artus VZV RG PCR Kit håndbog

Transkript

1 September 2009 artus VZV RG PCR Kit håndbog Version 1 24 (katalognr ) 96 (katalognr ) Kvantitativ in vitro-diagnostik Til anvendelse med Rotor-Gene Q-instrumenter , DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R DA Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN er den førende producent af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og detektion af indholdet i enhver form for biologisk prøve. Vores avancerede kvalitetsprodukter og -service sikrer vellykkede analyser fra prøvetagning til resultat. QIAGEN sætter standarden i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser MikroRNA-forskning og RNAi Automatisering af prøve- og analyseteknologier Vores mission er at give kunden redskaberne til at opnå stor succes og gennembrud. Læs mere på

3 Indhold Indhold af kittet 4 Symbolforklaring 4 Opbevaring 5 Anvendelse 5 Anvendelsesbegrænsninger 6 Teknisk support 6 Kvalitetskontrol 6 Sikkerhed 6 Indledning 8 Princip 8 Information om patogener 8 Performance-egenskaber 9 Udstyr og reagenser der ikke medfølger 13 Vigtige bemærkninger 15 Generelle forholdsregler 15 Isolation af DNA 15 Intern kontrol 15 Kvantifikation 16 Protokol: PCR- og dataanalyse 17 Fejlfinding 26 Litteratur 29 Bestilling 30 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009 3

4 Indhold af kittet artus VZV RG PCR Kit (24) (96) Katalognr Antal reaktioner Blå VZV RG Master 2 x 12 reaktioner 8 x 12 reaktioner Gul VZV RG Mg-Sol* 600 μl 600 μl Rød Rød Rød Rød VZV RG QS 1 (1 x 10 4 kopier/μl) VZV RG QS 2 (1 x 10 3 kopier/μl) VZV RG QS 3 (1 x 10 2 kopier/μl) VZV RG QS 4 (1 x 10 1 kopier/μl) 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl Grøn VZV RG IC 1000 μl 2 x 1000 μl Hvid Water (PCR-Grade) 1000 μl 1000 μl Håndbog 1 1 * Magnesiumopløsning. Kvantificeringsstandard. Intern kontrol. Symbolforklaring <N> Indeholder reagenser til <N> test Anvendes inden Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik Katalognummer 4 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

5 Lot nummer Materialenummer Komponenter Indhold Nummer Temperaturbegrænsninger Producent Se information i håndbogen Vigtig bemærkning Opbevaring Komponenterne i artus VZV RG PCR Kit skal opbevares ved -20 C og er stabile indtil udløbsdatoen på etiketten. Gentagen optøning og nedfrysning (>2 x) bør undgås, da dette kan reducere analysens sensitivitet. Hvis reagenserne kun skal anvendes med mellemrum, bør de nedfryses i afmålte portioner. Opbevaring ved 2-8 C bør ikke overstige 5 timer. Anvendelse artus VZV RG PCR Kit er en in vitro nukleinsyre-amplifikationstest til kvantificering af VZV DNA i human cerebrospinalvæske (CSF). Dette diagnostiske testkit anvender polymerasekædereaktion (PCR) og er fremstillet til anvendelse med Rotor-Gene Q-instrumenter. artus VZV RG PCR Kit må ikke anvendes med Rotor-Gene Q 2plexinstrumenter. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009 5

6 Anvendelsesbegrænsninger Produktet må kun anvendes af ansatte, der specielt er instrueret og uddannet i de pågældende in vitro-diagnostiske procedurer (EN375). Det er nødvendigt at følge brugervejledningen nøje for at få optimale PCRresultater. Vær opmærksom på de udløbsdatoer, der er trykt på alle komponenters æsker og etiketter. Komponenter, der er udløbet, må ikke anvendes. Teknisk support På QIAGEN er vi stolte af at kunne levere teknisk support af høj kvalitet. De ansatte på vores afdelinger for teknisk service er erfarne videnskabsfolk med omfattende praktisk og teoretisk ekspertise i prøve- og analyseteknologier samt anvendelse af produkter fra QIAGEN. Kontakt os, hvis du har spørgsmål om eller problemer med artus VZV RG PCR Kit eller produkter fra QIAGEN generelt. QIAGENs kunder er en vigtig kilde til information om avanceret eller specialiseret anvendelse af vores produkter. Denne information er også til gavn for andre videnskabsmænd og for forskerne hos QIAGEN. Derfor opfordrer vi dig til at kontakte os, hvis du har forslag til produktets ydeevne eller nye applikationer og teknikker. Teknisk support og flere oplysninger findes under Technical Support Center (tekniske support center) på Eller ring til en af QIAGEN-afdelingerne for teknisk service eller den lokale forhandler (se bagsiden eller gå ind på Kvalitetskontrol Hvert lot med artus VZV RG PCR Kit testes i overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede system for kvalitetskontrol mod forudbestemte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. Sikkerhed Bær altid egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller under arbejdet med kemikalier. Der er flere oplysninger på de relevante Material Safety Data Sheets (MSDS) (sikkerhedsdatablade). Sikkerhedsdatabladene ligger online i et kompakt pdf-format på hvor du kan finde, se og udskrive MSDS et for hvert QIAGEN-kit og kittenes komponenter. Affald fra prøver og analyser skal bortskaffes i henhold til lokale bestemmelser vedrørende sikkerhed. 6 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

7 Nødinformation 24 timer i døgnet Medicinsk nødinformation på engelsk, fransk og tysk kan fås 24 timer i døgnet fra: Die Beratungsstelle bei Vergiftungen (Giftinformationscenter) Mainz, Tyskland Tlf.: artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009 7

8 Indledning artus VZV RG PCR Kit er et brugsklart system til detektion af VZV-DNA ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q-instrumenter. VZV RG Master indeholder reagenser og enzymer til specifik amplifikation af en 82 bpregion af VZV genomet og til direkte detektion af den specifikke amplikon i fluorescens-kanalen Cycling Green i Rotor-Gene Q eller Rotor-Gene 6000 (kilde 470 nm, detektor 510 nm). Derudover indeholder artus VZV RG PCR Kit et andet heterologt amplifikationssystem til at identificere potentiel hæmning af PCR. Dette detekteres som en intern kontrol (IC) i fluorescens-kanalen Cycling Orange i Rotor-Gene Q eller Rotor-Gene 6000 (kilde 585 nm, detektor 610 nm). Detektionsgrænsen af den analytiske VZV-PCR (se Analytisk sensitivitet, side 9) reduceres ikke. Der medfølger eksterne positive kontroller (VZV RG QS 1 4), som muliggør bestemmelse af mængden af viralt DNA. Der er flere oplysninger under Kvantifikation, side 16. Princip Detektion af patogener ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) er baseret på amplifikation af specifikke regioner af det patogene genom. I Real Time PCR detekteres det amplificerede produkt ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Disse kobler sig normalt til oligonukleotidprober, der specifikt binder sig til det amplificerede produkt. Monitorering af fluorescensintensiteten under PCRkørslen (dvs. i realtid) muliggør detektion og kvantifikation af det akkumulerende produkt, uden at reaktionsrørene skal genåbnes efter PCRkørslen.* Information om patogener Varicella zoster-virus (VZV) er et virus-dna, som overføres mellem personer som dråbeinfektion eller gennem direkte kontakt. Infektion med VZV medfører let øget temperatur og påvirker det generelle helbred i moderat grad. Polymorf eksem med papler, blærer og skorper ledsaget af svær kløe (varicella) er karakteristisk for sygdommen. Alvorlig VZV-infektion observeres hyppigt hos immunsupprimerede patienter og kan medføre farlige komplikationer såsom lungebetændelse og encephalitis. Efter den akutte infektion persisterer patogenet i de sensoriske spinalganglier og i ganglier på hjernenerverne. Hvis immuniteten svækkes, kan der forekomme eksacerbation (f.eks. helvedesild). * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

9 Performance-egenskaber Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet af artus VZV RG PCR Kit blev bestemt ved at opsætte en fortyndingsserie af VZV-genomisk DNA fra 10 til nominelt 0,001 kopier/μl og analyseret på Rotor-Gene 6000 sammen med artus VZV RG PCR Kit. Analyse blev udført på 3 forskellige dage på 8 replikater. Resulaterne blev bestemt med en probitanalyse. Den analytiske detektionsgrænse for artus VZV RG PCR Kit sammen med Rotor-Gene Q/6000 er konsekvent 0,136 kopier/μl (p = 0,05). Det betyder, at der er 95 % sandsynlighed for, at 0,136 kopier/μl vil blive detekteret. Figur 1. Probitanalyse: VZV (Rotor-Gene 6000). Analytisk sensitivitet af artus VZV RG PCR Kit på Rotor-Gene Specificitet Specificiteten af artus VZV RG PCR Kit sikres først og fremmest af valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsforhold. Primerne og proberne blev kontrolleret for mulig homologi med alle publicerede sekvenser i genbanker ved hjælp af sekvenssammenligning. Detekterbarheden af alle relevante genotyper er dermed sikret. Derudover blev specificiteten valideret med 30 forskellige CSF-prøver, der var VZV-negative. Disse genererede ikke nogen signaler med de primere og prober, der var specifikke for VZV, og som er inkluderet i VZV RG Master. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009 9

10 En potentiel krydsreaktivitet for artus VZV RG PCR Kit blev testet ved hjælp af den kontrolgruppe, der er anført i tabel 1. Ingen af de testede patogener har været reaktive. Tabel 1. Testning af kittets specificitet med potentielt krydsreaktive patogener Kontrolgruppe Human herpesvirus 1 (herpes simplex virus 1) Human herpesvirus 2 (herpes simplex virus 2) Human herpesvirus 4 (Epstein-Barr virus) Human herpesvirus 5 (cytomegalovirus) VZV (Cycling Green) Intern kontrol (Cycling Orange) Human herpesvirus 6A + Human herpesvirus 6B + Human herpesvirus 7 + Human herpesvirus 8 (Kaposis sarkom-associeret herpesvirus) + Hepatitis A-virus + Hepatitis B-virus + Hepatitis C-virus + Human immundefekt virus (hiv) + Human T-celle leukæmivirus 1 + Human T-celle leukæmivirus 2 + Enterovirus + Parvovirus B19 + Vestnilvirus + 10 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

11 Præcision Præcisionsdataene for artus VZV RG PCR Kit er blevet indsamlet ved hjælp af Rotor-Gene-instrumenter og gør det muligt at bestemme analysens totale varians. Den totale varians består af variabilitet inden for samme analyse (variabilitet af flere resultater af prøver med samme koncentration i ét eksperiment), variabilitet mellem analyser (variabilitet af flere resultater af analysen, der genereres på forskellige instrumenter af samme type af forskellige operatører på ét laboratorium) og variabilitet mellem partier (variabilitet af flere resultater af analysen med anvendelse af forskellige partier). De indhentede data blev brugt til at bestemme standardafvigelse, varians og variationskoefficient for den patogenspecifikke PCR og PCR af den interne kontrol. Præcisionsdata for artus VZV RG PCR er blevet indsamlet ved hjælp af kvantificeringsstandarden af den laveste koncentration (QS 4; 10 kopier/μl). Analyse blev udført med 8 replikater. Præcisionsdataene blev beregnet baseret på C T -værdierne i amplifikationskurverne (C T : tærskelcyklus, se tabel 2, side 12). Derudover blev præcisionsdata for kvantitative resultater i kopier/μl bestemt ved hjælp af de tilsvarende C T -værdier (se tabel 3, side 12). Baseret på disse resultater er den samlede statistiske spredning for enhver given prøve med den nævnte koncentration 0,45 % (C T ) eller 8,32 % (koncentration) og 2,81 % (C T ) for detektion af den interne kontrol. Disse værdier er baseret på totaliteten af alle enkelte værdier af de bestemte variabiliteter. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

12 Tabel 2. Præcisionsdata på basis af C T -værdierne Variabilitet inden for samme analyse: VZV RG QS 4 Variabilitet inden for samme analyse: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: VZV RG QS 4 Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem partier: VZV RG QS 4 Variabilitet mellem partier: Intern kontrol Total varians: VZV RG QS 4 Total varians: Intern kontrol Varians Standardafvigelse Variationskoefficient (%) 0,08 0,01 0,26 0,04 0,002 0,17 0,15 0,02 0,5 0,39 0,15 1,63 0,1 0,01 0,34 0,66 0,43 2,65 0,13 0,02 0,45 0,68 0,47 2,81 Tabel 3. Præcisionsdata på basis af de kvantitative resultater (i kopier/μl) Variabilitet inden for samme analyse: VZV RG QS 4 Variabilitet mellem analyser: VZV RG QS 4 Variabilitet mellem partier: VZV RG QS 4 Total varians: VZV RG QS 4 Varians Standardafvigelse Variationskoefficient (%) 0,5 0,25 5,46 0,85 0,72 8,72 0,75 0,56 7,67 0,81 0,66 8,32 12 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

13 Robusthed Verifikationen af robustheden gør det muligt at bestemme den samlede fejlfrekvens for artus VZV RG PCR Kit. 30 VZV-negative CSF-prøver blev tilsat 0,4 kopier/μl elueringsvolumen af VZV-DNA (ca. tre gange koncentrationen af den analytiske sensitivitetsgrænse). Efter ekstraktion ved hjælp af EZ1 DSP Virus Kit (se Isolation af DNA, side 15) blev disse prøver analyseret med artus VZV RG PCR Kit. For alle 30 prøver var fejlfrekvensen 0 %. Derudover blev robustheden af den interne kontrol vurderet ved hjælp af oprensning og analyse af 30 CSF-prøver, der var VZV-negative. Den samlede fejlfrekvens var 0 %. Hæmning blev ikke observeret. Derfor er robustheden af artus VZV RG PCR Kit 99 %. Reproducerbarhed Data for reproducerbarhed muliggør en regelmæssig vurdering af ydeevnen af artus VZV RG PCR Kit samt en sammenligning af effektiviteten med andre produkter. Disse data indhentes gennem deltagelse i etablerede præstationsprogrammer. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

14 Udstyr og reagenser der ikke medfølger Bær altid egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller under arbejdet med kemikalier. Der er flere oplysninger på de relevante Material Safety Data Sheets (MSDS) (sikkerhedsdatablade), som kan fås hos produktleverandørerne. DNA isolationskit (se Isolation af DNA, side 15) Pipetter (justerbare)* Sterile pipettespidser med filtre Vortex-mixer* Bordcentrifuge* med rotor til 2 ml reaktionsrør Rotor-Gene Q eller Rotor-Gene-instrument* med fluorescens-kanaler til Cycling Green og Cycling Orange Rotor-Gene Q softwareversion (Rotor-Gene 6000 softwareversion , , ) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml, til anvendelse med rotor med 72 brønde (katalognr eller ) Alternativt: PCR Tubes, 0,2 ml, til anvendelse med rotor med 36 brønde (katalognr eller ) Køleblok (Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes, katalognr , eller Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes, katalognr ) * Sørg for at instrumenterne er blevet kontrolleret og kalibreret i overensstemmelse med producentens anbefalinger. artus VZV RG PCR Kit må ikke anvendes med Rotor-Gene Q 2plex-instrumenter. 14 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

15 Vigtige bemærkninger Generelle forholdsregler Vær altid opmærksom på følgende: Anvend sterile pipettespidser med filtre. Positive materialer (prøver, positive kontroller og amplikoner) skal opbevares og ekstraheres separat fra alle andre reagenser og tilsættes til reaktionsblandingen på en fysisk adskilt facilitet. Optø alle komponenter grundigt ved stuetemperatur (15-25 C) inden analysen påbegyndes. Når komponenterne er optøet, skal de blandes (ved at pipettere op og ned eller anvende pulserende vortex) og centrifugeres kort. Arbejd hurtigt og hold komponenterne på is eller i køleblokken (isætningsblok med 72/96 brønde). Isolation af DNA EZ1 DSP Virus Kit (QIAGEN, katalognr )* er valideret til viral nukleinsyreoprensning fra human CSF ved hjælp af EZ1 Advanced DSP Virus Card (katalognr ) på EZ1 Advanced (katalognr ) til anvendelse med artus VZV RG PCR Kit. Udfør oprensning af viral nukleinsyre ifølge instrukserne i EZ1 DSP Virus Kit håndbog. artus VZV RG PCR Kit bør ikke anvendes med fenolbaserede isolationsmetoder. Anvendelse af carrier-rna er kritisk for effektiviteten af ekstraktion og dermed for DNA/RNA-udbytte. Tilsæt den korrekte mængde carrier-rna til hver ekstraktion ifølge instrukserne i EZ1 DSP Virus Kit håndbog. Den interne kontrol i artus VZV RG PCR Kit kan anvendes direkte i isolationsproceduren (se Intern kontrol nedenfor). Intern kontrol En intern kontrol (VZV RG IC) medfølger. Dette gør det muligt for brugeren at kontrollere isolation af DNA og kontrollere for mulig hæmning af PCR. I denne applikation skal den interne kontrol tilsættes isolationen i et forhold på 0,1 μl pr. 1 μl elueringsvolumen. Anvender man f.eks. EZ1 DSP Virus Kit, og de virale * EZ1 DSP Virus Kit fås også som CE- og IVD-mærkede EASYartus VZV RG PCR Kits kombineret med artus VZV RG PCR Kit (bestillingsinformation er angivet på side 30). artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

16 nukleinsyrer elueres i 60 μl elueringsbuffer (AVE), skal der indledningsvis tilsættes 6 μl intern kontrol. Den interne kontrol og carrier-rna (se Isolation af DNA, side 15) skal kun tilsættes blandingen af lyseringsbuffer og prøvemateriale eller tilsættes lyseringsbufferen direkte. Den interne kontrol må ikke direkte tilsættes prøvematerialet. Hvis blandingen af intern kontrol og lyseringsbuffer/carrier-rna tilsættes lyseringsbufferen, skal den forberedes friskt og anvendes med det samme (opbevaring af blandingen ved stuetemperatur eller i køleskab blot nogle få timer kan medføre fejl i den interne kontrol og reduceret ekstraktionseffektivitet). Den interne kontrol og carrier-rna må ikke tilsættes prøvematerialet direkte. Den interne kontrol kan alternativt anvendes udelukkende til at kontrollere for mulig hæmning af PCR. I denne applikation tilsættes den interne kontrol direkte til blandingen af VZV RG Master og VZV RG Mg-Sol som beskrevet i trin 2b i protokollen (side 18). Kvantifikation De medfølgende kvantificeringsstandarder (VZV RG QS 1 4) håndteres som de oprensede prøver, og den samme volumen anvendes (20 μl). For at generere en standardkurve på Rotor-Gene Q-instrumenter, skal alle 4 kvantificeringsstandarder anvendes og defineres i dialogboksen Edit Samples (rediger prøver) som standarder med de specificerede koncentrationer (se brugervejledningen til instrumentet). Kvantificeringsstandarderne defineres som kopier/μl. Følgende ligning skal anvendes for at konvertere de fastsatte værdier ved hjælp af standardkurven til kopier/ml prøvemateriale: Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/μl) x elueringsvolumen (μl) Prøvevolumen (ml) Som princip skal den indledende prøvevolumen indtastes i ligningen ovenfor. Det skal tages i betragtning, når prøvevolumen ændres inden ekstraktion af nukleinsyre (f.eks. reducere volumen ved centrifugering eller øge volumen ved at tilsætte den til den volumen, der kræves til isolation). Retningslinjer for de systemer til kvantitativ analyse af patogendetektion på Rotor-Gene-instrumenter kan fås hos QIAGEN teknisk support ( Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments ). 16 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

17 Protokol: PCR- og dataanalyse Vigtigt inden start Læs Vigtige bemærkninger side 15-16, inden proceduren påbegyndes. Tag dig god tid til at gøre dig bekendt med Rotor-Gene Q, inden protokollen påbegyndes. Se brugervejledningen til instrumentet. Sørg for at mindst én kvantificeringsstandard og én negativ kontrol (vand af PCR-kvalitet) inkluderes i hver PCR-kørsel. For at generere en standardkurve skal alle 4 medfølgende kvantificeringsstandarder (VZV RG QS 1 4) anvendes til hver PCR-kørsel. Skal gøres inden start Sørg for at køleblokken (tilbehør til Rotor-Gene Q-instrument) forkøles til 2-8 C. Inden hver anvendelse skal alle reagenser optøs fuldstændigt, blandes (ved gentagen pipettering op og ned eller hurtig vortex-blanding) og centrifugeres kort. Procedure 1. Anbring det ønskede antal PCR-rør i adapterne på køleblokken. 2. Hvis den interne kontrol anvendes til at monitorere isolation af DNA og kontrollere for mulig hæmning af PCR, følges trin 2a. Hvis den interne kontrol udelukkende anvendes til at kontrollere for hæmning af PCR, følges trin 2b. 2a. Den interne kontrol er allerede blevet tilsat isolationen (se Intern kontrol, side 15). I dette tilfælde forberedes et mastermix ifølge tabel 4. Reaktionsblandingen indeholder typisk alle de komponenter, der er nødvendige for PCR, undtagen prøven. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

18 Tabel 4. Forberedelse af mastermix (intern kontrol der anvendes til at monitorere isolation af DNA og kontrollere for hæmning af PCR) Antal prøver 1 12 VZV RG Master 25,5 μl 306 μl VZV RG Mg-Sol 4,5 μl 54 μl VZV RG IC 0 μl 0 μl Total volumen 30 μl 360 μl 2b. Den interne kontrol skal tilsættes direkte til blandingen af VZV RG Master og VZV RG Mg-Sol. I dette tilfælde forberedes et mastermix ifølge tabel 5. Reaktionsblandingen indeholder typisk alle de komponenter, der er nødvendige for PCR, undtagen prøven. Tabel 5. Forberedelse af mastermix (intern kontrol der udelukkende anvendes til at kontrollere for hæmning af PCR) Antal prøver 1 12 VZV RG Master 25,5 μl 306 μl VZV RG Mg-Sol 4,5 μl 54 μl VZV RG IC 2 μl 24 μl Total volumen 32 μl* 384 μl* * Øgning af volumen pga. af tilsætning af den interne kontrol springes over, når PCRanalysen forberedes. Sensitiviteten af detektionssystemet forringes ikke. 3. Pipetter 30 μl af mastermix et ned i hvert PCR-rør. Tilsæt dernæst 20 μl elueret DNA-prøve (se tabel 6). Tilsvarende skal 20 μl af mindst en af kvantificeringsstandarderne (VZV RG QS 1 4) anvendes som positiv kontrol og 20 μl vand (vand af PCR-kvalitet) som negativ kontrol. 18 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

19 Tabel 6. Forberedelse af PCR-analyse Antal prøver 1 12 Mastermix 30 μl 30 μl hver Prøve 20 μl 20 μl hver Total volumen 50 μl 50 μl hver 4. Luk PCR-rørene. Sørg for at låseringen (tilbehør på Rotor-Geneinstrumentet) anbringes oven på rotoren for at forhindre, at rørene utilsigtet bliver åbnet under kørslen. 5. Opret en temperaturprofil til detektion af VZV-DNA ifølge disse trin. Indstilling af generelle analyseparametre Figur 2, 3, 4 Initiel aktivering af Hot Start-enzym Figur 5 Amplifikation af DNA Figur 6 Justering af fluorescens-kanalens sensitivitet Figur 7 Start af kørsel Figur 8 Alle specifikationer henviser til Rotor-Gene Q softwareversion og Rotor-Gene 6000 softwareversion , og Der er flere oplysninger om programmering af Rotor-Gene-instrumenter i brugervejledningen til instrumentet. På illustrationerne er disse indstillinger indrammet i en fed sort boks. Illustrationerne er inkluderet for Rotor-Gene Q-instrumenter. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

20 6. Først åbnes dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel) (figur 2). Sæt kryds i feltet Locking Ring Attached (låsering påsat) og klik på Next (næste). Figur 2. Dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel). 7. Vælg 50 som PCR-reaktionsvolumen og klik på Next (næste) (figur 3). Figur 3. Indstilling af generelle analyseparametre. 20 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

21 8. Klik på knappen Edit Profile (rediger profil) i den næste New Run Wizard (guiden ny kørsel) dialogboks (figur 4) og programmer temperaturprofilen som vist i figur 4-6). Figur 4. Redigering af profilen. Figur 5. Initiel aktivering af Hot Start-enzymet. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

22 Figur 6. Amplifikation af DNA. Sørg for at indstille Touch Down-funktionen til 10 cykler under hybridisering. 22 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

23 9. Detektionsområdet for fluorescens-kanalerne skal fastsættes i overensstemmelse med fluorescensintensiteterne i PCR-rørene. Klik på Gain Optimisation (optimering af forstærkning) i dialogboksen New Run Wizard (guiden ny kørsel) (se figur 4) for at åbne dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup (indstilling af optimering af automatisk forstærkning). Indstil kalibreringstemperaturen til 65, så den stemmer overens med hybridiseringstemperaturen i amplifikationsprogrammet (figur 7). Figur 7. Justering af fluorescens-kanalens sensitivitet. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

24 10. Forstærkningsværdierne, som blev bestemt ved kalibrering af kanalerne, gemmes automatisk. De er anført i det sidste menuvindue i programmeringsproceduren (figur 8). Klik på Start Run (start kørsel). Figur 8. Start af kørsel. 11. Når kørslen er færdig, skal dataene analyseres. Følgende resultater er mulige (11a, 11b og 11c). Figur 9 og figur 10 viser eksempler på positive og negative PCR-reaktioner. 11a.Et signal detekteres i fluorescens-kanalen Cycling Green. Resultatet af analysen er positiv: Prøven indeholder VZV-DNA. I dette tilfælde er detektion af et signal i Cycling Orange-kanalen ikke vigtig, eftersom høje initiale koncentrationer af VZV-DNA (positivt signal i Cycling Green-kanalen) kan føre til et reduceret eller fraværende fluorescenssignal i den interne kontrol i Cycling Orange-kanalen (konkurrence). 11b.Der detekteres intet signal i fluorescens-kanalen Cycling Green. Samtidigt forekommer der et signal fra den interne kontrol i Cycling Orange-kanalen. Der detekteres intet VZV-DNA i prøven. Den kan anses som negativ. I tilfælde af en negativ VZV PCR udelukker det detekterede signal i den interne kontrol muligheden for hæmning af PCR. 24 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

25 11c.Der detekteres intet signal i Cycling Green- eller Cycling Orangekanalen. Et resultat kan ikke konkluderes. Information om kilder til fejl og løsninger på fejlene findes i Fejlfinding, side 26. Figur 9. Detektion af kvantificeringsstandarderne (VZV RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green. NTC: Ingen skabelonkontrol (negativ kontrol). Figur 10. Detektion af den interne kontrol (IC) i fluorescens-kanalen Cycling Orange med samtidig amplifikation kvantificeringsstandarderne (VZV RG QS 1 4). NTC: Ingen skabelonkontrol (negativ kontrol). artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

26 Fejlfinding Fejlfindingsvejledningen kan hjælpe med at løse eventuelle problemer, der måtte forekomme. Der er flere oplysninger på siden Frequently Asked Questions (ofte stillede spørgsmål) på vores tekniske support center: Videnskabsfolkene hos QIAGEN teknisk support er altid klar til at svare på eventuelle spørgsmål om enten informationen og protokollen i denne håndbog eller om prøve- og analyseteknologier (kontaktoplysninger findes på bagsiden og på Bemærkninger og forslag Intet signal med positive kontroller (VZV RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green a) Den valgte fluorescenskanal til analyse af PCRdata er ikke i overensstemmelse med protokollen b) Ukorrekt programmering af temperaturprofilen i Rotor- Gene-instrumentet Til dataanalyse vælges fluorescenskanalen Cycling Green til PCR af den analytiske VZV, og fluorescens-kanalen Cycling Orange til PCR af den interne kontrol. Sammenlign temperaturprofilen med protokollen. Se Protokol: PCR- og dataanalyse, side 17. c) Ukorrekt konfiguration af PCR d) Opbevaringsbetingelserne for et eller flere kitkomponenter overholdt ikke instruktionerne i afsnittet Opbevaring (side 5) e) artus VZV RG PCR Kit er udløbet Kontroller arbejdsgangen ved hjælp af pipetteringsplanen og gentag PCR, hvis det er nødvendigt. Se Protokol: PCR- og dataanalyse, side 17. Kontroller opbevaringsbetingelserne for og udløbsdatoen (se etiketten på kittet) på reagenserne og anvend et nyt kit, hvis det er nødvendigt. Kontroller opbevaringsbetingelserne for og udløbsdatoen (se etiketten på kittet) på reagenserne og anvend et nyt kit, hvis det er nødvendigt. 26 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

27 Bemærkninger og forslag Svagt eller intet signal i den interne kontrol for en negativ CSF-prøve, der oprenses med EZ1 DSP Virus Kit i fluorescens-kanal Cycling Orange og samtidigt fravær af signal i Cycling Green-kanal a) PCR-forholdene er ikke i overensstemmelse med protokollen b) PCR blev hæmmet c) DNA gik tabt under ekstraktion d) Opbevaringsbetingelserne for et eller flere kitkomponenter overholdt ikke instruktionerne i afsnittet Opbevaring (side 5) Kontroller betingelserne for PCR (se ovenfor) og gentag PCR med de korrekte indstillinger, hvis det er nødvendigt. Sørg for at anvende den anbefalede isolationsmetode og nøje følge producentens vejledning. Hvis den interne kontrol blev tilsat ekstraktionen, kan fravær af et signal i den interne kontrol være tegn på tab af DNA under ekstraktion. Sørg for at anvende den anbefalede isolationsmetode (se Isolation af DNA, side 15) og nøje følge producentens vejledning. Kontroller opbevaringsbetingelserne for og udløbsdatoen (se etiketten på kittet) på reagenserne og anvend et nyt kit, hvis det er nødvendigt. e) artus VZV RG PCR Kit er udløbet Kontroller opbevaringsbetingelserne for og udløbsdatoen (se etiketten på kittet) på reagenserne og anvend et nyt kit, hvis det er nødvendigt. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

28 Bemærkninger og forslag Signaler med de negative kontroller i fluorescens-kanalen Cycling Green i den analytiske PCR a) Der er forekommet kontamination under forberedelse af PCR Gentag PCR med nye reagenser i replikater. Om muligt lukkes PCR-rørene direkte efter tilsætning af den prøve, der skal analyseres. Sørg for at pipettere den positive kontrol til sidst. Sørg for at arbejdspladsen og instrumenterne dekontamineres jævnligt. b) Der er forekommet kontamination under ekstraktion Gentag ekstraktion og PCR af den prøve, der skal analyseres, med nye reagenser. Sørg for at arbejdspladsen og instrumenterne dekontamineres jævnligt. 28 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

29 Litteratur QIAGEN har en stor, opdateret, online database over videnskabelige publikationer, hvor produkter fra QIAGEN anvendes. Omfattende søgefunktioner gør det muligt at finde de artikler, man har brug for, enten ved en simpel søgning på nøgleord eller ved at specificere applikation, forskningsområde, titel osv. En komplet liste over referencer findes online i QIAGEN Reference Database på eller den kan fås hos QIAGEN teknisk support eller den lokale forhandler. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

30 Bestilling Produkt Indhold Katalognr. artus VZV RG PCR Kit (24) Til 24 reaktioner: Master, Mg-opløsning, 4 kvantificeringsstandarder, intern kontrol, vand (PCR-kvalitet) artus VZV RG PCR Kit (96) Til 96 reaktioner: Master, Mg-opløsning, 4 kvantificeringsstandarder, intern kontrol, vand (PCR-kvalitet) EASYartus VZV RG PCR Kits - til integreret, automatiseret oprensning af prøver og detektion af patogener i overensstemmelse med CE og IVD EASYartus VZV RG PCR Kit 1 EASYartus VZV RG PCR Kit 2 Til 48 forberedelser af viral nukleinsyre og 24 analyser: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 1 x artus VZV RG PCR Kit (24) Til 48 forberedelser af viral nukleinsyre og 48 analyser: 1 x EZ1 DSP Virus Kit, 2 x artus VZV RG PCR Kit (24) EZ1 DSP Virus Kit - til automatiseret, samtidig oprensning af viralt DNA og RNA fra 1-6 humant plasma, serum eller CSF-prøver ved hjælp af EZ1 Advanced EZ1 DSP Virus Kit (48) EZ1 Advanced DSP Virus Card EZ1 Advanced Til 48 forberedelser af viral nukleinsyre: Forfyldte reagenskassetter, engangsholdere til spidser, engangsspidser med filter, prøverør, elueringsrør, buffere, carrier-rna Forprogrammeret kort til EZ1 DSP Virusprotokol Til in vitro-diagnostik i Europa: Robotarbejdsstation til automatiseret oprensning af nukleinsyrer ved hjælp af EZ1 DSP Kits, 1 års garanti på dele og arbejdstimer Rotor-Gene Q og tilbehør Rotor-Gene Q 5plex Real Time PCR-maskine med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, højrød), bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på dele og arbejdstimer EA10223 EA Kontakt os 30 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

31 Produkt Indhold Katalognr. Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex Real Time PCR-maskine og smeltemaskine med høj opløsning med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, højrød) plus HRM-kanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på dele og arbejdstimer Real Time PCR-maskine med 6 kanaler (blå, grøn, gul, orange, rød, højrød), inklusive bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på dele og arbejdstimer Kontakt os Kontakt os Loading Block 72 x 0,1 ml Tubes Loading Block 96 x 0,2 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0,1 ml (2500) PCR Tubes, 0,2 ml (1000) PCR Tubes, 0,2 ml (10.000) Aluminiumblok til manuel reaktionsopsætning med en enkeltkanalspipette i 72 x 0,1 ml rør Aluminiumblok til manuel reaktionsopsætning i standard 8 x 12 rækker med 96 x 0,2 ml rør 250 strips med 4 rør og låg til 1000 reaktioner 10 x 250 strips med 4 rør og låg til reaktioner 1000 tyndvæggede rør til 1000 reaktioner 10 x 1000 tyndvæggede rør til reaktioner Opdateret licensinformation og produktspecifikke ansvarsfraskrivelser findes i de respektive brugsanvisninger eller håndbøger fra QIAGEN. QIAGEN brugsanvisninger og håndbøger kan ses på eller anskaffes fra QIAGEN teknisk support eller den lokale forhandler. artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/

32 Denne side er med vilje tom 32 artus VZV RG PCR Kit håndbog 09/2009

33 Køb af dette produkt tillader køberen at anvende det til at udføre diagnostiske applikationer i human in vitro-diagnostik. Der gives hermed intet generelt patent eller anden licens i nogen form siden købet udover denne specifikke brugsret. Varemærker: QIAGEN, artus, EASYartus, EZ1 (QIAGEN Group); Rotor-Gene (Corbett Research Pty Ltd). artus VZV RG PCR Kit er et CE-mærket diagnostisk kit i overensstemmelse med Rådets direktiv om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik 98/79/EF. Kan ikke fås i alle lande. Begrænset licensaftale Ved brug af dette produkt tilkendegiver enhver køber eller bruger af artus VZV RG PCR Kit at indgå på følgende betingelser: 1. artus VZV RG PCR Kit må kun anvendes i overensstemmelse med artus VZV RG PCR Kit håndbog og er kun til brug med komponenterne i kittet. QIAGEN giver ingen licens under nogen af virksomhedens intellektuelle ejendomme til at bruge eller inkorporere de vedlagte komponenter i dette kit med komponenter, der ikke er inkluderet i dette kit, undtagen som beskrevet i artus VZV RG PCR Kit håndbog og i yderligere protokoller, der findes på 2. Udover de udtrykkeligt erklærede licenser giver QIAGEN ingen garanti for, at dette kit og/eller anvendelsen af det ikke krænker tredjeparters rettigheder. 3. Dette kit og dets komponenter er licenseret til engangsbrug og må ikke genbruges, omdannes eller videresælges. 4. QIAGEN ansvarsfraskriver sig specifikt enhver anden licens, udtrykt eller underforstået, end de, der udtrykkeligt er erklæret. 5. Køberen og brugeren af kittet accepterer ikke at foretage sig noget eller tillade andre at foretage sig noget, der kunne føre til eller lette nogen af de ulovlige handlinger ovenfor. QIAGEN kan gøre forbudene i denne begrænsede licensaftale gældende ved enhver ret, og vil inddrive alle undersøgelsesudgifter og juridiske omkostninger, inklusive advokatsalærer, i enhver handling for at gøre denne begrænsede licensaftale eller nogen af virksomhedens rettigheder over intellektuel ejendom gældende, som er relateret til kittet og/eller dets komponenter. Opdaterede licensbetingelser findes på QIAGEN, alle rettigheder forbeholdes.

34 Australien Bestilling Fax Teknisk Belgien Bestilling Fax Teknisk Brasilien Bestilling Fax Teknisk Canada Bestilling Fax Teknisk 800-DNA-PREP ( ) Danmark Bestilling Fax Teknisk Finland Bestilling Fax Teknisk Frankrig Bestilling Fax Teknisk Udvalg Hong Kong Bestilling Fax Teknisk Irland Bestilling Fax Teknisk Italien Bestilling Fax Teknisk Japan Telefon Fax Teknisk Kina Bestilling Fax Teknisk Korea (Sydkorea) Bestilling Fax Teknisk Luxembourg Bestilling Fax Teknisk Mexico Bestilling Fax Teknisk Nederlandene Bestilling Fax Teknisk Norge Bestilling Fax Teknisk Schweiz Bestilling Fax Teknisk Singapore Bestilling Fax Teknisk Spanien Bestilling Fax Teknisk Storbritannien Bestilling Fax Teknisk Sverige Bestilling Fax Teknisk Tyskland Bestilling Fax Teknisk USA Bestilling Fax Teknisk 800-DNA-PREP ( ) Østrig Bestilling 0800/ Fax 0800/ Teknisk 0800/ DA Sample & Assay Technologies