Figur 1: A, nukleotidsekvensen af starten og slutningen af RPB1 genet. Initierings- og terminerings

Transkript

1 Opgave 2 juni 2004 Eukaryote celler indeholder 3 forskellige RNA polymeraser. Hver RNA polymerase er ansvarlig for transkription af bestemte klasser af gener. Ud fra mutationsanalyse i bagegær (Saccharomyces cerevisiae) er det vist at RPB1 genet er essentiel for RNA polymerase II s transkriptionelle aktivitet. I Figur 1 er vist nukleotidsekvensen af den kodende del af RPB1 genet samt 25 nukleotider opstrøms for translationsstart kodon og 25 nukleotider nedenstrøms for translationsterminering. Endvidere er vist nukelotid-sekvensen af et oligonukleotid, der koder for en FLAG epitop. A 5 CTTTACCCCAAAATATAAATCAGACATGGTAGGACAACAGTATTCTAGTGCTCCACTCCG TACAGTAAAAGAGGTCCAATTCGGTCTTTTCTCACCTGAAGAAGTTAGAGCAATCAGTGT GGCCAAAATTAGATTTCCAGAGACAATGGATGAAACCCAGACGAGAGCGAAAATTGGTG G CTCTCCAAACTATAGCCCTACTTCACCTTCTTACTCCCCAACATCTCCAGGCTACAGCCC AGGATCTCCTGCATATTCTCCAAAGCAAGACGAACAAAAGCATAATGAAAATGAAAATTC CAGATGATATAGTATATCATCCTTACGTATTT 3 B 5 GAC/TAC/AAA/GAC/GAC/GAC/GAC/AAA/TGC 3 Figur 1: A, nukleotidsekvensen af starten og slutningen af RPB1 genet. Initierings- og terminerings kodon for translation er angivet med fed skrift; den stiblede linje angiver de nukleotider i RPB1 sekvensen, der ikke er vist; B, nukleotidsekvens der koder for FLAG epitopen; de enkelte kodons er adskilte af /. Spm. A: Beskriv hvorledes du vil fremstille en in-frame fusion mellem den kodende del af RPB1 genet og FLAG oligoen. Sekvensen og orienteringen af eventuelt anvendt syntetisk DNA skal angives. Den generede RPB1-FLAG DNA fusion blev klonet i et gær ekspressionsplasmid. Der ønskes fremstillet en gærstamme, hvor det endogene RPB1 gen er deleteret. 1

2 D + A + B D+A+B+F Spm.B: Beskriv i tekst og tegning hvorledes du vil knock-oute det endoge RPB1 gen i gær. Efter der blev generet en knock-out stamme indholdende plasmidet, der koder for RPB1-FLAG fusionen, ønskes det undersøgt hvilke protein-subunits RNA polymerase II består af. Spm.C: Beskriv i tekst og tegning hvorledes du med udgangspunkt i ovenfor nævnte gærstamme og ekspressionsplasmid vil bestemme, hvilke proteiner RNA polymerase II fra gær består af. De generelle transkriptionsfaktorer danner sammen med RNA polymerasen et pre-initierings kompleks, som kan initiere transkription i tilstedeværelse af frie nukleotider. For at undersøge kravene til dannelse af pre-initierings komplekset blev det i Figur 2 viste forsøg udført. D + A +PolII -IIF D+A+B+F D+A+B+PolII -D -B -A D+A+B+F+PolII Figur 2: Autoradiogram af EMSA assay med forskellige kombinationer af TFIID, A, B, F og RNA polymerase II fra gær samt [ 32 P]-mærket DNA indeholdende en adenoviral promotor. A, B, D, F angiver tilsætning af TFIIA, TFIIB, TFIID eller TFIIF; PolII, RNA polymerase II; angiver tilsætning af stigende mængde RNA polymerase II (startende med ingen tilsætning i lane 3); angiver tilsætning af faldende mængde TFIIF (sluttende med ingen tilsætning i lane 12); -D, kun TFIIA, B, F og RNA polymerase II er tilsat; -B, kun TFIIA, D, F og RNA polymerase II er tilsat; -A, kun TFIIB, F, D og RNA polymerase II er tilsat. +PolII -IIF 2

3 Spm. D: Hvad viser data i Figur 2? Figur 3 viser nukleotidsekvensen af promotorregionen fra Adenovirus, der blev anvendt til footprintet i Figur 4. 5 a catgtctcct tcttcagcgt ccatgaatgt gattggtttg taggtgtaag tcacgtgttc acaattttct ggtggtgggc tataaaaagg ggcgggtcct tggtcttcat cgctttcttc tgcttcgctg tttacgagcg ccaactggtt gggtgagtac acgcgctcaa aggcaggcat tacctctgta ctcaacgtgt cagtttctat aaacgatgag gatttgatgt ttaatcgccc cgctgcaatt 3 Figur 3: Nukleotidsekvensen af Adenovirus promotoren samt flankerende regioner. Til footprinting af non-template strengen er der anvendt den viste non-template streng. Den radioaktive mærkning er indkorporeret i 5 nukleotidet. Endvider er sekvensen af den primer, der blev brugt til sekventering af Adenovirus promotoren vist ved understregning. For at undersøge interaktioner mellem transkriptions-initierings-komplekset og en promotor blev de i Figur 4 viste DNase I footprint eksperimenter udført. Footprintet er udført med oprensede proteiner og det i Figur 3 viste radioaktive virale promotor fragment. 3

4 D DA DAB T - DABFPolII G A C Figur 4: DNase I footprint på non-template strengen af en adeno-viral promotor i tilstedeværelse af oprensede proteiner. Endvidere er vist resultatet af en sekvensreaktion med primeren fra Figur 3. -, angiver at footprintet er fremstillet uden tilsat protein; D, footprintet udført med TFIID; DA, footprintet udført med TFIID og TFIIA; DAB, footprintet udført med TFIID, TFIIA og TFIIB; DABFPolII, footprintet udført med TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIF og RNA polymerase II; G, A, T, C sekvensreaktioner på det i Figur 3 viste DNA fragment udført med den i Figur 3 viste primer. 4

5 Spm. E: Hvad viser data i Figur 4? For at undersøge binding af TFIID til TATA boxen blev der fremstillet et dobbeltstrenget oligonukleotid hvor thymin var udskiftet med cytosin og adenin var udskriftet med inosine. Nukleotidsekvensen af denne oligo er vist i Figur 5B. Strukturen af thymin, adenin, cytosin og inosin er vist i Figur 5A. Som det ses, ser thymin og cytosin ens ud i minor groove af DNAet men ikke i major groove. Tilsvarende ser adenin og inosin ens ud i minor grove men ikke i major groove. I Figur 5 er også vist resulatet af et EMSA assay med muteret eller vildtype TATA box samt oprenset TBP fra gær eller menneske. C CICI TATA NS Figur 5: A, Strukturen af thymin, cytosin, adenin og inosin i major- eller minor groove; dr angiver deoxy-ribose. B, nukleotidsekvensen af den muterede TATA box fra Adenovirus. C, EMSA assay med radioaktivt mærket mutant- (CICI) eller vild type (TATA) oligo samt oprenset gær TBP (lane 1, 3, 5) eller human TBP (lane 2, 4, 6). NS, her er anvendt en oligo med samme G/C indhold som vildtype TATA box oligo nukleotidet, blot uden TATA box. Spm. F: Hvad viser data i Figur 5? 5

6 funktion? 6

7 Opgave 1 juni TGF-β (Transforming Growth Factor) er en stor familie af cytokiner. Medlemmer af TGF-β familien udøver en lang række effekter på en række forskellige celletyper. De regulerer f.eks. cellevækst, differentiering, matrix produktion og apoptose. TGF-β har vigtige funktioner under embryogenesen, og hos færdigt udviklede individer er de involveret i vævs vedligeholdelse og modulering af immunsystemet. TGF-β kan ikke passere plasmamembranen og er derfor afhængig af tilstedeværelsen af specifikke receptorer i membranen for at kunne udøve sin biologiske effekt. Disse receptorer benævnes TβR. Denne opgave omhandler TβR-I og TβR-II. Binding af TGF-β til aktive receptorer i plasmamembranen medfører, at nogle promotorer i cellekernen induceres medens andre represseres. For at denne mekanisme kan fungere må der eksistere en signal transduktionsvej fra de aktiverede receptorer i membranen til specifikke promotorer i cellekernen. For at undersøge denne signal-transduktions-vej blev der fremstillet de i Figur 1 viste DNA konstruktioner. Figur 1: Strukturen af to in-frame fusioner mellem cdna kodende for TβR-II og DNA kodende for en Myc eller en Flag epitop og strukturen af en in-frame fusion mellem cdna kodende for TβR-I og en epitop fra en Adenovirus. Hver af de tre fusioner transkriberes fra en konstitutiv CMV promoter, der er funktionel i en cellelinje kaldet 293. Ikke-transficerede 293 celler udtrykker praktisk taget intet TβR- I eller TβR-II. To portioner 293 celler blev transient co-transficeret med ptβr-ii-myc og ptβr-ii-flag plasmiderne i ækvimolære mængder. D.v.s. at samtlige transficerede 293 celler indeholder begge plasmider. Den ene portion blev tilsat TGF-β. 48 timer efter transfektion blev der fremstillet et præparat indeholdende samtlige af cellens 7

8 membraner. Membranerne blev opløst i et detergent der ikke ødelægger proteinprotein interaktioner og der blev foretaget immunopræcipitation med et anti-mycantistof. Det isolerede immunopræcipitat blev opløst, separeret på en proteingel (SDS- PAGE) og der blev fremstillet et Western Blot med anti-flag-antistof. Resultaterne heraf er vist i Figur 2. Figur 2: Western Blot af immunopræcipitater fremstillet med anti-myc-antistof. Western Blottet er fremkaldt med anti-flag-antistof. TGF-β, immunopræcipitat af opløste membraner fra transficerede 293 celler dyrket uden TGF-β; + TGF-β, immunopræcipitat af opløste membraner fra transficerede 293 celler dyrket med TGF-β. Spm. A: Hvad viser Figur 2 med hensyn til støkiometrien af TβR-II receptoren i fravær henholdsvis tilstedeværelse af TGF-β? To portioner 293 celler blev transient co-transficeret med ptβr-ii-myc, ptβr-ii-flag og ptβr-i-adeno plasmiderne i ækvimolære mængder. D.v.s. at alle transficerede 293 celler indeholder samtlige tre plasmider. Den ene portion blev tilsat TGF-β. 48 timer efter transfektion blev der fremstillet et præparat indeholdende samtlige af cellens membraner. Membranerne blev opløst i et detergent der ikke ødelægger protein-protein interaktioner og der blev foretaget immunopræcipitation med et anti-myc-antistof. Det isolerede immunopræcipitat blev opløst og separeret på en proteingel (SDS-PAGE) og der blev fremstillet ét Western Blot med anti-flagantistof og ét med anti-adeno-antistof. Resultaterne heraf er vist i Figur 3. 8

9 Figur 3: Western Blot af immunopræcipitater fremstillet med anti-myc-antistof. Western Blot A er fremkaldt med anti-flag-antistof og Western Blot B er fremkaldt med anti-adeno-antistof. TGF-β, immunopræcipitat af opløste membraner fra 293 celler transficeret med ptβr-ii-myc, ptβr-ii-flag og ptβr-i-adeno plasmiderne og dyrket uden TGF-β; + TGF-β, immunopræcipitat af opløste membraner fra 293 celler transficeret med ptβr-ii-myc, ptβr-ii-flag og ptβr-i-adeno plasmiderne og dyrket med TGF-β. Spm. B: Hvad viser Figur 3 med hensyn til effekten af TGF-β på TβR-I og TβR-II? 293 celler blev transient transficeret med henholdsvis 1) ptβr-ii-flag, 2) ptβr-i-adeno og 3) co-transficeret med ptβr-ii-flag og ptβr-i-adeno i ækvimolære mængder. For hver transfektion blev cellerne delt i to portioner. Den ene portion celler blev tilsat TGF-β. 36 timer efter transfektion blev der tilsat [ P]-PO 4 til cellerne. 24 timer senere blev der fremstillet membranpræparationer fra cellerne. Membranerne blev opløst i et detergent der ikke ødelægger protein-protein interaktioner, og der blev udført immunoprecipitation med anti-flag-antistof eller anti-adeno-antistof. Immunopræcipitaterne blev adskilt ved elektroforese (SDS- PAGE) og analyseret ved PhosphotImage analyse. Resultatet er vist i Figur 4. 9

10 Figur 4: PhosphorImage analyse af immunoprecipitater fremstillet som beskrevet ovenfor. TGF-β, de transficerede celler er dyrket uden TGF-β i vækstmediet; + TGF-β, de transficerede celler er dyrket med TGF-β i vækstmediet. Over hver lane af gelen er angivet hvilket antistof, der er anvendt til immunopræcipitationen, og hvilke plasmider de tilhørende celler har været transficeret med. Spm C: Hvad viser Figur 4 om effekten af TGF-β på TβR-I og TβR-II? Der er til dato identificeret ni proteiner kaldet Smad1-9. Nogle af disse er involveret i signal transduktion fra TGF-β. For at bestemme hvilke af de øvrige Smad-proteiner, Smad3 kan interagere med, er der fremstillet de plasmider, der er vist i Figur 5. 10

11 Figur 5: Plasmider til undersøgelse af mulig interaktion mellem Smad3 og øvrige Smad proteiner. pgal4 DNA -Smad3, et plasmid indeholdende en Gal4 DNA -Smad3 in-frame genfusion, der resulterer i dannelse af et fusionsprotein mellem det DNA bindende domæne af Gal4 proteinet og Smad3 proteinet. psmadx-gal4 TR, et plasmid der indeholder en Smadx-Gal4 TR in-frame genfusion, der resulterer i dannelse af et fusionsprotein mellem Smadx proteinet og det transkriptionsaktiverende domæne af GAL4 proteinet. X, angiver et af tallene 1-9. P, konstitutiv promoter til transkription af begge fusionsgener; phis3, et plasmid hvor ekspressionen af et HIS3 gen er underlagt en GAL promoter; 2μ, et 2μ origin fra gær. Spm. D: Beskriv hvorledes det ved hjælp af ovenstående plasmider er muligt at afgøre hvilke Smad proteiner, Smad3 interagerer med. Ud over plasmiderne har du en gærstamme med følgende genotype til rådighed; ura3, lys2, leu2, his3, gal4. Det viser sig, at Smad3 interagerer med Smad2 i fravær af TGF-β. I tilstedeværelse af TGF-β fosforyleres Smad3 proteinet af TβR-I, hvorefter det bindes til Smad4 proteinet. Figur 6 viser den cellulære lokalisering af Smad3 proteinet i celler dyrket i fravær eller tilstedeværelse af TGF-β. Figur 6: Den cellulære lokalisering af Smad3 proteinet i celler dyrket uden TGF-β (A) og i celler dyrket med TGF-β (Β). Lokaliseringen af komplekset er visualiseret med fluorescerende antistoffer rettet mod Smad3. Sværtningen angiver således fluorescensen. 11

12 Spm. E: Foreslå ud fra Figur 6 en mekanisme for den TGF-β stimulerede ændring i den cellulære lokalisation af Smad3 proteinet. For at kunne undersøge den molekylære mekanisme bag de kernelokaliserede Smad proteiners transkriptionsregulerede effekt er det nødvendigt at fremstille de forskellige Smad proteiner rekombinant i E. coli. Det rekombinante protein skal blandt andet bruges til immunisering af kaniner med henblik på fremstilling af Smad specifikke antistoffer. Spm. F: Beskriv hvilke elementer en vektor skal indeholde, for at det er muligt at udtrykke Smad cdna i E. coli. Transkription af plasminogen aktivator inhibitor-1 (PAI-1) genet induceres i tilstedeværelse af TGF-β. Promotoren for PAI-1 genet indeholder tre boxe som har meget høj indbyrdes homologi. Lokaliseringen af boksene fremgår af Figur 7. For at undersøge den molekylære mekanisme bag denne regulation er der fremstillet de i Figur 7 viste reportergen konstruktioner. 12

13 Figur 7: Strukturen af forskellige reportergen konstruktioner og reportergen aktiviteten efter transfektion af HepG2 celler med de viste plasmider. Basalniveau er aktiviteten ved dyrkning i fravær af TGF-β. Fold induktion er det antal gange aktiviteten øges ved tilsætning af TGF-β. Konstruktionerne indeholder 3 homologe boxe (der findes i PAI-1 genet i positionerne - 730, og i forhold til transkriptions start site) fusioneret til den konstitutive HSV-Thymidin kinase promoter. De åbne kasser b1, b2 og b3 angiver de tre homologe boxe. En pil angiver transkriptions start sitet. Sorte kasser angiver at rækkefølgen af nukleotider i boxen er ændret. Box b1 har sekvensen AGCCAGACA, box b2 og b3 har sekvensen AGACAGACA og de ændrede boxe har sekvensen AGCTACATA henholdsvis AGATACATA De ændrede nukleotider er understregede. LUC, reportergenet luciferase. Spm. G: Hvad viser data i Figur 7 omkring funktionen af de tre bokse? Figur 8 viser en række EMSA (electrophoretic mobility shift assay) assays udført med et [ 33 P]-mærket, dobbeltstrenget, syntetisk oligonukleotid på 29 basepar indeholdende sekvensen fra box 1 fra Figur 7 og kerneekstrakt fra HepG2 celler. 13

14 Figur 8: EMSA assay udført med de ovenfor beskrevne komponenter. Competitor angiver hvorvidt der er tilsat ikke-radioaktive oligonukleotider til assayet; TGFβ +/-, angiver hvorvidt kerne ekstraktet er fra stimulerede eller ikke-stimulerede HepG2 celler; CAGA50x, tilsat 50 gange molært overskud af ikke-radioaktiv mærket oligo nukleotid identisk med det til assayet benyttede radioaktive oligo nukleotid; mutated CAGA, tilsat 100 gange molært overskud af et af de i Figur 7 beskrevne muterede oligonukleotider; consensus Sp1, consensus AP1, consensus NF1, consensus NFκB, Aktivin Responsive Element, ikke-radioaktive oligo nukleotider indeholdende konsensus bindings-sites for kendte transkriptionsfaktorer; + anti-smad1, + anti-smad2, + anti-smad3, + anti-smad4 og + anti- Smad5 angiver hvilke antistoffer, der er tilsat EMSA assayet; + immunogenic peptide, betyder at der er tilsat et stort overskud af det peptid, det enkelte antistof er rettet mod. Σπμ. Η: Hvad viser Figur 8 med hensyn til konsekvensen af tilsætning af TGF-β til HepG2 celler og de enkelte Smad proteiners funktion? 14