HercepTest Kodenr. K5204

Transkript

1 HercepTest Kodenr. K udgave Til immuncytokemisk farvning. Sættet er beregnet til 35 tests (70 objektglas). ( ) P04085DK_01_K / s. 1/54

2 Indhold Side Tilsigtet anvendelse... 4 Resumé og forklaring Bryst... 5 Baggrund... 5 Egenskaber... 5 Procedureprincip Bryst... 6 Reagenser Bryst... 6 Medfølgende materialer... 6 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 7 Opbevaring Bryst... 8 Klargøring af prøver Bryst... 8 Paraffinindstøbte snit... 8 Behandling af vævsprøver før farvning... 9 Forholdsregler Bryst... 9 BRUGSVEJLEDNING Bryst A. Klargøring af reagens A.1 Epitope Retrieval Solution A.2 Vaskebuffer A.3 Substratkromogenopløsning (DAB) A.4 Kontrastfarvning A.5 Monteringsmedie B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren B.2 Farvningsprotokol Kvalitetskontrol Bryst Fortolkning af farvning Bryst Begrænsninger Bryst Generelle begrænsninger Produktspecifikke begrænsninger Præstationskarakteristika Bryst Baggrund Sammenlignende forsøg Sammenligning med CTA analysen Nøjagtighed Reproducerbarhed Immunreaktivitet Fejlfinding Bryst Resumé og forklaring Gastrisk Baggrund Egenskaber Procedureprincip Gastrisk Reagenser Gastrisk Medfølgende materialer Nødvendige materialer, der ikke medfølger Opbevaring Gastrisk ( ) P04085DK_01_K / s. 2/54

3 Klargøring af prøver Gastrisk Paraffinindstøbte snit Behandling af vævsprøver før farvning Forholdsregler Gastrisk BRUGSVEJLEDNING Gastrisk A. Klargøring af reagens A.1 Epitope Retrieval Solution A.2 Vaskebuffer A.3 Substratkromogenopløsning (DAB) A.4 Kontrastfarvning A.5 Monteringsmedie B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren B.2 Farvningsprotokol Kvalitetskontrol Gastrisk Fortolkning af farvning Gastrisk Begrænsninger Gastrisk Generelle begrænsninger Produktspecifikke begrænsninger Præstationskarakteristika Gastrisk Baggrund Reproducerbarhed Immunreaktivitet Fejlfinding Gastrisk Referencer Symbolforklaring ( ) P04085DK_01_K / s. 3/54

4 Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik HercepTest er en semikvantitativ, immuncytokemisk analyse til påvisning af HER2 protein overekspression i væv fra brystkræft, der behandles rutinemæssigt med henblik på en histologisk vurdering og formalinfikseret, paraffinindstøbt cancervæv fra patienter med adenocarcinom, herunder den gastroesofageale overgang. HercepTest er beregnet som en hjælp til at udvælge de patienter, hvor behandling med Herceptin (trastuzumab) kan overvejes (se indlægssedlen for Herceptin ). NOTE alene for brystcancer: Alle patienterne i det kliniske forsøg med Herceptin blev udvalgt ved hjælp af en foreløbig immuncytokemisk klinisk undersøgelsesanalyse (clinical trial assay CTA). af patienterne i de kliniske forsøg blev udvalgt med brug af HercepTest. HercepTest blev sammenlignet med CTA analysen på uafhængige prøver, og det viste sig, at testen gav acceptabelt overensstemmende resultater. Den aktuelle korrelation mellem HercepTest og det kliniske resultat af behandlingen med Herceptin er ikke påvist. NOTE alene for gastrisk cancer: Alle patienterne i fase III-forsøget BO18255 (ToGA) sponsoreret af Hoffmann-La Roche blev udvalgt ved hjælp af Dako HercepTest (IHC) og Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Forsøget påviste den kliniske anvendelighed af begge tests til vurdering af HER2-status hos patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk, gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang. Gastrisk adenokarcinom, herunder adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang, kaldes også gastrisk cancer i dette dokument. Der henvises til side 5 26 for anvendelse til brystcancer. Der henvises til side for anvendelse til gastrisk cancer. Vigtigt: Bemærk forskellene på væv fra brystcancer og gastrisk cancer, især i afsnittene Fortolkning af farvning ( ) P04085DK_01_K / s. 4/54

5 Brystcancer Resumé og forklaring Bryst Baggrund Det humane HER2 gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) koder for et protein, der ofte omtales som HER2 protein eller p185 HER2. HER2 proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1 8). HER2 proteinet er en normal cellekomponent, der dannes i forskellige former for epitelceller (8). Hos en del patienter med brystkræft findes en overekspression af HER2 proteinet som et led i den maligne transformationsproces og tumorudvikling (9). Overekspression af HER2 protein på overfladen af brystkræftceller antyder, at der kan anvendes en antistofbehandling. Herceptin (trastuzumab) er et rekombinant humant monoklonalt antistof (10) der med høj affinitet binder sig til HER2 proteinet. Det er påvist, at det hæmmer proliferationen af humane tumorceller med overekspression af HER2 protein in vitro og in vivo (11 13). Egenskaber HercepTest er udviklet som et alternativ til den foreløbige analyse, der er anvendt i de kliniske forsøg med Herceptin. HercepTest evne til at påvise HER2 proteinets overekspression blev bestemt i en uafhængig undersøgelse ved at sammenligne resultaterne af HercepTest med CTA analysen for 548 brystkræftpræparater, hvoraf ingen var fra patienter, der deltog i de kliniske forsøg med Herceptin. Resultaterne viste 79% konkordans mellem resultaterne af de to analyser af de pågældende vævspræparater. Dataene om overensstemmelse indikerede også, at en 3+ aflæsning med HercepTest med stor sandsynlighed ville svare til en positiv aflæsning på CTA, som ville have opfyldt indgangskriteriet for afprøvningen (2+ eller 3+). Fundet af 2+ med HercepTest stemte ikke så godt overens med resultaterne af CTA analysen. Ca. 42% (53/126) af HercepTest 2+ resultaterne var negative i CTA analysen (0-1+), og ville ikke have haft adgang til deltagelse i de kliniske forsøg med Herceptin. HercepTest fortolkes som negativ for overekspression af HER2 protein (0 og 1+ farveintensitet), svagt positiv (2+ farveintensitet) og stærkt positiv (3+ farveintensitet). HercepTest er ikke beregnet til at give patienten og lægen prognostiske oplysninger og er ikke vurderet med henblik på dette. ( ) P04085DK_01_K / s. 5/54

6 Brystcancer Procedureprincip Bryst HercepTest indeholder de nødvendige reagenser til at gennemføre en to trins immun cytokemisk farvningsprocedure af rutinemæssigt behandlede, paraffinindstøbte prøver. Efter inkubation med det primære kaninantistof mod humant HER2 protein, anvender dette sæt et brugsklart Visualization Reagent baseret på dextranteknologi. Dette reagens består af både sekundære gede anti kanin immunglobulinmolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler, der er bundet til en fælles dextranpolymerbase, hvorfor der ikke er behov for sekventiel påføring af link antistof og peroxidase konjugat antistof. Visualization Reagent krydsreaktion med humane immunglobuliner og føtalt kalveserum er fjernet ved hjælp af fastfaseabsorption. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilføjede kromogen medfører dannelse af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Til vurdering af farvningerne leveres der kontrolobjektglas med tre formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farveintensiteter på 0, 1+ og 3+. Farveintensiteten af disse cellelinjer svarer til antallet af receptorer pr. celle. HercepTest, Kodenr. K5204, kan anvendes til både manuel farvning og automatisk farvning ved brug af Autostainer. Reagenser Bryst Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 35 analyser (35 objektglas inkuberet med primært antistof mod HER2 protein og 35 objektglas inkuberet med den tilsvarende negative kontrolreagens). Antallet af tests er baseret på brugen af 3 dråber (100 µl) pr. vævssnit fra flaskerne nr. 1, 2, 3 og 4, samt substrat chromogen opløsningen (DAB). Sættet indeholder materialer til maks. 5 individuelle farvninger. Flaske nr. Mængde 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml Beskrivelse Peroxidase Blocking Reagent: 3% hydrogenperoxid, der indeholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). Rabbit Anti Human HER2 Protein: Affinitetsisoleret antistof klar til brug. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. Immunogen: Syntetisk C terminal fragment (intracytoplasmatisk del) af HER2 proteinet koblet til hæmocyanin fra albueskæl. Specificitet: HER2 protein. Rensningsmetode: Antistoffet er affinitetsisoleret ved hjælp af et immobiliseret HER2 proteinpeptid. Visualiseringsreagens: Dextranpolymer konjugeret med peberrodsperoxidase og affinitetsisoleret gede antikanin immunglobuliner. Leveres i Tris/HCl buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. ( ) P04085DK_01_K / s. 6/54

7 Brystcancer 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml 5 objektglas Negativ Control Reagent: Immunglobulin fraktion af normalt kaninserum ved en ækvivalent proteinkoncentration som antistoffet til HER2 protein. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. DAB Buffer Substrate: Substratbufferopløsning, ph 7,5, indeholdende < 0,1% hydrogenperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et antimikrobielt stof. DAB kromogen: 5% 3,3' diaminobenzidintetrahydrochlorid kromogenopløsning. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citratbuffer med et vaskemiddel. Wash Buffer (10x): Tris/HCl buffer med et rengøringsmiddel og et antimikrobielt stof. Kontrolobjektglas: Hvert objektglas indeholder snit fra tre formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer fra brystkarcinomer, med forskellige niveauer af HER2 protein ekspressioner: MDA 231 (0), MDA 175 (1+) og SK BR 3 (3+). Kontrolobjektglassene er varmebehandlede, så snittene sidder bedre fast på objektglassene. Yderligere opvarmning af kontrolobjektglassene med henblik på at forbedre snittenes fastklæbning kan kompromittere resultatet af farvningen. BEMÆRK: Alle reagenser, herunder epitopgenfindingsopløsning og vaskebuffer, er sammensat specifikt til brug sammen med denne test. For at testen virker som specificeret, må der ikke foretages substitutioner, med undtagelse af vaskebufferen, hvor Dako Kodenr. S3006 kan anvendes. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Absorberende servietter Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 37 mmol/l Kontrastfarve: Hæmatoxylin, som f.eks. den vandbaserede Mayer's Hematoxylin, Dako Kodenr. S3301 (se BRUGSANVISNINGEN, A.4) Dækglas Afgrænsningspen, som f.eks. Dako Pen, Kodenr. S2002 Destilleret eller deioniseret vand (skyllevand) Tørreovn der kan holde en temperatur på 60 C eller mindre Ethanol, absolut og 95% Fugtkammer (valgfri) Lysmikroskop (4 40x objektivforstørrelse) ( ) P04085DK_01_K / s. 7/54

8 Brystcancer Monteringsmedium, som f.eks. Dako Faramount, Kodenr. S3025 eller Glycergel, Kodenr. C0563. Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas, SuperFrost Plus, poly L lysin coatede objektglas, eller Dako silaniserede objektglas, Kodenr. S3003 (se Klargøring af prøver) Farveskåle eller bade Timer (i stand til 2 40 minutters intervaller) Vaskeflasker Vandbad med låg (i stand til at holde epitopgenfindingsopløsningen på C) Xylen, toluen eller xylen erstatninger Opbevaring Bryst Opbevares ved 2 8 C. Anvend ikke sættet efter udløbsdatoen, der er trykt på emballagens yderside. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end de, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først evalueres af brugeren (14a, 14b). Bemærk, at kontrolobjektglassene også skal opbevares ved 2 8 C. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Derfor bør der udføres positive og negative kontroller samtidigt med patientprøver. Kontakt straks Dako s tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HercepTest produktet. Klargøring af prøver Bryst Biopsipræparater skal behandles, så vævet bevares til immuncytokemisk farvning. Der skal anvendes standardmetoder for vævsbehandling til alle præparaterne (15). Paraffinindstøbte snit Væv, der er opbevaret i neutralt bufferet formalin eller Bouins væske til rutinemæssig behandling og paraffinindstøbning, er egnet til denne analyse. Biopsipræparater skal for eksempel skæres i blokke af 3 4 mm og fikseres i timer i neutralt bufferet formalin. Vævsprøverne skal derefter dehydreres i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin ved højst 60 C. Korrekt fastgjorte og indstøbte vævsprøver, der udtrykker HER2 proteinet vil holde sig uendeligt inden udskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares på et køligt sted (15 25 C) (15, 16). I USA kræver Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (lov for kliniske laboratorieforbedringer af 1988) i 42 CFR (b) at Laboratoriet skal opbevare farvede præparatglas i mindst ti år fra undersøgelsesdato og vævsblokke i mindst to år fra undersøgelsesdato (16). Vævsprøverne skal skæres i snit på 4 5 µm, monteres på objektglas og lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer (eller indtil de er tørre) ved 37 C natten over eller ved 60 C i én time. FORSIGTIG: Overdreven opvarmning i mere end én time ved 60 C kan give anledning til et væsentligt fald i eller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, der er monteret på objektglas (SuperFrost Plus, poly L lysin eller silaniserede objektglas), farves inden 4 6 uger efter de er skåret, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (18). Objektglas, der er påkrævet til HER2 proteinevaluering og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Der anbefales et minimum på 5 objektglas, 1 objektglas til svulsttilstedeværelse, 2 objektglas til HER2 proteinvurdering (1 til inkubation med flaske nr. 2 og 1 til inkubation med flaske nr. 4), samt 2 objektglas som back up. Brugen af HercepTest på afkalket væv er ikke blevet valideret og anbefales ikke. Se Dako s Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) samt reference 15 og 16 for yderligere oplysninger om klargøring af præparater. ( ) P04085DK_01_K / s. 8/54

9 Brystcancer Behandling af vævsprøver før farvning Der skal anvendes en specifik epitopgenfindingsmetode, kogning i 10 mmol/l citratbuffer for at opnå optimalt analyseeffektivitet. Opløsningen til epitope retrieval leveres med HercepTest sættet. Denne metode omfatter opvarmning af vævssnit, der er monteret på objektglas som er nedsænket i 10 mmol/l citratbuffer (20) i et kalibreret vandbad, som er i stand til at holde epitopgenfindings-opløsningen på den krævede temperatur (95 99 C). Laboratorier, beliggende i større højder, skal finde den bedste metode til opretholdelse af den påkrævede vandbadstemperatur. Epitop retrieval skal udføres i vandbad. Andre opvarmningsmetoder er afprøvet og giver ikke reproducerbare resultater. Umiddelbart efter epitop retrieval påbegyndes farvningen. Afvigelser fra den beskrevne procedure kan påvirke resultaterne. Forholdsregler Bryst 1. Anvendes til in vitro diagnostik 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, peroxidaseblokerende reagens, indeholder 3% hydrogenperoxid. Sikkerhedsdatablade kan rekvireres af uddannet personale. 4. Flaske 6, DAB kromogen, indeholder 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid og er mærket: H350 H341 P201 P280 Farlig P308 + P313 P405 P501 Kan fremkalde kræft. Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. Indhent særlige anvisninger før brug. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. Opbevares under lås. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. Som en generel regel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Safety Data Sheet (SDS)) for yderligere oplysninger. 5. Flaske 8, Wash Buffer (10x), indeholder 5-<10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3- diolhydrochlorid og 0.1-<0.2% 5-brom-5-nitro-1, 3-dioxan. Kan forårsage en allergisk reaktion. Wash Buffer (10x) er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 6. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3 ), et kemisk stof der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Ved bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (21, 22). ( ) P04085DK_01_K / s. 9/54

10 Brystcancer 7. Flaske 2, 3 og 4 indeholder materiale af animalsk oprindelse. Som ved alle produkter, der er afledt ud fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 8. Alle kontrolglas og alle præparater både før og efter fiksering samt alt materiale, der har været i forbindelse med dem, skal håndteres som om de kunne overføre smitte, og de skal bortskaffes under overholdelse af passende forholdsregler (23). Pipetter aldrig med munden, og undgå at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenserne kommer i kontakt med følsomme områder, skylles der med rigeligt vand. 9. Minimér mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå uspecifik farvning. 10. Andre inkubationstider, temperaturer eller metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. Overdreven tørring ved 60 C i mere end én time kan give anledning til et væsentligt fald i eller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). 11. Reagensernes fortynding er optimeret. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvningen. 12. Alle reagenser, herunder epitopgenfindingsopløsning og vaskebuffer, er sammensat specifikt til brug sammen med denne test. For at testen virker som specificeret, må der ikke foretages substitutioner, med undtagelse af vaskebufferen, hvor Kodenr. S3006 kan anvendes. 13. Visualiseringsreagensen og DAB chromogen kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for store mængder lys. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 14. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. Se materialesikkerhedsarket (Safety Data Sheet (SDS)) for yderligere oplysninger. 15. Paraffinrester kan føre til falsk negative resultater. 16. Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan resultere i tab af synlig HER2- immunreaktivitet. Hvis vævssnittet i cirklen ikke kan dækkes fuldstændigt med 3 dråber (100 µl) reagens, skal der tilsættes yderligere 3 dråber. ( ) P04085DK_01_K / s. 10/54

11 Brystcancer BRUGSVEJLEDNING Bryst A. Klargøring af reagens Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Epitope Retrieval Solution Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) 1:10 ved brug af destilleret eller deioniseret vand til den planlagte farvningsprocedure. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér opløsni ngen, hvis den er uklar. A.2 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 8 (Wash Buffer 10x) 1:10 ved brug af destilleret eller deioniseret vand til vasketrinene. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér bufferen, hvis den er uklar. Destilleret eller deioniseret vand kan bruges til skylning efter peroxidaseblokeringsreagensen, substrat chromogen opløsningen og hæmatoxylin inkubationer. Alle andre skylletrin kræver brug af vaskebuffer. A.3 Substratkromogenopløsning (DAB) Nedenstående fremgangsmåde giver 1 ml substratkromogenopløsning. Hver portion på 1 ml er tilstrækkelig til ti vævssnit. Trin 1: Overfør 1 ml DAB Buffered Substrate fra flaske 5 til et testrør. Trin 2: Tilsæt en dråbe (25 30 µl) DAB Chromogen fra flaske 6. Bland og påfør på vævssnittene med en pipette. Forberedt substrat chromogen opløsning (DAB) er stabil i ca. 5 dage, når den opbevares ved 2 8 C. Opløsningen skal blandes grundigt inden bru g. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. BEMÆRK: Farven af DAB chromogenet i flaske 6 kan variere fra klart til let lavendel brunt. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i hendhold til vejledningen på denne indlægsseddel. Hvis der tilsættes for meget DAB Chromogen til DAB bufferet substrat, vil det medføre en forringelse af det positive signal. A.4 Kontrastfarvning Det farvede slutprodukt fra DAB farvningsreaktionen er uopløseligt i alkohol og vand. Brug en hæmatoxylin-kontrastfarve, og justér hæmatoxylinens farvningsintensitet til et lignende niveau som vist i Dakos HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Vejledning til fortolkning af HercepTest Brystcancer). Hæmatoxylin, enten alkohol eller vandbaseret, som f.eks. Dako Mayer s Hematoxylin, Kodenr. S3309, kan anvendes. Efterfølg hæmatoxylin kontrastfarvningen med en grundig skylning i destilleret eller deioniseret vand, og dyp derefter objektglassene med vævsprøver i et bad bestående af 37 mmol/l salmiakspiritus (se Sektion B.2, Trin 6). Salmiakspiritus (37 mmol/l) klargøres ved at blande 2,5 ml 15 mol/l (koncentreret) ammoniumhydroxid med 1 liter destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt 37 mmol/l ammoniakvand kan opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) i en flaske med tætslutte nde prop i max. 12 måneder. A.5 Monteringsmedie Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedie. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready to Use, Kodenr S3025, eller Glycergel monteringsmedium, Kodenr. C0563, anbefales til vandig montering. Glycergel skal gøres flydende ved opvarmning til ca. 40 (±5) C inden brug. ( ) P04085DK_01_K / s. 11/54

12 Brystcancer B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og blive fortrolig med alle komponenterne inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal have stuetemperatur (20 25 C) inden immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget non specifik farvning. Dæk objektglas, der er udsat for træk. Hvis der anvendes lange inkubationstider, skal vævet anbringes i et fugtigt miljø. Hvis farvningsproceduren skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i et bufferbad efter inkubation af det primære antistof (trin 3) i maks. 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at farvningsfunktionen påvirkes. Afparaffinering og rehydrering: Forud for farvning skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i absolut ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i 95% ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i destilleret eller deioniseret vand i mindst 30 sekunder. Begynd farvningsproceduren som angivet i Sektion B.2, Trin 1, Epitopgenfinding. Xylen og alkoholopløsninger skal udskiftes efter 40 objektglas. Toluen eller xylenerstatninger, så som Histoclear, kan anvendes i stedet for xylen. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturer kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige til brug ved udvælgelse af patienter til behandling med Herceptin. B.2 Farvningsprotokol Udført ved stuetemperatur, C. Trin 1: Epitope retrieval Fyld farvningsglassene, d.v.s. Coplin glas, med den fortyndede epitopgenfindingsopløsning (se BRUGSANVISNINGEN, Sektion A.1). Anbring farvningskarrene, der indeholder epitop retrieval opløsning, i vandbad. Opvarm vandbadet og epitopgenfindingsopløsningen til C. Ved opvarmning bliver epitopgenfindingsopløsningen uklar. Dæk glassene med låg for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Dyp de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i den forvarmede epitop retrieval opløsning i farvningskarrene. BRING VANDBADETS TEMPERATUR OG EPITOPGENFINDINGSOPLØSNINGEN TILBAGE PÅ C. Inkubér i 40 (±1) minutter ved C. Fjern hele skålen med objektglas fra vandbadet. Lad objektglassene få lov til at køle af i epitopgenfindingsopløsningen i 20 (±1) minutter ved stuetemperatur. ( ) P04085DK_01_K / s. 12/54

13 Brystcancer Hæld epitopgenfindingsopløsningen ud, og skyl sektionerne i den fortyndede vaskebuffer (se BRUGSANVISNINGEN, Sektion A.2). For optimale præstationer skal sektionerne gennemblødes i vaskebuffer i 5 20 minutter efter epitopgenfinding, og inden farvning. BEMÆRK: Epitope Retrieval Solution er udelukkende beregnet til engangsbrug. Må ikke genbruges. Trin 2: Peroxidaseblokerende reagens Tap overskydende buffer af med lette slag. Brug en fnugfri klud (f.eks. Kimwipe eller gaze), og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Afmærk vævssektionen med en Dako Pen. Påfør 3 dråber (100 µl) Peroxidase Blokeringsreagens for at dække prøven. Inkubér i 5 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret eller deioniseret vand, eller vaskebuffer fra en vaskeflaske (ret ikke strålen direkte mod vævet) og læg prøven i et friskt bufferbad. Trin 3: Primært antistof eller negativt kontrolreagens Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som beskrevet tidligere. Dæk prøverne med 3 dråber (100 µl) anti HER2 protein eller negativ kontrolreagens. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med vaskebuffer fra en vaskeflaske (ret ikke strålen direkte mod vævet) og læg prøven i et friskt bufferbad. Hvis farvningsproceduren nødvendigvis skal afbrydes, kan objektglassene holdes i et bufferbad, efter Trin 3, i op til en time ved stuetemperatur (20 25 C) uden det påvirker farvningsydelsen. Trin 4: Visualiseringsreagens Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som beskrevet tidligere. Dæk prøverne med 3 dråber (100 µl) visualiseringsreagens. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl objektglassene som i trin 3. Trin 5: Substratkromogenopløsning (DAB) Tør objektglassene som beskrevet tidligere. Dæk prøverne med 3 dråber (100 µl) substrat chromogenopløsning (DAB). Inkuber i 10 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret eller ioniseret vand fra en vaskeflaske (ret ikke strålen direkte mod vævet). Affald fra substratkromogenopløsning (DAB) opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. ( ) P04085DK_01_K / s. 13/54

14 Trin 6: Kontrastfarvning (vejledningen gælder hæmatoxylin) Brystcancer Nedsænk objektglassene i et hæmatoxylinbad. Inkuber i 2 5 minutter, afhængigt af styrken af den anvendte hæmatoxylin. Skyl forsigtigt i et bad med destilleret eller deioniseret vand. Sørg for at fjerne alt overskydende Hematoxylin. Valgfrit: Dyp objektglassene 10 gange i et bad med 37 mmol/l salmiakspiritus (se Sektion A.4). Skyl forsigtigt objektglassene i et bad med destilleret eller deioniseret vand i 2 5 minutter. BEMÆRK: Afhængigt af inkubationstiden og den anvendte hæmatoxylins styrke vil kontrastfarvning medføre en lyse til mørkeblå farvning af cellekernen. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. Trin 7: Montering Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedie. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Prøver kan monteres og afdækkes med et vandigt monteringsmedie, som f.eks. DakoCytomation Faramount, Kodenr. S3025, eller Glycergel, Kodenr. C0563. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan dog falme en smule, hvis objektglassene forsynes med dækglas med et vandbaseret monteringsmedium og udsættes for kraftigt lys i over en uge. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). ( ) P04085DK_01_K / s. 14/54

15 Brystcancer Kvalitetskontrol Bryst Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover de af Dako leverede kontrolobjektglas. I USA kan man rådføre sig med retningslinjerne for kvalitetskontrol fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24), og reference 25 for yderligere oplysninger. Tabel 1. Formålet med daglig kvalitetskontrol. Væv: Fikseret og behandlet som patientprøven Specifikt antistof og sekundært antistof Ikke specifikt antistof* eller buffer plus samme sekundære antistof som brugt sammen med specifikt antistof Positiv kontrol: Væv eller celler indeholdende målantigen, der skal detekteres (kan findes i patientvæv). Den ideelle kontrol er svagt positivt farvende væv, da dette er mest følsomt for antistof eller antigennedbrydning. Kontrollerer alle trin i analysen. Evaluerer reagenser og procedurer anvendt ved HER2 farvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Negativ kontrol: Væv eller celler, der forventes at være negative (kan findes i patientvæv eller positivt kontrolvæv). Påvisning af utilsigtet antistof krydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Patientvæv Påvisning af specifik farvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Kontrolobjektglas leveret af Dako. Kontrollerer udelukkende farvningsproceduren. * Serum fra samme arter som det specifikke antistof, men ikke rettet mod det samme mål antigen. Til påvisning af uspecifik antistofbinding, f.eks. vævets binding til Fc delen af antistoffet. Kontrolobjektglas (medfølger): Hvert af de leverede kontrolobjektglas indeholder tre runde, formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farvningsintensiteter på 0, 1+ og 3+. For hver farvningskørsel skal der farves et kontrolobjektglas. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. Positivt kontrolvæv: Kontrollerne skal være friske autopsi /biopsi /kirurgiske præparater, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven ( prøverne). Positivt kontrolvæv er tegn på korrekt præpareret væv og korrekte farvningsteknikker. For hvert sæt testforhold skal der medtages ét positivt kontrolvæv i hver farvningskørsel. Det positive kontrolvæv skal give en svag positiv farvning, så der kan påvises små forandringer i det primære antistofs følsomhed. Kontrolobjektglassene, der leveres sammen med dette sæt, eller præparater, der behandles anderledes end patientprøven ( prøverne), vurderer udelukkende reagenseffektiviteten og kontrollerer ikke vævspræpareringen. Brug det tidligere bestemte HER2 protein 2+ overudtrykkende, invasive (infiltrerende) humane brystcarcinomvæv til den ideelle positive vævskontrol. BEMÆRK: Kendt positivt kontrolvæv må kun anvendes til kontrol af, om det behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Hvis det positive kontrolvæv ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Negativt kontrolvæv: Brug negativt kontrolvæv (som vides at være negativt for HER2 protein), der er fikseret, behandlet og indstøbt på en måde, som svarer til patientprøven ( prøverne), i hver farvningskørsel for at kontrollere specificiteten af det primære antistof og få en angivelse af den specifikke baggrundsfarvning. Colon, lever og thyroidea er velegnet som negativt kontrolvæv. ( ) P04085DK_01_K / s. 15/54

16 Brystcancer De mange forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, indeholder interne, negative kontrolsteder (dette skal kontrolleres af brugeren). Normale ducti lactiferi kan bruges som interne negative kontroller. Hvis der forekommer specifik farvning i de negative kontroller eller i de interne negative kontrolområder, skal resultatet af patientpræparaterne erklæres ugyldigt, og analysen skal køres igen. Ikke specifik negativ kontrolreagens: Brug den medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof sammen med et snit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere non specifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Inkubationsperioden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. Analyseverifikation: Inden første brug af et antistof eller farvningssystem i en diagnostisk procedure, bør brugeren verificere antistoffets specificitet ved at teste det på en række af laboratoriets egne vævsprøver med kendte immuncytokemiske effektivitetskarakteristika, som repræsenterer kendt positivt og negativt væv. Se procedurerne vedr. kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen, og kravene til kvalitetskontrol i CAP Certification Program for Immunohistochemistry og/eller CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt antistofparti, eller når analyseparametrene ændres. Brystcarcinomer med kendte HER2 protein farvningsintensiteter fra 0-3+ og negativt væv, d.v.s. colon, lever eller thyreoid er egnede til analyseverifikation. Fortolkning af farvning Bryst Til en bestemmelse af HER2 protein overekspression skal kun membranens farvningsintensitet og mønster sammenlignes med den skala, der ses i tabel 2. Præparaterne skal vurderes med lysmikroskop af en patalog. Et objektiv med en forstørrelse på 10x er velegnet til evaluering af den immuncytokemiske farvning og scoring. Brugen af et 20 40x forstørrelsesobjektiv er nyttigt til bekræftelse af resultatet. Cytoplasmisk farvning skal altid betragtes som non specifik farvning og skal ikke inkluderes i bestemmelsen af membranens farvningsintensitet (8). Som en hjælp til at differentiere mellem 0, 1+, 2+ og 3+ farvning henvises der til Dakos HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Vejledning til fortolkning af HercepTest brystcancer), hvor der findes billeder af farvningsintensiteterne. Kun præparater fra patienter med invasivt brystkarcinom bør bedømmes. I tilfælde hvor der findes carcinoma in situ og invasivt carcinom i samme præparat, skal kun det invasive område bedømmes. Tabel 2. Celle membran farvningsintensitet kriterier. Farvningsmønster Farvningsgrad Rapporteres til den behandlende læge HER2 protein overekspression Vurdering Rapporteres til den behandlende læge Der ses ingen farvning eller membranfarvning ses i mindre end 10% af tumorcellerne. 0 Negativ Der ses svag/næsten ingen membranfarvning i mere end 10% af tumorcellerne. Cellerne er kun farvet i dele af membranen. 1+ Negativ Svag til moderat farvning af hele membranen ses i mere end 10% af tumorcellerne. Stærk farvning af hele membranen ses i mere end 10% af tumorcellerne Svagt positiv Stærkt positiv ( ) P04085DK_01_K / s. 16/54

17 Brystcancer HercepTest fortolkes som negativ for overekspression af HER2 protein (0 og 1+ farveintensitet), svagt positiv (2+ farveintensitet) og stærkt positiv (3+ farveintensitet). HercepTest er ikke beregnet til at give patienten og lægen prognostiske oplysninger og er ikke vurderet med henblik på dette. For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en semikvantitativ vurdering af præparaternes farvningsintensitet for hver farvningskørsel, skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 3. Tabel 3. Rækkefølge for objektglas vurdering. Objektglassenes aflæsningsrækkefølge Begrundelse 1. Kontrolobjektglas med tre cellelinjer Tilstedeværelse af 3+ brun cellemembranfarvning (randvist) i 3+ kontrolcellelinjen SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinjen MDA 175, og ingen farvning i 0 kontrolcellelinjen MDA 231 indikerer en gyldig analyse Punktvis og diskontinuert membranfarvning er til stede i et lille til moderat antal af cellerne i den svagt positive 1+ kontrolcellelinje MDA 175. Endvidere kan der ses pletvis immunofarvning i cytoplasmaens Golgi område i denne cellelinje Tilstedeværelsen af brun farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 (negativ for HER2 proteinfarvning) angiver at der er non specifik farvning i analysen. Analyseresultaterne kan være ugyldige på grund af overfarvning 2. Objektglas med positivt kontrolvæv. Der skal ses brunfarvning af membranen. Farvning af cytoplasma og negativt væv bør ikke være mere end Objektglas med negativt kontrolvæv. MANGEL på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvid der forekommer specifik membranfarvning i objektglasset med negativt kontrolvæv, bør resultaterne for patientprøven betragtes som ugyldige 4. Objektglas med patientvæv farvet ved brug af den Reagens 5. Objektglas med patientvæv farvet ved brug af det primære antistof Fravær af specifik membranfarvning verificerer den specifikke mærkning af målantigenet med det primære antistof Anden tone eller brunfarvning, der forekommer i prøvens cytoplasma, som er behandlet med den negative kontrolreagens, som f.eks. i bindevæv, leukocytter, erythrocytter eller nekrotisk væv, bør betragtes som ikke specifik baggrundsfarvning, og bør rapporteres i dataarkets kommentarafsnit Når der findes HER2 protein overekspression i prøven, vil dette vise sig som brun randfarvning på cellemembranen på svulstceller, der er behandlet med det primære antistof 1. Kontrolobjektglas (medfølger): Det positive kontrolobjektglas med Hercep Test skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Tilstedeværelsen af brunt (3,3 diaminobenzidine, DAB) reaktionsprodukt svarende til cellemembranerne angiver, at der er positiv reaktivitet. Tilstedeværelsen af en perifer, brun cellemembranfarvning (randfarvning) i 3+ kontrolcellelinje SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 og ingen farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 angiver at analysen er gyldig. Hvis nogle af kontrolcellelinjerne falder udenfor disse kriterier skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige. 2. Positivt kontrolvæv: Det positive kontrolvæv skal undersøges derefter. Dette objektglas bekræfter at fikserings og epitope retrieval processen er effektiv. Brug intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves non specifikt (26). Der skal ses brunfarvning af cellemembranen. Brunfarvning af cytoplasma og negativt væv inde i præparatet m ikke være mere end svarende til farveintensitetsgrad 1+. ( ) P04085DK_01_K / s. 17/54

18 Brystcancer 3. Negativt kontrolvæv: Objektglasset med negativt kontrolvæv bør undersøges efter det positive kontrolvæv, for at verificere specificiteten af det primære antistofs mærkningen af mål antigenet. Mangel på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren. Bemærk, at en svag reaktion (0-1+ farvningsintensitet) kan forekomme i de fleste normale epitelvæv. Muligt negativt kontrolvæv inkluderer: Colon, lever og thyroidea. En eventuel non specifik farvning vil have et diffust udseende. Sporadisk farvning af bindevæv kan også ses i snit fra for kraftigt formalinfikseret væv Patientvæv: Undersøg patientpræparater der er farvet med HercepTest til sidst. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel non specifik baggrundsfarvning med den negative kontrolreagens. Som det er tilfældet med enhver immuncytokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger samt Præstationskarakteristika for specifikke oplysninger om HercepTest immunreaktivitet. Yderligere forslag til fortolkning af farvning med HercepTest De fleste metastatiske brystkarcinomer der testes for HER2 protein overekspression bedømmes til at være grad 0 eller 3+. Mens de fleste af disse tilfælde er lige til, er en lille procentdel af de resterende 1+ og 2+ præparater vanskeligere at fortolke. Følg nedenstående retningslinjer for fortolkning af farvning med HercepTest i laboratoriet. Evaluer kontrolcellelinjerne for at kontrollere analysens effektivitet. Evaluer de positive og negative kontrolobjektglas. Det anbefales at farve vævsprøverne med en hæmatoxylin eosin (H&E) farvning til første evaluering. (tumoren ses måske ikke tydeligt i præparater, der er farvet med HercepTest. Et H&E farvet objektglas er nødvendigt for at patologen kan verificere tilstedeværelsen af svulsten). HercepTest bør udføres på parvise snit (seriel snit) fra samme paraffinblok af prøven. Evaluer først snittene, der er farvet for HER2 protein overekspression, med en lille forstørrelse. De fleste positive tilfælde vil være tydelige med en lille forstørrelse. Der skal anvendes velbevarede og korrekt farvede områder af præparaterne til bestemmelse af procentdelen af positive tumorceller. Generelt vil præparaternes farvningsgrad være tydelig ved en lille forstørrelse. Hvis det er svært at bedømme grænsetilfælde mellem 1+ og 2+ vil farvningsgraden normalt være 1+. For at verificere membranfarvning, brug da et objektiv med 20 40x forstørrelse. Hvis de fleste tumorceller viser en fuldstændig membran farvning, er farvningsgraden enten 2+ eller 3+. Gå over til et objektiv med 20 40x forstørrelse for at bekræfte scoringen. I de fleste tilfælde af 3+ vil mindst 80% af tumorcellerne være farvede, og membranfarvningen vil være kraftig. Hvis præparatet er tæt på grænsen for 10% positive tumorceller, anbefales det at tælle mindst 100 tumorceller for at bestemme procentdelen af farvede celler. Hvis der er fuldstændig membranfarvning med svag til moderat intensitet i mere end 10% af tumorcellerne, er præparatets farvningsgrad 2+. Denne tilstand ledsages normalt af en ufuldstændig membranfarvning i de fleste af de resterende tumorceller. Hvis mindre end 10% af tumorcellerne har fuldstændig, perifer membranfarvning er graden 1+ selvom andre tumorceller viser en ufuldstændig membranfarvning. Hvis mindre end 10% af tumorcellerne har en fuldstændig eller ufuldstændig perifer membranfarvning er graden 0. ( ) P04085DK_01_K / s. 18/54

19 Brystcancer Begrænsninger Bryst Generelle begrænsninger 1. Immuncytokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv, fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immuncytokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, skæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof trapping eller falsk negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske tests. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. 5. Vævsprøver fra personer, som er inficeret med hepatitis B virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non specifik farvning med peberrodsperoxidase (27). 6. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i vævstyper, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv (28). Kontakt Dakos tekniske service ved dokumenteret, uventet reaktion. 7. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C) (28). 8. Farvningen skal udføres ved stuetemperatur på C. Produktspecifikke begrænsninger 1. Antigenet i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 nedbrydes med tiden. Bedøm resultatet for kontrolobjektglasset i henhold til dets udløbsdato. Negativ farvning af MDA 175 celler er muligvis kun et tegn på, at kontrolobjektglasset er for gammelt. Kontrolobjektglassene skal opbevares ved 2 8 C. 2. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Prøver bør farves inden for 4 6 uger efter montering af vævene på objektglas, når de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (29). 3. For optimale og reproducérbare resultater kræver HER2 protein varmeinduceret epitopgenfinding når vævene er rutinemæssigt fikseret (neutral bufferjusteret formalin eller Bouins fiksativ) og paraffinindstøbning. Denne forbehandling skal være afsluttet ved begyndelsen af hele farvningsprocessen. Se afsnittet Prøveforberedelse, Behandling af væv inden farvning for vejledning. 4. Varmeinduceret epitopgenfinding af HER2 protein bør kun udføres ved brug af et kalibreret vandbad. Andre opvarmningsmetoder er afprøvet og giver ikke reproducerbare resultater. 5. Udskift ikke sættets reagenser med reagenser med andre partinumre eller med reagenser fra andre producenter. Eneste undtagelse herfra er vaskebufferen, som kan erstattes med Dako vaskebuffer, Kodenr. S3006. ( ) P04085DK_01_K / s. 19/54

20 Brystcancer 6. Der kan forekomme falsk positive resultater ved evaluering af den cytoplasmatiske farvning. Når resultaterne fortolkes, skal kun cellemembranens farvningsintensitet tages i betragtning. 7. Farvede kontrolobjektglas skal kun anvendes til kontrol af farvningskørslen og bør ikke anvendes til at bedømme farvningsreaktionen i vævssnittene. 8. Der kan undertiden ses stærkt fokaliseret farvning (3+) som for eksempel varme områder. Dette kan skyldes en ujævn fiksering og/eller behandling af vævet. Det anbefales at immunfarve en anden vævsblok fra samme vævsprøve. 9. Brugen af HercepTest på præparater, der er fikseret i andre fikseringsvæsker end neutral bufferet formalin eller Bouins væske, er ikke godkendt. 10. Normalt epitel i brystvæv bør farves mellem 0 og 1+. Hvis der ses en farvningsgrad højere end 1+ i det normale epitelvæv, skal analysen gentages. Bemærk at normalt epitelvæv fra tonsiller og øsofagus kan farves med en intensitet op til grad 2+. Præstationskarakteristika Bryst Baggrund Den foreløbige kliniske undersøgelsesanalyse (clinical trial assay CTA), der blev anvendt til at udvælge patienter til kliniske forsøg med Herceptin, var kun til forskningsbrug og er ikke længere tilgængelig. HercepTest blev udviklet som et sammenligneligt alternativ til CTA analysen. Sikkerheden og effektiviteten af Herceptin blev bedømt i et randomiseret, kontrolleret, klinisk forsøg og i et stort åbent forsøg (se indlægssedlen for Herceptin ). Alle patienter, der blev udvalgt til de kliniske forsøg med Herceptin, viste overekspression af HER2 protein ved immuncytokemisk test udført med CTA analysen på et centrallaboratorium. Patienterne var egnede til Herceptin behandling hvis deres svulst havde 2+ eller 3+ niveauer af HER2 rotein overekspression (baseret på en 0-3+ skala, hvor 3+ repræsenterede det højeste niveau). Subgruppeanalyser af resultaterne fra disse forsøg antyder, at patienter, hvis væv er stærkt positivt (3+) for HER2 protein overekspression, har mere gavn af Herceptin end patienter, hvis væv er svagt positivt (2+). Graden af HER2 protein overekspression er potentielt en vigtig indikation for resultatet af behandling med Herceptin. Da ingen af patienterne i forsøgene med Herceptin blev udvalgt ved hjælp af HercepTest, er forholdet mellem graden af positivitet og sandsynligheden for klinisk udbytte af behandling med Herceptin ikke kendt. Sammenlignende forsøg Der blev udført to undersøgelser for at karakterisere HercepTest 1) Sammenligning med Clinical Trial Assay (CTA) 2) Nøjagtighed ved sammenligning med fem yderligere analyser. Sammenligning med CTA analysen HercepTest blev sammenlignet med CTA analysen, der var brugt til at udvælge patienter egnet til behandling med Herceptin, med brug af 274 HER2 protein positive (2+ eller 3+) og et tilsvarende antal HER2 protein negative brystkræftpræparater. Tabel 4 viser resultaterne i et 2 x 2 skema, hvor 0 og 1+ betragtes som negative og 2+ og 3+ som positive. ( ) P04085DK_01_K / s. 20/54

21 Tabel 4. A 2 x 2 overensstemmelse af HercepTest med den kliniske prøveundersøgelse CTA (antal prøver). Brystcancer CTA analyse Positiv Negative I alt HercepTest Positiv Negative I alt Overensstemmelse: 79% (76 82%) 95% konfidensinterval. Den samlede binære konkordans for HercepTest med CTA analysen var 79% (431/548), med et 2 sidet 95% konfidensinterval på 76 82%. I enogtyve procent (21%) af resultaterne var der diskordans mellem de to metoder. HercepTest resultaterne rapporteres på en 0-3+ skala, og tolkes som negative for HER2 protein overekspression (0 og 1+ farvningsintensitet), svagt positive (2+ farvningsintensitet), og stærkt positive (3+ farvningsintensitet). Tabel 5. A 3 x 3 overensstemmelse mellem HercepTest og Clinical Trial Assay (CTA). CTA analyse I alt HercepTest I alt Denne 3 x 3 præsentation af overensstemmelsesundersøgelsen indikerer, at en 3+ aflæsning fra HercepTest med meget stor sandsynlighed svarer til et positivt resultat fra CTA, som ville have opfyldt adgangskriteriet til Herceptin afprøvningen (2+ eller 3+). Fundet af 2+ med HercepTest stemte ikke så godt overens med resultaterne af CTA analysen. Ca. 42% (53/126) af HercepTest 2+ resultaterne var negative i CTA analysen (0-1+), og ville ikke have haft adgang til deltagelse i de kliniske forsøg med Herceptin. Nøjagtighed HercepTest blev også afprøvet på 2 objektglas til mikroskopi med paraffinindstøbte vævssnit fra168 brysttumorer. Disse tumorer var tidligere blevet karakteriseret med fem forskellige metoder til bestemmelse af HER2 genamplifikation og overekspression af HER2 protein, her i blandt intern Southern blot, fluorescens in situ hybridisering (FISH) til DNA amplifikation, Northern blot RNA analyse, Western blot og immuncytokemi (ICC) på frosne snit (29). Resultaterne vises i tabel 6. Tabel 6. Sammenligning af HercepTest med de kombinerede resultater (OE) fra gen amplifikations og HER2 protein overekspressions tests. OE referenceklassificering + - I alt HercepTest I alt Positiv overensstemmelse: 43/69 = 62% Negativ overensstemmelse: 99/99 = 100% ( ) P04085DK_01_K / s. 21/54

22 Brystcancer Resultaterne angiver et 85% (142/168) overensstemmelsesniveau (95% konfidensinterval ud af 78 89%) mellem de positive (2+ og 3+) og de negative (0 and 1+) farvningsintensiteter med HercepTest. af de prøver, der blev fundet negative med de 5 forskellige metoder, blev fundet positive med HercepTest, hvorimod de samlede resultater af de 5 forskellige prøver viste et større antal positive tilfælde. Reproducerbarhed Reproducerbarhed inden for kørsel: Reproducerbarheden inden for kørslerne blev testet i et laboratorium med 5 præparater med forskellige immuncytokemiske farvningsgrader. Hvert præparat blev kørt i tre kopier i maskeret, randomiseret form. Denne protokol blev brugt med manuel farvning og igen med automatiseret farvning. Alle præparater gav 100% reproducerbare resultater. Reproducerbarhed mellem kørsler: Reproducerbarheden mellem kørsler blev afprøvet randomiseret og maskeret på tre laboratorier over 4 dage med 5 præparater med forskellige immuncytokemiske farvningsgrader ved hjælp af en automatiseret metode. Et af laboratorierne gentog også denne protokol ved brug af manuel metodik. Der blev fundet enestående reproducerbarhed for positive versus negative resultater (0 og 1+ vs. 2+ og 3+) med undtagelse af to prøver i et laboratorium, der anvendte den automatiserede metodik, og varierede mellem 1+ og 2+. Der var 100% reproducerbarhed for 2+ og 3+ præparaterne. Reproducerbarhed mellem laboratorier: Reproducerbarheden mellem laboratorier blev afprøvet på tre geografisk adskilte laboratorier med 40 identiske randomiserede og maskerede præparater med forskellige immuncytokemiske farvningsgrader. Friskt skårne snit på objektglas blev sendt til hvert testlaboratorium til manuel og automatisk farvning og evaluering foretaget af en patolog. Overensstemmelser mellem laboratorierne lå mellem 82% og 90% for en dikotomisk positiv/negativ bestemmelse, hvor 0 og 1+ var negative og 2+ og 3+ var positive for HER2 protein overekspression. Sammenlignet med resultater fra referencelaboratoriet, der udførte CTA analysen, var der 12,5% (15/120) diskrepans mellem negative (0 eller 1+) og positive (2+ eller 3+) bestemmelser i de sammenlignede resultater. Der fandtes en yderligere diskrepans på 10% (12/120) mellem 2+ og 3+ farvningsgraderne. ( ) P04085DK_01_K / s. 22/54

23 Brystcancer Immunreaktivitet Tabel 7 giver en oversigt over immunreaktiviteten for HercepTest med et anbefalet udvalg af normalt væv. Alle vævsprøver blev formalinfikserede, paraffinindstøbte og farvet med HercepTest i henhold til instruktionerne i indlægssedlen i pakken. Tabel 7. Sammenfatning af normal vævsreaktivitet for HercepTest. Vævstype (antal analyser) Adrenal (3) Knoglemarv (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Bryst (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunge (3) Mesotelceller (3) Ovarie (3) Pancreas (3) Parathyreoid (3) Perifer nerve (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spytkirtel (3) Skeletmuskulatur (3) Hud (3) Tyndtarm (3) Milt (3) Mave (3) Testis (3) Thymus (3) Thyreoid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Positivt farvet vævsbestanddel og farvningsmønster Mælkekirtel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet) Tubuli i nyremarv (3 af 3 væv, 1-2+ i 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Prostatakirtel/-gange (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Svedkirtler (1 af 3 væv, 1+, 30 % af cellerne, cytoplasmatisk) Søjleepitel, overflade (1 af 3 væv, 2+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Epitel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Pladeepitel (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 80 % af cellerne) Medmindre andet er angivet, var den rapporterede farvning i alle væv membranfarvning. Alle tre prøver af hver vævstype havde samme farvningsintensitet, med mindre andet er oplyst. ( ) P04085DK_01_K / s. 23/54

24 Brystcancer Fejlfinding Bryst Se Fejlfindingsafsnittet i den tidligere omtalte Dako håndbog (19) vedrørende udstyrsmæssige handlinger, eller kontakt Dako s tekniske serviceafdeling for at rapportere om usædvanlig farvning. Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. farvning af objektglas. 2. Svag farvning af objektglas. 1a. Reagenserne er ikke anvendt i den korrekte rækkefølge. 1b. Natriumazid i vaskeopløsningen 1c. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre tab af synlig HER2 immunreaktivitet. 2a. Utilstrækkelig epitopgenfinding 2b. Utilstrækkelige reagensinkubationstider. 2c. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 2d. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre en signifikant reduktion af synlig HER2 immunreaktivitet. 2e. Utilstrækkelig reagensvolumen påført. 1a. Gennemgå tilsætningen af reagenser. 1b. Brug frisklavet vaskebuffer som leveret i sættet 1c. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 2a. Kontroller, at epitop retrieval opløsningen når op på C i 40 minutter, og at det derefter afkøles i 20 minutter. 2b. Gennemgå instruktionerne om farvningsproceduren 2c. Sørg for at patientvævet ikke er overfikseret, eller at der ikke blev anvendt et alternativt fiksativ 2d. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 2e. Kontrollér den påførte reagensvolumen. ( ) P04085DK_01_K / s. 24/54

25 Brystcancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 3. For megen baggrundsfarvning af objektglas. 3a. Paraffinen er ikke helt fjernet 3b. Stivelsesadditiver anvendt ved montering af objektglas 3c. Objektglassene er ikke skyllet korrekt. 3d. Snittene er tørret ud under farvningen. 3e. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 3a. Brug friske renseopløsninger, og følg proceduren, der er beskrevet i afsnit B.1. 3b. Undlad at anvende stivelsesadditiver til at hæfte vævssnittene på objektglassene. Mange additiver er immuno reaktive 3c. Anvend frisk opløsning i bufferbade og vaskeflasker. 3d. Anvend fugtkammer. Tør kun tre til fire objektglas af ad gangen, inden der tilsættes reagens. 3e. Sørg for, at der blev anvendt en godkendt fikseringsvæske. Alternativt fiksativ kan medføre for stærk baggrundsfarvning 4. Vævet løsner sig fra objektglasset. 5. For kraftig specifik farvning 3f. Uspecifik reagensbinding til vævet. 3f. Kontroller metoden vævet blev fikseret med, og kontroller for tilstedeværelse af nekrose. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 4a. Brug silaniserede objektglas, som f.eks. Dako Silanized Slides, Kodenr. S3003, SuperFrost Plus eller poly L lysin dækkede objektglas 5a. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 5a Sørg for at der kun bruges godkendte fiksativer og fikseringsmetoder 5b. Brug af uegnet varmekilde til epitopgenfinding, f.eks. damp, mikroovn eller autoklave 5c. For lange reagensinkubationstider. 5d. Der er anvendt en uegnet vaskeopløsning. 5b. Sørg for at der kun bruges vandbad til epitopgenfindings trinnet 5c. Gennemgå instruktionerne om farvningsproceduren 5d. Anvend kun den vaskebuffer, som anbefales til brug med sættet. ( ) P04085DK_01_K / s. 25/54

26 Brystcancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 6. Svag farvning af 1+ kontrolobjektglas cellelinjen 7. Epitopgenfindingsopløsningen bliver uklar ved opvarmning 8. Epitopgenfindingsopløsningen er uklar ved opbevaring (inden opvarmning) 6a. Forkert epitopgenfindingsprotokol er blevet fulgt 6b. Fravær af reaktion med substrat chromogenopløsning (DAB) 6c. Degraderet/nedbrudt kontrolobjektglas 7. Opløsningen bliver uklar ved opvarmning 8. Opløsningen er opbevaret forkert, eller udløbsdatoen for opløsningen er passeret 6a. Neddyp objektglassene i den forvarmede epitopgenfindingsopløsning. Bring temperaturen af epitopgenfindingsopløsningen tilbage til C, og forbehandl i fulde 40 minutter 6b. Sørg for at der anvendes hele 10 minutters inkubationstid. Sørg for at der kun blev tilsat én dråbe DAB chromogen til 1 ml DAB bufferjusteret substrat 6c. Kontrollér sættets udløbsdato og sættets opbevaringsforhold, som vist uden på pakningen 7. Dette er normalt og påvirker ikke farvningen 8. Kontrollér udløbsdatoen og sættets opbevaringsbetingelser, der er trykt på pakningen. Kassér epitopgenfindingsopløsningen. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til nogen af ovennævnte årsager, eller hvis den foreslåede afhjælpning ikke løser problemet, så ring venligst til Dako s tekniske service for videre hjælp. Yderligere informationer om farvningsteknikker og klargøring af prøver, kan findes i Dako s tidligere omtalte håndbog (19) (fås hos Dako), Atlas of Immunohistology (30) og Immunoperoxidase teknikker. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04085DK_01_K / s. 26/54

27 Gastrisk cancer Resumé og forklaring Gastrisk Baggrund Det humane HER2 gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) koder for et protein, der ofte omtales som HER2 protein eller p185 HER2. HER2 proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1 8). HER2 proteinet er en normal cellekomponent, der dannes i forskellige former for epitelceller. Overekspression af HER2 proteinet og amplifikation af HER2 genet i gastrisk cancer er påvist i et stort antal undersøgelser. HER2 positivitet kan detekteres hos ca. 20% af patienterne ved enten IHC eller FISH (32). Prækliniske in vitro og in vivo undersøgelser har vist, at trastuzumab (Herceptin ) er effektivt i forskellige gastriske cancermodeller, hvilket således har ført til initiering af kliniske undersøgelser (32 36). I en fase III-undersøgelse BO18255, ToGA-forsøget, blev HER2-positive patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk, gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang randomiseret til at modtage 5-FU eller capecitabin og cisplatin enten alene eller i kombination med trastuzumab.. Der blev konstateret en statistisk signifikant stigning i den generelle overlevelsesfaktor (OS) hos patienter, der modtog den kombinerede behandling med trastuzumab og kemoterapi (37, 38). Trastuzumab er et humant monoklonalt antistof, der med høj affinitet binder sig til HER2 proteinet. Det er påvist, at det hæmmer proliferationen af humane tumorceller med overekspression af HER2 protein in vitro og in vivo (33 36). Egenskaber 3803 patienter er undersøgt for HER2-status med henblik på rekruttering i ToGA-undersøgelsen. I denne undersøgelse blev både HER2 proteinoverekspression ved IHC (HercepTest, Dako) og HER2-genamplifikation ved FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) målt. Der blev opnået gyldige testresultataer i 3665 prøver med enten IHC- eller FISH-tests og i 3280 prøver med begge tests. Resultaterne af ToGA-undersøgelsen viste, at 22,1% af patienterne med fremskreden gastrisk cancer var HER2-positive som fastslået enten ved IHC eller FISH i henhold til definition af ToGA HER2-udvælgelseskriterierne (38). Med hensyn til anvendelsen af HercepTest i vurderingen af patienter, for hvilke trastuzumab behandling overvejes, henvises der til indlægssedlen for Herceptin for yderligere oplysninger. Procedureprincip Gastrisk HercepTest indeholder de nødvendige reagenser til at gennemføre en to trins immun cytokemisk farvningsprocedure af rutinemæssigt behandlede, paraffinindstøbte prøver. Efter inkubation med det primære kaninantistof mod humant HER2 protein, anvender dette sæt et brugsklart Visualization Reagent baseret på dextranteknologi. Dette reagens består af både sekundære gede anti kanin immunglobulinmolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler, der er bundet til en fælles dextranpolymerbase, hvorfor der ikke er behov for sekventiel påføring af link antistof og peroxidase konjugat antistof. Visualization Reagent krydsreaktion med humane immunglobuliner og føtalt kalveserum er fjernet ved hjælp af fastfaseabsorption. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilføjede kromogen medfører dannelse af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Til vurdering af farvningerne leveres der kontrolobjektglas med tre formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farveintensiteter på 0, 1+ og 3+. Farveintensiteten af disse cellelinjer svarer til antallet af receptorer pr. celle. HercepTest, Kodenr. K5204, kan anvendes til både manuel farvning og automatisk farvning ved brug af Autostainer. ( ) P04085DK_01_K / s. 27/54

28 Gastrisk cancer Reagenser Gastrisk Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 35 analyser (35 objektglas inkuberet med primært antistof mod HER2 protein og 35 objektglas inkuberet med den tilsvarende negative kontrolreagens). Antallet af tests er baseret på brugen af 3 dråber (100 µl) pr. vævssnit fra flaskerne nr. 1, 2, 3 og 4, samt substrat chromogen opløsningen (DAB). Sættet indeholder materialer til maks. 5 individuelle farvninger. Flaske nr. Mængde 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml Beskrivelse Peroxidase Blocking Reagent: 3% hydrogenperoxid, der indeholder 15 mmol/l natriumazid (NaN 3 ). Rabbit Anti Human HER2 Protein: Affinitetsisoleret antistof klar til brug. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. Immunogen: Syntetisk C terminal fragment (intracytoplasmatisk del) af HER2 proteinet koblet til hæmocyanin fra albueskæl. Specificitet: HER2 protein. Rensningsmetode: Antistoffet er affinitetsisoleret ved hjælp af et immobiliseret HER2 proteinpeptid. Visualiseringsreagens: Dextranpolymer konjugeret med peberrodsperoxidase og affinitetsisoleret gede antikanin immunglobuliner. Leveres i Tris/HCl buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. Negativ Control Reagent: Immunglobulin fraktion af normalt kaninserum ved en ækvivalent proteinkoncentration som antistoffet til HER2 protein. Leveres i 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2, indeholder et stabiliserende protein. DAB Buffer Substrate: Substratbufferopløsning, ph 7,5, indeholdende < 0,1% hydrogenperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et antimikrobielt stof. DAB kromogen: 5% 3,3' diaminobenzidintetrahydrochlorid kromogenopløsning. Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l citratbuffer med et vaskemiddel. Wash Bbuffer (10x): Tris/HCl buffer med et rengøringsmiddel og et antimikrobielt stof. ( ) P04085DK_01_K / s. 28/54

29 Gastrisk cancer 5 objektglas Kontrolobjektglas: Hvert objektglas indeholder snit fra tre formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer fra brystkarcinomer, med forskellige niveauer af HER2 protein ekspressioner: MDA 231 (0), MDA 175 (1+) og SK BR 3 (3+). Kontrolobjektglassene er varmebehandlede, så snittene sidder bedre fast på objektglassene. Yderligere opvarmning af kontrolobjektglassene med henblik på at forbedre snittenes fastklæbning kan kompromittere resultatet af farvningen. BEMÆRK: Alle reagenser, herunder epitopgenfindingsopløsning og vaskebuffer, er sammensat specifikt til brug sammen med denne test. For at testen virker som specificeret, må der ikke foretages substitutioner, med undtagelse af vaskebufferen, hvor Dako Kodenr. S3006 kan anvendes. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Absorberende servietter Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 37 mmol/l Kontrastfarve: Hæmatoxylin, som f.eks. den vandbaserede Mayer's Hematoxylin, Dako Kodenr. S3301 (se BRUGSANVISNINGEN, A.4) Dækglas Afgrænsningspen, som f.eks. Dako Pen, Kodenr. S2002 Destilleret eller deioniseret vand (skyllevand) Tørreovn der kan holde en temperatur på 60 C eller mindre Ethanol, absolut og 95% Fugtkammer (valgfri) Lysmikroskop (4 40x objektivforstørrelse) Monteringsmedium, som f.eks. Dako Faramount, Kodenr. S3025 eller Glycergel, Kodenr. C0563. Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas, SuperFrost Plus, poly L lysin coatede objektglas, eller Dako silaniserede objektglas, Kodenr. S3003 (se Klargøring af prøver) Farveskåle eller bade Timer (i stand til 2 40 minutters intervaller) Vaskeflasker Vandbad med låg (i stand til at holde epitopgenfindingsopløsningen på C) Xylen, toluen eller xylen erstatninger Opbevaring Gastrisk Opbevares ved 2 8 C. Anvend ikke sættet efter udløbsdatoen, der er trykt på emballagens yderside. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end de, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først evalueres af brugeren (14a, 14b). Bemærk, at kontrolobjektglassene også skal opbevares ved 2 8 C. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Derfor bør der udføres positive og negative kontroller samtidigt med patientprøver. Kontakt straks Dako s tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HercepTest produktet. ( ) P04085DK_01_K / s. 29/54

30 Gastrisk cancer Klargøring af prøver Gastrisk Præparater af gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang fra biopsier, ekscisioner eller resektioner skal håndteres korrekt, så vævet bevares til immuncytokemisk farvning. Der skal anvendes standardmetoder for vævsbehandling til alle præparaterne (15). Ved test af små biopsipræparater fastslås intakt tumormorfologi og tilstedeværelsen af tilstrækkelige tumorceller for IHC evaluering. Hvis der udføres en HercepTest -analyse på et biopsipræparat, skal der analyseres flere (7-8) biopsipræparater fra forskellige regioner af tumoren for at sikre, at HER2-status bestemmes korrekt. Paraffinindstøbte snit Væv, der er paraffinindstøbt og konserveret i neutral bufferet formalin, egner sig. Præparaterne skal f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i neutral bufferet formalin. Biopsipræparaterne var fikserede i 6-8 timer i ToGA forsøget (se (37) vedrørende undersøgelsesreference). Vævsprøverne skal derefter dehydreres i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin ved højst 60 C. Korrekt fastgjorte og indstøbte vævsprøver, der udtrykker HER2 proteinet vil holde sig uendeligt inden udskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares på et køligt sted (15 25 C) (15, 16). I USA kræver Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (lov for kliniske laboratorieforbedringer af 1988) i 42 CFR (b) at Laboratoriet skal opbevare farvede præparatglas i mindst ti år fra undersøgelsesdato og vævsblokke i mindst to år fra undersøgelsesdato (16). Vævsprøverne skal skæres i snit på 4 5 µm, monteres på objektglas og lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer (eller indtil de er tørre) ved 37 C natten over eller ved 60 C i én time. FORSIGTIG: Overdreven opvarmning i mere end én time ved 60 C kan give anledning til et væsentligt fald i eller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). For at bevare antigeniciteten skal vævssnit, der er monteret på objektglas (SuperFrost Plus, poly L lysin eller silaniserede objektglas), farves inden 4 6 uger efter de er skåret, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (18). Objektgla s, der er påkrævet til HER2 proteinevaluering og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Der anbefales et minimum på 5 objektglas, 1 objektglas til svulsttilstedeværelse, 2 objektglas til HER2 proteinvurdering (1 til inkubation med flaske nr. 2 og 1 til inkubation med flaske nr. 4), samt 2 objektglas som back up. Brugen af HercepTest på afkalket væv er ikke blevet valideret og anbefales ikke. Se Dako s Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) samt reference 15 og 16 for yderligere oplysninger om klargøring af præparater. Behandling af vævsprøver før farvning Der skal anvendes en specifik epitopgenfindingsmetode, kogning i 10 mmol/l citratbuffer, for at opnå optimal analyseeffektivitet. Opløsningen til epitope retrieval leveres med HercepTest sættet. Denne metode omfatter opvarmning af vævssnit, der er monteret på objektglas som er nedsænket i 10 mmol/l citratbuffer (20) i et kalibreret vandbad, som er i stand til at holde epitopgenfindingsopløsningen på den krævede temperatur (95 99 C). Laboratorier, beliggende i større højder, skal finde den bedste metode til opretholdelse af den påkrævede vandbadstemperatur. Epitop retrieval skal udføres i vandbad. Andre opvarmningsmetoder er afprøvet og giver ikke reproducerbare resultater. Umiddelbart efter epitop retrieval påbegyndes farvningen. Afvigelser fra den beskrevne procedure kan påvirke resultaterne. ( ) P04085DK_01_K / s. 30/54

31 Forholdsregler Gastrisk 1. Anvendes til in vitro diagnostik 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, peroxidaseblokerende reagens, indeholder 3% hydrogenperoxid. Sikkerhedsdatablade kan rekvireres af uddannet personale. Gastrisk cancer 4. Flaske 6, DAB kromogen, indeholder 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid og er mærket: H350 H341 P201 P280 Farlig P308 + P313 P405 P501 Kan fremkalde kræft. Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. Indhent særlige anvisninger før brug. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. Opbevares under lås. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. Som en generel regel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se venligst sikkerhedsdatabladet (Safety Data Sheet (SDS)) for yderligere oplysninger. 5. Flaske 8, Wash Buffer (10x), indeholder 5-<10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3- diolhydrochlorid og 0.1-<0.2% 5-brom-5-nitro-1, 3-dioxan. Kan forårsage en allergisk reaktion. Wash Buffer (10x) er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 6. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3 ), et kemisk stof der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Ved bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (21, 22). 7. Flaske 2, 3 og 4 indeholder materiale af animalsk oprindelse. Som ved alle produkter, der er afledt ud fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 8. Alle kontrolglas og alle præparater både før og efter fiksering samt alt materiale, der har været i forbindelse med dem, skal håndteres som om de kunne overføre smitte, og de skal bortskaffes under overholdelse af passende forholdsregler (23). Pipetter aldrig med munden, og undgå at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenserne kommer i kontakt med følsomme områder, skylles der med rigeligt vand. 9. Minimér mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå uspecifik farvning. 10. Andre inkubationstider, temperaturer eller metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. Overdreven tørring ved 60 C i mere end én time kan give anledning til et væsentligt fald i eller tab af den specifikke membranassocierede HER2 immunreaktivitet (17). ( ) P04085DK_01_K / s. 31/54

32 Gastrisk cancer 11. Reagensernes fortynding er optimeret. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvningen. 12. Alle reagenser, herunder epitopgenfindingsopløsning og vaskebuffer, er sammensat specifikt til brug sammen med denne test. For at testen virker som specificeret, må der ikke foretages substitutioner, med undtagelse af vaskebufferen, hvor Kodenr. S3006 kan anvendes. 13. Visualiseringsreagensen og DAB chromogen kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for store mængder lys. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 14. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. Se materialesikkerhedsarket (Safety Data Sheet (SDS)) for yderligere oplysninger. 15. Paraffinrester kan føre til falsk negative resultater. 16. For at opnå nøjagtig fortolkning af HercepTest resultaterne i farvede biopsipræparater fra gastrisk adenokarcinom, herunder adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang, anbefales det at anvende en klynge med mindst 5 farvede tumorceller. En klynge med mindst 5 farvede tumorceller består af 5 forbundne, HER2-farvede tumorceller. 17. Da biopsipræparater af gastrisk cancer er heterogene, er det vigtigt at udføre IHC-testen for HER2 på flere (7-8) biopsistykker fra forskellige regioner af tumoren for at opnå et pålideligt resultat. 18. Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan resultere i tab af synlig HER2- immunreaktivitet. Hvis vævssnittet i cirklen ikke kan dækkes fuldstændigt med 3 dråber (100 µl) reagens, skal der tilsættes yderligere 3 dråber. 19. Det anbefales at teste mere end én vævsblokresektion af ventrikelcancer, når prøven udviser en høj grad af heterogenitet (41). ( ) P04085DK_01_K / s. 32/54

33 Gastrisk cancer BRUGSVEJLEDNING Gastrisk A. Klargøring af reagens Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Epitope Retrieval Solution Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) 1:10 ved brug af destilleret eller deioniseret vand til den planlagte farvningsprocedure. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér opløsningen, hvis den er uklar. A.2 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 8 (Wash Buffer 10x) 1:10 ved brug af destilleret eller deioniseret vand til vasketrinene. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér bufferen, hvis den er uklar. Destilleret eller deioniseret vand kan bruges til skylning efter peroxidaseblokeringsreagensen, substrat chromogen opløsningen og hæmatoxylin inkubationer. Alle andre skylletrin kræver brug af vaskebuffer. A.3 Substratkromogenopløsning (DAB) Nedenstående fremgangsmåde giver 1 ml substratkromogenopløsning. Hver portion på 1 ml er tilstrækkelig til ti vævssnit. Trin 1: Overfør 1 ml DAB Buffered Substrate fra flaske 5 til et testrør. Trin 2: Tilsæt en dråbe (25 30 µl) DAB Chromogen fra flaske 6. Bland og påfør på vævssnittene med en pipette. Forberedt substrat chromogen opløsning (DAB) er stabil i ca. 5 dage, når den opbevares ved 2 8 C. Opløsningen skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. BEMÆRK: Farven af DAB chromogenet i flaske 6 kan variere fra klart til let lavendel brunt. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i hendhold til vejledningen på denne indlægsseddel. Hvis der tilsættes for meget DAB Chromogen til DAB bufferet substrat, vil det medføre en forringelse af det positive signal. A.4 Kontrastfarvning Det farvede slutprodukt fra DAB farvningsreaktionen er uopløseligt i alkohol og vand. Brug en hæmatoxylin-kontrastfarve, og justér hæmatoxylinens farvningsintensitet til et lignende niveau som vist i Dakos "HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Vejledning til fortolkning af HercepTest gastrisk cancer). Hæmatoxylin, enten alkohol eller vandbaseret, som f.eks. Dako Mayer s Hematoxylin, Kodenr. S3301, kan anvendes. Efterfølg hæmatoxylin kontrastfarvningen med en grundig skylning i destilleret eller deioniseret vand, og dyp derefter objektglassene med vævsprøver i et bad bestående af 37 mmol/l salmiakspiritus (se Sektion B.2, Trin 6). Salmiakspiritus (37 mmol/l) klargøres ved at blande 2,5 ml 15 mol/l (koncentreret) ammoniumhydroxid med 1 liter destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt 37 mmol/l ammoniakvand kan opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) i en flaske med tætslutten de prop i max. 12 måneder. A.5 Monteringsmedie Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedie. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready to Use, Kodenr S3025, eller Glycergel monteringsmedium, Kodenr. C0563, anbefales til vandig montering. Glycergel skal gøres flydende ved opvarmning til ca. 40 (±5) C inden brug. ( ) P04085DK_01_K / s. 33/54

34 Gastrisk cancer B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og blive fortrolig med alle komponenterne inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal have stuetemperatur (20 25 C) ind en immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget non specifik farvning. Dæk objektglas, der er udsat for træk. Hvis der anvendes lange inkubationstider, skal vævet anbringes i et fugtigt miljø. Hvis farvningsproceduren skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i et bufferbad efter inkubation af det primære antistof (trin 3) i maks. 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at farvningsfunktionen påvirkes. Afparaffinering og rehydrering: Forud for farvning skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i absolut ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Tap overskydende væske af og placer objektglassene i 95% ethanol i 3 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i destilleret eller deioniseret vand i mindst 30 sekunder. Begynd farvningsproceduren som angivet i Sektion B.2, Trin 1, Epitopgenfinding. Xylen og alkoholopløsninger skal udskiftes efter 40 objektglas. Toluen eller xylenerstatninger, så som Histoclear, kan anvendes i stedet for xylen. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturer kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer i brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige til brug ved udvælgelse af patienter til behandling med Herceptin. B.2 Farvningsprotokol Udført ved stuetemperatur, C. Trin 1: Epitope retrieval Fyld farvningsglassene, d.v.s. Coplin glas, med den fortyndede epitopgenfindingsopløsning (se BRUGSANVISNINGEN, Sektion A.1). Anbring farvningskarrene, der indeholder epitop retrieval opløsning, i vandbad. Opvarm vandbadet og epitopgenfindingsopløsningen til C. Ved opvarmning bliver epitopgenfindingsopløsningen uklar. Dæk glassene med låg for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Dyp de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, i den forvarmede epitop retrieval opløsning i farvningskarrene. BRING VANDBADETS TEMPERATUR OG EPITOPGENFINDINGSOPLØSNINGEN TILBAGE PÅ C. Inkubér i 40 (±1) minutter ved C. Fjern hele skålen med objektglas fra vandbadet. Lad objektglassene få lov til at køle af i epitopgenfindingsopløsningen i 20 (±1) minutter ved stuetemperatur. ( ) P04085DK_01_K / s. 34/54

35 Gastrisk cancer Hæld epitopgenfindingsopløsningen ud, og skyl sektionerne i den fortyndede vaskebuffer (se BRUGSANVISNINGEN, Sektion A.2). For optimale præstationer skal sektionerne gennemblødes i vaskebuffer i 5 20 minutter efter epitopgenfinding, og inden farvning. BEMÆRK: Epitope Retrieval Solution er udelukkende beregnet til engangsbrug. Må ikke genbruges. Trin 2: Peroxidaseblokerende reagens Tap overskydende buffer af med lette slag. Brug en fnugfri klud (f.eks. Kimwipe eller gaze), og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Afmærk vævssektionen med en Dako Pen. Påfør 3 dråber (100 µl) Peroxidase Blokeringsreagens for at dække prøven. Inkubér i 5 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret eller deioniseret vand, eller vaskebuffer fra en vaskeflaske (ret ikke strålen direkte mod vævet) og læg prøven i et friskt bufferbad. Trin 3: Primært antistof eller negativt kontrolreagens Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som beskrevet tidligere. Dæk prøverne med 3 dråber (100 µl) anti HER2 protein eller negativ kontrolreagens. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med vaskebuffer fra en vaskeflaske (ret ikke strålen direkte mod vævet) og læg prøven i et friskt bufferbad. Hvis farvningsproceduren nødvendigvis skal afbrydes, kan objektglassene holdes i et bufferbad, efter Trin 3, i op til en time ved stuetemperatur (20 25 C) uden det påvirker farvningsydelsen. Trin 4: Visualiseringsreagens Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som beskrevet tidligere. Dæk prøverne med 3 dråber (100 µl) visualiseringsreagens. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl objektglassene som i trin 3. Trin 5: Substratkromogenopløsning (DAB) Tør objektglassene som beskrevet tidligere. Dæk prøverne med 3 dråber (100 µl) substrat chromogenopløsning (DAB). Inkuber i 10 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret eller ioniseret vand fra en vaskeflaske (ret ikke strålen direkte mod vævet). Affald fra substratkromogenopløsning (DAB) opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. ( ) P04085DK_01_K / s. 35/54

36 Trin 6: Kontrastfarvning (vejledningen gælder hæmatoxylin) Gastrisk cancer Nedsænk objektglassene i et hæmatoxylinbad. Inkuber i 2 5 minutter, afhængigt af styrken af den anvendte hæmatoxylin. Skyl forsigtigt i et bad med destilleret eller deioniseret vand. Sørg for at fjerne alt overskydende Hematoxylin. Valgfrit: Dyp objektglassene 10 gange i et bad med 37 mmol/l salmiakspiritus (se Sektion A.4). Skyl forsigtigt objektglassene i et bad med destilleret eller deioniseret vand i 2 5 minutter. BEMÆRK: Afhængigt af inkubationstiden og den anvendte hæmatoxylins styrke vil kontrastfarvning medføre en lyse til mørkeblå farvning af cellekernen. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. Trin 7: Montering Det anbefales at anvende et ikke vandbaseret, permanent monteringsmedie. Vandbaserede monteringsmedier kan dog også bruges. Prøver kan monteres og afdækkes med et vandigt monteringsmedie, som f.eks. DakoCytomation Faramount, Kodenr. S3025, eller Glycergel, Kodenr. C0563. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan dog falme en smule, hvis objektglassene forsynes med dækglas med et vandbaseret monteringsmedium og udsættes for kraftigt lys i over en uge. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). ( ) P04085DK_01_K / s. 36/54

37 Gastrisk cancer Kvalitetskontrol Gastrisk Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet udover de af Dako leverede kontrolobjektglas. I USA kan man rådføre sig med retningslinjerne for kvalitetskontrol fra College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry, se også CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24), og reference 25 for yderligere oplysninger. Tabel 8. Formålet med daglig kvalitetskontrol. Væv: Fikseret og behandlet som patientprøven Specifikt antistof og sekundært antistof Ikke specifikt antistof* eller buffer plus samme sekundære antistof som brugt sammen med specifikt antistof Positiv kontrol: Væv eller celler indeholdende målantigen, der skal detekteres (kan findes i patientvæv). Den ideelle kontrol er svagt positivt farvende væv, da dette er mest følsomt for antistof eller antigennedbrydning. Kontrollerer alle trin i analysen. Evaluerer reagenser og procedurer anvendt ved HER2 farvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Negativ kontrol: Væv eller celler, der forventes at være negative (kan findes i patientvæv eller positivt kontrolvæv). Påvisning af utilsigtet antistof krydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Patientvæv Påvisning af specifik farvning. Påvisning af non specifik baggrundsfarvning. Kontrolobjektglas leveret af Dako. Kontrollerer udelukkende farvningsproceduren. * Serum fra samme art som det specifikke antistof men ikke rettet mod samme målantigen. Til påvisning af uspecifik antistofbinding, f.eks. vævets binding til Fc delen af antistoffet. Kontrolobjektglas (medfølger): Hvert af de leverede kontrolobjektglas indeholder tre runde, formalinfikserede, paraffinindstøbte, humane brystkræftcellelinjer med farvningsintensiteter på 0, 1+ og 3+. For hver farvningskørsel skal der farves et kontrolobjektglas. Evalueringen af de af Dako leverede kontrolobjektglas med cellelinjer angiver farvningskørslens gyldighed. Positivt kontrolvæv: Kontrollerne skal være friske autopsi /biopsi /kirurgiske præparater, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven ( prøverne). Positivt kontrolvæv er tegn på korrekt præpareret væv og korrekte farvningsteknikker. For hvert sæt testforhold skal der medtages ét positivt kontrolvæv i hver farvningskørsel. Det positive kontrolvæv skal give en svag positiv farvning, så der kan påvises små forandringer i det primære antistofs følsomhed. Kontrolobjektglassene, der leveres sammen med dette sæt, eller præparater, der behandles anderledes end patientprøven ( prøverne), vurderer udelukkende reagenseffektiviteten og kontrollerer ikke vævspræpareringen. Som ideel positiv vævskontrol anvendes væv fra gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang, der tidligere er bestemt for 2+ overekspression af HER2-protein. BEMÆRK: Kendt positivt kontrolvæv må kun anvendes til kontrol af, om det behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Hvis det positive kontrolvæv ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. ( ) P04085DK_01_K / s. 37/54

38 Gastrisk cancer Negativt kontrolvæv: Brug negativt kontrolvæv (som vides at være negativt for HER2 protein), der er fikseret, behandlet og indstøbt på en måde, som svarer til patientprøven ( prøverne), i hver farvningskørsel for at kontrollere specificiteten af det primære antistof og få en angivelse af den specifikke baggrundsfarvning. Colon, lever og thyroidea er velegnet som negativt kontrolvæv. De mange forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, indeholder interne, negative kontrolsteder (dette skal kontrolleres af brugeren). Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige, og analysen skal køres igen. Ikke specifik negativ kontrolreagens: Brug den medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof sammen med et snit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere non specifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Inkubationsperioden for den negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. Analyseverifikation: Inden første brug af et antistof eller farvningssystem i en diagnostisk procedure, bør brugeren verificere antistoffets specificitet ved at teste det på en række af laboratoriets egne vævsprøver med kendte immuncytokemiske effektivitetskarakteristika, som repræsenterer kendt positivt og negativt væv. Se procedurerne vedr. kvalitetskontrol, som er beskrevet tidligere i dette afsnit af indlægssedlen, og kravene til kvalitetskontrol i CAP Certification Program for Immunohistochemistry og/eller CLSI (tidligere NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt antistofparti, eller når analyseparametrene ændres. Gastrisk adenokarcinom, herunder adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang, med en kendt HER2-protein-farvningsintensitet mellem 0 og 3+ og negativt væv, for eksempel fra colon, lever eller thyroidea, er egnede til kontrol af analysen. Fortolkning af farvning Gastrisk Til en bestemmelse af HER2 proteinekspression skal kun membranens farvningsintensitet og mønster sammenlignes med den skala, der ses i tabel 9. Præparaterne skal vurderes med lysmikroskop af en patalog. Et objektiv med en forstørrelse på 10x er velegnet til evaluering af den immunhistokemiske farvning og scoring. Brugen af et 5 40x forstørrelsesobjektiv er nyttig til bekræftelse af resultatet. Cytoplasmisk farvning skal altid betragtes som uspecifik farvning og skal ikke inkluderes i bestemmelsen af membranens farvningsintensitet (8). Som en hjælp til at differentiere mellem 0, 1+, 2+ og 3+ farvning henvises der til Dakos HercepTest Interpretation Manuel Gastric Cancer (Vejledning til fortolkning af Herceptest Gastrisk cancer), hvor der findes billeder af farvningsintensiteter og mønstre. Kun prøver fra patienter med gastrisk adenokarcinom, herunder adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang, bør evalueres. I tilfælde af intestinal metaplasi og gastrisk adenokarcinom i den samme prøve er det kun komponenten med gastrisk adenokarcinom, der skal evalueres. Til fortolkning af HercepTest -farvede biopsier anbefales der en klynge med mindst 5 farvede tumorceller. En klynge med mindst 5 farvede tumorceller består af 5 forbundne, HER2-farvede tumorceller. ( ) P04085DK_01_K / s. 38/54

39 Gastrisk cancer Tabel 9. Fortolkning og evaluering af HER2 immunhistokemisk farvning Farvningsgrad Kirurgisk præparat Farvningsmønster Biopsipræparat Farvningsmønster Evaluering af HER2 overekspression 0 reaktivitet eller ingen membranøs reaktivitet i < 10% af tumorcellerne reaktivitet eller ingen membranøs reaktivitet i nogen (eller < 5 i klyngen) tumorcelle Negativ 1+ Svag/næsten ingen synlig membranøs reaktivitet i 10% af tumorcellerne; cellerne er kun reaktive i en del af deres membran Tumorcelleklynge ( 5 celler) med en svag/næsten ingen synlig membranøs reaktivitet uanset procentsatsen af farvede tumorceller Negativ 2+ Svag til moderat, komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet i 10% af tumorcellerne Tumorcelleklynge ( 5 celler) med en svag til moderat, komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet uanset procentsatsen af farvede tumorceller Tvetydig 3+ Kraftig, komplet, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet i 10% af tumorcellerne Tumorcelleklynge ( 5 celler) med en kraftig, fuldstændig, basolateral eller lateral membranøs reaktivitet uanset procentsatsen af farvede tumorceller Positiv Retningslinjerne er baseret på Hofmann et al. (40). HercepTest fortolkes som negativ for overekspression af HER2 protein (0 og 1+ score), tvetydig (2+ score) og positiv (3+ score). HercepTest er ikke beregnet til at give patienten og lægen prognostiske oplysninger og er ikke vurderet med henblik på dette. For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en semikvantitativ vurdering af præparaternes farvningsintensitet for hver farvningskørsel, skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 10. ( ) P04085DK_01_K / s. 39/54

40 Gastrisk cancer Tabel 10. Rækkefølge for objektglas vurdering. Objektglassenes aflæsningsrækkefølge Begrundelse 1. Kontrolobjektglas med tre cellelinjer Tilstedeværelse af 3+ brun cellemembranfarvning (randvist) i 3+ kontrolcellelinjen SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinjen MDA 175, og ingen farvning i 0 kontrolcellelinjen MDA 231 indikerer en gyldig analyse Punktvis og diskontinuert membranfarvning er til stede i et lille til moderat antal af cellerne i den svagt positive 1+ kontrolcellelinje MDA 175. Endvidere kan der ses pletvis immunofarvning i cytoplasmaens Golgi område i denne cellelinje Tilstedeværelsen af brun farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 (negativ for HER2 proteinfarvning) angiver at der er non specifik farvning i analysen. Analyseresultaterne kan være ugyldige på grund af overfarvning 2. Objektglas med positivt kontrolvæv. Der skal ses brunfarvning af membranen. Farvning af cytoplasma og negativt væv bør ikke være mere end Objektglas med negativt kontrolvæv. MANGEL på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvid der forekommer specifik membranfarvning i objektglasset med negativt kontrolvæv, bør resultaterne for patientprøven betragtes som ugyldige 4. Objektglas med patientvæv farvet ved brug af den Reagens 5. Objektglas med patientvæv farvet ved brug af det primære antistof Fravær af specifik membranfarvning verificerer den specifikke mærkning af målantigenet med det primære antistof Anden tone eller brunfarvning, der forekommer i prøvens cytoplasma, som er behandlet med den negative kontrolreagens, som f.eks. i bindevæv, leukocytter, erythrocytter eller nekrotisk væv, bør betragtes som ikke specifik baggrundsfarvning, og bør rapporteres i dataarkets kommentarafsnit Når der findes HER2 protein overekspression i prøven, vil dette vise sig som brun randfarvning på cellemembranen på svulstceller, der er behandlet med det primære antistof 1. Kontrolobjektglas (medfølger): Det positive kontrolobjektglas med Hercep Test skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Tilstedeværelsen af brunt (3,3 diaminobenzidine, DAB) reaktionsprodukt svarende til cellemembranerne angiver, at der er positiv reaktivitet. Tilstedeværelsen af en perifer, brun cellemembranfarvning (randfarvning) i 3+ kontrolcellelinje SK BR 3, delvis brun randfarvning i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 og ingen farvning i 0 kontrolcellelinje MDA 231 angiver at analysen er gyldig. Hvis nogle af kontrolcellelinjerne falder udenfor disse kriterier skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige. 2. Positivt kontrolvæv: Det positive kontrolvæv skal undersøges derefter. Dette objektglas bekræfter at fikserings og epitope retrieval processen er effektiv. Brug intakte celler til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves non specifikt (26). Der skal ses brunfarvning af cellemembranen. Brunfarvning af cytoplasma og negativt væv inde i præparatet m ikke være mere end svarende til farveintensitetsgrad 1+. ( ) P04085DK_01_K / s. 40/54

41 Gastrisk cancer 3. Negativt kontrolvæv: Objektglasset med negativt kontrolvæv bør undersøges efter det positive kontrolvæv, for at verificere specificiteten af det primære antistofs mærkningen af mål antigenet. Mangel på specifik farvning i det negative kontrolvæv bekræfter sættets manglende antistofkrydsreaktivitet med celler/cellebestanddele. Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren. Bemærk, at en svag reaktion (0-1+ farvningsintensitet) kan forekomme i de fleste normale epitelvæv. Muligt negativt kontrolvæv inkluderer: Colon, lever og thyroidea. En eventuel non specifik farvning vil have et diffust udseende. Sporadisk farvning af bindevæv kan også ses i snit fra for kraftigt formalinfikseret væv Patientvæv: Undersøg patientpræparater der er farvet med HercepTest til sidst. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel non specifik baggrundsfarvning med den negative kontrolreagens. Som det er tilfældet med enhver immuncytokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger samt Præstationskarakteristika for specifikke oplysninger om HercepTest immunreaktivitet. Yderligere forslag til fortolkning af farvning med HercepTest Gastrisk adenokarcinom, herunder adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang, der er testet for HER2-protein-overekspression, evalueres fra 0 til 3+. Mens tilfældene med 0 og 3+ er lige til, er en lille procentdel af de resterende 1+ og 2+ præparater vanskeligere at fortolke. Følg nedenstående retningslinjer for fortolkning af farvning med HercepTest i laboratoriet. Evaluer kontrolcellelinjerne for at kontrollere analysens effektivitet. Evaluer de positive og negative kontrolobjektglas. Det anbefales at farve vævsprøverne med en hæmatoxylin eosin (H&E) farvning til første evaluering. (tumoren ses måske ikke tydeligt i præparater, der er farvet med HercepTest. Et H&E farvet objektglas er nødvendigt for at patologen kan verificere tilstedeværelsen af svulsten). HercepTest bør udføres på parvise snit (seriel snit) fra samme paraffinblok af prøven. Evaluer først snittene, der er farvet for HER2 protein overekspression, med en lille forstørrelse. De fleste positive tilfælde vil være tydelige med en lille forstørrelse. Til 1+ tilfælde anvendes en 40x objektivforstørrelse til verifikation af membranfarvning. Til 2+ tilfælde anvendes en 10 20x objektivforstørrelse til verifikation af membranfarvning. Kirurgiske prøver Der skal anvendes velbevarede og korrekt farvede områder af præparaterne til bestemmelse af procentdelen af positive tumorceller. Hvis de fleste tumorceller viser en fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning, er farvningsgraden enten 2+ eller 3+. Hvis der er fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning med en kraftig intensitet, der er lig med eller større end 10% af tumorcellerne i kirurgiske prøver, er prøvens score 3+. Hvis der er fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning med en svag til moderat intensitet, der er lig med eller større end 10% af tumorcellerne i kirurgiske prøver, er prøvens score 2+. Hvis 10% eller flere af tumorcellerne i kirurgiske prøver, der kun er farvede i en del af deres membran, har en svagt/næsten ikke synlig intensitet, er prøvens score 1+. Hvis mindre end 10% af tumorcellerne i kirurgiske prøver har en farvning, uanset farvningsmønsteret (f.eks. fuldstændig, basolateral eller lateral eller i en del af deres membran), er scoren 0. Hvis der ikke observeres farvning, er scoren for det kirurgiske præparat 0. ( ) P04085DK_01_K / s. 41/54

42 Biopsiprøver Gastrisk cancer En klynge med mindst 5 farvede tumorceller består af 5 forbundne, HER2-farvede tumorceller. Hvis der forekommer en tumorcelleklynge på mindst 5 farvede tumorceller med en kraftig, fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning, er biopsiprøvens score 3+, uanset procentsatsen af farvede tumorceller. Hvis der forekommer en tumorcelleklynge på mindst 5 farvede tumorceller med en svag til moderat, fuldstændig, basolateral eller lateral membranfarvning, er biopsiprøvens score 2+, uanset procentsatsen af farvede tumorceller. Hvis der forekommer en tumorcelleklynge med mindst 5 farvede tumorceller med en svag/næsten ikke synlig membranfarvning, og cellerne kun er farvede i en del af deres membran, er biopsiprøvens score 1+, uanset procentsatsen af farvede tumorceller. Hvis der ikke observeres farvning eller membranfarvning i færre end 5 tumorceller, er biopsiprøvens score 0. Begrænsninger Gastrisk Generelle begrænsninger 1. Immuncytokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv, fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immuncytokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, skæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof trapping eller falsk negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For meget eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske tests. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. 5. Vævsprøver fra personer, som er inficeret med hepatitis B virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non specifik farvning med peberrodsperoxidase (27). 6. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i vævstyper, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv (28). Kontakt Dakos tekniske service ved dokumenteret, uventet reaktion. 7. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C) (28). 8. Farvningen skal udføres ved stuetemperatur på C. ( ) P04085DK_01_K / s. 42/54

43 Produktspecifikke begrænsninger Gastrisk cancer 1. Antigenet i 1+ kontrolcellelinje MDA 175 nedbrydes med tiden. Bedøm resultatet for kontrolobjektglasset i henhold til dets udløbsdato. Negativ farvning af MDA 175 celler er muligvis kun et tegn på, at kontrolobjektglasset er for gammelt. Kontrolobjektglassene skal opbevares ved 2 8 C. 2. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Prøver bør farves inden for 4 6 uger efter montering af vævene på objektglas, når de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) (29). 3. For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver HER2 proteinet varmeinduceret epitop retrieval, når vævene fikseres (neutral bufferet formalin) og paraffinindstøbes rutinemæssigt. Denne forbehandling skal være afsluttet ved begyndelsen af hele farvningsprocessen. Se afsnittet Prøveforberedelse, Behandling af væv inden farvning for vejledning. 4. Varmeinduceret epitopgenfinding af HER2 protein bør kun udføres ved brug af et kalibreret vandbad. Andre opvarmningsmetoder er afprøvet og giver ikke reproducerbare resultater. 5. Udskift ikke sættets reagenser med reagenser med andre partinumre eller med reagenser fra andre producenter. Eneste undtagelse herfra er vaskebufferen, som kan erstattes med Dako vaskebuffer, Kodenr. S Der kan forekomme falsk positive resultater ved evaluering af den cytoplasmatiske farvning. Når resultaterne fortolkes, skal kun cellemembranens farvningsintensitet tages i betragtning. 7. Farvede kontrolobjektglas skal kun anvendes til kontrol af farvningskørslen og bør ikke anvendes til at bedømme farvningsreaktionen i vævssnittene. 8. Der kan undertiden ses stærkt fokaliseret farvning (3+) som for eksempel varme områder. Dette kan skyldes en ujævn fiksering og/eller behandling af vævet. Det anbefales at immunfarve en anden vævsblok fra samme vævsprøve. 9. Brug af HercepTest på præparater, der er fikseret i andre fikseringsvæsker end neutral bufferet formalin, er ikke blevet valideret. 10. Bemærk, at normalt epitelvæv fra tonsil og øsofagus kan farves med en intensitet op til grad Anvendelse af knuste prøver af gastrisk cancer og fortolkning af artefaktisk farvning omkring en biopsikant bør undgås. Præstationskarakteristika Gastrisk Baggrund Sikkerheden og effektiviteten ved trastuzumab (Herceptin ) er blevet påvist i en klinisk undersøgelse (ToGA forsøget) (38, 39). Undersøgelsen blev udformet som en open-label, randomiseret, multicenter fase III-undersøgelse af HER2-positive patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk adenokarcinom eller adenokarcinom i den gastroøsofageale overgang. I ToGA forsøget var HER2 positivitet defineret som enten værende IHC positiv (3+) (HercepTest, Dako) og/eller positiv ved HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Patienterne blev efter inklusion i undersøgelsen randomiseret til at modtage kemoterapi (5 FU eller capecitabin og cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Det primære endepunkt i undersøgelsen var generel overlevelse (OS). Der blev i alt randomiseret 594 patienter i undersøgelsen, og 584 patienter modtog medicinsk behandling og blev inkluderet i hele analysesættet (FAS). For det primære endepunkt blev det påvist, at kombinationen af kemoterapi plus trastuzumab var statistisk bedre end kemoterapi alene. Den mediane OS steg fra 11,1 til 13,8 måneder (p=0,0046) med en hazard ratio på 0,74 (95% CI: 0,60 0,91). Kaplan Meier kurverne for OS vises i Figur 1. ( ) P04085DK_01_K / s. 43/54

44 Gastrisk cancer Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 Logrank-test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (måneder) Epitopgenfindingsopløsningen Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 1. Kaplan Meier kurve for OS (n=584). Præspecificerede, eksploratoriske undergruppeanalyser af HER2-status blev udført, når dataene var til rådighed. Der blev defineret to nye HER2-undergrupper post hoc baseret på IHC-scoring: Gruppe 1 ( gruppe med lav HER2 ekspression ): IHC 0/FISH+ og IHC 1+/FISH+ (n=131) Gruppe 2 ( gruppe med høj HER2 ekspression ): IHC 2+/FISH+ og IHC 3+ (FISH+ eller FISH- eller FISH intet resultat (n=446) Da den primære analyse af OS blev gentaget post hoc for gruppen med høj HER2 ekspression (n=446), var fordelene ved den kombinerede behandling endnu større. Den mediane OS for gruppen af patienter, der havde modtaget kemoterapi plus trastuzumab, steg til 16,0 måneder sammenlignet med 11,8 måneder for patienterne på kemoterapi alene. Hazard ratio for denne analyse faldt til 0,65 (95% CI: 0,51 0,83). Kaplan Meier kurverne for OS for gruppen med høj HER2 ekspression vises i Figur 2. ( ) P04085DK_01_K / s. 44/54

45 Gastrisk cancer Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (måneder) Epitopgenfindingsopløsningen Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 2. Kaplan Meier kurve for OS for gruppen med høj HER2 ekspression (n=446). ToGA-forsøget har påvist, at kombinationen af IHC- og FISH-test er prædiktiv for virkningen af den kombinerede behandling med kemoterapi og trastuzumab. De eksploratoriske post hoc-analyser synes imidlertid at indikere, at patienter med højere niveauer af HER2-proteinekspression (IHC2+/FISH+ og IHC3+) opnår større fordel. Dette kan forklares ved, at proteinet er target for trastuzumab. For yderligere oplysninger om ToGA forsøget henvises til indlægssedlen for Herceptin. ( ) P04085DK_01_K / s. 45/54

46 Reproducerbarhed Gastrisk cancer Reproducerbarhed inden for kørsel: Reproducerbarheden inden for kørslerne blev testet i et laboratorium med 11 præparater med forskellige ICH farvningsgrader. Hvert præparat blev kørt i tre kopier. Denne protokol blev anvendt med manuel farvning. Alle præparater gav 100% reproducerbare resultater. Reproducerbarheden inden for kørslerne blev testet i et laboratorium med 3 præparater med forskellige ICH farvningsgrader. Hvert præparat blev kørt i tre kopier. Denne protokol blev anvendt med automatisk farvning. Alle præparater gav 100% reproducerbare resultater. Reproducerbarhed mellem kørsler og laboratorier: Der blev udført HercepTest analyse af 60 forskellige cancerprøver taget fra gastriske eller gastroøsofageale overgangsområder ved kirurgisk resektion og biopsi over fem ikke på hinanden følgende dage på tre forsøgssteder. De 60 præparater i forsøget var ligeligt fordelt over de tre HER2-statuskategorier. Seks patologer udførte i alt HER2-scoringer. Dag til dag-overensstemmelsen (negativ, tvetydig, positiv) varierede mellem 83,1% til 98,3%. I 47 af de 60 mulige sammenligninger var overensstemmelsen 90,0% eller derover. Tabel 11 viser specifikke eksempler på dag til dag-sammenligninger med gennemsnitlige overensstemmelser på 91,2%, 92,5% og 92,5% for de tre steder. Sted til sted-overensstemmelsen var henholdsvis 82,7%, 75,0% og 88,0% for parvis sammenligning mellem steder (se tabel 12). Ifølge Fishers eksakte test var der ingen forskel på resultaterne fra de forskellige steder. Observatør til observatør-overensstemmelsen mellem patologerne på de enkelte steder var henholdsvis 88,0%, 83,6% og 81,0% for de tre forsøgssteder (tabel 13). HercepTest analysen af gastriske cancerprøver på de tre forsøgssteder påviste således god overensstemmelse mellem forskellige dage, steder og observatører. Tabel 11. Overordnet dag til dag-overensstemmelse i procent delmængde på 12 ud af 60 sammenligninger Sted 1 Sted 2 Sted 3 Observatør 1 Observatør 2 Gennemsnitlig Overensstemmelse CI95 LL 1 Overensstemmelse CI95 LL 1 overensstemmelse Dag 1 ift. dag 2 85,0 74,4 93,3 84,9 91,2 Dag 3 ift. dag 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Dag 1 ift. dag 2 95,0 87,3 83,1 72,0 92,5 Dag 3 ift. dag 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Dag 1 ift. dag 2 90,0 80,5 91,7 82,7 92,5 Dag 3 ift. dag 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95% nederste grænse for konfidensinterval. ( ) P04085DK_01_K / s. 46/54

47 Gastrisk cancer Tabel 11. Overordnet sted til sted-overensstemmelse i procent Overensstemmelse CI95 LL 1 Gennemsnitlig overensstemmelse Sted 1 ift. sted 2 Sted 1 ift. sted 3 Sted 2 ift. sted 3 Dag 1 ift. dag 1 83,3 72,4 Dag 2 ift. dag 2 85,0 74,4 Dag 3 ift. dag 3 85,0 74,4 Dag 4 ift. dag 4 81,7 70,5 Dag 5 ift. dag 5 78,3 66,7 Dag 1 ift. dag 1 80,0 68,6 Dag 2 ift. dag 2 73,3 61,2 Dag 3 ift. dag 3 78,3 66,7 Dag 4 ift. dag 4 68,3 55,9 Dag 5 ift. dag 5 75,0 63,0 Dag 1 ift. dag 1 88,3 78,5 Dag 2 ift. dag 2 86,7 76,4 Dag 3 ift. dag 3 90,0 80,5 Dag 4 ift. dag 4 86,7 76,4 Dag 5 ift. dag 5 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 1 CI95 LL: 95% nederste grænse for konfidensinterval. Tabel 12. Observatør til observatør-overensstemmelse i procent Overensstemmelse CI 95 LL 1 Gennemsnitlig overensstemmelse Sted 1 Sted 2 Sted 3 Dag 1 91,7 82,7 Dag 2 91,7 82,7 Dag 3 93,3 84,9 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 80,0 68,6 Dag 1 86,4 76,0 Dag 2 83,3 72,4 Dag 3 83,3 72,4 Dag 4 83,3 72,4 Dag 5 81,7 70,5 Dag 1 80,0 68,6 Dag 2 78,3 66,7 Dag 3 80,0 68,6 Dag 4 78,3 66,7 Dag 5 90,0 80,5 88,0 83,6 81,0 1 CI95 LL: 95% nederste grænse for konfidensinterval. ( ) P04085DK_01_K / s. 47/54

48 Gastrisk cancer Immunreaktivitet Tabel 14 giver en oversigt over immunreaktiviteten for HercepTest med et anbefalet udvalg af normalt væv. Alle vævsprøver blev formalinfikserede, paraffinindstøbte og farvet med HercepTest i henhold til instruktionerne i indlægssedlen i pakken. Tabel 14. Sammenfatning af normal vævsreaktivitet for HercepTest. Vævstype (antal analyser) Adrenal (3) Knoglemarv (3) Hjerne/cerebellum (3) Hjerne/cerebrum (3) Bryst (3) Cervix uteri (3) Colon (3) Esophagus (3) Hjerte (3) Nyre (3) Lever (3) Lunge (3) Mesotelceller (3) Ovarie (3) Pancreas (3) Parathyreoid (3) Perifer nerve (3) Hypofyse (3) Prostata (3) Spytkirtel (3) Skeletmuskulatur (3) Hud (3) Tyndtarm (3) Milt (3) Mave (3) Testis (3) Thymus (3) Thyreoid (3) Tonsil (3) Uterus (3) Positivt farvet vævsbestanddel og farvningsmønster Mælkekirtel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet) Tubuli i nyremarv (3 af 3 væv, 1-2+ i 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Prostatakirtel/-gange (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 50 % af cellerne, cytoplasmatisk) Svedkirtler (1 af 3 væv, 1+, 30 % af cellerne, cytoplasmatisk) Søjleepitel, overflade (1 af 3 væv, 2+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Epitel (1 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 25 % af cellerne) Pladeepitel (3 af 3 væv, 1+ farvningsintensitet, 80 % af cellerne) Medmindre andet er angivet, var den rapporterede farvning i alle væv membranfarvning. Alle tre prøver af hver vævstype havde samme farvningsintensitet, med mindre andet er oplyst. ( ) P04085DK_01_K / s. 48/54

49 Gastrisk cancer Fejlfinding Gastrisk Se Fejlfindingsafsnittet i den tidligere omtalte Dako håndbog (19) vedrørende udstyrsmæssige handlinger, eller kontakt Dako s tekniske serviceafdeling for at rapportere om usædvanlig farvning. Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. farvning af objektglas. 2. Svag farvning af objektglas. 1a. Reagenserne er ikke anvendt i den korrekte rækkefølge. 1b. Natriumazid i vaskeopløsningen 1c. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre tab af synlig HER2 immunreaktivitet. 2a. Utilstrækkelig epitopgenfinding 2b. Utilstrækkelige reagensinkubationstider. 2c. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 2d. Overdreven opvarmning af monterede vævssnit forud for afparaffinering og varmeinduceret antigen retrieval kan medføre en signifikant reduktion af synlig HER2 immunreaktivitet. 2e. Utilstrækkelig reagensvolumen påført. 1a. Gennemgå tilsætningen af reagenser. 1b. Brug frisklavet vaskebuffer som leveret i sættet 1c. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 2a. Kontroller, at epitop retrieval opløsningen når op på C i 40 minutter, og at det derefter afkøles i 20 minutter. 2b. Gennemgå instruktionerne om farvningsproceduren 2c. Sørg for at patientvævet ikke er overfikseret, eller at der ikke blev anvendt et alternativt fiksativ 2d. Vævssnittene skal lufttørres ved stuetemperatur i mindst 12 timer, eller indtil de er tørre. Eller de kan tørres ved 37 C natten over eller ved 60 C i maksimalt én time. Tørring af vævssnit ved høje temperaturer må kun udføres i en kalibreret ovn med en jævn varmefordeling (17). 2e. Kontrollér den anvendte reagensvolumen. ( ) P04085DK_01_K / s. 49/54

50 Gastrisk cancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 3. For megen baggrundsfarvning af objektglas. 3a. Paraffinen er ikke helt fjernet 3b. Stivelsesadditiver anvendt ved montering af objektglas 3c. Objektglassene er ikke skyllet korrekt. 3d. Snittene er tørret ud under farvningen. 3e. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 3a. Brug friske renseopløsninger, og følg proceduren, der er beskrevet i afsnit B.1. 3b. Undlad at anvende stivelsesadditiver til at hæfte vævssnittene på objektglassene. Mange additiver er immuno reaktive 3c. Anvend frisk opløsning i bufferbade og vaskeflasker. 3d. Anvend fugtkammer. Tør kun tre til fire objektglas af ad gangen, inden der tilsættes reagens. 3e. Sørg for, at der blev anvendt en godkendt fikseringsvæske. Alternativt fiksativ kan medføre for stærk baggrundsfarvning 4. Vævet løsner sig fra objektglasset. 5. For kraftig specifik farvning 3f. Uspecifik reagensbinding til vævet. 3f. Kontroller metoden vævet blev fikseret med, og kontroller for tilstedeværelse af nekrose. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 4a. Brug silaniserede objektglas, som f.eks. Dako Silanized Slides, Kodenr. S3003, SuperFrost Plus eller poly L lysin dækkede objektglas 5a. Uegnet fikseringsmetode anvendt. 5a Sørg for at der kun bruges godkendte fiksativer og fikseringsmetoder 5b. Brug af uegnet varmekilde til epitopgenfinding, f.eks. damp, mikroovn eller autoklave 5c. For lange reagensinkubationstider. 5d. Der er anvendt en uegnet vaskeopløsning. 5b. Sørg for at der kun bruges vandbad til epitopgenfindings trinnet 5c. Gennemgå instruktionerne om farvningsproceduren 5d. Anvend kun den vaskebuffer, som anbefales til brug med sættet. ( ) P04085DK_01_K / s. 50/54

51 Gastrisk cancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 6. Svag farvning af 1+ kontrolobjektglas cellelinjen 7. Epitopgenfindingsopløsningen bliver uklar ved opvarmning 8. Epitopgenfindingsopløsningen er uklar ved opbevaring (inden opvarmning) 6a. Forkert epitopgenfindingsprotokol er blevet fulgt 6b. Fravær af reaktion med substrat chromogenopløsning (DAB) 6c. Degraderet/nedbrudt kontrolobjektglas 7. Opløsningen bliver uklar ved opvarmning 8. Opløsningen er opbevaret forkert, eller udløbsdatoen for opløsningen er passeret 6a. Neddyp objektglassene i den forvarmede epitopgenfindingsopløsning. Bring temperaturen af epitopgenfindingsopløsningen tilbage til C, og forbehandl i fulde 40 minutter 6b. Sørg for at der anvendes hele 10 minutters inkubationstid. Sørg for at der kun blev tilsat én dråbe DAB chromogen til 1 ml DAB bufferjusteret substrat 6c. Kontrollér sættets udløbsdato og sættets opbevaringsforhold, som vist uden på pakningen 7. Dette er normalt og påvirker ikke farvningen 8. Kontrollér udløbsdatoen og sættets opbevaringsbetingelser, der er trykt på pakningen. Kassér epitopgenfindingsopløsningen. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til nogen af ovennævnte årsager, eller hvis den foreslåede afhjælpning ikke løser problemet, så ring venligst til Dako s tekniske service for videre hjælp. Yderligere informationer om farvningsteknikker og klargøring af prøver, kan findes i Dako s tidligere omtalte håndbog (19) (fås hos Dako), Atlas of Immunohistology (30) og Immunoperoxidase teknikker. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04085DK_01_K / s. 51/54

52 Referencer 1. Coussens L, Yang Feng TL, Liao Y C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v erbb related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v erbb related protooncogene, c erbb 2, is distinct from the c erbb 1/epidermal growth factor receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c erb B 2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319: Schechter AL, Hung M C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229: Bargmann CI, Hung M C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor related protein. Nature 1986;319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45: Press MF, Cordon Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER 2/neu proto oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb 2 product is an atypical receptor like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an anti p185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti HER2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4: Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides, Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC 22, Atlanta, GA, April 30, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29 A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4 A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: ( ) P04085DK_01_K / s. 52/54

53 26. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER 2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press). 33. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04085DK_01_K / s. 53/54

54 Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer GHS-piktogram (se afsnittet med forholdsregler) Medicinsk produkt til in vitro diagnostik Skørt, håndteres forsigtigt Anvendes senest GHS-piktogram (se afsnittet med forholdsregler) Se brugsanvisningen Indeholder tilstrækkeligt materiale til <n> tests Producent Produceret af: Distribueret i USA af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK 2600 Glostrup Danmark Tlf Fax Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tlf. 805/ , Frikald: 800/ Bestillingsoplysninger: Tlf. 800/ Fax 805/ Teknisk afdeling: Tlf. 800/ HercepTest og Herceptin er varemærker der tilhører Genentech, Inc., og de er udviklet under licenser fra Dako Denmark A/S og F. Hoffmann La Roche Ltd. ( ) P04085DK_01_K / s. 54/54