et al Replikative polymeraser griber om DNA-templaten med tommelfinger-domænet, der har kontakt til DNA minor groove og med finger-domænerne, der ligger over baseparret samt med håndflade -domænet, som er enzymets aktive site [Nair et al. 2004]. Y-familiernes tommel- og finger-domæner er dog små og stumpede, hvilket betyder, at de har et løst greb om DNA-templaten og væsentligt lavere processivitet end replikative polymeraser [Ling et al. 2001, Trincao et al. 2001, Silvian et al. 2001]. Processiviteten af en polymerase henviser til, hvor mange nukleotider den indsætter, før den dissocierer væk fra template [reviewed i Kelman 1998]. Y-familien har yderligere et lillefinger-domæne eller PAD-domæne (polymerase accessory domain), der kontakter læsionen på template-strengen [Ling et al. 2001, Silvian et al. 2001, Trincao et al. 2001]. PAD-domænet er formentligt involveret i læsion-specificitet, der definerer, hvilke typer læsioner polymerasen bypasser, og dermed hvilket mutationsspektrum den genererer [Boudsocq et al. 2004]. Humane celler besidder fem kendte TLS-polymeraser: kappa, iota, eta, zeta og Rev1 [reviewed i Waters et al. 2009], og for nyligt er der fundet to andre eukaryote DNA polymeraser med lav fidelitet, der menes at udføre TLS: pol nu [Arana et al. 2007, Takata et al. 2006] og pol theta [Seki et al. 2003, Seki og Wood 2008]. E.coli har to TLS-polymeraser (pol II og pol IV) [reviewed i Sutton 2010] og S. cerevisiae har tre TLS-polymeraser (zeta, eta og Rev1) [Morrison et al. 1989, Nelson et al. 1996b, Johnson et al. 1999, Nelson et al. 1996a]. Funktionen af alle polymeraserne er opsummeret i Tabel 2. 19

20 Navn E.coli Familie Biologisk funktion(er) Pol I A DNA replikation, modning af Okazaki fragmenter, DNA reparation Pol II B TLS Pol III C DNA replikation og reparation Pol IV Y TLS, formodet involveret i DNA-skade checkpoint kontrol Pol V Y TLS S. cerevisiae Pol gamma (γ) A Mitokondriel DNA replikation Pol alpha (α) B Priming i nuklear DNA replikation Pol delta (δ) B Nuklear DNA replikation Pol epsilon (ɛ) B Nuklear DNA replikation Pol zeta (ζ) B TLS Pol IV (λ) X Non-homologous end joining), base excision repair Pol eta (η) Y TLS Rev1 Y TLS H. sapiens Pol gamma (γ) A Mitokondriel DNA replikation Pol theta (θ) A TLS, base excision repair Pol nu (ν) A DNA reparation, TLS Pol alpha (α) B Priming af nuklear DNA replikation Pol delta (δ) B Nuklear DNA replikation Pol epsilon (ɛ) B Nuklear DNA replikation Pol zeta (ζ) B TLS, somatisk hypermutation Pol beta (β) X Base excision repair Pol lamda (λ) X Non-homologous end joining Pol mu (µ) X Non-homologous end joining Pol eta (η) Y TLS, somatisk hypermutation, rekombination Pol iota (ι) Y TLS, somatisk hypermutation, base excision repair Pol kappa (κ) Y TLS, nucleotide excision repair Rev1 Y TLS, somatisk hypermutation Tabel 2: Tabellen viser alle kendte polymeraser i E.coli, S. cerevisiae og H. sapiens [Sutton 2010]. 20