Håndbog til QIAamp DSP Viruskit

Transkript

1 November 2016 Håndbog til QIAamp DSP Viruskit 50 QIAamp DSP Virus-kittet er et generisk system, der anvender QIAamp-teknologi til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra humane plasma- eller serumprøver til in vitro-diagnostiske procedurer. Til in vitro-diagnostisk brug QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, TYSKLAND R Sample & Assay Technologies

2 Varemærker: QIAGEN, QIAamp, artus, MinElute (QIAGEN Group), AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche Group), RealArt (artus GmbH), Eppendorf (Eppendorf AG). Registrerede navne, varemærker osv. anvendt i dette dokument, selv når de ikke specifikt er markeret som sådan, skal ikke betragtes som værende juridisk ubeskyttede. PCR-processen er dækket af amerikanske patenter 4,683,195 og 4,683,202 og udenlandske ækvivalenter tilhørende Hoffmann-La Roche AG QIAGEN. Alle rettigheder forbeholdes.

3 Indholdsfortegnelse Kittet indeholder 4 Symboler 6 Opbevaring 7 Kvalitetskontrol 7 Tilsigtet anvendelse 7 Begrænsninger i produktanvendelsen 8 Advarsler og forholdsregler 8 Indledning 10 Princip og procedure 12 Vigtige bemærkninger 17 Vigtige anvisninger før start 17 Klargøring af RNA 17 Opbevaring af prøver 18 Klargøring af reagenser og buffere 18 Eluering af virale nukleinsyrer 21 Udbytte og kvalitet af virale nukleinsyrer 21 Opsætning af QlAvac 24 Plus-vakuumsystemet 22 Protokol Isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra plasma og serum 24 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016 3

4 Kittet indeholder QIAamp DSP Virus Kit Katalognr Antal præparater 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute Columns with Wash Tubes (WT) (QIAamp MinElute kolonner med vaskerør) (2 ml) 50 EXT ET Column Extenders (Kolonneforlængere) (3 ml) Elution Tubes (Elueringsrør (1,5 ml)) VC VacConnectors 50 LT Lysis Tubes (Lyserør) (2 ml) 50 WT Wash Tubes (Vaskerør) (2 ml) 50 AL Lysis Buffer* (Lysebuffer) 33 ml AW1 Wash Buffer 1* (Vaskebuffer 1) (koncentrat) 19 ml AW2 Wash Buffer 2 (Vaskebuffer 2 ) (koncentrat) 13 ml AE Elution Buffer (Elueringsbuffer ) (lilla hætter) 4 x 2 ml PS Protease Solvent (Proteaseopløsning) 4,4 ml Carrier Carrier RNA (Bærer-RNA) (røde hætter) 310 QP QIAGEN Protease 1 hætteglas Cd 1 Håndbog 1 * Indeholder guanidinhydrochlorid. Ikke kompatibel med desinfektionsmidler, der indeholder blegemiddel. Se advarsler og forholdsregler på side 8. 4 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

5 Indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Genopslæmningsvolumen 4,4 ml. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016 5

6 Symboler 50 Kit indeholder reagenser til 50 prøvepræparater Se informationen i håndbogen Skal anvendes inden In vitro-diagnostisk medicinsk produkt Katalognummer Lotnummer Materialenummer Komponenter Volumen Temperaturbegrænsninger Efter levering Juridisk fabrikant Vigtig bemærkning Skift handsker efter protokoltrin med dette mærke Åbnes ved levering; opbevar QIAamp Mini Spin-kolonner ved 2 8 C Globalt handelsvarenummer Efter tilsætning af ethanol i flasken skrives den aktuelle dato på Tilsætter Indeholder Frysetørret Rekonstituér i Ethanol Guanidinhydrochlorid Maleinsyre Subtilisin Fører til 6 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

7 Opbevaring QIAamp MinElute-kolonner bør opbevares ved 2 8 C ved ankomst. Alle buffere kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C). Frysetørret bærer-rna kan opbevares ved stuetemperatur indtil udløbsdatoen på kittets kasse. Bærer-RNA kan kun opløses i elueringsbuffer (AVE), opløst bærer-rna skal straks tilsættes lysebuffer (AL) som beskrevet på side 19. Denne opløsning skal forberedes frisk og er stabil ved 2 8 C i op til 48 timer. Ubrugte portioner bærer-rna opløst i elueringsbuffer (AVE) bør nedfryses i alikvoter ved 20 C. Frysetørret QIAGEN-protease (QP) kan opbevares ved stuetemperatur indtil udløbsdatoen uden forringelse af ydeevne. Rekonstitueret QIAGEN-protease (QP) er stabilt i op til 1 år, når det opbevares ved temperaturer på 2 8 C, men kun indtil udløbsdatoen. Rekonstitueret vaskebuffer 1 (AW1) og rekonstitueret vaskebuffer 2 (AW2) er stabile i 1 år, når opbevaret ved stuetemperatur, men kun indtil udløbsdatoen. Kvalitetskontrol I henhold til QIAGEN's certificerede totale kvalitetshåndteringssystem testes hvert lot QIAamp DSP Virus-kit mod forudbestemte specifikationer for at sikre konstant produktkvalitet. Tilsigtet anvendelse QIAamp DSP Virus-kittet er et generisk system, der anvender QIAamp-teknologi til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra humane plasma- eller serumprøver til in vitro-diagnostiske formål. Alle diagnostiske resultater, der genereres vha. prøvepræparatproceduren sammen med diagnostisk NATdownstreamanalyse, bør tolkes under hensyntagen til andre kliniske eller laboratorieresultater. Produktet er beregnet til professionelle brugere såsom laboratoriepersonale og læger, der er uddannet i molekylærbiologiske teknikker. Det er beregnet til anvendelse sammen med enhver downstreamapplikation, der anvender enzymatisk amplifikation eller anden enzymatisk modifikation af DNA eller RNA efterfulgt af signaldetektion eller amplifikation. De isolerede og oprensede virale nukleinsyrer kan anvendes i kvalitative (f.eks. blodscreening) og kvantitative (f.eks. monitorering af virusbelastning) diagnostiske NAT-analyser. For at minimere uregelmæssigheder i de diagnostiske resultater skal produktet anvendes med en intern kontrol samt positive og negative kontroller under hele prøveklargøringsprocessen og prøveamplifikation og -detektion i henhold til downstreamanalysen. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016 7

8 Produktet er designet til brug med QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet eller et tilsvarende vakuumsystem. Begrænsninger i produktanvendelsen Kittet er ikke beregnet til blod, væv, knoglemarv eller dyrkede celler. Kittet er heller ikke beregnet til isolering og oprensning af nukleinsyrer fra bakterier, svampe eller parasitter. Kittets ydeevne med hensyn til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra andre cellefrie kropsvæsker, f.eks. urin og CSF, er ikke evalueret. Advarsler og forholdsregler Der skal altid anvendes laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der henvises til de relevante sikkerhedsdatablade (SDS) for yderligere information. De findes online i bekvemt og kompakt pdf-format på hvor sikkerhedsdatabladene til hvert QIAGEN-kit og hver kitkomponent kan læses og udskrives. ADVARSEL: Tilsæt IKKE blegemiddel eller sure opløsninger til væskeaffaldet fra prøveklargøringen. Lysebuffer (AL) og vaskebuffer 1 (AW1) indeholder guanidinhydrochlorid, som kan danne højreaktive forbindelser, når de kombineres med blegemiddel. Hvis væske, der indeholder disse buffere, spildes, rengøres med egnet rengøringsmiddel til laboratorier og vand. Hvis den spildte væske indeholder potentielt smittefarlige stoffer, rengøres det påvirkede område først med rengøringsmiddel til laboratorier og vand og dernæst med 1 % (v/v) natriumhypochlorit. Hvis bufferflaskerne er beskadigede eller lækker, bæres der handsker og beskyttelsesbriller, når flaskerne bortskaffes, for at undgå personskade eller skade på andre. QIAGEN har ikke testet det flydende affald, der genereres af QIAamp DSP Virus-proceduren mht. resterende infektiøse materialer. Kontaminering af det flydende affald med resterende infektiøse materialer er meget usandsynligt, men kan ikke helt udelukkes. Derfor skal flydende affald betragtes som infektiøst og håndteres og bortskaffes i henhold til lokale sikkerhedsbestemmelser. 8 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

9 Følgende fare- og sikkerhedssætninger gælder komponenterne i QIAamp DSP Virus-kittet. Buffer AL Indeholder: guanidinhydrochlorid; maleinsyre. Advarsel! Kan være farlig ved indtagelse eller ved indånding. Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenirritation. Kan forårsage allergisk hudreaktion. Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. Forurenet tøj tages af og vaskes, før det bruges igen. Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ansigtsbeskyttelse. Buffer AW1 Indeholder:guanidinhydrochlorid. Advarsel! Farlig ved indånding og ved indtagelse. Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenirritation. Ring til en GIFTINFORMATION eller en læge, hvis du er utilpas. Indholdet/beholderen bortskaffes til godkendt behandlingsanlæg. Forurenet tøj tages af og vaskes, før det bruges igen. Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenværn/ansigtsværn. QIAGEN-protease Indeholder: Subtilisin. Fare! Forårsager let hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Kan forårsage allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved indånding. Undgå indånding af støv/gas/røg/dampe/aerosoltåger. Indholdet/beholderen bortskaffes til godkendt behandlingsanlæg. Ved luftvejssymptomer: Ring til en GIFTINFORMATION eller en læge. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. VED INDÅNDING: Ved vejrtrækningsbesvær: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vedkommende hviler i en stilling, som letter vejrtrækningen. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ansigtsbeskyttelse. Anvend åndedrætsværn. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016 9

10 Indledning QIAamp DSP Virus-kittet anvender veletableret teknologi til samtidig isolering og oprensning af viralt DNA og RNA. QIAamp DSP Virus-proceduren kombinerer en silicabaseret membrans selektive bindingsegenskaber med minimale elueringsvolumener på 20 µl eller 60 µl. Det lineære område af QIAamp DSP Virus-proceduren er blevet bestemt for HIV RNA og HBV DNA i i flere diagnostiske downstreamanalyser (tabel 1, figur 1 og 2). Tabel 1. Diagnostiske downstreamanalyser, hvor det lineære område af QIAamp DSP Virus-proceduren er testet Analyse Realtids-RT-PCR af HIV RNA TaqMan analyse og COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR test Kit Realtids-PCR af HBV DNA TaqMan-analyse og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR test 10 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

11 Lineært område af QIAamp DSP Virus-proceduren med TaqMananalyser A log-resultat IE/ml log-resultat IE/ml B y = 1,0042x + 0,0832 R 2 = 0,9974 log-input IE/ml y = 0,9725x + 0,0982 R 2 = 0,9984 log-input IE/ml Figur 1. Det lineære område af QIAamp DSP Virus-proceduren ved 60 µl elueringsvolumen blev bestemt med TaqMan-analyser for A HIV RNA og B HBV DNA. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

12 Lineært område af QIAamp DSP Virus-proceduren med COBAS AMPLICOR MONITOR-tests A log-resultat IE/ml y = 1,0098 x R 2 = 0,9982 log-input IE/ml B log-resultat IE/ml y = 0,8839x R 2 = 0,984 log-input IE/ml Figur 2. Det lineære område af QIAamp DSP Virus-proceduren ved 60 µl elueringsvolumen blev bestemt med COBAS AMPLICOR MONITOR-tests for A HIV RNA og B HBV DNA. Proceduren er egnet til brug med plasma eller serum; de kan begge indeholde citrat eller EDTA. Prøverne kan være enten friske, frysetørrede eller frosne, hvis de ikke har været frosset og optøet mere end én gang. Proceduren kan anvendes til isolering af viralt RNA og DNA fra en bred række RNA- og DNAvira. Proceduren er designet til at undgå muligheden for prøve-til-prøvekrydskontaminering og muliggør sikker håndtering af potentielt infektiøse prøver. Proceduren er særdeles velegnet til samtidig behandling af flere prøver. Virale nukleinsyrer elueres i elueringsbuffer (AVE), klar til anvendelse i amplifikationsreaktioner eller opbevaring ved 20 C. Princip og procedure QIAamp DSP Virus-proceduren består af 4 trin: 12 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

13 Lysering af viruspartiklerne i prøven Binding af de virale nukleinsyrer i lysatet til membranen i en QIAamp MinElute-kolonne Vask af membranen Eluering af de virale nukleinsyrer fra membranen Proceduren udføres med QIAamp MinElute-kolonner på en vakuummanifold. Prøvevolumen Detektionsgrænsen (DL) og kvantificeringsgrænsen (QL), i henhold til ICHguideline 2QA og 2QB, er bestemt for QIAamp DSP Virus-proceduren (med et startprøvevolumen på 500 µl og elueringsvolumener på 20 µl og 60 µl) ved hjælp af forskellige diagnostiske downstreamanalyser (tabel 2 og 3). Tabel 2. Detektionsgrænse for QIAamp DSP Virus-proceduren Analyse Elueringsvolumen 95 % skæringspunkt artus RealArt HBV DNA 20 µl 2,31 IE/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 µl 24,31 IE/ml (n=192) AMPLICOR manuel HIV RNA 60 µl 90,92 IE/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 µl 4,73 IE/ml (n=192) Tabel 3. Kvantificeringsgrænse for QIAamp DSP Virus-proceduren Analyse QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IE/ml < 70 % (n=88) TaqMan HIV RNA COBAS AMPLICOR HIV RNA COBAS AMPLICOR HBV DNA COBAS AMPLICOR HCV RNA 52 IE/ml < 60 % (n=88) 100 IE/ml < 60 % (n=88) 30 IE/ml < 60 % (n=88) 700 IE/ml < 60 % (n=66) Lysering af viruspartikler Prøver bliver lyseret under denatureringsforhold ved forhøjede temperaturer. Lyse udføres ved tilstedeværelsen af QIAGEN-protease (QP) og lysebuffer (AL), som sammen sikrer inaktivering af RNaser. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

14 Binding af nukleinsyrer til QIAamp MinElute-kolonnemembranen For at optimere bindingen af viralt DNA og RNA til QIAamp MinElutekolonnemembranen tilsættes der først ethanol til lysaterne. Hvert lysat overføres dernæst til en QlAamp MinElute-kolonne, og virale nukleinsyrer adsorberes på silicagelmembranen, samtidig med at lysatet trækkes igennem vha. vakuumtryk. Fjernelse af restkontaminanter Mens de virale nukleinsyrer forbliver bundet til QIAamp MinElutekolonnemembranen, bliver kontaminanter effektivt vasket bort vha. først vaskebuffer 1 (AW1), dernæst vaskebuffer 2 (AW2) og til sidst ethanol. Eluering af rene nukleinsyrer Virale nukleinsyrer elueres fra QIAamp MinElute-kolonnemembranen ved hjælp af elueringsbuffer (AVE). QIAamp MinElute-kolonner tillader elueringsvolumener på 20 µl eller 60 µl. Alt efter hvilken downstreamanalyse der anvendes, kan nukleinsyreeluatet indeholde op til 50 % af reaktionsvolumen uden nogen hæmmende effekter. 14 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

15 QIAamp DSP Virus-procedure Prøve Lysér Bind Læs protokollen (side 24 nøje, før der startes Tilsæt 75 μl QP, 500 μl pr Vortex 15 sek. Inkubér 15 min (±1 min) ved 56 C (±1 C) Tilsæt 600 μl ethanol Vortex 15 sek. Inkubér 5 min. (-1 min.) ved stuetemperatur (15 25 C) Overfør lysat til QIAamp MinElute-kolonne med påsat EXT Vacuum Vacuum Vask (AW1) Fjern EXT, før der påføres vakuum Tilsæt 600 µl rekonstitueret AW1 Fjern EXT Vask (AW2) Tilsæt 700 µl rekonstitueret AW2 Vacuum Vask (ethanol) Tilsæt 750 μl ethanol Vacuum Tørcentrifugér Eluér Anbring QIAamp MinElute-kolonne i WT Centrifugér 1 min. ved o./min. Anbring QIAamp MinElute-kolonne i WT Inkubér 3 min. ved 56 C Anbring QIAamp MinElute-kolonne i ET Tilsæt 20 µl eller 60 µl AVE Inkubér 3 min. ved stuetemperatur Centrifugér 1 min. ved o./min. Rene virale nukleinsyrer Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

16 Udstyr og reagenser, der skal leveres af bruger Der skal altid anvendes laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Læs mere i det relevante sikkerhedsdatablad (MSDS), der fås fra produktets leverandør. Ethanol ( %) Pipetter* og pipettespidser (for at forhindre krydskontaminering anbefaler vi på det kraftigste at anvende pipettespidser med aerosolskærme) Engangshandsker Varmeblok* til lysering af prøver ved 56 C (vi anbefaler Eppendorf Thermomixer comfort med thermoblok til 2,0 ml mikroprøverør ) Mikrocentrifuge* Målecylinder (50 ml) Vortexer QIAvac 24 Plus-vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr , QIAvacforbindelsessystem, kat.nr og vakuumpumpe, kat.nr ) eller et tilsvarende generelt laboratorievakuumsystem * For at sikre, at prøver bliver behandlet korrekt i QIAamp DSP Virus-proceduren, anbefaler vi på det kraftigste, at instrumenter (f.eks. pipetter og varmeblokke) kalibreres i henhold til fabrikantens anbefalinger. Dette er ikke en fuldstændig liste over forhandlere og omfatter ikke mange vigtige leverandører af biologiske forsyninger. I handlen fra midten af 2004, se 16 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

17 Vigtige bemærkninger Vigtige anvisninger før start Når du har modtaget kittet, kontrolleres kittets komponenter for beskadigelse. Hvis blisterpakningerne eller bufferflaskerne er beskadigede, kontaktes QIAGEN's tekniske service eller den lokale forhandler. Se " Advarsler og forholdsregler " (side 8Fehler! Textmarke nicht definiert.), hvis der spildes væske. Der må ikke anvendes beskadigede kitkomponenter, eftersom deres anvendelse kan føre til ringe ydeevne af kittet. Brug altid RNase-frit udstyr. Ethanol ( %) opbevares på is under proceduren. Udskift altid pipettespidser mellem væskeoverførsler. For at undgå krydskontaminering anbefaler vi anvendelse af pipettespidser med aerosolskærme. Alle centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur (15 25 C). Anvend altid engangshandsker og tjek regelmæssigt, at de ikke er kontamineret med prøvemateriale. Bortskaf handsker, hvis de bliver kontaminerede, og som minimum ved alle trin, der er markeret med handskesymbolet. For at undgå krydskontaminering åbnes der kun ét rør ad gangen. Anvend ikke kitkomponenter fra andre kits sammen med det kit, som du i øjeblikket anvender, medmindre lotnumrene er identiske. Undgå, at kitreagenserne udsættes for bakteriekontaminering. For at sikre mod potentielt infektiøst materiale anbefaler vi at arbejde under laminare luftstrømsforhold, indtil prøverne er lyserede. Dette kit bør kun anvendes af personale, der er uddannet i in vitrodiagnostisk laboratoriepraksis. Proceduren giver anvisninger i behandling af en enkelt plasma- eller serumprøve. Der kan imidlertid behandles op til 24 prøver på samme tid på QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

18 Klargøring af RNA Når der klargøres viralt RNA, skal der arbejdes hurtigt ved de manuelle trin i proceduren. Elueringsbuffer (AVE) indeholder natriumazid*, et antimikrobielt stof, som forhindrer vækst af RNase-producerende organismer. Da denne buffer ikke indeholder nogen RNase-nedbrydende kemikalier, hæmmer den ikke aktivt RNaser, som er introduceret ved forkert håndtering. Der skal udvises ekstrem forsigtighed for at undgå kontaminering med RNaser ved håndtering af elueringsbuffer (AVE). Opbevaring af prøver Efter prøvetagning og centrifugering, kan plasma eller serum opbevares ved 2 8 C i op til 6 timer. Ved langtidsopbevaring anbefales det at fryse dem ned ved 20 C eller 80 C i alikvoter. Frosne plasma- eller serumprøver må ikke optøs mere end én gang. Gentagen nedfrysning-optøning resulterer i denaturering og udfældning af proteiner, hvilket resulterer i reducerede virale titre og derfor reduceret udbytte af virale nukleinsyrer. Cryopræcipitater, der er dannet under nedfrysningen-optøningen, vil endvidere tilstoppe QIAamp MinElute-kolonnemembranen. Hvis cryopræcipitater er synlige, bør de pelleteres via centrifugering ved ca x g i 3 minutter. Den rensede supernatant bør aspireres og behandles straks uden at forstyrre pelleten. Klargøring af reagenser og buffere Klargøring af QIAGEN-protease Tilsæt hele indholdet af hætteglasset med 4,4 ml protaseopløsning (PS) til hætteglasset med frysetørret QIAGEN-protease (QP), og bland grundigt. For at undgå, at det skummer, blandes det ved at vende hætteglasset på hovedet adskillige gange. Sørg for, at QIAGEN-proteasen (QP) er fuldstændigt opløst. Tilsæt ikke QIAGEN-protease (QP) direkte til lysebuffer (AL). * Der bør altid anvendes laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. 18 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

19 Tilsætter bærer-rna og intern kontrol til lysebuffer Bærer-RNA tjener to formål. For det første forbedrer det bindingen af virale nukleinsyrer til QIAamp MinElute-kolonnemembranen, især hvis der er meget få målmolekyler i prøven. For det andet reducerer tilføjelsen af store mængder bærer-rna chancen for viral RNA-nedbrydning i de sjældne tilfælde, hvor RNase-molekyler ikke denatureres via de kaotropiske salte og detergenter i lysebuffer AL. Hvis bærer-rna ikke bliver tilsat til lysebuffer (AL), kan dette føre til reduceret viral RNA- eller DNA-udvinding. Bærer-RNA kan også inkluderes i nogle interne kontrolreagenser i kommercielle downstreamanalyser. I disse tilfælde henvises der til de relevante brugsanvisninger fra producenten af downstreamanalysen. Det anbefales på det kraftigste at anvende en intern kontrol, når QIAamp DSP Virus-kittet anvendes i kombination med diagnostiske amplifikationssystemer. Intern kontrol-rna eller -DNA og rekonstitueret bærer-rna bør tilsættes lysebuffer (AL) og blandes grundigt ved at vende røret 10 gange. For at undgå skumning må der ikke bruges vortex. Se producentens anvisninger for at fastlægge den optimale koncentration af intern kontrol. Hvis der anvendes en anden koncentration end den anbefalede, kan det resultere i ukorrekte resultater. Når den korrekte mængde intern kontrol beregnes, skal der tages højde for prøvens startvolumen og elueringsvolumen. Husk, at QIAamp DSP Virus-kittet bruger en startprøvevolumen på 500 µl. Til klargøring af bærer-rna-opløsningen tilsættes 310 µl elueringsbuffer (AVE) til røret med 310 µg frysetørret bærer-rna for at opnå en opløsning på 1 µg/µl. Opløs bærer-rna grundigt, del det op i alikvoter af passende størrelse, og opbevar det ved 20 C. Alikvoter med bærer-rna må ikke optøs-nedfryses mere end 2 gange. Bemærk, at bærer-rna ikke opløses i lysebuffer (AL). Det skal først opløses i elueringsbuffer (AVE) og dernæst tilsættes lysebuffer AL. Sørg for, at bærer- RNA'et er helt opløst i den korrekte volumen elueringsbuffer (AVE), før det blandes med lysebuffer (AL). Brug altid den rigtige interne kontrol til downstreamanalysen. Se producentens anvisninger for yderligere oplysninger. Beregn volumen af lysebuffer (AL)/bærer-RNA-blandingen, der er nødvendig pr. batch af prøver ved at vælge antallet af prøver der samtidig skal behandles fra tabel 4 (side 20). Volumenerne beregnes med følgende prøveberegning: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl hvor: n = antallet af prøver, der skal behandles samtidigt y = beregnet lysebuffervolumen (AL) Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

20 z = volumen af bærer-rna/elueringsbuffer (AVE), der skal tilsættes til lysebuffer (AL) Tabel 4. Volumener af lysebuffer (AL) og bærer-rna/elueringsbuffer (AVE), der skal bruges til QIAamp DSP Virus-proceduren Antal prøver Vol. AL (ml) Vol. bærer- RNA/AVE (µl) Antal prøver Vol. AL (ml) Vol. bærer- RNA/AVE (µl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43, ,45 117,0 8 4,40 49, ,00 123,2 9 4,95 55, ,55 129,4 10 5,50 61, ,10 135,5 11 6,05 67, ,65 141,7 12 6,60 73, ,20 147,8 Klargøring af vaskebuffer 1 Vha. en målecylinder tilsættes 25 ml ethanol ( %) til flasken med 19 ml vaskebuffer 1-koncentrat (AW1). Opbevar den rekonstituerede vaskebuffer 1 (AW1) ved stuetemperatur (15 25 C). Bland altid den rekonstituerede vaskebuffer 1 (AW1) ved at vende flasken på hovedet adskillige gange, før proceduren startes. Klargøring af vaskebuffer 2 Vha. en målecylinder tilsættes 30 ml ethanol ( %) til flasken med 13 ml vaskebuffer 2-koncentrat (AW2). Opbevar den rekonstituerede vaskebuffer 2 (AW2) ved stuetemperatur (15 25 C). 20 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

21 Bland altid den rekonstituerede vaskebuffer 2 (AW2) ved at vende flasken på hovedet adskillige gange, før proceduren startes. Klargøring af elueringsbuffer Der følger fire rør elueringsbuffer (AVE) med kittet. Pas på ikke at kontaminere bufferen med RNaser. Hvis der udføres 4 oprensningsprocedurer eller mindre med et enkelt kit, anbefaler vi, at røret med elueringsbuffer (AVE) kasseres efter hver procedure. Eluering af virale nukleinsyrer Til downstreamapplikationer, der kræver små startvolumener (f.eks. nogle PCRog RT-PCR-analyser), kan anvendelse af virale nukleinsyrer elueret i 20 µl elueringsbuffer (AVE) øge analysesensitiviteten. Volumen af virale nukleinsyrer elueret fra en QIAamp MinElute-kolonne kan være op til 5 µl mindre end den elueringsbuffer (AVE)-volumen, der tilsættes kolonnen. Eluering af virale nukleinsyrer med 60 µl elueringsbuffer (AVE) giver f.eks. til et eluat på ca. 55 µl, mens eluering med 20 µl giver ca. 15 µl eluat. Voluminet af genfundet eluat afhænger af prøvens beskaffenhed. Hvis det genfundne eluatvolumen er for lavt til downstreamanalysen, øges volumen ved at tilsætte mere elueringsbuffer (AVE). Eluerede virale nukleinsyrer samles i elueringsglas (ET). Hvis de virale nukleinsyrer skal opbevares i op til 24 timer, anbefaler vi opbevaring ved 2 8 C. Udbytte og kvalitet af virale nukleinsyrer Udbyttet og kvaliteten af de isolerede virale nukleinsyrer er egnet til alle typer downstreamdetektionsprocedurer i molekylære diagnostikker. Diagnostiske analyser bør udføres i henhold til fremstillerens anvisninger. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

22 Opsætning af QlAvac 24 Plus-vakuumsystemet Sørg for at sætte kolonneforlænger (EXT), QIAamp MinElute-kolonne, VacConnector (VC) og VacValve rigtigt op (se figur 3). Figur 3. Samling af komponenterne til QIAamp DSP Virus-kittet til vakuumbehandling af prøver: 1: VacValve (følger med vakuumsystemet) 3: QIAamp MinElute-kolonne 2: VacConnector (VC) 4: Kolonneforlænger (EXT) Vi anbefaler at etikettere lyserør (LT), elueringsrør (ET) og QIAamp MinElutekolonner til brug på QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet i henhold til oversigten på figur 4 for at undgå forveksling af prøver. Denne figur kan fotokopieres og mærkes med navnene på prøverne. 22 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

23 Dato: Bruger: Kørsels-id: Figur 4. Etiketteringsoversigt over lyserør (LT), elueringsrør (ET) og QIAamp MinElute-kolonner til anvendelse på QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

24 Protokol: Isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra plasma og serum Til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra 500 µl EDTA- eller citratbehandlet plasma eller serum. Ting, der skal gøres før start Ækvilibrér prøver til stuetemperatur (15 25 C) og sørg for, at de er blandet godt. Tilsæt bærer-rna rekonstitueret i elueringsbuffer (AVE) eller intern kontrol til lysebuffer (AL) i henhold til anvisningerne på side 19. Sørg for, at vaskebuffer 1 (AW1), vaskebuffer 2 (AW2) og QIAGENprotease (QP) er blevet forberedt i henhold til anvisninger i "Vigtige bemærkninger" på side 17. Ækvilibrér elueringsbuffer (AVE) til stuetemperatur (18 25 C) til anvendelse i trin 18. Hvis det er muligt, anvendes der frisk elueringsbuffer (AVE) til hver procedure (der leveres 4 rør). Indstil en varmeblok til 56 C til anvendelse i trin 4 og 17. For at undgå krydskontaminering isættes en VacConnector (VC) på hver lueradapter på vakuumsystemet. Sørg for, at affaldsflasken på vakuumsystemet er tom, og at alle koblinger er forbundet korrekt. Se den vedlagte håndbog for at få yderligere oplysninger om vakuumsystemets drift, specielt vedligeholdelse. Procedure 1. Pipettér 75 µl QIAGEN-protease (QP) i et lyserør (LT). Kontroller udløbsdatoen på den rekonstituerede protease før anvendelse. 2. Tilsæt 500 µl plasma eller serum til lyserør (LT). 24 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

25 3. Tilsæt 500 μl er lysebuff (AL) (med 11,2 µg/ml bærer-rna) til lyserør (LT), luk låget, og bland via impuls-vortexmixer i 15 sekunder. For at sikre effektiv lysering er det vigtigt, at prøven og lysebufferen (AL) blandes grundigt for at give en homogen opløsning. Lysebuffer (AL) indeholder intern kontrol. Eftersom lysebuffer (AL) har en høj viskositet, sørges der for, at den korrekte mængde lysebuffer (AL) tilsættes ved nøje pipettering eller ved hjælp af en egnet pipette såsom en Eppendorf multistep-pipette eller lignende. Tilsæt ikke QIAGEN-protease (QP) direkte til lysebuffer (AL). 4. Inkubér ved 56 C (±1 C) i 15 min (±1 min). 5. Centrifugér lyserør (LT) i 5 sekunder ved fuld hastighed for at fjerne dråber fra den indvendige side af låget. 6. Skift handsker, og åbn lyserør (LT) forsigtigt. 7. Tilsæt 600 μl 100%) ethanol til lyserøret (96 (LT), luk låget, og bland grundigt med impuls-vortexmixer i 15 sekunder. Inkubér i 5 min. (±1 min.) ved stuetemperatur (15 25 C). 8. Centrifugér lyserør (LT) i 5 sekunder ved fuld hastighed for at fjerne dråber fra den indvendige side af låget. 9. Indsæt QIAamp MinElute-kolonne i VacConnector (VC) på vakuumsystemet (se figur 3, side 22). Indsæt en kolonneforlænger (EXT) i den åbne QIAamp MinElute-kolonne. Behold vaskerør (WT) til tørcentrifugeringen i trin Skift handsker, og åbn ét glas ad gangen. 11. Applicer omhyggeligt hele lysatet fra trin 7 i kolonneforlænger (EXT) i QIAamp MinElute-kolonnen uden at fugte kanten. Undgå at berøre QIAamp MinElute-kolonnemembranen med pipettespidsen. Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

26 12. Tænd for vakuumpumpen. Når lysatet er blevet trukket gennem QIAamp MinElute-kolonnen, åbnes ventilen på vakuumsystemet, og vakuummet udløses. Hvis der behandles flere QIAamp MinElute-kolonner samtidig, anbefaler vi at lukke VacValve på hver kolonne, når lysatet er passeret igennem, for at kunne reducere varigheden af dette vakuumtrin. Hvis lysatet ikke er passeret helt igennem membranen efter 15 min., kasseres QIAamp MinElute-kolonnen, og proceduren gentages med en ny prøve. Vakuumsystemets ventil bør anvendes til hurtig udløsning af vakuumtrykket. 13. Applicer 600 µl vaskebuffer 1 (AW1) på QIAamp MinElute-kolonne. Fjern og kassér forsigtigt kolonneforlængeren (EXT), og luk vakuumsystemets ventil. Når vaskebuffer 1 (AW1) er blevet trukket gennem QIAamp MinElute-kolonnen, åbnes ventilen, og vakuummet udløses. For at undgå krydskontaminering skal det tilsikres, at den fjernede kolonneforlænger (EXT) ikke passerer hen over QIAamp MinElutekolonnerne ved siden af. 14. Applicer 750 µl vaskebuffer 2 (AW2) på QIAamp MinElute-kolonnen uden at fugte kanten. Undgå at berøre QIAamp MinElutekolonnemembranen med pipettespidsen. Lad låget på kolonnen stå åbent, og luk ventilen på vakuumsystemet. Når vaskebuffer 2 (AW2) er blevet trukket gennem QIAamp MinElute-kolonnen, åbnes ventilen, og vakuummet udløses. 15. Applicer 750 µl ethanol ( %) på QIAamp MinElute-kolonnen uden at fugte kanten. Undgå at berøre QIAamp MinElutekolonnemembranen med pipettespidsen. Lad låget på kolonnen stå åbent, og luk ventilen på vakuumsystemet. Når ethanol er blevet trukket gennem QIAamp MinElute-kolonnen, åbnes ventilen, og vakuummet udløses. Brug pipettespidser med aerosol-barriere til at applicere ethanol på QIAamp MinElute-kolonnen. 26 Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/2016

27 16. Luk låget på QIAamp MinElute-kolonnen, fjern den fra vakuumsystemet, og kassér VacConnector (VC). Anbring QIAamp MinElute Colum i det vaskerør (WT), som blev gemt fra trin 9, og centrifugér ved fuld hastighed (ca x g eller o./min.) i 1 min. for at tørre membranen helt. Bortskaf vaskerøret (WT) med filtratet. Undlades tørrecentrifugeringen, kan det føre til hæmning af downstreamanalysen. 17. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et nyt vaskerør (WT), og inkubér med låget åbent ved 56 C i 3 min. for at lade eventuel tilbagebleven væske fordampe. 18. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et rent elueringsrør (ET), og kassér vaskerøret (WT). Åbn forsigtigt låget på QIAamp MinElutekolonnen, og applicer 20 µl eller 60 µl elueringsbuffer (AVE) (afhængigt af downstreamanalysen) på midten af membranen. Luk låget, og inkubér ved stuetemperatur (15 25 C) i 3 min. Centrifugér ved fuld hastighed (ca x g eller o./min.) i 1 min. for at eluere de virale nukleinsyrer. Følg vedligeholdelsesproceduren for vakuumsystemet efter udførelse af denne protokol (se håndbogen, der var vedlagt vakuumsystemet, for yderligere oplysninger). Håndbog til QIAamp DSP Virus-kit 11/

28 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) /2016 Sample & Assay Technologies