KONSEKVENSER VED UDSKIFTNING AF KONVENTIONELLE PRÆPARERINGSTEKNIKER MED AUTOMATISERET VÆSKEBASERET PRÆPARERINGSTEKNIKER TIL SØRESE VÆSKER

Transkript

1 KONSEKVENSER VED UDSKIFTNING AF KONVENTIONELLE PRÆPARERINGSTEKNIKER MED AUTOMATISERET VÆSKEBASERET PRÆPARERINGSTEKNIKER TIL SØRESE VÆSKER Professionsbachelor projekt udarbejdet af: Issa Hassan ( ) I-vejleder: Birte Bunch Larsen Bioanalytikkeruddannelsen VIAUC, Campus Aarhus N Kliniske vejledere: Dorthe Ejersbo Patologiafdelingen, Odense universitetshospital Antal tegn:

2

3 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet ved Patologiafdelingen på Odense Universitets Hospital og henvender sig til medstuderende, undervisere, vejledere, bioanalytikere og andre med interesse for Cytologi. Den praktiske del af projektet blev udført af projektgruppen bestående af bioanalytikerstuderende Rene Skov Bærentsen, Mads Hoffmann Merrild og Issa Hassan. Databehandling og metodeafsnit i følgende rapport er udarbejdet i samråd med projektgruppens medlemmer mens de resterende afsnit er udarbejdet af Issa Hassan Rene Skov Bærentsen og Mads Hoffmann Merrild takkes for at udvise god samarbejdsevne. I forbindelse med udførelsen af professionsbachelorprojektet, vil jeg takke min kliniske vejleder Dorthe Ejersbo og Birte Bunch Larsen for deres professionelle vejledning samt konstruktive kritik under hele forløbet. Herudover skal der rettes en speciel tak til Tina Hyldebrandt, Kirsten Hartmann og Ole Nielsen for deres hjælp til udførelsen af den praktiske del af projekt. Jeg vil rette en speciel tak til specialeansvarlig overlæge på afdelingen, Karen Ege Olsen, for hendes diagnostiske bidrag til projektet. Issa Hassan 2

4 Indholdsfortegnelse Indhold Forord... 3 Indholdsfortegnelse... 4 Abstract... 6 Introduktion... 7 Problembaggrund... 7 Formål... 8 Problemformulering... 8 Målformulering... 8 Teoriafsnit... 9 Serøse væsker... 9 Cytolyt og Preservcyt Thinprep Præparering af non-gynækologisk præparater Cellient Præparering af Cellient celleblokke May-Grünwald Giemsa Papanicolaou Hæmatoxlin Eosin Immunhistokemisk farvning EMA Calret TTF Cytokeratin Materialer og metoder

5 Materiale Prøvemateriale Metode Indsamling af prøvemateriale Pilotprojekt vedrørende forsøget Blinding Forsøgsopsætning Kvalitetsvurdering Mikroskopering og kriterier Anvendte statistiske metoder Resultater Teknisk kvalitet Farvekvalitet Diagnostisk Kvalitet Diskussion Metodevalg Forsøgs design Reproducerbarhed Pilotprojekt Blinding Fejlkilder Udløbsdato Udfældninger Cellient Scoresystem Teknisk kvalitet

6 Farvekvalitet Diagnostisk kvalitet Konklusion Perspektivering Anbefaling Referenceliste

7 Abstract The aim of the study is to determine how the technical-, staining- and diagnostic quality is affected by implementing automation of liquid based thin-layer preparations technique for non-gynecologic fluids. This was achieved by performing split samples on 29 effusion fluids. A half of the split samples were prepared the using conventional smears and plasma-thrombin clots. The other halves were prepared using the thin-layer preparations technique on ThinPrep T2000 system and Hologic Cellient. Samples were blinded and then treated with Papanicolaou (PAP), May Grünwald Giemsa (MGG) and Hematoxylin and Eosin (HE) stains. The study revealed that LBC samples prepared on ThinPrep T2000 achieved the same technical quality and improved diagnostic quality. But the study cannot conclude whether there has been an improvement in staining quality, because of the conflicting results between Dorthe Ejersbo and the project group. Furthermore the study revealed that a replacement of the conventional plasma-thrombin clots, with Cellient leads to a better technical and staining quality for PAP, MGG and HE staining. Cellient achieved the same diagnostic quality as the conventional plasma-thrombin clot. However, Cellient given poor results by IHC staining. 6

8 Introduktion Problembaggrund På afdeling for Klinisk Patologi (AKP) på Odense Universitets Hospital (OUH) indgår serøse væsker (pleura-, ascites- og perikardievæske) som en del af det diagnostiske grundlag for en bred vifte af tumor diagnostik. Ved inflammation eller cancer kan der ske en øgning i produktion af væske, og i denne væske kan der dannes en ophobning af inflammatoriske celler og afstødte tumorceller. Formålet med cytologiske undersøgelser af serøse væsker er, at identificere og diagnosticere eventuelle morfologiske forandringer i de underliggende cellelag, ud fra afstødte eller afskrabede celler i væsken. Dette gøres ved farvning af celler i væsken, og efterfølgende mikroskopering af disse (1). I dag fremstilles der rutinemæssigt to udstrygninger vha. udstrygningsteknik (UST). Prøvematerialet udtages og centrifugeres hvorefter en dråbe af bundfaldet overføres til et objektglas og fordeles med et hårrør. Herefter lufttørres glassene og farves efter henholdsvis Papanicolau farvemetode (PAP) og May-Grunwald-Giemsa farvemetode (MGG). Samtidig fremstilles et koagel ved at tilsætte plasma og thrombin til prøvematerialet. Herefter foretages der vævsfremføring til paraffin for koaglet. Af denne paraffinblok skæres et snit til HEfarvning, hvorefter celleblokken gemmes til eventuelle immunhistokemisk undersøgelser (IHC). AKP på OUH har i en årrække benyttet væskebaseret cytologi (VBT), bl.a. på deres gynækologiske præparater (cervixcytologi), og på bronkie- og blæreskyllevæsker. Væskebaseret cytologi har nogle fordele i forhold til den konventionelle UST metode, bl.a. ved en ensartet kvalitet, reduceret indholdet af blod og slim, cellerne forbliver velbevaret, restmateriale til anden undersøgelse mm (2). Samtidig viser en undersøgelse fortaget af Rana S.Hoda (3) at VBC giver bedre resultater ved mikroskopering end UST. Derfor ønsker vi at sammenligne præparater fremstillet ved VBC med UST. Vi ønsker herudover at sammenligne immunfarvninger på præparater fra koagler med præparater fra celleblokke fremstillet på Hologic Cellient. 7

9 Formålet med projektet er således, at sammenligne to nye automatiserede metoder med de konventionelle metoder inden for præparering af serøse væsker. Dette med henblik på at øge præparaternes kvalitet og reducere tidsforbruget til præparering. For at sammenligne kvaliteten mellem præparater fremstillet ved hhv. VBT og UST, samt koagler og celleblokke fra Cellient, er det nødvendigt, at benytte nogle kvalitets kriterier. Inden for histologi og cytologi vurderes kvaliteten ud fra følgende tre kriterier: Farve kvalitet Teknisk kvalitet Diagnostisk kvalitet For uddybelse af disse kriterier henvises der til metode afsnittet. Formål At undersøge og vurdere hvorvidt det er muligt, at skifte fra udstrygningsteknik til væskebaseret teknik samt at skifte fra plasma-thrombin koagler til Cellient celleblokkeder for serøse væsker. Problemformulering Hvordan påvirkes præparaters farve-, teknisk - og diagnostiske kvalitet ved automatisering af præpareringsteknikken til serøse væsker? Målformulering For at besvare vores problemformulering vil vi gøre følgende: Vi vil fremstille splitsamples af ascites, pericadie og peluravæsker, der modtages på KPA, OUH. Den ene sample behandles med de nuværende anvendte metoder til præparering af serøse væsker på KPA, OUH (kaldet rutineprøver). Den anden sample behandles efter Hologics anbefalinger for VBC. Vi vil farve præparater, fremstillet ved væskebaseret- og udstrygningsteknik, MGG og PAP farvning. 8

10 Vi vil fremstille præparater fra Cellient celleblokke der HE farves. Vi vil udføre fire immunfarvninger på snit fra Cellient celleblokke, på de rutineprøver hvor afdelingens patologer har bestilt immunfarvninger. Vi vil blinde alle præparaterne og herefter mikroskoperes og vurderes de af den ansvarligoverlæge Karen Ege Olsen og klinisk vejleder Dorthe Ejersbo, der giver hver deres svar. Vi vil ligeledes selv lave en fælles vurdering af alle præparaterne. Vi vil vurdere præparaternes kvalitet indenfor farve-, tekniske- og diagnostiske kvalitet, ved hjælp af et udarbejdet pointsystem. Teoriafsnit Serøse væsker Serøse væsker dannes af specialiseret epiteltype kaldet mesotelceller. Disse celler sidder på ydersiden af vores indre organer. Disse væsker navngives alt efter hvilket hulrum de tilhører f.eks. perikardie væske. Mesotelceller står for reguleringen af volumen af vores beskyttende hindevæske, da disse celler indeholder en funktion, der tillader dem at optage og sekrere væske. Serøse væsker er mukøse væsker hvis formål er, at minimere friktionen i forbindelse med sammentrækning og udvidelse af vores indre organer. Det normale cellebillede i serøse væsker består af histocytter, afstødte mesotelceller, leukocytter og lymfocytter. Ved cancer eller infektion i nærliggende organer forandres dette cellebillede i form af øget tilstedeværelse af inflammatoriske celler samt forandringer i mesotelcellerne. Disse forandringer vil optræde som lavere differentierede med forstørret KC -ratio hvilket vil fortæller os hvor stor en procentdel kernen udgør af hele cellen. Mesotelcellerne kan også udvikle sig til reaktive mesotelceller ved påvirkning af ekstern stimuli. Dette udtrykkes via forstørrede kerner, da cellen vil være hyperaktiv. Ovennævnte funktioner samt beskrivelse af mesotelceller gør dem til oplagte kandidater til brug i sammenhængen med tumordiagnostik på patologiske afdelinger landet over. Ved at anvende PAP, 9

11 MGG, HE og IHC farvning til visualisering af celler i serøse væsker er det muligt at diagnosticere både primær og sekundære tumorer (14). Cytolyt og Preservcyt PreservCyt er en opløsning indeholdende methanol og buffer. Denne kombination af buffer og methanol bevirker, at der i opløsningen skabes bakterie- og virusdræbende forhold. PreservCyt anvendes ved præparering af cellemateriale på ThinPrep. Formålet med PreservCyt er at virke som cellebevarende medium under transporten og ved overførsel af cellemateriale til objektglasset. Prøvemateriale kan opbevares i 3 uger i PreservCyt ved 4-37 C (Bilag 1). Cytolyt er en opløsning indeholdende methanol og buffer, samt hæmolytiske og mucolytiske reagenser. Cytolyt indeholder en mindre koncentration methanol end Preservcyt. Cytolyt reagenset lyserer og nedbryder erytrocytter og slim inden cellematerialet overføres til PreservCyt. Produktet virker ligeledes som en cellebevarende medium under transporten. Cytolyt har modsat preservcyt ingen bakterie- og virusdræbende effekt. Prøvematerialet kan opbevares i 8 dage ved C. (Bilag 2). Methanol også kaldet methylalkohol indgår i begge ovennævnt opløsninger. Methanol er et koagulerende fiksativ, der virker denaturerende på proteiner. Alkohol fiksativet bevirker at vandmolekylerne i proteinet udskiftes med alkoholmolekyler. Denne proces ødelægger proteinets tertiære struktur samt dele af den sekundære struktur. De hydrofobe grupper blotlægges og samtidig dannes der tværbindinger i mellem proteinerne (bilag 3). Thinprep TP 2000 er en fuld automatiseret væskebaseret system, der har til formål at erstatte den konventionelle udstrygningsteknik, der bruges til identificere atypiske celler. TP T2000 lejre cellerne i monolag vha. en tyndtlagsteknik. TP T2000 har et special designet filter til henholdsvis gynækologiske og non- gynækologiske præparater. 10

12 Billede 1: ThinPrep T2000 apparaturet Præparering af non-gynækologisk præparater. TP 2000 starter med at gøre TransCyt filteret vådt for derefter, at blæse alt væske væk igen. Dette gøres for at rense alt cellulært materiale væk. Herefter starter en forbehandlingsproces på tre stadier. 1) Dispensering af cellematerialet med TransCyt filteret. Dette gøres for at fjerne forstyrrende elementer såsom slim, blod og celle debris. 2) Opsugning af cellemateriale gennem TransCyt filtermembranen som er speciale designet til at indsamle diagnostiske celler via små negative impulser. PreservCyt væsken vil derved løbe op igennem det porøse filter hvilket resulterer i at cellematerialet tilbageholdes på ydre membranen. TP 2000 stopper opsugningen når detektoren registrerer en tilpas mængde af celler på ydre membranen. 3) Dernæst skabes et vakuum indeni filtret, som suger den overskydende PreservCyt væske væk. TP 2000 vender nu filteret 180 grader hvorved ydre membranen presses op imod et speciale designet non-gynækologisk objektglas. Den negative ladning på objektglas samt et positivt lufttryk medfører at cellerne bedre adhærerer til objektglasset. 11

13 Figure 1: Oversigt over ThinPrep T2000s tre forbehandlende stadier; dispensering, indsamling og overførsel af cellemateriale TP 2000 tipper til sidst objektglasset ned i en Ethanol beholder. TP 2000 har indbygget software som kontrollere homogeniseringen, opsugningen og overførslen af celler til objektglasset. Disse tiltag kontrolleres af softwaret for at sikre et aftryk der er repræsentativt for hele prøven (4, side 11-30). Cellient Cellient automatiseret system til fremstilling af paraffin indstøbte celleblokke, har til formål at erstatte den konventionelle plasma-trombin koagel. Cellient har visse fordele i form af reduceret præpareringstid og samtidigt opnås der samme konsistente præparering af cellematerialet samt en god bevaring af cellematerialets morfologi. Præparering af Cellient celleblokke ThinPrep beholderen overføres til Cellient apparatet sammen med sammen med tre pipettespidser og en blok med filter (Bilag 23). Herefter vælges der et præpareringsprogram med eller uden Eosin samt om man ville bruge cellematerialet eller om man manuelt vil tilsætte en spontan koagel til blokken. Fremstillingstiden for en celleblok tager min. Filteret tages forsigtigt af og celleblokken overføres til en eksternt finishingsstation som indstøber cellerne med et nyt lag paraffin. Dette paraffin lag bevirker at snitoverfalden øges. Herved er celleblokken klar til mikrotomi og derefter farvning (5, 9-23). May-Grünwald Giemsa May-Grünwald Giemsa (MGG) metoden er en oversigtfarvning som primært bruges i cytologien, hvor den bl.a. anvendes til at farvning af udstrygningspræparater. 12

14 MGG farvningen består af to farveopløsninger Giemsa som indeholder kationfarvestofferne Azur A, Azur B og Methylenblåt samt Anionfarvestof Eosin Y. May-Grünwald indeholder anionfarvestoffet Eosin Y og kationfarvestof Methylenblåt. Farvningen vil resultere i et purpur farvning af kernen (billede 2), bedre kendt som Romanowski- Giemsa effekt. Dette skyldes enten bindinger mellem kation og polyanion eller polykation og anion farvestoffer. Typisk ses det ved at Eosin Y og Azur B, der binder sig til hinanden samtidig med at det er bundet til henholdsvis DNA og Histoner. Billede 2: MGG farvning på udstrygning, hvorved Romanowski-Giemsa effekt kan ses Den negativ ladede Eosin Y farver de positiv ladede proteinerne i cytoplasmaet samt histoner i cellekernen. Samtidig farver Methylenblåt, Azur A og Azur B nukleinsyrer i cellekernen (DNA og RNA) (6). Papanicolaou Formålet med Papanicolaou farvning (PAP) er at synliggør kromatinstrukturen i cellekernen samt give en mindre detaljeret farvning af cytoplasmaet. PAP anvendes typisk til farvning af Cytologisk cellemateriale. PAP indeholder en kernefarvning samt flere farvereagenser til farvning af cytoplasmaet. 13

15 Billede 3: PAP farvet VBT præparat med velafgrænset Cytoplasma og tydelig kromatinstruktur. Ved brug af PAP farvning skal præparaterne fikseres umiddelbart efter prøveudtagningen for at undgå udtørring og for at bevare cellemorfologien. Her bruges et koagulerende fiksativ hvilket udskifter vand i proteinerne med alkohol derved blotlægges samtidig de reaktive grupper. De autolytiske enzymer inaktiveres, for derved at undgå autolyse af cellerne (7). Hæmatoxlin Eosin Ved diagnostik af histologiske og cytologiske prøver, er den mest anvendte oversigtsfarvning til at vurdere vævets morfologi Hæmatoxylin-Eosin metoden (HE). Aluminium-Hæmatoxylin (Al- Hæmatoxylin) er et metalkompleksfarvestof, hvilket binder sig til væv enten via en kompleksbinding ved ligandudskiftning af H 2 O eller ved hydrofob stabilisering. Cellekernen vil af hematein blive farvet blå, da den indeholder store mængder af fosfat ioniserede grupper i både DNA og RNA. Disse negativt ladet fosfat grupper vil binde sig til de positive ladet Al-Hæmatoxyliner via en kompleksbinding (Bilag 4). 14

16 Immunhistokemisk farvning Billede 4: HE farvet VBT præparat med tydelig kerne og Cytoplasmadetaljer. EMA Epithelial membrane antigen (EMA) er et monoklonal antigen, som tilhører til en heterogen population af HMFG (Humant mælkefedt globulus). Antistoffet mærker epitelceller i en lang række forskellige væv og er et nyttigt værktøj til identifikation af neoplastisk epitel. Antistoffet mærker en lang række neoplastiske epiteler samt ligeledes neoplastiske mesotelceller (Bilag 5) Forekomsten af EMA øges ved celleaktivitet og celle proliferation(8). Calret Calretinin (Calret) er et calciumbindende protein der tilhører Troponin C familien. Calret optræder bl.a. i normale og reaktiv mesothelium. Calret findes både i kerne og cytoplasma, hvor det virker som calciumbuffer(9). Calret anvendes til identifikation af lungehindekræft, og til at skelne mellem lungehindekræft og adenocarcinom (Bilag 6). TTF-1 Thyroid transcritions faktor -1 (TTF-1) er et nukleært protein som findes i glandula thyroidea både i C-celler, follikelceller og i resperatorisk epitel. TTF-1 generne transskriberer for thyroglobulin, thyroperoxidase og thyrotropin receptor. Det antages også at TTF-1 i forsterlivet har betydning for morfogenesen og cytodifferentiering af embryonale celler. TTF-1 påvises ved alle typer ikke-anaplastisketyper ved glandula thyroidea karcinom. På patologisk afdeling på OUH anvendes TTF-1 som thyroideavævs markør, da der forekommer eksperssion af TTF-1 i vævet (8). Cytokeratin 7 Cytokeratin tilhører en gruppe proteiner af typen intermediært filament, hvilket findes i alle epitelceller og mesotelceller. På nuværende tidspunkt findes der 20 forskellige Cytokeratin 15

17 polypeptider, hvilket er nummeret 1-20 alt efter deres molekylevægt samt ph værdi. Cytokeratin (CK) ses ved kernen og ved cellemembranen, hvor filamenterne i epitelceller befinder sig (8). Cytokeratin 7 (CK7) påvises i næsten alle tilfælde af adenokarcinom, follikulært og papillært thyroideakarcinom samt lungeadenokarcinom. CK 7 er særdeles nyttig til at identificere den primære lokalitet for adenokarcinomer. I dag anvendes CK 7 som markør for primære lunge andenokarcinom (10). 16

18 Materialer og metoder Materiale Utensilier, reagenser og apparatur ses i bilag 7 og 19. Prøvemateriale 30 prøver bestående af 9 Acitis, 20 Pleura og 1 Perikadie. For at illustrere fordelingen og præparering af både UST og VBT prøverne, er der udarbejdet følgende flowdiagram: Metode Figur 2: Flowdiagram over fordelingen af prøver samt præpareringsforløb for UST og VBT. Indsamling af prøvemateriale. Vi havde i samråd med vores kliniske vejleder Dorthe Ejersbo (DO), besluttet at påbegynde indsamling af prøver mandag d. 26. september Indsamlingen sluttede, da vi havde de 30 ønsket prøver, hvilket vi opnåede d. 18. oktober

19 Forsøget havde et omfang på 32 prøver, hvoraf de 30 skulle indgå aktivt i forsøget. Der blev ikke sorteret på prøverne på baggrund af de kliniske data, men derimod blev de medtaget i den rækkefølge de kom ind. Derved blev de sidste 2 prøver ekskluderet. Vi havde følgende eksklusionskriterier for indsamlingen af vores prøver. Eksklusionskriterier: Andre væsker end ascites-, pleura- eller perikardievæsker. Prøver under 500 ml Spontankoagler indgår ikke Under forsøget var vi nød til at ekskludere en prøve pga. manglende præparater. Vi manglede både de PAP farvede præparater og de immunhistokemisk farvede præparater på den ekskluderede prøve. Eksklusionsbeslutningen blevet taget i samråd med vores kliniske vejleder DO. Vi fik dermed denne præparatfordeling som fremgår af tabel 1. Farvning Teknik Antal præparater PAP VBT 29 MGG VBT 29 PAP UST 29 MGG UST 29 HE Cellient (Celleblok) 29 HE Koagel 29 I alt 174 Tabel 1: Præpararfordeling af PAP, MGG og HE præparater i vores forsøg Præparatfordelingen af immunhistokemisk farvede præparater er skitseret i tabel 2. Afdelingens læger havde bestilt immunhistokemisk farvning på 5 af de konventionelle præparater. Derved skulle vi bestille 5 immunhistokemisk farvninger på de tilhørende VBT præparater. Formålet med dette var at have sammenligningsmateriale til den diagnostiske kvalitet. Farvning Teknik Antal præparater TTF1 x 2 Koagel/Cellient Celleblok 10 Calretinin x 2 Koagel/ Cellient Celleblok 10 EMA x 2 Koagel/ Cellient Celleblok 10 CK7 x 2 Koagel/ Cellient Celleblok 10 18

20 I alt 40 Tabel 2: Præparatfordelingen af immunhistokemisk farvede præparater i projektet. Der blev fremstillet 2 præparater af hver immunhistokemisk farvning til henholdsvis Cellient celleblok og koagel. Vi har i alt mikroskoperet, vurderet og scoret 214 præparater, hvilket fremgår af tabel 1 og 2. Vores diagnostiske fordeling af prøverne er illustreret i tabel 3 herunder: Pilotprojekt vedrørende forsøget Prøvens diagnose Antal Maligne celler 12 Uegnet til specialundersøgelse 1 Malignsuspekt 1 Atypiske celler 4 Akut og kronisk 2 inflammation Ingen maligne celler 10 I alt 30 Tabel 3: Den diagnostiske fordeling af de 30 præparaterne. I samarbejde med mine medstuderende startede vi med at lave nogle ThinPrep præparater, hvilket blev farvet med MGG. MGG protokollen til VBT var indhentet af en bachelor gruppe i København (Bilag 8). Vi anvendte denne protokol for, at vurdere hvorvidt den skulle justeres. Herudover ønskede vi at vurdere, hvorvidt der var en homogen lejring af celler på præparatet. Pilot projektet tillod os at udvikle et erfaringsmæssigt grundlag til vurderingen af præparaterne. Derved kunne vi undgå forskellighed imellem vurderingen af de første præparater og de sidste. Den anvendte MGG farveforskrift viste sig at være tilfredsstillende. Cellelejringen derimod viste sig at være dårlig. Alle cellerne havde lejret sig i en ring ved kanten af filter aftrykket. Dette betød at en stor celletæthed gav dårlig aftryk og dermed dårlig præparater Vi besluttede at prøven skulle fortyndes for at opnå en korrekt koncentration af celler, således at cellerne lejre sig jævn på glasset. Vi lavede derved 4 forskellige fortyndinger med Cytolyt, for at se hvilken af disse, var bedst egnede til vores forsøg. Fortyndingerne var som følgende; 1:5, 1:10, 1:20 og 1:40. 19

21 Ovennævnte fortyndinger blev farvet med PAP farvning og mikroskoperet. Ved mikroskopering fandt vi frem til at de bedste resultater forekom ved 20 og 40 gange fortynding. Ud fra disse resultater lavede vi en standard. Standarden var en afmærket højde mål på centrifugerøret hvilket i praksis vil sige, at hvis cellepelletens størrelse/højde overstiger denne afmærkning skal prøven fortyndes 1:20 (Bilag 17, side 1-3). Billede 5: centrifugerrør fra vores pilotprojekt, indeholdende 4 ml prøvemateriale. Hvilket svarer til den acceptable koncentration af celler, for at opnå en jævn overflade på objektglasset. Vores resultat fra pilot projektet stemte overens med det anbefalede fortyndingsforhold i ThinPrep T2000 manualen. I manualen anbefales det at fortynde prøver med høj koncentration af celler i forholdet 1: 20 ved ring dannelse (11, punkt1,24). Blinding For at mindske den informations bias variation i vores projekt, var det mest hensigtsmæssigt at blinde vores prøver. Dette blev gjort ved at nummerer de indsamlede prøver med numrene Derved fik vores ThinPrep og Cellient præparater numrene fra Vores UST præparater og koagler bevarede afdelingens C- numre. Vi lavede et dokument, hvori de fortløbende numre blev noteret og parret med tilhørende C-numre. Dokumentet blev gemt og først taget op igen, da alle præparater var vurderet. Til vurdering af præparaterne tog vi en metode ad gangen. Vi startede med at mikroskopere og vurdere alle PAP og MGG præparater fra VBT. Dernæst vurderede vi alle PAP og MGG præparater fra UST. 20

22 Ved HE farvning startede vi med den konventionelle koagel og derefter Cellient. I samråd med projektkoordinatoren på afdelingen, Ole Nielsen, fandt vi frem til, at det ikke var muligt at blinde præparaterne ved vurdering af de immunhistokemisk glas. Vi skulle i stedet vurdere Cellient præparaterne sammen med afdelingens koagel præparater for at gøre det muligt at bruge kontrolsnittet som sammenligningsmateriale. Herefter sammenlignes præparaterne for henholdsvis koagel og Cellient. Forsøgsopsætning Fremstilling af præparater Afdelingen modtager næsten dagligt serøse væsker, hvorved der rutinemæssigt bliver fremstillet 2 udstrygninger vha. udstrygningsteknik (UST) og 1 plasma- trombin koagel (bilag 9-10). Ud af cellematerialet fra hver originalprøven udtages der en splitsample på ca. 50 ml som overføres til centrifugerør med CytoLyt. Centrifugerørende gemmes til fremstilling af VBT præparater og Cellient celleblokke. Der tilsidesættes 30 centrifugerør i alt til forsøget. Herefter vurdere vi makroskopisk de 30 centrifugerør med de tildelte projektnumre 1-30, for at frasortere alle blodige præparater, så der kan overføres CytoLyt med henblik på at resuspendere cellematerialet vha. Vibrax omrysteren. Billede 6: Forsøgets centrifugerør nr. 22 er et eksempel på et blodig præparat som skal resuspenderes i Cytolyt for at lysere erytrocytter og fjerne det resterne slim. 21

23 Forsøgets 30 prøver centrifugeres, hvorved bundfaldet afmåles efter standarden fra pilotprojektet. Præparater som indeholder en cellekoncentration over standardlinjen, fortyndes i forholdet 1:20 og centrifugeres. Supernantanten hældes fra og der tilsættes op til 45 ml PreservCyt til cellepellet. Prøvematerialet resuspenderes på Vibrax, og overføres til en ThinPrep beholder, hvor cellematerialet henstår i ca. 15 min (4, side 45-48). Fremstilling af ThinPrep og Cellient præparater ThinPrep beholderen sættes på ThinPrep T2000 apparaturet sammen med et non-gynækologisk filter og objektglas. ThinPrep T2000 kører på program 2 (FLU/FNA) og starter med at homogenisere prøven ved at filtreret dispenserer prøven. Prøvematerialet suges op gennem filteret som detekterer celle koncentrationen. Når der er tilpas mængde celler på filter overfladen, vender maskinen filteret og der afsættes et aftryk på objektglasset vha. vakuum og ved at føre en positiv ladning gennem filteret. Objektglasset bliver derefter overført til en beholder med 96 % ethanol (4). Der bliver lavet 2 glas til henholdsvis PAP og MGG farvning (Bilag 11-12). ThinPrep beholderen overføres derefter til Cellient fra Hologic sammen med tre pipettespidser og en blok med filter. Cellient er en fuldautomatiseret system, hvilket fremstiller en paraffin indstøbt celleblok. Når Cellient er færdig tages blokken ud og filteret fjernes forsigtigt. Blokken overføres til finishingsstationen, som indstøber cellerne med et nyt lag paraffin, hvilket giver blokken en større snitoverflade som vist herunder. Celleblokken er derved klar til mikrotomi og derefter farvning. 22

24 Billede 7: Her er illustreret en færdig Cellient celleblok, hvor prøvematerialet er koncentreret i en cirkel i midten. Farvning For UST præparaterne og plasma-trombin koagler foretages HE, PAP, MGG og immunhistokemisk farvninger efter afdelingens forskrifter (bilag 4,11-16). Disse fremstilles af afdelingen i forbindelse med rutinearbejdet under indsamlingsperioden. For VBT præparaterne foretages PAP farvning efter afdelingens forskrifter, mens MGG farvning foretages efter opskriften indhentet fra et bachelorprojekt i Kbh. (bilag 8). På Cellient blokken udføres HE farvning, samt eventuelt immunfarvning efter afdelingens protokoller (Bilag 13-16). Kvalitetsvurdering UST og VBT Vi har valgt at bruge PAP farvning til vurdering af den tekniske kvalitet af UST og VBT præparaterne, da der bruges samme farvemetode. Der blev som tidligere nævnt brugt to forskellige MGG farveprotokoller. UST præparaterne blev farvet efter afdelings farveprotokol, hvorimod VBT præparaterne blev farvet af den indhentede MGG farveprotokol fra bachelor gruppen i Kbh.(Bilag 7). Vi har til scoringen af præparaterne udarbejdet definitioner til henholdsvis teknisk- og farvekvalitet. Disse definitioner har til formål at beskrive prøven for hvert karaktertrin i de forskellige kategorier. Karakteren gives derved til den beskrivelse der bedst repræsenterer prøven. Herunder er der en oversigt over de udarbejdet definitioner for henholdsvis teknisk- og farvekvalitet. Teknisk kvalitet Score Definition 0 Et præparat hvor der generelt er for få eller for mange mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er meget blodigt samt inflammatorisk præget, eller udflydende autolyserede celler 1 Et præparat hvor der er en acceptabel mængde af mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er præget af let blodig baggrundsstøj, hvor få celler ligger enkeltvis i et monolag, og der forekommer få velafgrænsede celler med en svag grad af autolyse 2 Et præparat hvor der er en acceptabel mængde af mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er præget af moderat baggrundsstøj og celler ligger primært enkeltvis i et monolag. Der forekommer en tilpas mængde af velafgrænsede celler uden autolyse 3 Et præparat hvor der er en acceptabel mængde af mesotelceller per synsfelt, hvor det generelle billede af prøven er præget af svag baggrundsstøj og cellerne ligger enkeltvis i monolag, og størstedelen af cellerne er velafgrænsede uden autolyse Tabel 4: oversigt over de udarbejdede sætninger og tilhørende karaktertrin for teknisk kvalitet. 23

25 På grund af de forskellige farveprotokoller har vi været nød til at ændre på definitionerne for henholdsvis MGG og PAP. Vi har revurderet scoringssystemet. Revurdering skyldes, at ovennævnte farvninger har hver deres styrker inden for farvningen af celleelementer. F.eks. er kernedetaljer tydeligst ved PAP farvning, hvorimod cytoplasma detaljerne er tydeligst ved MGG farvning (Bilag 18). Tabel 5: oversigt over de udarbejdede definitioner og karaktertrin for MGG Farvekvalitet. Score MGG Definition 0 Et præparat hvor det generelle cellebillede kan byde på mange farveudfældninger eller farvekomplekser, samt hvor farvningen er hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen kan være utydelig, og det er umuligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. 1 Et præparat hvor det generelle cellebillede er en del farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er enten hypo- eller hyper-kromatisk, hvor det kun lige er muligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. Der kan forekommer udflydende celler, og i kernen er det kun muligt at skelne om cellen er enkelt eller flerkernet. 2 Et præparat hvor det generelle cellebillede er få farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er tæt på optimal, dvs. højest let hypo/hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen er tilfredsstillende og det er muligt at genkende cytoplasmastrukturer i en del af cellerne. 3 Et præparat hvor der er få eller ingen farvningsudfældninger, og farveintensiteten er optimal. Cytoplasmastrukturer er tydelige og ved mesotelceller ses brushborder. Der kan eventuelt ses nukleoler i cellekernen. Score PAP Definition 0 Et præparat hvor det generelle cellebillede, for raske mesotelceller, er mange farveudfældninger eller farvekomplekser, samt hvor farvningen er hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen kan være utydelig, og det er umuligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. 1 Et præparat hvor det generelle cellebilleder er en del farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er enten hypo- eller hyper-kromatisk, hvor det kun lige er muligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. Der kan forekommer udflydende celler, og i kernen er det kun muligt at skelne om cellen er enkelt eller flerkernet. 2 Et præparat hvor det generelle cellebillede er få farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er tæt på optimal, dvs. højest let hypo/hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen er tilfredsstillende og det er muligt at genkende cytoplasmastrukturer i en del af cellerne. Ved kernen er antallet af kerner tydeligt, og der kan ses nukleoler. 3 Et præparat hvor der er få eller ingen farvningsudfældninger, og farveintensiteten er optimal. Cytoplasmastrukturer er tydelige og ved mesotelceller ses brushborder. Antallet af kerner ses tydeligt, samt nukleoler kan ses tydeligt, og kernemembranen kan ses. Tabel 6: oversigt over de udarbejdede definitioner og tilhørende karaktertrin for PAP Farvekvalitet. 24

26 0 OBS I vurderingen af præparaterne blev der taget udgangspunkt i raske mesotelceller. I nogle præparater var der ikke mesotelceller tilstede og derved fik de en teknisk score, da vi ikke kunne vurdere og score disse præparater ud fra vores definitioner. Vi besluttede os derfor at oprette en ny gruppe som fik tildelt 0 OBS i farvekvalitet. Cellient og Koagel Til HE farvning af koagel og Cellient valgte vi at foretage både teknisk- og farvekvalitetsvurdering. Den tekniske kvalitetsvurdering bygger på samme vurderingspunkter som for UST og VBT præparaterne. For farvekvaliteten blev der lavet nye beskrivende sætninger, da HE adskiller sig fra MGG farvningerne. HE definitionerne minder meget om PAP farvningens definitioner, da begge er gode til at fremvise kernedetaljer. Definitionerne for HE er illustreret af tabel 7. Score HE Definition 0 Et præparat hvor det generelle cellebillede, for raske mesotelceller, er mange farveudfældninger eller farvekomplekser, samt hvor farvningen er hyperkromatisk. Cytoplasmafarvningen kan være utydelig, og det er umuligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden 1 Et præparat hvor det generelle cellebilleder er en del farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er enten hypo- eller hyper-kromatisk, hvor det kun lige er muligt at skelne kerne og cytoplasma fra hinanden. I kernen er det kun muligt at skelne om cellen er enkelt eller flerkernet, og der kan eventuelt ses nukloler. 2 Et præparat hvor det generelle cellebillede er få farvningsudfældninger og farvningsintensiteten er tæt på optimal, dvs. højest let hypo/hyperkromatisk.. Ved kernen er antallet af kerner tydeligt, og der kan ses nukleoler og kernemembran 3 Et præparat hvor der er få eller ingen farvningsudfældninger, og farveintensiteten er optimal. Antallet af kerner ses tydeligt, samt nukleoler og kernemembranen kan ses. Tabel 7: oversigt over de udarbejdede definitioner og karaktertrin for HE Farvekvalitet (inkluderer både koagel og Cellient. Diagnostisk kvalitet Den diagnostiske kvalitet er en sammenligning af UST med VBT præparater, og koagel med Cellient. Hvorfra der laves en vurdering, af hvilket præparat der er bedst egnet til at stille en diagnose på. Denne vurdering foretages af specialeansvarlig læge på afdelingen Karen Ege Olsen (KEO) og vores kliniske vejleder DO. Vi har til denne vurdering udarbejdet et skema, hvori KEO og DO noterer, hvilken af metoderne der er bedst at vurdere ud fra. Dette skema fremgår af resultatafsnittet. 25

27 Mikroskopering og kriterier Til mikroskopering af UST og VBT præparaterne blev der opstilet følgende kriterier til henholdsvis, farve- og teknisk kvalitet. Opsummering af Teknisk kvalitet o Scores: ; hvor 3 er det bedste o Vurderingsgrundlag: Celletæthed, baggrundsmiljø, cellemorfologi. o Udgangspunktet er en vurdering af raske mesotelceller. Opsummering af Farvekvalitet o Scores: ; hvor 3 er det bedste o Vurderingsgrundlag: farvningsartefakter (udfældninger, farvekompleks), farveintensitet, cytoplasmafarvning, kernefarvning. Ved mikroskopering af den tekniske kvalitet starter projektgruppen med at vurderer de PAP farvede præparater fra både VBT og UST på en 10 x forstørrelse. Dette med henblik på, at danne et overblik over celletæthed og baggrund. Herefter undersøges cellemorfologien ved 20 eller 40 x forstørrelse. Ved vurdere af Farvekvalitet, starter projektgruppen med at mikroskoperer alle PAP præparater, dernæst MGG og HE præparaterne. Der startes med at scrolle præparatet på en 10 x forstørrelse. Dette gøres for at undersøge hvor stort omfanget af farvningsartefakter /debris der er i præparatet. Farveintensiteten vurderes på 20 x forstørrelse, mens cytoplasma og kernefarvning vurderes på 40 x forstørrelse. HE farvningen bruges normalt til at visualisere kernedetaljer, hvilket gør at farvekriterierne minder om PAP farvningskriterierne. Der kigges på følgende punkter: Nukleoler Kernemembran Kromatinstruktur Kernens farve (brun/violet) 26

28 Den tekniske kvalitet af HE farvningen er vurderet på samme måde som ved UST og VBT præparaterne. Farvekvaliteten er blevet vurderet ud fra ovennævnte HE punkter. For at kunne vurdere de immunhistokemisk farvet præparat bedst muligt, har vi valgt at kigge på dem i cases, hvilket vil sige at UST præparaterne parres med deres tilhørende VBT præparater. Vi foretager samme parring, med koagel præparaterne og deres tilhørende Cellient præparater. Parringen af præparaterne sker ved at benytte vores logbog (Bilag 17), hvori afdelingens tildelte C- numre er parret med et projektnummer. Vi benytter kontrolsnittet til at vurdere om de to parrede præparater har samme farveintensitet, derved undersøges der, hvorvidt de to præparater er sammenlignelige. Hvis kontrolsnittet på koagel og celleblokken fra Cellient ikke har samme intensitet, er det ikke muligt at sammenligne dem overfor hinanden. Hvis kontrolsnittets farveintensitet er den samme på begge præparater kan vi sammenligne de to metoder. Ved mikroskoperingen noterede projektgruppen observationerne i et felt i et skema (Bilag 20). Efterfølgende vurderes hvert præparat enkeltvis. I vores vurdering medtager vi hvor mange celler der er positive for antigenet, samt hvor specifik farvningen er for det område, der forventes farvet f.eks. kerne/cytoplasma/membran mm.. Anvendte statistiske metoder Projektgruppen har til resultatafsnittet valgt at bruge beskrivende statistik i form af oversigtstabeller med kumuleret data fra Dorthe Ejersbo (DO) og projektgruppen, for henholdsvis teknisk- og farvekvalitet. Ved at drage fordel af vores parret design har vi illustreret den tekniske kvalitet og farvekvaliteten for henholdsvis VBT overfor UST, samt Cellient overfor koagel vha. differenceplotte. Til den tekniske kvalitet, har vi valgt at indsætte DO og projektgruppens resultater i samme differenceplot, for at skabe et bedre overblik over fordelingen af karakter. Ved Farvekvalitet har vi valgt at adskille DO og projektgruppens resultater i hver sit differenceplot. Denne opstilling, valgte projektgruppen som den mest hensigtsmæssige fremstilling af DO og projektgruppens resultater. 27

29 Projektgruppen har valgt ikke at foretage en X 2 test på vores data, da det ikke var muligt grundet forekomsten af tælletal under 5 i vores kumulerede data. Vi valgte, at præsenterer DO og projektgruppens opsummerede notater for hvert enkelt immunhistokemisk præparat via en tabel i resultatafsnittet. Resultater Resultatafsnittet er delt op i tre underoverskrifter; Teknisk-, Farve- og diagnostisk kvalitet. De første 3 tabeller udgør vores kumuleret rå-data. For bedre visualisering af disse informationer er resultaterne indsat i differenceplot. Samtidig er der udarbejdet en procentvisfordeling af scoringerne. Disse tiltag er illustreret herunder uden 0 OBS. Alt rå-data, figurere i bilag 21 og alle tabeller indeholdende 0 OBS fremgår af bilag Teknisk kvalitet Den tekniske kvalitet er vurderet ud fra PAP farvning for UST og VBT, hvorved HE farvning er anvendt til Cellient og koagel. DO og projektgruppens karakterer for tekniks kvalitet er vist i tabel 8 for at skabe et bedre overblik. Vurderet af os Teknisk kvalitet n UST VBT Koagel Cellient Vurderet af Dorthe Teknisk kvalitet n UST VBT Koagel Cellient Tabel 8: Kumuleret karakterfordelingen af Dorthes og projektgruppens tekniske score af præparaterne fra henholdsvis UST, VBT, Cellient og koagel. Der indgår 29 prøver, da en prøve er ekskluderet for forsøget. DO og projektgruppen er enig i at Cellient præparaterne har klaret sig bedst, hvilket kommer til udtryk via antallet af præparater der har scoret karakteren 3. Samtidig kan man se at DO og projektgruppen er uenig i hvilken teknik, der er bedst af VBT og UST. 28

30 Ved at drage fordel af projektets parrede design kan jeg illustrere den tekniske kvalitet for henholdsvis VBT overfor UST og Cellient overfor koagel, vha. figur 3 og figur 4, hvilket giver mulighed for at se om der er en tendens til at den ene teknik score bedre karakter end den anden via hyppighedsfordelingen af præparater. Figur 3: oversigt over differencen mellem VBT og UST for teknisk kvalitet, scoret af Dorthe og projektgruppen. Af figur 3 kan man se at projektgruppen har scoret VBT præparaterne højst, da antallet af præparater er størst på intervallet (1:3) end (-1;-3). DO har lige så mange præparater på begge sider, hvilket betyder at teknikkerne vurderes til at være ligeså gode. 29

31 Figur 4: oversigt over differencen mellem Cellient og koagel for teknisk kvalitet, scoret af Dorthe og projektgruppen. Figur 4 viser, at både DO og projektgruppen er enig i at Cellient præparaterne har klaret sig bedst af de to præpareringsteknikker. Farvekvalitet Farvekvaliteten er vurderet på alle tre farvninger samt de 4 immunhistokemisk farvninger. For at skabe et overblik over de tre farvninger, har jeg valgt at samle de kumulerede resultater fra DO og projektgruppen i tabel 9. Vurderet af os Farvekvalitet n PAP UST PAP VBT MGG UST MGG VBT HE Koagel HE Cellient Vurderet af Dorte Farvekvalitet n PAP UST PAP VBT MGG UST MGG VBT HE Koagel HE Cellient Tabel 9: Præparaternes farvekvalitets karakter for henholdsvis VBT, UST, koagel og Cellient. Antallet af prøver varier pga. Manglende raske mesotelceller i præparatet, hvilket var vurderingsgrundlag for farvekvalitet. Der er i denne tabel ikke medteget 0 OBS. 30

32 Tabel 10 illustrerer den procentvise fordeling af DO og projektgruppens scoring af præparaterne. Her skal der tages højde for variationen af antallet af prøver. Vurderet af projektgruppen Farvekvalitet Antal prøver UST PAP 0% 27% 55% 18% 22 VBT PAP 0% 52% 41% 7% 27 UST MGG 9% 39% 39% 13% 23 VBT MGG 8% 48% 36% 8% 25 Koagel HE 5% 35% 55% 5% 20 Cellient HE 0% 15% 50% 35% 20 Vurderet af Dorthe Farvekvalitet Antal prøver UST PAP 0% 37,5% 12,5% 50% 24 VBT PAP 0% 0% 12,5% 87,5% 24 UST MGG 15% 30% 10% 45% 20 VBT MGG 0% 12,5% 20,8% 66,7% 24 Koagel HE 0% 33% 29% 38% 21 Cellient HE 14% 0% 0% 86% 22 Tabel 10: Præparaternes farvekvalitets karakter for henholdsvis VBT,UST, koagel og Cellient illustreret ud fra en procentvisfordeling. Antallet af prøver varier pga. Raske mesotelceller i præparatet, hvilket var vurderingsgrundlag for farvekvaliteten. Der er i denne tabel ikke medtaget 0 OBS. DO og projektgruppen er enig i at Cellient har opnået de bedste resultater inden for farvekvalitet, hvilket kommer til udtryk af tabel 9 og 10. DO og projektgruppen uenig i hvilken teknik der er bedst til henholdsvis PAP og MGG. Figur 5 og figur 6 tillader os at illustrere farvekvalitet for henholdsvis PAP, MGG og HE. Dette giver os mulighed for at se, hvilken af farvningerne der har scoret de højeste karakterer udtryk via hyppighedsfordelingen af præparaterne. Figur 5: oversigt over differencen mellem PAP, MGG og HE for farvekvalitet, scoret af projektgruppen. Der er i denne figur ikke medtaget 0 OBS. 31

33 Tabel 11: oversigt over differencen mellem PAP, MGG og HE for farvekvalitet, scoret af Dorthe. Det er i denne tabel ikke medtaget 0 OBS. DO og projektgruppen har begge vurderet VBT til at være bedste ved HE farvning, men har været uenig i vurderingen af PAP og MGG farvning. DO vurderede VBT præparaterne til at være bedst, hvorimod projektgruppen vurderede UST til at være bedst. Som tidligere nævnt bliver de immunhistokemisk præparater vurderet via kommentarer i stedet for karaktertrin. Tabel indeholder de opsummerede observationer fra henholdsvis DO og projektgruppen. Antistof Prøvenummer Opsummering Projektgruppen Kommentar - Dorthe CK7 3 Koaglet var bedst, men meget lidt intenst farvet. Cellient: Cellient sparsomt og kun én positiv celle. Til gengæld fyldt cytoplasmatisk reaktion Koagel: Koagel bedst (flest celler og kraftig reaktion) 15 Der er mere af cytoplasma der er farvet ved koaglet, hvilket gør den mindre specifik i farvningen. Cellient: Flot positiv reaktion i tumorcellerne, cellerne står tydeligst i Cellient. Koagel Flot positiv reaktion i 18 Ringen ved cellemembranen er meget tyk ved koagel, mens den er tyndere og finere ved cellient. Ved koagel er der langt flere positive celler at vurdere på, men kvaliteten er nok ikke nær så stor. 19 Svært at vurdere om celler i Cellient virkelig er positive. Mindre uspecifik baggrundsfarvning ved koagel. tumorcellerne Cellient: Positiv reaktion, mere sparsomt og man kan tydeligt se, at cellerne er mindre her Koagel: Positiv reaktion Cellient: Mest baggrundsfarvning i Cellient. Koagel: Positiv reaktion, koagel bedst. Jeg har bedømt glas: som er det oprindelige glas er skåret dybere 32

34 29 Her virker det til at det er koagel der er bedst. Baggrunden er mere klar. Cellient: Kraftig positiv. Koagel: Kraftig positiv Tabel 12: opsummering af Dorthes og projektgruppens observationer ved CK 7 farvningen. Tabel 12 viser, at DO og projektgruppen vurderer koagel til at være bedst i 2 ud af 5 præparater. I 3 ud af 5 præparater vurderes Cellient og koagel til at være lige gode. 15 Ved Cellient er der flere detaljer, og de er bedre at se på. 18 Begge farvninger er lige specifikke i farvningen, det er svært at sammenligne dem med så få positive celler. 19 Ingen EMA bestilt på prøven 29 Cellient og Koagel har ikke fået samme svar i denne prøve. Vi dobbelt tjekkede at begge prøver er farvet med samme protokol, og det er de. Kommentar - Dorthe Cellient: Cellient sparsomt materiale og kun få positive celler (Uspecifik reaktion?). Koagel: koagel bedst. Flot positiv flage, men en del uspecifik baggrundsfarvning Cellient: Cellient har kraftigere baggrundsfarvning og kernefarvningen med hæmatein er svær at se. Koagel: Flot positiv reaktion i begge. koagel bedst Cellient: Meget uspecifik farvning i Cellient, der gør det vanskeligt at se en svag reaktion i mesotelcellerne. Koagel: Bedst i koagel Cellient: Cellient er ikke overbevisende positivt pga. den kraftige uspecifikke baggrundsfarvning. Koagel: Svag til moderat i farvning. Tabel 13: opsummering af Dorthes og projektgruppens observationer ved EMA farvningen. Der var ikke bestilt EMA farvning på prøve 19. Tabel 13 viser, at DO vurderede koagel til at være bedst i 3 ud af 4 præparater. Ved præparat 29 vurdere DO koagel til at være svag til moderat reaktion, derimod vurderes Cellient til at være mindre overbevisende positiv. Antisto f Antistof Prøvenummer Opsummering - Projektgruppen EMA 3 På trods af kvalitetsforskellen i prøverne, er det kun koagel der evt. kan påvise en malignitet Prøvenumme r Opsummering Projektgruppen TTF1 3 Koagel har mere baggrundsfarvning end Cellient. 15 Vi har her en positiv og negativ ved samme prøve. Mindre uspecifik baggrundsfarvning ved Cellient end set før. 18 Mere uspecifik baggrundsfarvning ved Cellient end ved koagel. 19 Vi har svært ved at tolke om de begge er svært positive, eller om de er negative. Vi så en stor grad af uspecifik baggrundsfarvning ved Cellient og ingen ved koagel. Kommentar - Dorthe Cellient: Negativ Prøve. Koagel: Negativ prøve Cellient: Cellient svag farvning og diffus baggrundsfarvning. Koagel: Kraftigst reaktion i koagel. Cellient: Negativ Prøve. Koagel: Negativ prøve Cellient: I Cellient ingen sikker positiv nukleær reaktion men kraftig uspecifik baggrundsfarvning. Koagel: Svag men tydelig nukleær reaktion i koagel 29 Begge prøver negative Cellient: Negativ prøve, bedst i Cellient hvor der ikke er nogen baggrundsfarvning. Koagel: Negativ prøve Tabel 14: opsummering af Dorthes og projektgruppens observationer ved TTF-1 farvningen. 33

35 I tabel 14 har DO og projektgruppen vurderet at Cellient og koagel er negative i 3 ud af 5 præparater. hvorved de er enige i at koagel er bedst i 2 ud af 5 præparater. Antistof Prøvenumme r Opsummering - Projektgruppen Calretinin 3 Stor forskel på hvordan de positive celler ser ud. Ved koagel er de store plamager af farve, mens ved Cellient virker det mere som en kernefarvning. Der er stor forskel i farveintensiteten. 15 Stor forskel på cellebilledet ved de to præparater. Det ligner to forskellige prøver. Farveintensiteten er også meget forskellig hvor den er meget positiv ved koagel og svag/moderat ved Cellient. 18 Stor forskel i antallet af positive celler. Dette skyldes ikke kun mængden af celler. Mere uspecifik baggrundsfarvning ved Cellient 19 Svært at vurdere om celler i Cellient virkelig er positiv. Mindre uspecifik baggrundsfarvning ved koagel 29 Stor forskel i farveintensitet, men mere detaljeret farvning ved Cellient. Kommentar - Dorthe Cellient: Neg. Reaktion i begge dcs. Ingen mesotelceller. Cellient særdeles sparsomt. Koagel Neg. Reaktion i begge dvs. ingen mesotelceller Cellient: Mange positive celler. Svag baggrundsfarvning. Farvninger er koncentreret omkring kernen. Koagel: Næsten alle celler er positive, i varierende grad. Det ser ud som om flere cellertyper er farvet, da der er variation i hvor der er sket en farvning. Ved nogle er det en membran. Cellient: Meget uspecifik farvning i Cellient, der gør det vanskeligt at se en svag reaktion i mesotelcellerne. Materialet er sparsomt og der ses ingen sikre mesotelceller. Koagel: Bedst i koagel Cellient: Cellient er vanskelig at aflæse pga. kraftig uspecifik farvning. Koagel: Positiv reaktion i få mesotelceller i koagel Cellient: I Cellient ses overvejsende en fin delikat nukleær reaktion - derfor bedst. Koagel. Særdeles positiv i cytoplasma i koagel Tabel 15: opsummering af Dorthes og projektgruppens observationer ved Calretinin farvningen. Ud fra tabel 15 ses der at 3 ud af 5 præparater er DO og projektgruppe enige i at koagel har den kraftigste reaktion. Præparat 3 er vurderet til at være negativ i både Cellient og koagel. DO og projektgruppen er enige om at Cellient har den kraftigste reaktion i præparat 29. En detaljeret oversigt over observationerne og notaterne ses i bilag 20. Diagnostisk Kvalitet Den diagnostiske kvalitet af præparaterne blev vurderet af DO og Speciallæge Karen Ege Olsen (KEO). Ved vurdering af den diagnostiske kvalitet var UST og koagel præparaterne parret med deres tilhørende VBT og Cellient præparater. Diagnostisk kvalitet UST foretrukket VBT foretrukket Koagel foretrukket Cellient foretrukket Dorthe Karen Tabel 16: oversigt over den diagnostiske kvalitet for henholdsvis UST vs. VBT og Cellient vs. Koagel fra Dorthe og Karen. 34