Betydningen af vaskulær endothelial vækst faktor, VEGF, ved colorectal cancer. Ph.D. projektbeskrivelse. Torben Hansen

Transkript

1 Betydningen af vaskulær endothelial vækst faktor, VEGF, ved colorectal cancer. Ph.D. projektbeskrivelse Torben Hansen Februar

2 Baggrund Der forekommer ca nye tilfælde af colorectal cancer årligt i Danmark [1]. Ca. 2/3 har udgangspunkt i colon og 1/3 i rectum. Det er en af de hyppigste cancerformer hos såvel kvinder som mænd, og sygdommen udgør ca. 10 % af alle maligne sygdomme. En lille del af tilfældene er betinget af arvelige forhold, men langt hovedparten optræder sporadisk med multifaktoriel ætiologi. Sygdommen har ikke alene en betydelig morbiditet men også en betydelig mortalitet med en samlet femårs overlevelse på % [2]. Langt hovedparten af patienterne (ca. 80 %) har lokal sygdom på diagnosetidspunktet, og er kandidater til kurativt intenderet kirurgi [3]. Den kirurgiske behandling har de senere år undergået betydelige fremskridt med nye teknikker baseret på total mesorectal excision (TME). Denne behandling har nedsat lokalrecidiv frekvensen for cancer recti fra % til ca. 10 % [4]. Lokalrecidiv frekvensen kan reduceres yderligere med præoperativ strålebehandling. [5]. Ca. halvdelen af patienterne vil på et tidspunkt få metastaserende sygdom og have behov for systemisk behandling med kemoterapi. Hovedhjørnestenen i den cytostatiske behandling har i mange år været 5-FU, men udviklingen i de seneste år har givet adgang til nye cytostatika, og standardbehandlingen er i dag kombinationskemoterapi [6]. Ofte anvender man som første linje behandling en kombination af 5-FU eller et pro-drug til 5-FU kombineret med Oxaliplatin. Som anden linje behandling anvendes ofte Irinotecan. Den cytostatiske behandling ved metastaserende sygdom må betragtes som palliativ. Med enkeltstof kemoterapi opnås en median overlevelse på ca. 12 måneder, og med de bedste kombinationsregimer forlænges medianoverlevelsen til ca. 20 måneder. Kun ca. halvdelen af patienterne responderer på behandlingen, der ofte har betydelige bivirkninger. Der er derfor et indlysende behov for forbedring af den systemiske behandling. I forsøg på at målrette behandlingen yderligere, har monoklonale antistoffer og tyrosin kinase inhibitorer (TKI) været afprøvet. Det har åbnet op for muligheden for at individualisere behandlingen, såkaldt tailored treatment. En af de vækstfaktorer der er kontrolleret i denne forbindelse er vascular endothelial growth factor (VEGF). Det er et biologisk system af betydelig interesse i forbindelse med udvikling og vækst af maligne tumorer. Det er velkendt, at en tumor har brug for adækvat blodtilførsel med henblik på vækst og metastasering. Angiogenese med dannelsen af nye blodkar er derfor helt essentiel. Tumor kan kun forsynes med ilt via simpel diffusion indtil en størrelse på 0,5 mm. Herefter er karnydannelse nødvendig [7]. Angiogenesen afhænger af forholdet mellem proangiogenetiske og antiangiogenetiske faktorer. På et tidspunkt tipper denne balance til fordel for de proangiogenetiske faktorer ( the angiogenic switch ) [8]. Dette fører til migration og proliferation af endothelceller og efterfølgende dannelse af nye blodkar. Dette kan foregå ved dannelse af nye kapilærer eller ved deling af allerede eksisterende blodkar. VEGF er et heparinbindende glykoprotein, med en molekyle vægt på ca 40 kilodalton. På grund af alternativ splicing kan VEGF forekomme i flere isoformer. VEGF familien består af: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E og placenta growth factor (PIGF) 1 og 2. Vækstfaktorerne binder sig til tre specifikke receptorer, VEGFR-1, VEGFR-2 og VEGFR-3. Receptorerne udtrykkes bl.a. på endothelceller og visse cancerceller. VEGF receptoren består af tre domæner. Et 2

3 ekstracellulært hvortil VEGF binder sig, et transmembrant domæne og et intracelluært bestående af et tyrosinkinase domæne [9]. Neuropilin (NRP) 1 og 2 er coreceptorer for specifikke isoformer af VEGF receptoren. De øger bindingsaffiniteten mellem liganden (VEGF) og de pågældende receptorer. VEGFR-1 er vigtig for endothelcelle migration og differentiering. Forekomsten på humane cancerceller menes at føre til cancer vækst og metastasering. VEGFR-2 er ansvarlig for karpermeabiliteten, proliferation, invasion og migration af endothelceller. VEGFR-3 er specielt tilknyttet lymfangiogenesen, og menes at have betydning for den regionære spredning til lymfeknuder [10]. Fra et terapeutisk synspunkt er VEGFR systemet et oplagt target, da receptoren er placeret i endothelcellernes cellemembran og specielt i de tumornære kar. VEGF systemet kan hæmmes på flere forskellige måder. Enten ved brug af antisoffer rettet mod VEGF eller VEGFR eller ved hæmning af de signalveje som aktiveres når VEGF binder sig til VEGFR. Bevacizumab (Avastin), er det bedst undersøgte antistof rettet mod VEGF-A. Bevacizumab givet som monoterapi til patienter med colorectal cancer fører ikke til regression af tumorerne, men bremser væksten. Behandlingen kan gives i kombination med de etablerede kemoterapi regimer. Resultaterne viser signifikant øget respons rate, tid til progression og overlevelse [11,12]. Hæmning af tyrosin kinasen er en alternativ blokering af VEGF systemets funktion. TKI er små lavmolekylære, adenosin-tri-phosphat (ATP)-ligende, molekyler, som binder sig til det ATPbindende katalytiske område i tyrosin kinasen. I behandling af colorectal cancer er Vatalanib den bedst undersøgte TKI. Teoretisk burde denne terapi medføre en mere potent blokering idet den hæmmer tyrosin kinaser knyttet til alle VEGF receptorer, og således ikke er specifikt knyttet til en subgruppe som fx behandling med bevacizumab. Imidlertid har fase-3 undersøgelserne ikke kunnet påvise nogen signifikant effekt ved behandling med Vatalanib i kombination med kemoterapi [13,14]. Generelt er behandling med angiogenese hæmmere forbundet med relativt få bivirkninger. De hyppigste er hovedpine, hypertension, kvalme, proteinuri og thromboser. Generelt ser man færre bivirkninger ved TKI end ved antistoffer rettet mod VEGF og VEGFR. VEGF systemet er kun dårligt belyst med henblik på prædiktiv anvendelse i klinikken. Man ved således ikke, om VEGF eller VEGFR ekspressionen målt ved immunohistokemi kan anvendes som prædiktiv faktor. Det samme gælder genekspressionen målt på RNA niveau. Men savner ligeledes oplysninger om den eventuelle betydning af genamplifikation og genpolymorfier. Der er endviderer brug for mere viden om den eventuelle relation mellem VEGF systemet og andre angiogenetiske faktorer. Disse forhold bør belyses i et prospektivt klinisk studie. Problemstillinger Behandling rettet mod VEGF er fortsat blandt de nyeste behandlings tiltag inden for onkologien, og der er stadigvæk mange uafklarede forhold. De fleste tumorer vil på et tidspunkt progrediere på trods af hæmning af angiogenesen, hvilket kunne tyde på tilstedeværelse af alternative aktiveringsveje, eller behandlingssvigt af andre årsager. Fælles for disse nye behandlingsmodaliteter er, at der trods et oplagt behandlingsmål endnu ikke er identificeret egnede markører for effekt. 3

4 Anti-VEGF behandling har undertiden alvorlige bivirkninger, der er derfor et påtrængende behov for markører for såvel effekt som toxicitet. Virkningen af antistoffer som bevacizumab synes at være afhængig af konkomitant behandling med kemoterapi. Årsagssammenhængen er ukendt, men man ved, at kar anordningen i tumorer er kaotisk, og hæmning af angiogenesen fører i retning af en normalisering. Dette medfører nedsat interstitielt tryk og formentlig et øget influx af cytostatika i cancercellerne [15,16]. Andre angiogenetiske faktorer udover VEGF kan dog meget vel spille en rolle i denne sammenhæng, og det forekommer rationelt at sammenholde VEGF systemet med andre angiogenetiske markører. Man ved at forskellige markører så som EGFR, COX-2 og HIF1α er korreleret til dårlig prognose, tumorvækst og evnen til at metastasere [17,18]. I tilfælde af hypoxi bindes HIF-1 til specifikke enhancer elementer, hvilket fører til øget gen transkription af VEGF [19]. HIF-1 er ikke nødvendigvis den eneste måde, hvorpå hypoxi medfører øget transkription af VEGF ved colorectal cancer [20], men spiller en central rolle i VEGF stimulationen. Analyse af disse og andre angiogenese relaterede markører er derfor relevant i denne sammenhæng. Genpolymorfier, dvs. forskelle i arvematerialet som optræder i en befolkningsgruppe hos mere end 1 %, kan vise sig at have betydning for bl.a. sygdomsrisiko, behandlingsrespons og prognose. Betydningen af genpolymorfier i DNA et som koder for VEGF og VEGFR er endnu kun sparsomt undersøgt ved denne sygdom. Dertil kommer at sammenhængen mellem VEGF systemet i primære tumorer og metastaser kun er dårligt belyst i den eksisterende litteratur. Kendskab til systemet i metastaser er helt centralt, hvis man vil udnytte behandlingen mod VEGF systemet ved metastaserende sygdom. En rationel tilgang til denne problemstilling vil være at sammenligne målinger på DNA, mrna og proteinniveau i tumorer og metastaser. Den prædiktive værdi af faktorer i VEGF systemet kan kun belyses med evidens i en prospektiv kliniske undersøgelse. Dette kan ske ved at man analyserer ovennævnte faktorer i VEGF systemet sammen med andre angiogenetiske markører under behandling med Bevacizumab. I denne sammenhæng vil det også være interessant at foretage målinger af VEGF og VEGF-R i serum med henblik på at belyse den eventuelle prædiktive værdi af ændringer i serum koncentrationerne under behandling [21,22]. Formål 1) At foretage sammenlignende analyser af VEGF og VEGFR på DNA, RNA og protein niveau i primær tumor og metastaser. 2) At undersøge relationen til andre angiogenese relaterede markører. 3) At undersøge den prædiktive værdi af angiogenese markører under behandling med kemoterapi og angiogenesehæmmer. 4) At belyse en eventuel prognostisk værdi af angiogenese markørerne (VEGF). 4

5 5) At belyse den mulige prædiktive værdi af ændringer i serum koncentrationen af VEGF og VEGFR under behandling med kemoterapi og bevacizumab. Materiale og Metoder Studiet vil blive inddelt i tre delprojekter. 1) På et materiale bestående af frisk frosset tumorvæv og blod fra ca. 200 colorectalcancer patienter foretages en sammenligning af metoder til analyse af VEGF og VEGFR på DNA, RNA og protein niveau. Resultaterne fra primærtumor sammenholdes med væv fra lymfeknuder og normalvæv. 2) På det samme materiale undersøges microvessel density ved hjælp af dobbeltfarvning med CD105 og ASMA. 3) Undersøgelse af den prædiktive værdi af ændringer i VEGF systemet under behandling med kemoterapi og angiogenesehæmmer. Patienter Der undersøges væv fra ca. 200 patienter som har indgået i studiet: Molekylærbiologiske markører ved colorectal cancer. Der foretages analyser på såvel normalvæv som tumorvæv og lymfeknudemetastaser. Den prædiktive værdi af angiogenese markører, under behandling med kemoterapi og angiogenesehæmmer, foretages på blodprøver og væv fra patienter som indgår i ACT-protokollen. Denne fælles nordiske protokol er en randomiseret undersøgelse, der skal belyse effekten af bevacizumab versus bevacizumab + erlotinib som vedligeholdelsesbehandling efter initial behandling med capecitabine, oxaliplatin og bevacizumab. Metoder Fra det indsamlede væv oprenses DNA, RNA og proteiner til undersøgelserne. Ved DNA analyserne undersøges for mutationer og SNP ved brug af PCR metoden. Genkopi tal / amplifikation undersøges ved FISH. Revers Transcriptase PCR benyttes ved analyse af mrna, og protein analyserne laves bl.a. udfra immunhistokemi, ELISA og Western blot. Der benyttes internationalt standardiserede procedurer. Apparaturet forefindes allerede og de fleste analyser fungerer på Vejle Sygehus. De kliniske data hentes i patient journaler og kliniske databaser. Etik Undersøgelserne vil blive foretaget på væv og blod udtaget fra patienter i forbindelse med udredning eller behandling af deres sygdom. Patienterne vil således ikke blive udsat for yderligere 5

6 ubehag eller risici, og de følger afdelingens vanlige behandlings og kontrolforløb. Der foreligger skriftligt samtykke fra samtlige patienter. Alle protokollerne er anmeldt til og godkendt af Videnskabsetisk Komité. Perspektiver I flere årtier har man arbejdet med muligheden for at hæmme cancercellers blodforsyning, men det er først inden for de seneste år, det er lykkedes at dokumentere en klinisk effekt af denne behandling. Der hersker ikke længere tvivl om denne behandlings potentiale. For tiden arbejdes der intenst på at finde lægemidler der kan blokere de processer som fører til karnydannelse. Nogle af de fremtidige udfordringer vil bl.a. være at kunne forudse hvem der vil få gavn af behandlingen med henblik på individualiseret behandling. Herudover er der behov for mere viden om VEGF og VEGFR og den gensidige interaktion. Målet med dette projekt er at bidrage yderligere til denne viden med henblik på mere rationel behandling af colorectal cancer. Referenceliste 1) Sundhedsstyrelsen, Cancerregisteret ) Statens Institut for Medicinsk Teknologivurdering. Kræft i tyktarm og endetarm. Diagnostik og screening 2001;3(1): ) Dansk Kolorectal Cancer Database. Ugeskr læger 2005;167(44): ) Jakobsen AKM, Kronborg O. Cancer coli. Ugeskr læger 2002;164: ) Colorectal Cancer Collaborative Group. Adjuvant radiotherapy for rectal cancer: a Systematic overview of 8507 patients from 22 randomised trials. Lancet 2001;358: ) Cassidy J, Tabernero J, Twelves C et al. XELOX (Capecitabine Plus Oxaliplatin): Active First-Line Therapy for Patients With Metastatic Colorectal Cancer. J Clin Oncol 2004;22: ) Folkman J. What is the Evidence That Tumors Are Angiogenesis Dependent?. J Natl Cancer Inst 1990;82:4-6. 8) Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor as a Target for Anticancer Therapy. The Oncologist 2004;9(suppl 1): ) Ferrara N, Gerber H-P, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature Medicine 2003;9: ) Takahashi H, Shibuya M. The vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions. Clinical Science 2005;109: ) Midgley R, Kerr D. Bevacizumab-current status and future directions. Annals of Oncology 2005;16(No. 7): ) Kabbinavar F, Hurwitz HI, Fehrenbacher L et al. Phase 2, Randomized Trial Comparing Bevacizumab Plus Flurouracil (FU)/Leucovorin (LV) With FU/LU Alone in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. J Clin Oncol 2003;21: ) O Dwyer PJ. The Present and Future of Angiogenesis-Directed Treatment of Colorectal Cancer. The Oncologist 2006;11(No. 9):

7 14) Morabito A, Maio ED, Maio MD et al. Tyrosine Kinase inhibitors of Vascular Endothelial Growth Factor Receptors in Clinical Trials: Current Status and Future Directions. The Oncologist 2006;11(No. 7): ) Lee CG, Heijn M, Tomaso ED et al. Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Treatment Augments Tumor Radiation Response under Normoxic or Hypoxic Conditions. Cancer Research 2001;60: ) Rosen LS. VEGF-Targeted Therapy: Therapeutic Potential and Recent Advances. The Oncologist 2005;10(No. 6): ) Soumaoro LT, Uetake H, Takagi Y et al. VEGF-C and COX-2 in human colorectal cancer and its association with lymph node metastasis. Dis Colon Rectum 2006 Mar;49(3): ) Xiong B, Sun TJ, Hu WD et al. Expression of cyclooxygenase-2 in colorectal cancer and its clinical significance. World J Gastroenterol 2005 Feb 28;11(8): ) Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Porgress. Endocrine Reviews 2004;25(4): ) Mizukami Y, Li J, Zhang X et al. Hypoxia-Inducible Factor-1-Independent Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor by Hypoxia in Colon Cancer. Cancer Research 2004;64: ) Bocci G, Man S, Green SK et al. Increased Plasma Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) as a Surrogate Marker for Optimal Therapeutic Dosing of VEGF Receptor-2 Monoclonal Antibodies. Cancer Research 2004;64: ) Poon RTP, Fan ST, Wong J. Clinical Implications of Circulating Angiogenic Factors in Cancer Patients. J Clin Oncol 2001;19: