Forskning skaber fremtidens forebyggelse og behandling af infektioner

Transkript

1 Forskning skaber fremtidens forebyggelse og behandling af infektioner Et forskningskatalog Forskning skaber fremtidens forebyggelse og behandling af infektioner Et forskningskatalog fra Infektionsmedicinsk Afdeling Q, Århus Universitetshospital, Skejby, Klinisk Institut, Aarhus Universitet, 2009 AU AARHUS UNIVERSITY

2 Introduktion Introduktion...5 Forskningsprojekter HIV HIV- snyde-virus et nyt koncept til forebyggelse af HIV-smitte...7 Peptid-HIV-1 vaccine en ny vaccinetilgang...9 HIV-1 gruppe O transmission og patogenese i humaniserede mus betydning for effektiv HIV-vaccine In vivo antigenproduktion via indkapslede celler og apatogene amøber HIV infektion og det innate immunsystem: mekanismer for viral genkendelse og aktivering af inflammation Immuncellers funktion hos HIV-smittede Innat immunaktivering og HIV patogenese, samt betydningen HIV behandling for immunaktiveringen og inflammation Effekt og sikkerhed af behandling mod HIV ved skift fra behandling med retrovir til abacavir eller tenofovir Tidlige vaskulære ændringer hos patienter inficeret med HIV-HIVASC Prævalens af medicinresistente virus hos HIV-patienter, der serokonverterede i perioden fra 2002 til Immunaktivering hos patienter samtidig smittet med HIV-1 og HIV-2 - the Co-infection and Immunology Network of West Africa (COINWA) Medicin-adherence i en vestafrikansk HIV kohorte HIV og depression HIV og adherence Populations-baseret HIV-plasma viral load og HIV transmissionsrisiko Genetiske og funktionelle ændringer i HIV1 envelope hvilken betydning har det for udviklingen af AIDS Hepatitis Undersøgelse af arvævsdannelse i leveren hos patienter med Hæmofili A eller B ved hjælp af en modificeret ultralydsundersøgelse Studie af cerebral funktion og depression hos kronisk hepatitis C virus patienter før og efter standard behandling med pegyleret interferon α-2a i kombination med ribavirin Projekt: T-celle respons efter hepatitis B vaccination Forskning skaber fremtidens forebyggelse og behandling af infektioner Infektionsmedicinsk Afdeling Q, Århus Universitetshospital, Skejby samt Klinisk Institut, Aarhus Universitet Tryk: UNI-Tryk Tuberkulose Inter-observatør variation af Bandim TB-scoren Tuberkulose kohortestudier i et høj-endemisk område Genetiske risikofaktorer for udvikling af tuberkulose Tuberkulosepatienter indlagt på Århus Universitetshospital fra 2001 til Et forskningskatalog fra Infektionsmedicinsk Afdeling Q, Århus Universitetshospital, Skejby, Klinisk Institut, Aarhus Universitet, 2009 Layout: Informationsafdelingen, Århus Universitetshospital, Skejby AS0509GS Tryksag Vacciner (HIV og HBV vacciner beskrevet under sygdommene) Øger innat immunaktivering med CPG-adjuvans den kliniske effekt af pneumokok-vaccination af HIV-smittede?

3 Indholdsfortegnelse Immunologisk respons blandt HAART og ikke-haart behandlede hiv-smittede individer efter immunisering med konjugeret pneumokokvaccine +/- CpG 7909 adjuvant Toxoplasma gondii anvendt som model til studier af beskyttende immunitet overfor kronisk intracellulære infektioner som f.eks. hepatitis B og C, HIV, tuberkulose og Leishmaniasis HIV & Rejse Chlamydia pneumoniae, malaria og plasma-cytokin respons hos børn, der vaccineres eller ikke vaccineres med DTP booster vaccine Chlamydia pneumoniae, malaria og plasma-cytokin respons hos børn, der vaccineres eller ikke vaccineres med DTP booster vaccine Akutte livstruende infektioner Cystisk fibrose Infektion med gule stafylokokker hos patienter med cystisk fibrose Seksuelt overførte infektioner Overvågning af seksuel sundhed i Danmark Udvikling og afprøvning af intervention til øget kondombrug Effekten af klamydia screening på fertiliteten hos kvinder Sent diagnosticerede HIV infektioner: Årsager og mulighed for intervention Partneropsporing ved seksuelt overførte infektioner i EU (EuroPN) Er der sammenhæng mellem klamydia strategi og komplikationer hos kvinder? Et internationalt sammenligningsstudie Infektioner og autisme Infektioner i barndommen og udvikling af autisme Infektioner i graviditeten og udvikling af autisme Udviklingsprojekter HIV case-by-case i Guinea-Bissau (CASBY) et lægeligt videreuddannelsesprojekt mellem Bandim Health Project, Bissau samt Aarhus Universitetshospital Patientuddannelse for nydiagnosticerede hiv-smittede Etablering af en web-baseret patientjournal for hepatitis B og C. InfCare Rejserelateret sundhed i den danske befolkning Personer tilknyttet afdelingens forskning og udvikling Forskergruppens publikationer gennem de seneste tre år Introduktion På såvel lands- som verdensplan udgør infektioner en væsentlig del af det samlede sygdomsbillede. Ofte bliver cancer og hjerte-karsygdomme fremhævet som de væsentligste sygdomsgrupper, men fakta er, at den største sunhedsmæssige gevinst fås ved at intervenere over for infektioner. Dette skyldes, at cancer og hjerte-karsygdomme forholdsvis oftere rammer den ældre del af befolkningen, hvorimod infektioner rammer alle aldersklasser. En indsats over for infektioner vil således på verdensplan give det største sundhedsmæssige udbytte, når der regnes i leveår (de 5 blå søjler tilsammen i figur 1). Figur 1 Mental illness...193, 278, 495 Injuries...181, 991, 119 Cardiovascular diseases...148, 190, 083 Perinatal conditions...97, 335, 086 Respiratory infections...94, 603, 349 HIV infection or AIDS...84, 457, 784 Cancer...75, 544, 632 Sensory organ diseases...69, 380, 870 Diarrheal diseases...61, 966, 183 Respiratory diseases...55, 153, 199 All other noncommunicable diseases..156, 268, 016 All other communicable diseases , 956, Disability-Adjusted Life-Years (billions) Der opstår løbende nye infektionssygdomme. Inden for de seneste årtier kan bl.a. nævnes HIV, SARS, fugleinfluenza, Lyme s sygdom og Hepatitis C, der alle har ramt forskellige dele af verden i forskellig grad. Infektionssygdomme kan også forsvinde, oftest som følge af en intensiv forskningsindsats som f.eks. vaccination mod kopper og polio, der har ført til, at disse to sygdomme stort set er udryddede. Forskning har også bidraget til udvikling af ny medicin, der har betydet at sygdomsforløbet for en række infek- Emerging and re-emerging infectious diseases: Pacific Ocean Atlantic Ocean Ebola and Crimean Congo haemorrhagic fever Influenza H5N1 Lassa fever Monkeypox Nipah Hendra Rittvalley fever New variant Creutzfeld- Jakob disease SARS coronavirus venezuelan equine encephalomyelitis Indian Ocean Yellow fever West Nile fever Cryptosporidiosis Leptospirosis Lyme borreliosis Escherichia coli 0157 Multidrug-resistant Salmonella Plague Source: WHO 4 5

4 Introduktion Forskningsprojekter > HIV tioner er væsentlig ændret. Således lever patienter med HIV i dag væsentlig længere end for blot få år siden, og der findes nu effektive behandlinger mod hepatitis B og C. Arten og antallet af infektioner i et specifikt område er afhængig af mange ydre faktorer som f.eks. befolkningstæthed, befolknings-adfærd, hygiejne og klima. Derfor forekommer infektioner med forskellig hyppighed i forskellige dele af verden. Uanset hvilke ekspertgrupper, der arbejder med at forudsige graden af global opvarmning, så antages det, at gennemsnitstemperaturen stiger mellem 2 og 5 grader i år Dette vil give et stort grundlag for at spektret af infektionssygdomme vil ændre sig. Infektionssygdomme udgør således en stor sundhedsmæssig udfordring, og med de kommende globale klimaændringer må det forventes, at udfordringerne vil blive endnu større. Der har imidlertid været talrige eksempler på, at forskning og udvikling har bidraget til at udrydde infektioner, gøre folk immune eller ændre sygdomsforløbet for de allerede smittede. Infektionsmedicinsk afdeling, Århus Universitetshospital, Skejby har som sit mål at bedre sundhedstilstanden gennem forskning i infektionssygdomme. Fokus ligger på infektioner, hvor både alvorlighedsgrad og hyppighed er vægtet og omfatter projekter vedrørende behandling og forebyggelse (vaccination) mod HIV, hepatitis, meningitis, blodforgiftning, tuberkulose og seksuelt overførte infektioner. Afdelingen råder over unikke fysiske rammer til forskning og har et ungt, men yderst kompetent og ambitiøst personale til at udføre denne forskning. Forskningsaktiviteten ved afdelingen har været stigende gennem de senere år. En vækst, som vil kunne stige i takt med øget funding. I det følgende gives en beskrivelse over den forskning, der aktuelt finder sted ved infektionsmedicinsk afdeling, og som skal bidrage til en bedre sundhed såvel nationalt som internationalt. Først følger en oversigt over de enkelte projekter (detaljerede projektbeskrivelser kan om ønsket rekvireres), her efter følger en beskrivelse af gruppen og sidst en publikationsliste. Lars Østergaard, september 2009 HIV HIV- snyde-virus et nyt koncept til forebyggelse af HIV-smitte HIV-epidemien er et af de største sundhedsmæssige problemer på verdensplan. Der har været gjort utallige forsøg på at udvikle en HIV-vaccine, men hidtil har alle tiltag været fejlslagne på grund af manglende effekt. Senest har en HIV-DNA vaccine med anvendelse af en adenovirus-5 vektor været forsøgt i et klinisk forsøg. Forsøget viste, at i gruppen der fik HIV-vaccinen var der flere, der fik HIV end i gruppen, der fik saltvand. Dette skyldtes IKKE, at vaccinen i sig selv gav HIV, men at immunsystemet blev mere modtageligt for HIV-smitte, når det blev udsat for HIV. Da stort set alle øvrige vacciner, der er under udvikling, bygger på samme koncept, er der behov for helt nye tilgangvinkler. Fra dyreforsøg vides det, at levende-svækkede HIV vacciner kan give et beskyttende immunforsvar. Men da HIV indsætter sit arvemateriale i værtscellen, vil levende-svækkede HIV-vacciner smitte den vaccinerede person. I modsætning til de effektive polio-vacciner, vil denne vaccinationsform derfor ikke være praktist muligt at anvende. Vi vil udvikle en HIV-vaccine på basis af en udviklet snyde-hiv. Retrovirale vektorer afledt fra MLV kan pseudotypes med HIV s funktionelle envelope protein, som gennem binding til CD4 receptoren og en af co-receptorerne CXCR4/CCR5 er grunden til, at HIV selektivt inficerer CD4+ celler. HIV-Env pseudotypede retrovirus imiterer en egentlig HIV-infektion, idet deres infektionsvej er den samme, afleveringen af genetisk materiale foregår via en revers transkription af viralt RNA til DNA og insertion i værtscellens genom. Snyde-HIV er således i stand til at inficere de samme celler som HIV, men giver ikke HIV. Derimod vil den udtrykke HIV-antigener (envelope) på overfladen af de inficerede celler, og disse antigener vil fungere som en vaccine. Fordelen er at HIV-antigenerne bliver præsenteret for kroppen på præcis samme måde som ved HIV, og vil derfor teoretisk set kunne give det nødvendige antistof-respons og cellulære immunitet. Herudover giver det udviklede snyde-hiv mulighed for samtidig at inficere cellen med et immun-stimulatorisk gen for at øge den immunstimulerende effekt på cellulært niveau. Vores foreløbige resultater har indikeret, at vaccinekonceptet, når det anvendes på mus, er i stand til at generere et immunrespons for såvel det cellulære immunforsvar (figur side 8 venstre side) og det humurale immunforsvar (figur side 8 højre side). Vi ønsker nu at optimere den udviklede snyde-hiv og undersøge det i aber. Global Warming Projections CCSR/NIES CCCma CSIRO Hadley Centre GFDL MPIM NCAR PCM NCAR CSM Temperature Anomaly ( C) HIV gag pol Envelope SKAU Immunogenic stimuli Envelope HIV-1 LTR ψ gag pol vif vpr vpu env nef LTR EgfpHIVMo LTR ψ egfp/neo IRES HIV-1 env ΔCT LTR 6 7

5 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV SFC 1 million cells SFC 1 million cells IFN-γ ELISPOT IFN-γ ELISPOT 400 IP IP+ IP CpG SCIP+ SC+ SC CpG CpG Neg SC+ CpG Neg 1. At vurdere graden og varigheden af CD8+ T-celle respons hos mus med anvendelse af snyde-hivvirus indeholdende forskellige immunstimulatoriske molekyler. 2. At vurdere de neutraliserende egenskaber af anti-hiv antistoffer dannet i mus samt bestemme antistofkoncentrationen på slimhinder og kvaliteten af disse afhængig af administrationsvej (subkutant, rektalt, intravaginalt og intranasalt). 3. At studere aktiveringen af det innate immunsystem med anvendelse af Toll-like receptor (TLR) agonister som adjuvans 4. At beregne et æstimat for sikkerhed af alle skridt i vaccinationsprocessen ved anvendelse af Monte Carlo simulationer i en Markov model. Valg af optimal immunstimulatorisk (adjuvans) cytokin: Vektoren vil blive modificeret til samtidigt at udtrykke enten IL-2, GM-CSF, TNF-α,IL-12 eller IL-15. Deres immunogenicitet vil blive testet med IFN-γ og Granzyme B ELISpot på splenocytter. Heruodver vil splenocytter fra vaccinerede mus blive stimuleret ex vivo med homologe epitoper og analyseret med flow cytometri mhp. at identificere hvilke lymfocyt-typer, der prolifererer. Reciprocal Endpoint Dilution Endpointer Endpointer titer, total titer, IgGtotal IgG Note: Mice where immunized twice with murine Akv vector expressing an MHC I HIV epitope (RGPRAFGVT). IP; Intraperitoneal, SC; Subcutaneous, CpG is a specibic Toll-like Receptor 9 agonist. Negative mice where injected with PBS. B) Total serum anti-hiv Envelope IgG from mice immunised with HIV mimic-virus. 1: Negative vector control. 2: HIV envelope only expressed endogenously - not on particles. 3: HIV-mimic virus. 4: HIV- mimic virus boosted with gp160. 5: gp160. 6: UV-irradiated HIV-mimic virus. Reciprocal Endpoint Dilution Administrationsvej: Vi har godtgjort, at intraperitoneal og subkutan applikation giver sammenlignelige immunrespons. Vi vil yderligere studere intra-rektal, intra-vaginal og intra-nasal applikation. Herudover vil vi udføre en detaljeret patoanatomisk og patofysiologisk analyse af slimhinder i lunge og tarm med særlig henblik på lymfocyt-populationer og antistoffer. Viral like particles: Alle forsøg vil blive udført med ikkeinficerbart snyde-hiv for at vurdere forskellen mellem snyde-hiv som infektiøs vaccine og snyde-hiv som ikke infektiøs vaccine. At udvikle en forebyggende HIV-vaccine har særdeles store perspektiver for verdenssundheden. Den beskrevne teknologi har imidlertid flere applikationsmuligheder inden for en række af områder, hvor en målrettet aflevering af gener kunne være ønskværdig. Disse områder omfatter bl.a. vaccineudvikling, genterapi ved cancersygdomme, immundefekter, mangelsygdomme etc. Martin Tolstrup Peptid-HIV-1 vaccine en ny vaccinetilgang Den optimale løsning på HIV-pandemien ville være en sikker og effektiv vaccination mod HIV. Der er voksende evidens for, at en fremtidig HIV-vaccine må stimulere både det humorale (antistoffer) og det cellemedierede immunrespons. Nye data indikerer således, at især to faktorer har en beskyttende effekt mod HIV-smitte; HIVspecifikke antistoffer i vaginalslimhinden og et HIV-specifikt proliferativt immunrespons i cirkulerende perifere blod mononukleære celler (PBMC er). I mange vaccinestudier anvendes HIV-DNA som vaccineantigen. Ofte injiceres flere DNA-plasmider; ét der koder for vaccineantigenet enten et helt gen fra HIV eller en konstrueret polyepitop og et eller flere andre plasmider, der koder for et immunstimulerende cytokin. DNA et optages af celler, som processerer det. Nogle celler binder HIV-epitoper i MHC-1 molekyler og præsenterer dem for antigenpræsenterende celler (APC er), mens andre celler secernerer immunstimulerende cytokiner. DNA er i sig selv ikke særlig immunogent, og for at sikre en effektiv aflevering af vaccineantigenerne benytter vi os af en γ-retroviral vektor, CMVbipep. På flere punkter adskiller vi os fra de oven for beskrevne DNA-vacciner: Vi vil begrænse os til at overføre genet for én enkelt HIV MHC-1 epitop til SFC / million cells CpG + Epitop CpG + Epitop/IL-2 IL-2 ELISPOT CpG + Epitop/GM-csf CpG + Epitop/IL-2/GM-csf Neg målcellerne. en herfor er en antagelse om, at processeringen af DNA et vil være mere effektiv, når kun én epitop, skal præsenteres i MHC-1 molekyle. Yderligere vil vi målrette brugen af immunstimulerende cytokiner, så netop de celler, der præsenterer vaccineantigenet for APC er, også selv tiltrækker og aktiverer APC erne via sekretion af relevante cytokiner. Vi har klonet HIV-1 epitopen RGPGRAFVT og gener for cytokinerne GM-csf og IL-2 ind i CMVbipep og vaccineret mus subkutant med vektor og adjuvanten CpG. Vi har vist, at immunresponset mod vaccineantigenet kan gøres meget mere potent, når gener for både RGPGRAFVT og GM-csf afleveres til samme celle. Vi fandt ingen yderligere effekt af at vaccinere med RGPGRAFVT og IL-2, og der var ingen synergistisk effekt mellem GM-csf og IL-2. Vi ønsker at udvikle et epitop- og cytokinbibliotek, hvor genet for en enkelt epitop fra HIV overføres til målceller, evt. i kombination med et cytokin. Målet med nærværende projekt er at foretage vaccinationsstudier i mus, hvor HIV vaccineantigener og immunstimulerende cytokiner afleveres med en γ-retroviral vektor. r Vi har udvalgt 8 MHC-1 epitoper fra forskellige HIV proteiner. Alle epitoperne har i tidligere studier givet anledning til et cellemedieret immunrespons i Balb/c SFC / million cells CpG + Epitop CpG + Epitop/IL-2 IFN-γ ELISPOT CpG + Epitop/GM-csf CpG + Epitop/IL-2/GM-csf Neg 8 9

6 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV mus. Epitoperne placeres i CMVbipep som hhv. 8 enkelt epitoper og én samlet polyepitop. Tillige indsættes gener for cytokinerne TNF-α, IL-12 og IL-15 i vektoren. Tidligere studier har vist en synergistisk effekt mellem TNF-α, IL-12 og GM-csf, mens IL-15 har vist sig at kunne forbedre den immunologiske hukommelse efter vaccinationer. Vi vil teste intramuskulær, intranasal og intrarectal aflevering af vaccinen. Intramuskulær immunisering inkluderes fordi metoden er universelt anvendt i humane vacciner. Med intranasal og intrarectal immunisering vil vi primært undersøge, om vi kan fremkalde et immunrespons på slimhinderne. Den epitop (RGPGRAFVT) som har været anvendt i pilotstudiet (resultat ovenfor) stammer fra HIV-1 Envelope og et følsomt loop (V3). Vi ønsker derfor at kunne generere potente antistoffer mod denne del af envelope. Dette vil kunne opnås ved at booste en epitop-vaccination med V3 loop peptider som vi har samarbejdsaftale om at teste gennem biotekfirmaet EnFutech. I alle vaccinationsstudier høstes milten til isolering af splenocytter, der tappes blod til oprensning af PBMC er og fra tyndtarmen oprenses mucosale lymfocytter. Cellerne bruges til nedenstående analyser, hvor de stimuleres med specifikke HIV-antigener: a) IFN-γ ELISPOT assay b) IL-2 ELISPOT assay c) Granzyme b ELISPOT assay d) Fluorescens-baseret lymfocyt proliferations assay At udvikle en forebyggende HIV-vaccine har store perspektiver for verdenssundheden. Den beskrevne teknologi har imidlertid flere applikationsmuligheder inden for en række af områder, hvor en målrettet aflevering af gener kunne være ønskværdig. Disse områder omfatter bl.a. vaccineudvikling, genterapi ved cancersygdomme, immundefekter, mangelsygdomme etc. Lars Toft HIV-1 gruppe O transmission og patogenese i humaniserede mus betydning for effektiv HIV-vaccine HIV-1 omfatter tre distinkte virus-grupper M, N og O. HIV-1 gruppe O har kun spredt sig yderst begrænset. HIV-1 gruppe O kunne derfor tænkes at være en variant, som immunsystemet bedre kan bekæmpe, og derfor ikke giver anledning til pandemi, som er tilfældet med HIV-1 gruppe M. Dette er dog ikke undersøgt tidligere. Vi har i samarbejde med Bioinformatic Research Center (BIRC) fundet, at HIV-1 gruppe O Envelope har et område i Envelope gp41 i det immunsuppressive domæne, som adskiller sig fra HIV-gruppe M primært ved 3 aminosyrepositioner. Vores hypotese er, at disse positioner er væsentlige for HIV gruppe O s forskellige patogenese i forhold til HIV-1 gruppe M. Således at Envelope fra gruppe O ikke besidder immunsvækkende egenskaber, som kendes fra gruppe M Envelope. Vi vil konstruere en funktionelt kimære HIV M/O Envelope, som primært ligner Envelope fra gruppe M, men med ændringer i de 3 aminosyrepositioner fra gruppe O og altså dermed ikke besidder de kendte immunsvækkende egenskaber. Ved brug af kimære M/O Envelope uden immunhæmmende egenskaber i vores snyde-hiv -vaccine, vil vi kunne inficere og aktiverer immunforsvaret uden en samtidig immunhæmning. Derved vil den givne vaccine medføre bedre aktivering af immunsystemet og mere effektiv beskyttelse. et er at karakterisere HIV-1 gruppe O patogenese og anvende denne viden til at fremstille en effektiv HIVvaccine baseret på en HIV-1 Envelope uden immunhæmmende egenskaber. 1. At karakterisere transmission og patogenese af HIV-1 gruppe O i humaniserede mus (BLT mus) og sammenligne med HIV-1 gruppe M. 2. At karakterisere de immunsuppresive egenskaber af HIV-1 Envelope fra HIV-1 gruppe M, gruppe O og M/O kimære Envelopes. 3. At vurdere immunologien i gut associated lymphoid tissue (GALT) hos HIV-1 gruppe O infektioner i humaniserede mus. r Immunogeniciteten af Envelope gruppe M, O og kimære M/O Envelopes in vitro: HIV-1 gruppe M, O og kimære M/O Envelopes testes i et HeLa CD4 Luciferase syncytia assay og et lymphocyt proliferations-assay. HIV-1 gruppe O transmission og patogenese vil blive studeret i humaniserede BLT mus. Forsøget vil blive udført i 10 BLT mus, som vil blive inokuleret intrarektalt eller intravaginalt med HIV-1 gruppe O-CMO2.5 virus. Systemisk infektion monitoreres med viral load (HIV-RNA) og HIV antigenæmi (capsid p24). Resultaterne vil blive sammenlignet med data for HIV-1 gruppe M infektion, transmission og patogenese i BLT mus. Projektet udføres i samarbejde med Division of Infectious Disease, University of Texas, Southwestern Medical Center (UTSW), Dallas, som har ekspertise i humaniserede BLT mus. At forstå forskellene i HIV gruppe M og O for der igennem bedre at kunne designe en vaccine som har den rette blanding af immunogenicitet og bredde. Rikke Olesen In vivo antigenproduktion via indkapslede celler og apatogene amøber For at kunne udvikle en effektiv HIV-1 vaccine, som forebygger HIV-infektion er det nødvendigt at immunsystemet giver 1) et cellulært immunrespons (CTL-respons), 2) et humoralt immunrespons (antistoffer) og 3) at antistofferne præsenteres på slimhindeoverflader. En effektiv vaccine skal kunne give et immunrespons overfor HIV s overfladeprotein, benævnt Envelope. For at opnå et immunrespons, der er beskyttende og for at tilgodese de ovenstående 3 punkter, skal Envelope-antigenet præsenteres i dets naturlige form (korrekt konfiguration). Da HIV er et retrovirus og således integrere sit DNA, kan der ikke vaccineres med levende vaccine, som det kendes fra f.eks. polio-vaccine ej heller selvom vaccinen er svækket. En løsning på dette problem kan være at fremstille uskadelige virus-lignende partikler (VLP), med HIV-envelope på overfladen. For at opnå den korrekte konformitet og korrekte præsentation over for immunsystemet, vil det være vigtigt, at VLP genereres i kroppen. Vi har over en årrække arbejdet med fi-retrovirusen, Murin leukæmi virus (MLV), og ved brug af dennes konstruktionsproteiner (Gag og Pol) er det muligt at danne MLV med HIV-1 Envelope på overfladen, såkaldt pseudotyping. Virus-lignende partikler afledt af Moloney MLV, pseudotyped med funktionel HIV-1 Env (VLPEnv) og Envelope fra Vesikulær stomatitis virus (VSV-G) (VLPVSVG/ENV) er allerede karakteriseret og kvalitetstestet ved in vitro analyser (figur 1A+B). Herudover har vi i tidligere studier, opnået gode CTL responser i mus (figur 1C) efter multi-dosisindsprøjtninger med VLP er. På baggrund af disse erfaringer forventer vi at kunne opnå et rigtig godt immunrespons gennem kontinuerlig in vivo produktion af partiklerne. At vurdere graden af humoralt respons i slimhinder og CTL-respons ved tre forskellige tilgange, der alle giver mulighed for lokal kontinuerlig præsentation af HIV-1 Envelope

7 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV En vedvarende eksponering for et HIV-1 antigen, der kan give beskyttende slimhindeantistoffer rettet mod HIV og som samtidig giver et cellulært immunrespons vil være et væsentligt skridt mod udviklingen af en effektiv HIVvaccine. Den opnåede viden, vil også kunne bruges mere generelt ved vaccine-udvikling. Tea Kirkegaard Nielsen A) C) HIV infektion og det innate immunsystem: mekanismer for viral genkendelse og aktivering af inflammation HIV er et retrovirus, som etablerer kronisk infektion karakteriseret ved destruktion af adaptiv cellemedieret immunitet og deraf følgende udvikling af AIDS. Det innate (medfødte) immunforsvars rolle under HIV infektion er kun sparsomt belyst, men meget tyder på, at innate immunologiske sygdomsmekanismer initieret tidligt under HIV infektionen er medansvarlige for etablering af den irreversible og progredierende immundefekt karakteristisk for ubehandlet sen HIV infektion. Desuden er det blevet foreslået, at den vedvarende immunstimulering induceret og vedligeholdt af pågående viral replikation (virusformering) medieres via aktivering af pattern recognition receptors (PRRs), som genkender virale strukturer (pathogen associated molecular patterns, PAMPs), og at dette er centralt i sygdomsudviklingen. et er 1) at identificere virale PAMPs og cellulære PRRs, herunder specielt Toll-like receptorer, involveret i genkendelse af HIV, 2) at beskrive mekanismer for HIV- 125 B) SFU pr 10 6 celler Figur 1, Kvalitetsanalyse af VLP ENV samt CTL-respons i immuniserede mus. VLP Env VLP Env/VS-G VLP Gp140 TRIF A) B) D) LPS LPS LPS TLR4 TRIF TRIF IRAK TRAF6 TAK1 IKKα/β NF-κΒ TLR4 TLR4 MyD88 MyD88 IRAK IRAK TRAF6 TAK1 TAK1 dnikkβ IKKα/β NF-κΒ dnikkβ dnikkβ HIV-LTR transcription (Luciferase activity) HIV LTR HIV HIV LTR Inflammatory LTR Inflammatory genes genes p/iκbα / IκBα total p/iκbα / IκBα total p/iκbα / IκBα total Time of LPS Time Time trearment of of LPS LPS trearment (min) (min) (min) HIV-LTR transcription HIV-LTR (Luciferase transcription activity) (Luciferase activity) pcdna3 C) pcdna3 pcdna3 pcdna3 dnikkβ LPS pcdna3 pcdna3 dnikkβ dnikkβ LPS LPS HIV-LTR transcription (Luciferase activity) LTR Luc LTR LTR Luc Luc HeLa (CD4+CCR5+CXCR4+) HeLa HeLa (CD4+CCR5+CXCR4+) HIV-LTR transcription HIV-LTR (Luciferase transcription activity) (Luciferase activity) Untreated Untreated Untreated HIV (zxb2) HIV HIV (zxb2) (89.6) (zxb2) HIV HIV (89.6) (89.6) A) Transduction af CD4 +, CXCR4 + celler med infektiøse VLP ENV med egfp-bærende transgen godtgør tilstedeværelsen af funktionel HIV Env trimer på overfladen af partiklerne. B) Env på overfladen af VLP er yderligere verificeret: VLP oprenset på 20% sukrose-søjle er lyseret og kørt på SDS-PAGE efterfulgt af Westernblotting med anti-gp120. 1: negative kontrol (VLP VSV-G ) 2: VLP VSV-G/Env 3: VLP Env C) Middelværdier af CTL respons i fem mus immuniserede med henholdsvis VLP ENV, VLP ENV/VSV-G og rgp140. Målt via IFN-g-ELISpot analyse af miltceller. SFU; spotforming-units. PRR-aktiveret signal-transduktion og cellulære systemer til at studere HIV replikation. (A) PRRs (her eksemplificeret ved TLR4) aktiverer en række signalveje, hvor specielt vejen til NF-κB er velbeskrevet. (B-C) HEK293 celler transfekteret med TLR4 og et HIV-LTR luciferase konstrukt blev behandlet med LPS og aktivering af NF-κB samt HIV-LTR transkription blev undersøgt. DnIKKβ hæmmer aktivering af NF-κB. (D) HeLa-celle baseret system til måling af LTR aktivering via infektiøst HIV. De viste data demonstrer, at metoden er sat op i laboratoriet, og kan benyttes til nærværende projekt

8 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV induceret cellulær signaltransduktion og aktivering af organismens innate immunrespons mod HIV infektion, samt 3) at studere betydningen af det innate immunrespons for aktivering af latent virus og HIV replikation. r Til projektet vil der blive benyttet en række molekylærbiologiske metoder, hvoraf de fleste forefindes i laboratoriet, inklusiv et klasse 3 laboratorium til håndtering af infektiøst materiale samt et HIV ambulatorium, hvorfra patientprøver i overensstemmelse med etiske retningslinjer kan indhentes. Opnåelse af en bedre forståelse af de immunologiske mekanismer involveret i kroppens tidlige såvel som sene respons på HIV infektion. Indsigt i disse mekanismer er af afgørende betydning for på længere sigt at kunne udvikle bedre og mere målrettet behandling og potentielt at kunne udvikle en vaccine med beskyttende immunitet overfor HIV infektion. Trine Mogensen Immuncellers funktion hos HIV-smittede Hiv (human immundefekt virus) er en kronisk virusinfektion karakteriseret ved faldende antal CD4+ T celler, som bl.a. er karakteriseret ved øget ekspression af CTLA-4 molekylet og aftagende produktion af signalmolekylet IL-2. Samtidig er immunsystemet konstant aktiveret dels på grund af replikation af virus og dels på grund af mikrobiel translokation over tarmslimhinden. Dette afspejles af høje koncentrationer af cirkulerende cytokiner, der er prædiktor for død hos ubehandlede hiv-smittede patienter. De seneste års fejlslagne vaccinestudier har understreget, at en bedre forståelse af immunforsvarets reaktion på hiv-infektion er påkrævet. I dette projekt vil vi fokusere på en bedre forståelse af udvikling af anergi hos NK-celler og den ændrede DC fænotype under infektion med hiv samt relatere dette til hiv progressionsmarkører. Desuden vil vi med materiale fra et igangværende pneumokok vaccine studium (ITAP) undersøge, hvordan T celle fænotype og polyfunktionalitet af T celler prædikerer respons på polysakkarid-vaccine hos hiv-smittede patienter. En undersøgelse af specifikke CD8+ T celler fra hiv-inficerede patienters tarm vil blive anvendt til studier af slimhinde-immuniteten (GALT). Fænotypisk undersøgelse af natural killer (NK) celler, CD8+ cytotoksiske T lymfocytter (CTL) og dendritiske celler (DC) i perifert blod (PBMC) hos hiv-1 smittede patienter. Funktionel undersøgelse af pluripotente T-celler efter stimulation med vaccine-antigener samt karakterisering af mucosa-immunitet i rektalbiopsier hos hiv-1 smittede patienter. r Det forventes at inkludere 75 hiv-1 smittede patienter fundet via den diagnostiske og terapeutiske kontakt i infektionsmedicinsk ambulatorium på Århus Universitetshospital Skejby. Disse skal på inklusionstidspunktet ikke modtage ART, mens 25 hiv-1 smittede patienter foreslås undersøgt før og efter påbegyndt ART. Som kontrolgruppe indgår 50 raske individer fra korpset af frivillige bloddonorer i Blodbanken, Klinisk Immunologisk Afdeling, Århus Universitetshospital, Skejby. NK-, T, B og dendritiske celle subpopulationer undersøges med flowcytometric analysis and cell sorting (FACS) for overflademarkører i relation til PD-1 ekspression på T-celler hos patienter i alle fire grupper. Til undersøgelse af pluripotente T cellers (=udtryk af >2 cytokiner) funktion og antistof respons hos hiv-smittede patienter vaccineret med pneumokovaccine indeholdende CpG adjuvant (TLR9-agonist) udføres i samarbejde med Klinisk assistent Ole Søgaard på Infektionsmedicinsk Afdeling, Århus Universitetshospital, Skejby analyser på 96 hiv-patienter, der er randomiseret til pneumokokvaccination med og uden CpG som vaccineadjuvans. Der er indsamlet, oprenset og nedfrosset PBMC til tiden 0, 3, 4, 9 og 10 måneder efter påbegyndt vaccinationsprogram i januar 2008, patientidentitet afblindes december Hovedendemålet er 2 fold AB stigning til min 5 af 7 epitoper, 6 måneder efter 2. vaccination. Flg. vil blive udført på alle ART naive patienter samt 20 tilfældigt udvalgte patienter i ART til baseline og 6 måneder efter 2. vaccination; Oprensede PBMC stimuleres med henholdsvis PAM3Cys, LPS, CpG og PHA. Cytokinresponset (TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-8, IL-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β) måles i supernatanterne via multiplex assay på Luminex platformen. Desuden opstilles en flowcytometrisk profil for pluripotent specifikt T-celle respons mod hiv-peptider. PBMC tilsættes co-stimulatoriske antistoffer CD28 og CD107a og mærkes med CD3, CD4 og CD8, permeabiliseres og mærkes intracellulært med IL-2, IFN-γ og TNF-α, MIP-1β. Ved efterfølgende flow cytometri bestemmes intracellulær cytokinekspression på CD3+, CD4+ og CD8+ gatede T celler. Desuden vil oprenset DNA blive undersøgt med real time polymerase chain reaction (PCR) af CCL3L1 gen kopier og IL-10 promoter polymorfier for at karakterisere den enkelte patients modtagelighed eller modstandsdygtighed overfor hiv-infektionen. Forekomst af pluripotente T-celler sammenlignes mellem vaccineresponders og inkomplette responders. Supernatant cytokinkoncentrationer korreleres til antallet af pluripotente T-celler. Til studier af GALT tages 12 rectumbiopsier fra 10 hiv-inficerede patienter med lavt CD4-tal (<200) hhv. 10 patienter med højt CD4-tal (>400) og fra 10 alders og køns matchede personer uden hiv-infektion tages 4 biopsier henholdsvis 10, 15 og 20 cm fra sphincter ani. Der udføres in situ bioimaging med confocal laser på Institut for Medicinsk Biokemi for at kvantitere evt. tab af celler i separationsprocessen. Biopsierne inkuberes med 0.5 mg/ml collagenase (Type II-S; Sigma) i RPMI med 5% serum pool, HEPES og pen-strep ved 37 C i 30 min. Herefter vaskes gentagne gange og lagres koldt, resterende væv behandlet med 1.0 mg/ml collagenase i yderligere 30 min. PBMC oprenses og flow cytometri udføres som tidligere beskrevet. Genekspressionsanalyse med genchip (Affymetrix) i samarbejde med Mogens Kruhöffer på Klinisk Biokemisk Afdeling. LPS-måling foretages på plasma med Limulus Amebocyte Lysate Assay (IngentaConnect, Ottawa, ON, Canada) og PCR bestemmelse af det bakterielle 16sRNA gen. Studiet vil kunne øge den nuværende viden omkring modning og funktionalitet af immunceller og hvad der forudsætter effektivt vaccine repons hos hiv-smittede patienter. Desuden vil den lokale destruktion af immunsystem i tarmen blive undersøgt på en mindre invasiv måde end hidtil, hvilket muliggør nye bedre dimensionerede studier. Matthias Zaccarin Innat immunaktivering og HIV patogenese, samt betydningen af HIV behandling for immunaktiveringen og inflammation HIV infektion resulterer i en kronisk aktivering af immunsystemet, der gradvist reducerer antallet af CD4-positive celler. Herved nedbrydes immunforsvaret og AIDS udvikles. De fleste patogenesestudier er fokuseret på det adaptive immunforsvar. Nye resultater tyder imidlertid på, at kronisk immunaktivering skyldes, at mikrobielle produkter og HIV selv kontinuerligt aktiverer et antal innate immunreceptorer på en uhensigtsmæssig måde. De innate immunreceptorer benævnes pattern recognition receptors (PRRs) og inkluderer de såkaldte Toll-Like Receptorer (TLRs), NOD-like receptorer (NLRs), and RIG-like helicaser (RLH). Receptorerne er vigtige for genkendelse af patogener og udvikling af et adækvat immunrespons til bekæmpelse af mikroorganismer. En vedvarende og kraftig stimulation af PRR kan imidlertid føre til ukontrolleret inflammation, der er skadelig for individet. Det vides ikke hvorledes den kroniske immunaktivering af det innate immunsystem reguleres under HIV-infektionen, eller hvad den kroniske immunaktivering betyder for HIV-infektionens forløb. På trods af effektiv HIV behandling har patienterne en 14 15

9 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV Infections and bacteria translocation RLHs TLRs Cellular stress IRFs MAPK NF-κB Casepase 1 Immunity NLRs Inflammation Cell death HIV drugs forøget risiko for sekundære luftvejsinfektioner. Desuden medfører HIV-medikamenterne brugt bivirkninger som reduktion i knoglemassen og forøget risiko for hjerte-kar bivirkninger. Grunden hertil kender man ikke i detaljer, dvs. samspillet mellem HIV-medikamenter, kronisk immunaktivering og generel inflammation. Dette samspil kunne meget vel have betydning for effekten af i) den medikamentelle behandling, ii) effekten af vacciner til HIV-patienterne og iii) det af behandlings bivirkningsprofilen, der er relateret til immunaktivering (f.eks. hjerte-kar bivirkningerne). Dette studie vil 1) afdække mekanismerne bag den kroniske immunstimulering ved HIV patienter med særlig fokus på innate immunstimulering gennem PRRs, 2) hvorledes HIV-behandlingen brugt i dag påvirker innate immunstimulering, samt 3) hvordan HIV-præparater kan indvirke på vaccinerespons i patienter. r En række molekylærbiologiske metoder implementeret i IL-8 (pg/ml) laboratoriet anvendes til in vitro studierne. Patientceller indsamles fra to at afdelingens kliniske studier. Et hvor forskellig HIV behandling gives og et andet hvor vacciner administreres til HIV patienter. Herudover anvendes cellelinier til detaljeret at studere aktiveringsveje, samt på hvilket cellulære niveau HIV-præparaterne indvirker. Følgende præparater indgår i undersøgelserne: Tenofovir SF (Viread), Abacavir (Ziagen), Ziduvudine (Retrovir), Lamuvidine (Epivir) and Didanosine (Videx). Dette projekt vil kunne øge forståelsen af samspillet mellem HIV og det innate immunsystem, og viden om hvorledes den anvendte HIV-behandling indvirker på immunaktivering og vaccinationer af HIV-smittede. Dette med henblik på at udvikle effektive og mindre risikofyldte, individuelle HIV-behandlingsforløb afhængigt af f.eks. patientens forløb i HIV sygdommen, risiko for sekundære infektioner og vaccinationsplaner. Jesper Melchjorsen 2000 Control 1500 LPS Control Monocyte-like cells (U937) Tenofovir SF Retrovir (AZT) In vitro systemer til studier af immunaktivering og HIV medicins immunmodulatoriske effekter. Tv, Innate stimulation via PRRs og aktivering af signalering gennem NF-kB, MAPK er, IRF er og caspase-1 fremmer immunitet, inflammation og celledød. Midt, Celler stimuleret med patogener og HIV medikamenter undersøges for udtryk af cytokiner. Th, Præliminære data viser en differentiel immun-modulatorisk effekt af HIV medikamenterne Tenofovir og Retrovir på TLR-induceret produktion af proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-8. IL-6 IL-8 IFN Effekt og sikkerhed af behandling mod HIV ved skift fra behandling med retrovir til abacavir eller tenofovir Behandling mod HIV omfatter sædvanligvis 3 stoffer med effekt på HIV. Denne behandling har over de seneste 10 år ændret udsigterne for HIV smittede og medført en markant bedring af overlevelsen og livskvaliteten. Behandlingen har løbende undergået ændringer med henblik på at øge sandsynligheden for varig effekt og simplificering af medicinindtagelsen med det formål at øge livskvaliteten og sikre daglig og regelmæssig medicinindtagelse et forhold der er afgørende for behandlingseffekten. Retrovir har igennem mange år udgjort grundstammen i HIV behandlingen. Stoffet indtages 2 gange dagligt, og man er gennem de seneste år blevet opmærksom på bivirkninger ved stoffet. Det drejer sig bl. a. om påvirkning af knoglemarven, således at der produceres færre hvide blodlegemer (lymfocytter), bl.a. T-hjælpe lymfocytter, som specielt rammes af HIV og som er helt centrale ved bekæmpelse af mikroorganismer. Et andet problem er tab af fedtlaget i underhuden, som medfører stigmatiserende ændringer af ansigtet og øget risiko for sukkersyge hos visse patienter. Nyere midler indenfor samme stofklasse som abacavir og tenofovir synes ikke at have disse bivirkninger, og i dag anvendes disse stoffer fortrinsvis. Der skal dog understreges at erfaringen med disse stoffer er ringere end retrovir. Abacavir og tenofovir har ydermere den fordel, at de kan indtages én gang om dagen. Der er dog også knyttet potentielle bivirkninger til disse stoffer; således kan abacavir hos enkelte give en særlig i nogle tilfælde svær overfølsomhedsreaktion, som kan være livstruende, såfremt patienten genudsættes for stoffet. Ud over omtalte reaktion har man i store kohorte studier mistanke om en foreløbig uafklaret forøget risiko for hjertekarstgdomme. Denne risiko hvis den er til stede lader sig ikke forklare ved de klassiske markører for hjertekarsygdomme. Tenofovir har hos enkelte patienter givet anledning til nyrepåvirkning og et beskedent tab af knoglemasse er ligeledes beskrevet. Mekanismen her er uafklaret. Nærværende forsøg er iværksat med henblik på at vurdere sikkerheden og risikoprofilen ved udskiftning af retrovir med abacavir eller tenofovir ud fra ovenstående viden. Der vil blive anvendt mere detaljerede undersøgelser af nyrefunktion, knogleomsætning, inflammations- og koagulationsmarkører samt resistensudvikling end anvendt i tidligere arbejder, og de dertil knyttede risici herunder strålingsbelastning skønnes at være beskedne. at vurdere bivirkningsprofilen ved to af de hyppigst anvendte stoffer i behandling ag HIV: abacavir og tenofovir hos patienter, der aktuelt er i behandling med retrovir. Halvfems patienter fra infektionsmedicinsk afdeling Q, Århus Universitetshospital, Skejby, der aktuelt er i retrovir-behandling randomiseres til at få udskiftet retrovir med enten abacavir eller tenofovir. Følgende forhold undersøges: 1) Påvirkning af nyrefunktion 2) Påvirkning af knoglemasse og omsætning 3) Påvirkning af underhuds fedt 4) Allergiske manifestationer 5) Ændringer i kolesterol og blodfedt 6) Måling af markører for betændelse dels generelt (CRP og IL-6) samt specifik i kar (ICAM, VCAM, E-selektin). 7) Måling af markører for koagulationsstatus (D-dimer og fibrinogen) 8) Forekomst og type af resistens mod de anvendte stoffer 9) Forskelle i indtagelse af medicin (komplians) Fordelingen af bivirkninger undersøges over 96 uger, og speficikke analyser iht. skemaet på næste side udføres

10 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV Medicinsk behandling af HIV er effektiv og resulterer i en markant overlevelse, Medicinen skal imidlertid tages vedvarende og ofte i adskillige årtier. Kendskab til effekt og bivirkningsprofiler er derfor alfa- og omega for optimal behandling af HIV-smittede. Alex L. Laursen Tidlige vaskulære ændringer hos patienter inficeret med HIV-HIVASC Det dramatiske fald i dødeligheden af AIDS som følge af nye og bedre behandlingsmuligheder har medført en stigende interesse for mulige langtidsvirkninger af både HIV infektionen i sig selv og den givne medicinske behandling (HAART). Et stort prospektivt studie har vist øget hyppighed af hjertekarsygdom hos HIV positive personer i HAART-behandling, behandling med proteaseinhibitor (PI) medfører ofte forhøjet niveau af lipider i blodet og senest Baseline uge 4 uge 8 uge 12 uge 24 uge 48 uge 96 Klinisk kontrol inkl. opgørelse af medicin og adverse events. X X X X X X X Rutineblodprøver* samt HIV-1 RNA, resistens og CD4-celletal** X X X X X X X Cystatin-C**** X X X X X X X Markører i blodet for knogleomsætning***** og tubulusfunktion**** (fastende) Markører i urin for for knogleomsætning***** og tubulusfunktion**** X X X X X X X X X X Fastelipider X X X X X Måling af faste blodsukker og serum insulin til beregning af HOMA X X X X X DEXA-scanning X X X X Lipodystrofi-spørgeskema X X X X X Antropometri og BT X X X X X ICAM, VCAM, E-selektin, højsensitiv CRP, IL-6, D-dimer, P-fibrinogen X X X X X X X er der rejst mistanke om, at behandling med visse nukleosid-analoger (NRTI) kan øge risikoen for hjertekarsygdom. Mindre tværsnitsundersøgelser har vist, at HIV infektionen både kan aktivere det vaskulære endotel og inducere ændringer i blodets koagulation, De nævnte tilstande er kendte risikofaktorer for kardiovaskulær lidelse hos ikke- HIV inficerede, hvorimod forholdene hos HIV smittede er uafklarede. At undersøge endotel aktivering, koagulationsstatus, lipidprofil, insulinfølsomhed samt tidlige tegn på atherosklerose (endotheldysfunktion) hos personer inficeret med HIV. 20 HIV positive individer undersøges før behandlingsstart samt under HAART-regimer med og uden proteaseinhibitor. Patienterne sammenlignes med 20 raske kontrolpersoner. Endothelfunktionen måles ved ultralydsskanning af arterie på underarmen, idet en nedsat dilatation af arterien efter 5 minutters okklusion med blodtryksmanchet er et udtryk for endotheldysfunktion. Ændringer i endotel aktivering, koagulationsstatus, lipidprofil og insulinfølsomhed, samt specifikke biokemiske markører for hjertekarsygdom måles ved serielle blodprøver før og under behandling. ing Påviser studiet at endothel funktion, lipidprofil eller koagulationsstatus hos HIV-smittede er ændret i en atherogen retning vil det videre perspektiv af undersøgelsen være tidlige profylaktiske tiltag eller muligvis ændrede behandlingsregimer for at reducere udviklingen af tidlig klinisk hjertekarsygdom hos denne patientgruppe. Studiet vil yderligere kunne bidrage med ny viden omkring sammenhængen mellem inflammation og atherosclerose. Hanne Arildsen Prævalens af medicinresistente virus hos HIV-patienter, der serokonverterede i perioden fra 2002 til 2007 Medicinsk behandling af HIV-1 er effektiv. En forudsætning for dette er imidlertid, at virus ikke er resistente overfor den medicinske behandling. Resistens kan imidlertid udvikles under behandling. Dette skyldes, at medicin-koncentrationen ikke er høj nok, der hvor virus befinder sig (kompartments), og at der som følge af en høj mutationsrate opstår kloner af HIV-virus (quasispecies), der tåler det pågældende HIV-præparat. Disse kan så dele sig, og en resistent population af HIV-virus er etableret. Et at de tiltag, der i klinikken bruges for at sikre behandlingseffekt og derved symptomfrihed samt begrænse resistensudvikling, er at udføre genotypiske analyser på patienters blodprøver. Analysen giver et billede af de mutationer, relateret til kendt HAART resistens, der findes i patienten. n bruges hovedsageligt i to situationer: 1) HIV-naive patienter i forbindelse med påvisningen af HIV antistoffer for at vurdere niveauet af circulerende resistens blandt smittede og med henblik på vælge den korrekte behandling, når dette bliver aktuelt. 2) Påvisning af HIV RNA under behandling og mistanke om resistensudvikling. Der er dog væsentlige tekniske begrænsninger med genotypemetoden; det kræves således, at den samlede cirkulerede virusmængde i blodet skal være moderat (viral load >1000 kopier/ml) og mutationers tilstedeværelse skal udgøre >20% af den samlet baggrundspopulation for at den kan påvises. Med andre ord, virus typer, der findes som minoritets populationer, og som vil kunne medvirke til ny resistens ved behandling start/skift bliver ikke påvist med metoden. Quasispecies med resistensmutationer kan overføres, uanset smittevejen, til både ikke-smittede og smittede HIV-patienter. Man har formodet, at disse quasispecies muterer tilbage til vildtype virus i ny smittede patienter, da medicinfrit miljø ikke selekterer for resistens. Nye resultater fra store kohorte studier har dog vist, at transmittere medicin resistente viruser (TMR) kan påvises år efter smitte og muligvis endnu længere som minoritets/ arkiverede mutationer. Dette kan give behandlingssvigt hos behandlingsnaive patienter trods normal genotypisk resistensundersøgelse. De nuværende retningslinjer anbefaler at der testes for TMR i nysmittede HIV-patienter ved brugen af genotype test. De seneste estimater af TMR viser hvor stort et problem vi muligvis står overfor. I USA ses der >20% TMR (REF), Canada er det <10% TMR (REF), Europa >10% TMR og i Danmark er den seneste estimering 5% TMR. TMR estimaterne er geografisk afhængig, hvilket blandt andet skyldes forskellige faktorer, som infektionsgraden, oplysning om resistens, vedvarende monitorering og compliance. Der er dog en vis usikkerhed forbundet til estimaternes troværdighed. Problemstillingen er derfor, at de nuværende teknikker ikke tillader en tilstrækkelig nøjagtig bestemmelse af resistens i minoritetspopulationer af HIV-virus, og som følge heraf kendes det eksakte tal for overført resistens ikke

11 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV Vi har udviklet en metode (HIV-SNaPshot). Denne metode har væsentlige fordele frem for de nuværende teknikker. Med HIV-SNaPshot metoden kan vi undersøge blodprøver med en viral load på 40 kopier/ml og vi kan detektere minoritetsmutationer med en hyppighed ned til 5-10%. n adskiller sig fra hidtidige metoder ved at 1) den kan appliceres på maskiner der i dag bruges til resistensundersøgelser (ABI sekvensmaskiner), 2) den er ikke væsentlig tidskrævende fra prøve til svar maks. 2 dage, 3) vi kan undersøge for mange mutationer samtidig, 4) er delvis uafhængig af genetiske variationer i områderne omkring esistensmutationerne og 5) Hver mutation dobbelttjekkes. At sammenligne resistensprofilen fra plasma og PBMC vurderet med HIV-SNaPshot metoden med resultaterne fra den sædvanligvis anvendte metode (Viroseq genotype) resultaterne indhentet fra resistensovervågning studiet. At vurdere hvor mange måneder efter HIV-infektion resistensmutationer kan påvises. At vurdere om genotypeundersøgelser foretaget på både plasma og hvide blodlegemer kan styrke resistenspåvisning i patienter og derved bedre behandlingsmulighederne. Indsamlede prøver fra ny-smittede danske HIV-patienter i perioden 2002 til 2007 vil blive analyseret med såvel den nuudviklede HIV-SNaPshot metode som med den nuværende anvendte metode Viroseq. Projektet vil bidrage til et bedre kendskab til udvikling og transmission af HIV-resistens, hvilket igen vil kunne bidrage til en mere optimal behandling af HIV-smittede. Projektdeltager Martin Roelsgaard Immunaktivering hos patienter samtidig smittet med HIV-1 og HIV-2 the Co-infection and Immunology Network of West Africa (COINWA) For at kunne udvikle en optimal HIV-1 vaccine og for at kunne designe de mest optimale behandlingsprojekter i tredje-verdens lande, er en yderligere forståelse af de immunologiske og behandlingsmæssige forhold hos co-inficerede patienter en nødvendighed. I Guinea Bissau findes en unik mulighed for at undersøge disse forhold nærmere. Således fandes i 1987 en HIV-2 prævalens på 9% hos voksne men på daværende tidspunkt fandtes ingen smittede med HIV-1. Gennem de seneste 20 år er befolkningen blevet smittet med både HIV-1 og HIV-2 så prævalensen nu er 5% HIV-1 og 4% HIV-2. Antiretroviral behandling (HAART) har kunnet gives siden 2007, på hvilket tidspunkt Bandim Health Project også etablerede den første HIV-kohorte i landet (WARAID). HIV kohorten indeholder i øjeblikket ca HIV patienter. 54% er i HAART-behandling, og der er en årlig mortalitet på 8%. Der tilkommer ca. 800 nye patienter til kohorten hvert år og 70% af patienterne er kvinder. Kohorten vil være udgangspunkt for en biobank med en indgående og detaljeret immunologisk karakterisering af de co-inficerede patienter som kobles til en analyse af det kliniske forløb. At sammenligne HIV-1 og HIV-2 dobbelt-inficerede med enkelt og uinficerede mht. plasma cytokin-niveauer, ex vivo cytokinproduktion, T-celle, monocyt og NK celle-fænotype og mikrobiel translokation. At vurdere incidensen af superinfektion med andet HIV eller HTLV virus og analyserer den samtidige intra-individuelle ændringer i plasma cytokin-niveauer, ex vivo cytokinproduktion, T-celle, monocyt, og NK celle fænotype samt mikrobiel translokation. At identifcere SNPs, der påvirker cytokin-responset på TLR agonister med med genchip analyse. CD4 celle tab før HAART og restituering efter HAART såvel som modtagelighed for superinfektion vil blive sammenlignet mellem genotyper for de identificerede SNPs. At beskrive forskellene i dendrit-celle funktionen og markører for immunaktiveringen hos HIV-1 versus dobbeltinficerede patienter. Undersøge den virale fitness af HIV-1 fra enkelt og dobbeltinficerede Sammenligne HIV-1/2 dobbelt-inficerede patienter i forhold til enkeltinficerede mht. antistof-respons dvs. antistof-titer, subklasser i cerviko-vaginale, gingivale og plasma kompartments. Undersøge nye Envelope-specifikke antistof-markører for virologisk kontrol og klinisk progression hos HIV-2 og HIV-1/HIV-2 co-inficerede. Korrelere HIV-1/2 Envelope patogene determinanter til CD4 celletal, sygdomsprogression og antistofrespons. Undersøge udviklingen af antistof/envelope konformitet over tid - herunder Identificere HIV-1/2 krydsneutraliserende epitoper Identificere immun-korrelater for beskyttelse mod superinfektion r Projektet er et led i et større EU-projekt. De kliniske, virologiske, genetiske og immunologiske analyser vil alle blive udført med state-of-the-art teknikker. Ledelsen af HIV-kohorten og de kliniske dataanalyse vil blive varetaget af infektionsmedicinsk afdeling. Projektet vil kunne bidrage med væsentlig ny viden i bestræbelsen for at kunne finde den optimale forebyggende HIV-vaccine samt optimere den antiretrovirale behandling i en gruppe af ko-inficerede i et tredjeverdens land. Christian Wejse Medicin-adherence i en vestafrikansk HIV kohorte I henhold til UNAIDS 2007 er der på verdensplan 33 millioner HIV-smittede, og i 2007 døde 2,1 millioner mennesker af AIDS og langt hovedparten i Afrika syd for Sahara. I en lang række afrikanske lande er der etableret behandlingsprogrammer. En effektiv behandling reducerer sygeligheden betragteligt. Dette er særlig vigtigt i et land, hvor den smittede ofte er ene-forsøger uden socialt hjælpesystem. Herudover bidrager en effektiv behandling til at reducere smitterisikoen, hvorved smittespredningen vil kunne reduceres. For at behandlingen er effektiv, og for at virus ikke udvikler resistents overfor behandlingen har adskillige undersøgelser imidlertid vist, at mindst 90 procent af doserne skal tages på de foreskrevne tidspunkter (adherence). Dette kan være en udfordring i geografiske områder, hvor sundhedsvæsenet og sygdomsopfattelsen i befolkningen adskiller sig væsentligt fra det vi kender i de udviklede lande. En karakterisering af adherence-grad og faktorer, der hindrer optimal adherence er af væsentlig betydning for succesfulde HIV-behandlingsprogrammer. At beskrive såvel kvantitativt som kvalitativt de væsentligste problemstillinger relateret til adherence i en vestafrikansk population af HIV-smittede, herunder: At vurdere adherence iht. til et modificeret ACTG Adherence Questionnaire At foretage en detaljeret beskrivelse af forhold relateret til non-adherence ved gennemførelse af semistrukturerede patientinterviews At vurdere nye redskaber til måling af adherence Projektet vil blive udført i hovedstaden Bissau i det vestafrikanske land Guinea Bissau. I relation til The Bandim Health Project ( er der siden 2006 etableret en HIV-kohorte (WARAID), der nu omfatter mere end 900 patienter ved to behandlingscentre

12 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV Der vil blive foretaget en tværsnitsundersøgelse og kvalitative interviews mhp at identificere de hyppigste og væsentligste faktorer relateret til non-adherence. Den samlede kohorte vil blive anvendt til tværsnitsundersøgelsen og på basis af denne udvælges tilfældigt 30 patienter, som har været i behandling i minimum 3 måneder til de kvalitative interviews. Følgende parameter vil blive vurderet: Patientrapporterede problemstillinger relateret til adherence. Successfulde strategier til øgning af adherence. Hyppigheden af non-adherence vurderet på basis af tablet-udlevering og tablet-optælling. Hyppigheden af udeblivelser fra kontrolbesøg. Sammenligning af Karnofsky score hos patienter, der er adherente og non-adherente Hvis HIV-behandlingsprogrammer skal fungere optimalt i tredje-verdenslande er det yderste vigtighed, at der opnås en høj adherence. Dette dels for at sikre optimal behandling af den enkelte patient og dels for at undgå udvikling af resistens, som har endnu større konsekvenser i områder, hvor kun begrænsede HIVpræparater finder anvendelse. Studiet vil også kunne Forberedelser Tilladelser Træning Forberedelser on site Field word Rekruttering Follow-up Databearbejdning Inklusion Analyser Sammenskrivning danne grundlag for undersøgelser af adherence i andre udviklingslande. Christian Wejse / Lotte Ø. Rodkjær HIV og depression At leve med hiv-sygdommen er stadig tabubelagt og stigmatiserende, hvilket gør at det for den stor del af patienterne er en svær sygdom at leve med, og medfører psykiske og sociale belastninger. Internationale undersøgelser tyder på at 20-37% af hiv patienterne har en behandlingskrævende depression, og at dette er overset i den daglige kliniske praksis. Der er ikke publiceret danske undersøgelser vedrørende forekomsten af depression ved hiv-positive. Forebyggelse af depression og/eller tidlig opsporing af depression hos hiv-positive kan forbedre denne gruppes livskvalitet og øge compliance til den medicinske behandling, hvilket forhindrer progression af sygdommen og øger den enkelte patients levetid. Year 1 Year 2 J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A S O N D et er at undersøge stabiliteten af depression hos hiv-positive over tid, kortlægge hvor stor en del af hivpatienterne, der har/har haft eller udvikler en behandlingskrævende depression og identificere prædiktorer af betydning for udvikling af en depression. 1) Kortlægge antallet af hiv-positive der har en behandlingskrævende depression, finde faktorer af betydning for udvikling af depression. 2) At beskrive mestringsstrategier hos deprimerede/ikke deprimerede hiv-positive. 3) At sammenligne karakteristika hos hiv-positive på Århus Universitetshospital, Skejby, hiv-positive på Odense Universitetshospital og hiv-positive på The Alfred Hospital i Melbourne, Australien. 4) At udvikle et konkret, empirisk baseret instrument til praktisk anvendelse som screeningsinstrument til depression. r Undersøgelsen gennemføres dels som en tværsnitsundersøgelse og som en prospektiv follow-up undersøgelse. Skejby Kohorten: 205 hiv-positive (>18 år), som deltog i en spørgeskemaundersøgelse i perioden maj - september 2005 vedr. depression. Odense Kohorten: Alle hiv-positive (>18 år) som bliver fulgt infektionsmedicinsk afdeling Odense Universitetshospital, i perioden maj september 2008, undtagen de patienter der ikke taler eller skriver dansk (ca.250). Melbourne kohorten: Kohorte på Infectious Diseases Unit, The Alfred Hospital, Melbourne, Australien (ca. 150) Den Danske HIV Kohorte (DHK) ved overlæge Niels Obel, Rigshospitalet: Der er indledt et samarbejde med DHK om udveksling af data. Ad1) Data vil blive indsamlet ved hjælp af et spørgeskema, som udfyldes af patienten. Spørgeskemaet og informeret samtykke sendes til patienten med brev og en frankeret svarkuvert. I 2005 blev spørgeskemaet udarbejdet på baggrund af fokusgruppeinterview med 12 hiv-positive. Til validering af skemaet blev der foretaget 12 pilottests inden første udsendelse i Dette skema sendes ud igen, både til hiv-positive på Århus Universitetshospital, Skejby og Odense Universitetshospital. Til undersøgelse af depression bruges Becks Depression Scale II. Hvis denne viser tegn på moderat eller svær depression, tilbydes patienten efterfølgende en samtale hos en psykiater. Der sammenlignes med Hamilton Depression Scale. Til undersøgelse af graden af adherence, og mestringsstrategier anvendes ACTG Instruments. Ad 2) Data vedrørende patienternes mestringsstrategier indhentes også ved kvalitative interviews med deprimerede/ikke-deprimerede patienter på Århus Universitetshospital, Skejby og Odense Universitetshospital. Ad 3) Sammenligne karakteristika ved hiv-positive mellem kohorten på Århus Universitetshospital, Skejby, Odense Universitets Hospital og The Alfred Hospital, Melbourne, Australien (Studieophold juli 2009). Ad 4) Data er fund under mål 1,2,3. Undersøgelsens resultater kan øge forståelse for sammenhængen mellem hiv og infektionens udvikling, livskvalitet og depression. Behandlere kan anvende denne viden til at forbedre redskaberne til at individualisere information, rådgivning og støtte til hiv-positive til at leve med en kronisk sygdom og mestre en livslang behandling. Lotte Ø. Rodkjær HIV og adherence For at opnå et effektivt behandlingsrespons på hiv-medicin er det af afgørende betydning, at denne tages regelmæssigt og dagligt på faste tidspunkter. Projektleder har i 2004 udviklet og afprøvet en metode (Adherence Journal) til start og opfølgning af antiviral behandling. et med metoden er at få afdækket de forudsætninger og vilkår, som patienten har for at håndtere kronisk sygdom og livslang behandling, således at patienten kan følge behandlingen, ikke får følgesygdomme eller udvikler resistens. Denne har vist sig som et brugbart 22 23

13 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > HIV redskab i klinisk praksis og indgår som et indsatsområde i afdeling Q s strategiarbejde. et med undersøgelsen er at hiv-patienten opnår optimal adherence for at forebygge udvikling af resistens og forværring i sygdomsprognosen, at evaluere en metode til monitorering af hiv og adherence (Adherence Journal), at identificere prædiktorer ved non-adherente hiv patienter, pilotteste et skema til vurdering af patientens parathed ved start og vurdere om patienten oplever at få den information der er behov for. Alle hiv patienter på infektionsmedicinsk afdeling Q, som starter eller skifter antiviral behandling i perioden skal have oprettet en Adherence Journal. Denne er en intervention som er bygget op omkring tre faser. Samtalerne foregår ud fra tjeklister, som er faktorer der har vist sig at have indlfydelse på adherence. Fase 1: Information vedrørende antiviral behandling. Mål: Patienten er informeret om antiviral behandling og har udtrykt sine tanker/følelser, og har haft mulighed for at stille spørgsmål. Fase 2: Start af antiviral behandling. Mål: Patienten er informeret om, hvordan behandlingen virker og om vigtigheden af at følge behandlingen korrekt. Patienten er motiveret og behandlingen er tilpasset patientens liv. Fase 3: Opfølgning. Mål: Patienten oplever vejledning og støtte i at følge den antivirale behandling. Til redegørelse af hvor mange af hiv-patienterne som får oprettet en Adherence Journal sammenlignes andelen af nyoprettede Adherence journaler med antallet af patienter som er startet eller har skiftet behandling. Til vurdering af patientens adherence opgøres antal af de patienter, som starter eller skifter behandling og opnår umåleligt viral load (< 20 kopier/ml) i løbet af 4 mdr. Data til at identificere prædiktorer ved non-adherente hiv patienter indsamles via Adherence Journalen og patientens primær journal. Kontaktsygeplejersken dokumenterer data i journalen ved samtalerne med patienten og spørger konkret til patientens vurdering af indtaget medicin. Til redegørelse for graden af adherence (ACTG Questionnaire), om patienten er parat til at starte (Medication Readiness Scale)og hvordan patienten oplever at få den kvalitet vi siger vi giver (spørgsmål i relation til målene under faserne), udfylder patienten et skema efter hver samtale i relation til de ovenfor nævnte faser i et år. Optimering af adherence medfører et bedre behandlingsrespons for hiv patienterne og dermed en bedre prognose. Resultaterne af undersøgelsen vil kunne anvendes til andre patientgrupper, og således medvirke til bedring af compliance til behandling af andre kroniske sygdomme. Lotte Ø. Rodkjær Populations-baseret HIV-plasma viral load og HIV transmissionsrisiko For at kunne foretage en så optimal rådgivning, forebyggelse og behandlingsrekomendation for HIV som muligt, er det vigtig at have kendskab til transmissionsveje og transmissionsrisici. Den seksuelle transmission i en befolkning omfatter befolkningens størrelse og viral load i befolkningen såvel som andre variable herunder seksual adfærd, antal partnere, graden af kondombrug, graden af omskæring og ulcerative seksuelle overførte infektioner. Transmission via intravenøst misbrug afhænger af viral load og brugen af kontamineret injektionsudstyr. Størrelsen af den HIV-smittede population i forskellige lande er kendte fra overvågningsdata, og vi kan æstimere viral load i denne population fra data i Eurosida-kohorten. Virus-mængden i den gruppe af HIV-smittede, der ikke er bekendte med dette kan æstimeres på basis af naturhistorien for viral-load hos ubehandlede og fordelingen af time since infection. Disse data samt tilgængelige registerdata giver mulighed for at undersøge følgende: At vurdere ændringer i populationsbaseret viral load over tid i forskellige europæiske regioner At vurdere hvilket bidrag antiretroviral behandling giver til ændringer i transmissionsrisiko i forskellige europæiske regioner At æstimere andelen af nye HIV-infektioner som følge af transmission fra personer, der var ubevidste om deres HIV-positivitet over tid i forskellige europæiske regioner At modellere betydningen af HIV-incidens, prævalens, morbiditet og mortalitet ved at påvise HIV-infektionen på et tidligere tidspunkt (et tidspunkt hvor CD-4 celletallet er højere end det niveau, hvor behandling initieres) i forskellige europæiske regioner At modellere betydningen af HIV incidenc, prævalenc, morbiditet og mortalitet ved at initiere HIV-behandling på et tidligere tidspunkt (ved højere CD4 celletalsgrænse). Fra Eurosida kohorten fås oplysninger om CD4 celletal, plasma viral load, behandlingsanamnese og andre rutinedata. Fra nationale overvågningsdata fås oplysninger om HIV incidens, prævalens, æstimeret antal personer, der ikke er bekendte med deres HIV-status, prævalensen af circumcision og prævalensen af seksuelt overførbare infektioner. Fra litteraturen opnås information om tiden siden infection hos personer, der er ubekendte med deres HIV-status, naturhistorien for viral load hos personer, der ikke får HIV-behandling, seksuel adfærd, migration in og ud af studie-områderne og transmissionsrisiko (seksuelt eller intravenøst misbrug) iht. forskellige niveauer for viral load. Den opnåede viden vil kunne bidrage væsentligt til behandlingsregimer og en bedring af folkesundheden. Herudover vil resultaterne af disse observationelle studier være vigtige for designet og planlægningen af randomiserede klinisk kontrollerede undersøgelser. Ole Søgaard Genetiske og funktionelle ændringer i HIV1 envelope hvilken betydning har det for udviklingen af AIDS Projektet udføres i samarbejde med forskere fra The Burnet Institute, Centre of Virology, HIV Molecular Pathogenesis Laboratory, Melbourne, Australien. På verdensplan er det ti forskellige HIV virusstammer der styrer HIV-epidemien. HIV virusstammen type B findes hovedsageligt i Europa, Nordamerika og Australien, og er skyld i 10% af alle infektioner på verdensplan. Virusstammen type C derimod, dækker over 50% af alle infektioner globalt, og er alene skyld i mere end 90% af smittetilfældene i Afrika og Asien. Ny forskning tyder på at specielt virusstammen type C, adskiller sig fra andre virusstammer. Den er ligeså infektiøs som virusstammen type B og viser samme karaktertræk under den akutte fase af HIVinfektionen. Alligevel er sygdomsudviklingen mod AIDS, hos individer smittet med HIV type C, mere langstrakt. I dag ved vi ikke hvorfor det er sådan, og der forelægger ikke nogen konkret viden om de mekanismer, der styrer HIV type C sygdomsudvikling. Vi ved fra mange studier foretaget på virusstammen type B at HIV-1 overflademolekylet envelope spiller en væsentlig rolle for hvor hurtig HIV infektionen udvikler sig til AIDS. Sygdomsudviklingen hos HIV-smittede afhænger i høj grad af hvordan envelope fungerer og om den kan binde sig til hjælpe-receptoren CCR5 eller CXCR4. De første mange år efter smitte, inficerer HIV hovedsageligt kun de celler der bærer CD4 og hjælpe-receptoren CCR5. Hos 40-50% af HIV-smittede med virusstammen type B, vil virussen dog med tiden udvikle sig til at bruge CXCR4. Dette skift i hjælpe-receptor valget har vist sig at være forbundet med en kraftig sygdomsforværring. Målet med det igangværende projekt er at udforske HIV envelope s egenskaber hos HIV-C smittede, før og efter de har udviklet AIDS. Vi vil arbejde på at kortlægge effekten af genetiske ændringer i envelope og undersøge 24 25

14 Forskningsprojekter > HIV Forskningsprojekter > Hepatitis hvordan de er med til at påvirker HIV-virus evne til at inficere menneskets immunceller, og derved hvor hurtig AIDS udvikles. Projektet har tre overordnet målsætninger: 1. At belyse og beskrive de mulige sygdomsfænotyper af HIV type C envelope der forekommer før og efter udviklingen af AIDS 2. At undersøge om envelope fra sygdomsfasen AIDS giver anledning til udviklingen af nye angrebsmuligheder på grundlag af ændret strukturelle egenskaber 3. At identificere mulige genetiske kendetegn ved envelope fra AIDS-fasen, der måtte forårsage mere aggressive sygdomsfænotyper. r rne vi benytter os af er udviklet af Dr. Paul Gorry, Burnet Institute, Melbourne, Australia. Patientmaterialet vi benytter os af er indsamlet gennem samarbejdet Christian Erikstrup og Henrik Ullum, ansvarlige for The Mupfure Schistosomiasis & HIV cohort study group (forkortet MUSH). Vi har på nuværende tidspunkt (januar 2009) etableret et bibliotek bestående af 400 forskellige funktionelle pseudoviruser, der alle udtrykker HIV-1 envelope genet fra forskellige patienter, inficeret med HIV-C, under forskellige tidspunkter fra deres sygdomsforløb (før-aids og AIDS). dovirusser der både kan inficere CD4+ T-celler samt CD4+ makrofager. Bioinformatik: Forskellige computeranalyser og protein/ krystal moduleringer vil blive brugt til at kortlægge genetiske ændringer i genet der koder for envelope proteinten, samt koble det til de ændret molekylære struktur og bindingsfunktionalitet af AIDS CCR5 envelope i forhold til før-aids CCR5 envelope molekyler. Følsomhed overfor neutraliserende antistoffer: Tidligere resultater har vist at visse AIDS CCR5 virusser med reduceret CD4/CCR5 afhængighed udvikler øget resistens mod de typer medicin, der hæmmer HIV s binding til immunceller. Dette falder sammen med en øget eksponering af områder i envelope, der er følsom overfor neutraliserende antistoffer. På baggrund af dette vil vi undersøge forskellige Før-AIDS CCR5 og AIDS CCR5 Envelope pseudovirussers følsomhed mod to forskellige medikamenter, kaldet Maraviroc og T-20, og sammenholde disse data med følsomheden mod forskellige kendte neutraliserende antistoffer. Hvis vi på sigt skal kunne udvikle en HIV-vaccine til områder som Afrika og Asien, er det altafgørende at vi har en grundig forståelse af blandt andet HIV type C infektionen. Vores studie vil være med til at klarlægge afgørende mekanismer, for måden hvormed HIV type C inficerer immunceller. Det vil være muligt, for os at gå ind og definerer, samt karakteriserer, de forskellige sygdomsfremkaldende fænotyper, der dannes i kroppen under udviklingen af AIDS. Denne viden vil kunne bruges til udviklingen af ny og avanceret medicin, til hæmning af HIV s binding til immuncellerne. Vores resultater vil endvidere have væsentlig betydning for den fremtidige udvikling af en HIV-vaccine rettet mod HIV-C, fordi vi med en kortlægning af envelope s struktur, vil kunne kortlægge områder der er mere modtagelige for neutraliserende antistoffer. Martin Roelsgaard Jakobsen Hepatitis Undersøgelse af arvævsdannelse i leveren hos patienter med Hæmofili A eller B ved hjælp af en modificeret ultralydsundersøgelse Inden varmebehandling af faktorpræparater blev indført i 1985 blev 1/3 af bløder-populationen smittet med leverbetændelse C (Hepatitis C). Sygdom og øget dødelighed på grund af kronisk leverbetændelse ses næsten udelukkende hos patienter, der har udviklet arvævsdannelse i leveren (skrumpelever) som følge af lang tids leverbetændelse. Flere studier har påvist skrumpelever hos op til 20 % af smittede. De bløder, som blev smittede med leverbetændelse C, har nu været smittet i mere end 20 år, og en del må forventes at have udviklet skrumpelever. I dag påvises arvæv i leveren eller skrumpelever ved udtagelse af en vævsprøve fra leveren (leverbiopsi). Dette er en invasiv undersøgelse der er forbundet med ubehag, komplikationer og i sjældne tilfælde dødsfald. Denne undersøgelse er mere risikabel hos patienter med en blødersygdom, på grund af en øget blødningsrisiko. Denne risiko kan nedsættes noget ved behandling med faktorpræparat inden vævsprøven udhentes, men på grund af den øgede risiko er dette kun foretaget hos et fåtal. I stedet kontrolleres patienterne med blodprøver og almindelig ultralydsundersøgelse for at vurdere eventuel leverskade. Disse metoders følsomhed for arvævsdannelse/ skrumpelever er imidlertid ikke så god som man kunne ønske. Et fransk firma lancerede for et par år siden en modificeret ultralydsscanner (Fibroscanner ), der i foreløbige undersøgelser har kunnet måle leverens stivhed - og dermed arvævsdannelse - med stor nøjagtighed. n bestemmer leverens elasticitet (stivhed) ved at måle udbredelses-hastigheden af en lavfrekvent trykbølge Co-receptor: Samtlige 400 pseudovirusser vil blive testet for bindingen til et panel af HIV co-receptorer (CCR5, CXCR4, CCR2b, CCR3, CCR8, Gpr1, Gpr15, Strl33 og Apj) i et luciferase-udtrykt triple-vektor system. Pseudovirusserne bliver samtidig sekventeret så vi kan koble eventuelle nukleotid ændringer og aminosyre mønstre til co-receptor valg. Bindingsstudier: Vi vil belyse bindingsaffiniteten af forskellige envelope molekylerne til CCR5 receptoren. Blandt andet vil vi teste HIV Env-pseudoviruser for, hvor gode de er til at inficere celler der udtrykker få, mellem eller mange CD4 og CCR5 receptor på celleoverfladen. Vi vil også undersøge hvor hurtig pseudovirusserne er til at inficere CD4+ celler, da det siger noget om envelope s egenskaber for både bindingen og fusion mekanismen. Derudover vil vi undersøge hvilke typer af envelope pseugennem vævet jo stivere væv jo hurtigere udbredelse. Proceduren er uden risici eller bivirkninger for patienten og kan gennemføres på 5-10 minutter hos 95%. Skrumpelever kan forudsiges med stor sikkerhed, mens de mildere grader af arvævsdannelse kan være sværere at påvise. et med undersøgelsen er at finde ud af om flere hæmofilipatienter med kronisk leverbetændelse C har øget mængde arvævsdannelse i leveren eller skrumpelever end det der idag er påvist ved blodprøver og ultralyd. Vi ønsker at skanne patienter med en blødersygdom uanset om de har en kronisk leverbetændelse eller ej, for at kunne undersøge om blødersygdommen har nogen betydning for leverstivheden. Patienter med hæmofili A eller B, som er tilknyttet et af hæmofili centrerne i Danmark vil blive tilbudt en ekstra konsultation med henblik på elastiometri måling (Fibroscanning). I forbindelse med fibroscanningen tages blodprøver og der udfyldes et skema med demografiske oplysninger, risikofaktorer som f.eks. alkohol eller stofbrug, transfusionsdata, dato for evt. HCV/ HBV/ HIV diagnose, evt. behandling +/- behandlingseffekt. Patienter med en kendt leverbetændelse, hvor der påvises høj stivhed i leveren vil blive tilbudt behandling efter afdelingens sædvanlige retningslinier. Patienter uden en kendt leverbetændelse, hvor der påvises høj stivhed i leveren, vil blive tilbudt henvisning til udredning for den øgede leverstivhed som markør for øget bindevævsdannelse. Der findes i dag effektive medicinske behandlinger mod leversygdom. En forudsætning for at give den rigtige behandling på det rigtige tidspunkter er imidlertid, at leversygdommene opdages, før der er indtruffet en uhelbredelig skade. Fibroscanning vil give mulighed for på en enkel og ikke-invasiv måde at diagnosticere flere patienter med en potentiel mulighed for behandling af leversygdom. Alex L. Laursen 26 27

15 Forskningsprojekter > Hepatitis Forskningsprojekter > Tuberkulose Studie af cerebral funktion og depression hos kronisk hepatitis C virus patienter før og efter standard behandling med pegyleret interferon α-2a i kombination med ribavirin Behandling af patienter med kronisk hepatitis C virus (HCV) med interferon-alfa og ribavirin tilstræber at eradikere virus for at forebygge udvikling af levercirrhose og hepatocellulært carcinom. Allerede i det præ-cirrotiske forløb er der hos HCV patienter påvist øget forekomst af kronisk træthed, depression, samt reduceret kognition. Udover epifænomener, herunder psykiatrisk co-morbiditet og infektionsrelateret stigmatisering, som årsag til disse manifestationer, har der været rejst mistanke om HCV, som det er tilfældet med HIV, har en direkte skadelig cerebral påvirkning. Internationalt arbejdes der i disse år ud fra den trojanske hest-hypotese i hvilken HCV bærende lymfocytter migrerer over blodhjerne-barrieren til centralnervesystemet med efterfølgende virusreplikation i hjernens makrofager/mikroglia. Denne replikation tænkes at inducere degenerative neuroimmunologiske processer med cerebral dysfunktion som følge. Hypotesen er baseret på fund af HCV RNA negative strand, et intermediært replikationsprodukt, i hjernevæv fra post mortem studier af HCV patienter. Endvidere har man ved anvendelse af MR spektroskoi til vurdering af metaboliske forhold i cerebrum påvist af abnorme forhold i den frontale hvide substans og basalganglier, der har betydning for bl.a. kognition og affektniveau. Med anvendelse af neuropsykologisk testbatteri, at undersøge om anti-virale behandling med efterfølgende viruseradiaktion, samtidig vil medføre bedring i HCV patienternes cerebrale funktion inden for specielt de kognitive- og affektive domæner. 60 ubehandlede HCV-patienter tilknyttet infektionsmedicinsk afdeling Q vil opstarte behandling for hepatitis C. I relation hertil vil der blive foretaget neuropsykologisk testing. Endvidere vil en detaljeret MR skanningsprotokol indeholdende magnetization transfer, diffusion tensor og perfusion med kontrast blive anvendt til vurdering af hjernens forhold omkring volumetri, gennemblødning og vævets struktur i relation til mulige neuropsykologiske ændringer i tilslutning til behandling. Endelig vil HCV serologisk undersøgelse, herunder virussekvens-analyser, samt cytokinprofil i serum og cerebrospinal væske indgå. Endvidere måles Neopterin og Neurofilament chain i cerebrospinalvæske som udtryk for henholdsvis neuroinflammation og neuronskade. Samlet set har projektet betydning for at vurdere hvorvidt tilstedeværelse af HCV associeret cerebral dysfunktion i sig selv kunne være indikation for at tilbyde patienterne anti-viral behandling uafhængigt af graden af leverpatologi, som idag er den primære behandlingsindikation. Projektdeltager Peter Derek Christian Leutscher Projekt: T-celle respons efter hepatitis B vaccination Hepatitis B er på verdensplan en væsentlig årsag til levercirrose og levercancer. I dag findes en sikker rekombinant hepatitis B vaccine, der hos børn og yngre voksne giver en effektiv beskyttelse hos ca. 95%. Vaccination mod hepatitis B er af væsentlig betydning for at forebygge akut og kronisk leversygdom forårsaget af hepatitis B. For at opnå klinisk effekt af vaccinen er et immunologisk T-cellerespons formentlig vigtigt. Det vides imidlertid, at evnen til at generere et T-cellerespons falder med alderen. Der kan således være en reduceret vaccine-effekt hos ældre. Det undersøges hvorvidt der er en aldersrelateret sammenhæng mellem graden af antistofrespons og T-celleaktivitet. Traditionelle T-celleproliferationstests (inkorporering af 3 H-thymidin) samt flow-baserede metoder anvendes til ekspressionsanalyse af overflademarkører samt proliferations- og cytokinanalyser. Der rekrutteres 60 raske personer, som deles i 2 grupper (<35 år og >55 år). I studiet vurderes T-cellernes proliferative potentiale hos HBV vaccinerede personer (responders og non-responders). Der fokuseres i særlig grad på lymphocytproliferation efter respons på anti-cd3 og anti-cd28 stimulation, da ekspressionen af netop disse to overflademarkører falder med alderen. Proliferation af CD4 og CD8 T celler korreleres med CD3/CD28 ekspression og HBV specifikke antistoffer med flow-cytometri. En mere indgående forståelse af det cellulære immunrespons ved hepatitis B vaccination i relation til alder, vil kunne føre til udviklingen af bedre vacciner eller vaccinationsstrategier. Carina Agerbo Rosenberg Tuberkulose Inter-observatør variation af Bandim TB-scoren Tuberkulose (TB) er en global udbredt sygdom. Det antages at 1/3 af verdensbefolkningen er latent inficeret med bakterien Mycobacterium Tuberculosis og at der årligt dør 1.7 millioner af aktiv TB. Incidensen er særligt høj i verdens fattigste områder, der grundet ressource mangel ikke har adgang til avanceret teknologi i kampen mod TB. Det planlagte projekt omhandler en nyligt udviklet TBscore, der kan anvendes til at bestemme sværhedsgraden af TB patienters sygdom. En sådan score kan få stor betydning i fattige områder, hvor avancerede diagnostiske muligheder er begrænset. En simpel score vil her være et vigtigt redskab til at tilrettelægge og følge behandlingen for den enkelte patient med baggrund i kliniske tegn for sygdommens sværhedsgrad (f.eks. hoste, brystsmerter, fund ved stetoskopi, patientens puls etc). Undersøgelse af forskellen mellem to individer, der graduerer tuberkulosepatienter efter et klinisk gradueringssystem, i en vestafrikansk population. Herunder: At måle Kappa værdi af TBscoren for patienter med aktiv tuberkulose (TB), når den bestemmes af to uafhængige observatører. At sammenligne TBscoren med Karnofsky performance score. Vores studie er follow-up studie der skal bestemme graden af variation mellem to uafhængige observatører, der begge anvender TBscoren. Dette vil bidrage afgørende mht. viden om TBscorens reproducerbarhed og dermed anvendelighed. Samtidig vil TBscoren blive sammenlignet med Karnofsky scoren, der tidligere har været anvendt til både cancer, HIV og TB patienter. Ydermere 28 29

16 Forskningsprojekter > Tuberkulose Forskningsprojekter > Tuberkulose vil vi søge at optimere TBscoren idet de parametre, der bidrager mest til variation i patientdata og dermed giver mest information om scoren identificeres. Studiet vil foregå på Bandim Health Project (www. bandim.org) i Guinea Bissau, Vestafrika. Guninea Bissau er et af verdens fattigste land og har samtidigt en af verdens højeste TB forekomster. Bandim Health Project er en danskledet forskningsinstitution med 30 års erfaring inden for infektionssygdomme og langtidskonsekvenser af forskellige sundhedsinterventioner. Basis for studierne på Bandim Health Project har i alle årene været en meget veldefineret studiepopulation på i hovedstaden Bissau, der følges epidemiologisk og demografisk. Siden 1996 har et overvågningssystem ydermere fundet alle TB patienter i området. Det forventes at der på et år kan inkluderes over 200 TB patienter. Samlet vil studiet af TBscoren få stor betydning i kampen mod TB i verdens fattigste lande, hvor enkle redskaber til anvendelse i TB behandling er stærkt nødvendige. Bandim TBscoren er hidtil den eneste og validerede kliniske skala for TB patienter og det er nødvendigt med supplerende data omkring pålideligheden af dette værktøj. En stærkere dokumentation for TBscoren kan medvirke en bedre klinisk håndtering af TB patienter især i lavindkomst-lande og føre til en fokuseret indsats på patienter i høj risiko for at dø. En styrkelse af dokumentationen kan også medføre øget brug af scoren som endpoint i kliniske forsøg og dermed åbne op for inklusion af mikroskopi negative TB patienter hvilket vil øge effektiviteten og nedbringe omkostninger af kliniske TB forsøg. Christian Wejse / Frauke Rudolf Tuberkulose kohortestudier i et høj-endemisk område Siden 1996 har vi løbende inkluderet tuberkulose (TB) patienter i Guinean Bissau i Bandim Health Project studieområdet med en befolkning på individer. Der inkluderes ca 200 TB patienter om året, foretages en grundig klinisk undersøgelse, tages blodprøver og patienterne følges klinisk i de 6 mdr behandlingen står på samt løbende for mortalitet via projektets database over alle i studieområdet. Indenfor disse rammer foretages en række studier af risikofaktorer for TB At beskrive ændring i TB incidens over tid i takt med HIV-1 prævalensen i området vokser. At beskrive prævalensen af Hepatitis C i TB patienter og raske kontroller. At kortlægge betydningen af Mannan Bindende Lectin niveauer i plasma hos TB patienter og raske kontroller. At dokumentere hyppigheden af co-infektion med HTLV-1 retrovirus i TB kohorten og relatere dette til kliniske symptomer og overlevelse At undersøge betydningen af Vitamin D receptor polymorfier for det kliniske udkomme af TB infektionen At beskrive effekten af forsinkelse af TB diagnosen der ofte stilles 3-12 måneder efter symptomstart Ovenstående studier kan gennemføres med allerede indsamlede data og blodprøver, nogle af analyserne foreligger og skal bearbejdes yderligere. TB patient kohorten består aktuelt af 1100 TB patienter med kliniske data og 700 blodprøver. 900 raske kontroller er inkluderede i tidligere studier og har fået foretaget blodprøver der ligesom TB patienternes prøver opbevares i en biobank i infektionsmedicinsk forskningsafsnit. Der er etisk tilladelse til anvendelse af dette materiale til andre studier end de studier til hvilke data og prøvemateriale i sin tid blev indsamlet. Der inkluderes fortsat patienter og indsamles kontinuerligt datamateriale finansieret af EU til studier der skal facilitere kapacitetsopbygning af Bandim Health Project mhp senere TB vaccine trials af SSI s vaccine kandindat, en adjuvant TB subunit vaccine (Ag85B-ESAT-6 + IC31) i samarbejde med Peter Andersen og Mark Doherty, SSI. Disse studier vil medføre opbygning af kapaciteten til fremtidige vaccinestudier med GCP standard. De vil desuden medvirke til at kortlægge hvilke forhold der har betydning for dårligt udkomme af TB infektion i et af verdens fattigste lande. Christian Wejse Genetiske risikofaktorer for udvikling af tuberkulose Tuberkulose (TB) udgør et stort sundhedsproblem globalt, TB er den hyppigste årsag til død forårsaget af en infektionssygdom der kan helbredes og forårsager 25% af de dødsfald i verden der potentielt kunne undgås. Selv om sygdommen forårsager høj sygelighed og dødelighed, så er det faktisk kun omkring 10% af de der inficeres med bakterien M.tuberculosis der bliver syge med aktiv TB. I dag har man ingen metoder der kan udpege de 10% der progredierer til aktiv smitsom TB fra de 90% som undertrykker TB og bevarer den som latent infektion hele livet. Der er en hel del viden fra muse modeller og tvillingestudier samt store befolkningsundersøgelser der tyder på at progression til aktiv TB influeres af genetiske faktorer. Vi har deltaget i opbygning af et multi-etnisk ressource af individer med TB sammenholdt med raske personer fra samme områder i USA, Argentina og Vestafrika og har foretaget associations undersøgelser af forskellige kandidatgener. Det er især gener af betydning for genkendelse af patogener samt innat immun-signalering (TLR2, TLR4, TLR9, PTX3, CD209) der har vist sig interessante. Vi vil nu gerne undersøge også sjældnere forekommende gen-varianter da sjældne mutationer i IL-2 og INF-G systemet har vist sig at medføre direkte nedarvet stor risiko for mykobakteriel sygdom. Vi vil derfor øge den eksisterende kohorte og foretage supplerende undersøgelse af kandidatgener med mulig TB risiko. 1. Indsamling af DNA fra yderligere 1000 TB patienter og 1000 raske med latent TB infektion 2. Identifikation af nye gener der medfører øget mod tagelighed for TB, primært gener involveret i patogen genkendelse og intracellulær respons på MTB infektion vil blive undersøgt. 3. Identifikation af både sjældne og hyppige funktionelle varianter associeret med udvikling af TB ved sekventering af gener i cases og kontroller. 4. Undersøgelse af effekter af TB-associerede varianter i multi-lokus modeller og evaluering af indflydelsen af disse varianter på det kliniske udkomme. Dette projekt er et samarbejde mellem Dr. William Scott, the Miami Institute for Human Genomics (MIHG), University of Miami, Dr. Carol Dukes Hamilton, Family Health International, North Carolina, Dr. Martin Stryjewski, CEMIC F.J. Muñiz Hospital, Argentina, Dr William Scott, Vanderbilt, Nashville and Giorgio Sirugo, Intitute of Human Genetics, Hospital San Piedro, Rom. De eksisterende kohorter vil blive udbygget og samlet, DNA vil blive ekstraheret lokalt og sendt til Miami. De genetiske analyser af polymorfier og genome wide scan vil primært foregå i Miami samt i Rom. Dataanalyser i form af haplotype analyse med Powermarker og multilocus interaktions-analyse med Multifactor Dimensionality Reduction vil blive foretaget på Vanderbilt. Studiet vil øge den eksisterende viden om TB epidemiologi og afklare genetiske risikofaktorers betydning for TB infektion. På sigt vil en øget forståelse af genetiske determinanters betydning for infektion kunne føre til forebyggelse og behandling af infektionssygdomme så som TB. Christian Wejse 30 31

17 Forskningsprojekter > Tuberkulose Forskningsprojekter > Tuberkulose Tuberkulosepatienter indlagt på Århus Universitetshospital fra 2001 til 2007 Incidensen af Tuberkulose (TB) i Danmark har gennem de seneste årtier været stigende med et lille foreløbigt fald fra 2001 [Fig. 1] pga. strammere indvandrelovgivning. Immigranter fra høj-endemiske lande har siden begyndelsen af 1990-erne udgjort og udgør stadig størstedelen af vores TB tilfælde. Øget rejseaktivitet til lande med stor forekomst af TB og boligkoncentrationsdannelse af visse etniske grupper var med til at øge antallet af TB tilfælde fra midtfirserne. Studier har vist, at majoriteten af TB patienter kommer fra Afrika, hvor den største gruppe er repræsenteret af Somaliere. Andre etniske grupper, så som grønlændere, er også en udfordring for det danske sundhedsvæsen. I Grønland er en ud af ti inficeret med TB. Radikal livsstilsændring, som alkoholisme, er I nogle tilfælde resultatet af udvandring til Danmark. Tuberkulosepatienter med misbrugsproblemer er en udfordring for klinikeren pga. den lange behandlingsperiode for TB, hvilket ofte fører til compliance-problemer. Fig. 1. TB tilfælde i Danmark A nt al 1976 Total Danskere Indvandrere I Danmark diagnosticeres og behandles TB af tre forskellige interne medicinske specialer. Afdelinger for lungemedicin behandler de fleste tilfælde af TB i Danmark og de udfører den efterfølgende miljøopsporing som et led i at finde indekstilfældet og sekundært smittede. Miljøopsporing er vigtig for at opretholde, at Danmark forbliver et lav-endemisk land. Specialister på Infektionsmedicinske afdelinger behandler primært ekstra-pulmonal tuberkulose(ekstra-tb) og TB patienter generelt med HIV- co-infektion. På børneafdelingerne diagnosticeres og initieres behandling af TB patienter yngre end 15 år. Lungemedicinerne tager sig af den efterfølgende behandlingskontrol. Dette studie vil give klinikere i lav-incidens lande som Danmark ny information om diagnose og behandling af TB og som resultat forbedre diagnostikken og behandlingen af patienterne. Studiet vil være baseret på et samarbejde mellem lungemedicinsk afdeling, infektionsmedicinsk afdeling og børneafdelingen på Århus Universitetshospital, hvilket yderligere vil bidrage til en øget erfaringsudveksling til nytte for TB patienterne og pårørende. Dette samarbejde er det første af sin art i Danmark omkring TB kontrol og behandling. På sigt Å r 2006 Evidens-baseret information om denne svære patientgruppe vil føre til bedre retningslinjer for diagnostik og behandling af TB generelt. Specielt fordi Danmark er et lavincidens land, og vi ønsker at fastholde dette, må vi alt andet lige ruste vores klinikere på bedst mulig måde. Det kan gøres via dette studie, som både handler om at indsamle data i et retrospektivt studie og bygge bro mellem de tre afdelinger, som tager sig af TB i Danmark. Erfaringsudveksling afdelingerne imellem er et vigtigt aspekt i at optimere den diagnostiske proces og efterfølkunne tilsvarende implementeres ved andre hospitaler i landet. Hypoteser Manglende erfaring med håndtering af TB i lav-incidens lande kan forsinke diagnosen TB specielt, ekstra-tb. Gode evidens-baseret kliniske retningslinjer er derfor vigtige for klinikeren. Parametre, som alder, køn, etnicitet, symptomer osv., er indsamlet fra patient journaler fra Århus Universitetshospital til at beskrive prævalensen af TB og de associerede parametre. Vi ønsker at belyse sammenhænge og forskelle køn, alder og etnicitet imellem og ud fra TB typen; ekstra-tb vs. pulmonal-tb. Vores hypoteser er følgende: Størstedelen af patienter diagnosticeret med TB I Danmark vil være af anden etnisk oprindelse. Somaliere vil udgøre den største sub-gruppe. Der vil være en negativ korrelation mellem ophold i Danmark og TB incidens rate. Pulmonal TB vil være den hyppigste kliniske præsentation, men blandt immigranter og deres efterkommere vil andelen af ekstra-tb være højere. Hoste med ekspektorat vil være associeret med positiv mikroskopi af syre-alkoholfaste stave. Sputum negative vil have normalt røntgen af thorax. Diagnosen pulmonal TB kan forsinkes, når patienten er ryger og har hoste. De klassiske TB symptomer (nattesved, vægttab og træthed) er ofte ikke en dokumenteret observation pga. sprogbarrierer mellem immigranter og sundhedspersonale. Dårligere compliance ved behandling samt recidiv hos immigranter kan være resultat af sprogbarriere og kulturforskelle. Der vil være korrelation mellem bivirkninger, alkoholmisbrug, etnicitet og compliance. Data og metode Der blev søgt på relevante TB diagnosekoder (D15-19) i den elektroniske journaldatabase fra til på de tre afdelinger på Århus Universitetshospital. Denne søgning gav 408 patienter, hvoraf 50 er blevet ekskluderet, da de ikke opfyldte vores kriterier. Kriterierne for inklusion var, at patienterne havde været diagnosticeret og indlagt på Århus Universitetshospital til regelret TB behandling for verificeret eller non-verificeret TB med Mykobakterium Tuberkulose (MT)i perioden til De 358 patientjournaler, som opfylder vores kriterier, skal nu gennemgås systematisk. Data vil blive registreret og analyseret. Laboratorieresultater, så som positiv mikroskopi af syre-alkohol faste stave, PCR og/eller dyrkning, var ikke et strengt inklusionskriterium. Patienter med kliniske symptomer på TB, som blev opstartet i regelret behandling, blev kun ekskluderet, hvis der senere blev fundet fx. atypiske mykobakterier. Patientjournalerne vil blive gennemgået og information omkring alder, køn, etnicitet, kontaktmønster med andre TB patienter, HIV status, immunsuppressivbehandling, ryge- og alkohol vaner, første hospitals indlæggelse, symptom varighed, symptomer, røntgen af thorax og biokemi ved indlæggelse, mikrobiologisk diagnostik, behandlingslængde, compliance og recidiv registreres. Klinisk biokemisk afdeling, klinisk mikrobiologisk afdeling, Statens Serum Institut og CPR (central person registret), vil være behjælpelig med yderligere data. Der er opnået godkendelse fra Datatilsynet (nr /053). Mål Vores fund og data vil blive analyseret og præsenteret i danske samt internationale peer-reviewed medicinske tidsskrifter. Foreløbige data fra patienter indlagt på Infektionsmedicinsk afdeling Århus Universitetshospital Skejby, er blevet præsenteret på poster ved Scandinavien Sociaty for Antimicrobial Chemotherapy og mundtligt præsenteret ved TB-update på Rigshospitalet

18 Forskningsprojekter > Vacciner Forskningsprojekter > Vacciner gende behandling af TB patienter. Hvis data bekræfter vores hypotese, at visse etniske grupper, såsom somaliere, har en højere risiko for at udvikle aktiv TB, bør flere studier foretages med henblik på at undersøge, om et screeningsprogram af risiko minoritetsgrupper vil have positiv cost- benefit. Det overordnede mål er at reducere sygdomsbyrden ved at hindre latent TB i reaktivering. Screening for latent TB med efterfølgende behandling vil kunne indgå i TB kontrol. Profylaksebehandling tilbydes i form af to-stof antibiotika behandling i tre måneder, dette skal sættes i forhold til den regelrette behandling mod aktiv TB som består af fire-stof antibiotikabehandling i tre måneder efterfulgt af to-stof antibiotika i tre måneder. Patienter i immunsuppressiv behandling er stigende i Danmark, og hvis en patient i immunsuppressiv behandling har en latent TB, vil vedkommende have en øget risiko for at udvikle aktiv TB. Derfor er diagnostiske metoder til screening for latent TB nødvendige. I de senere år er en ny metode til at diagnosticere TB kommet på markedet. Fuldblod stimuleres med MT specifikke antigener, og γ-interferon frigøres fra T-celler med antistoffer mod MT specifikke antigener. Mængden af γ-interferon viser om testen er positiv og patienten dermed har en latent eller aktiv TB. Traditionelt har man brugt Tuberculin Skin Test(TST), hvor tuberkulin injiceres intradermalt, og induration ved positiv test aflæses efter 72 timer. Denne undersøgelse kræver, at patienten møder op på hospitalet to gange, og resultatet kan blive falsk positiv ved infektion med atypiske mykobakterier, og/eller hvis patienten er tidligere BCG vaccineret. Derfor vil en simple blodprøve, som er uafhængig af vaccinationsstatus og andre mykobakterier, være at foretrække ved screening af latent TB. To tests er på det danske marked QuantiFE- RON, som bruges på Statens Serum Institut, og T-spot, som bl.a. bliver brugt på Lungemedicinsk afdeling Århus universitets hospital. Gitte Madsen Vacciner* *(HIV og HBV vacciner beskrevet under sygdommene) Øger innat immunaktivering med CPG-adjuvans den kliniske effekt af pneumokok-vaccination af HIV-smittede? Vi har for nylig vist, at incidensen af indlæggelseskrævende pneumoni fortsat er 6 gange højere blandt hiv-smittede end ikke hiv-smittede personer i Danmark. Pneumokokker er den hyppigste årsag til pneumoni, og en væsentlig årsag til sygelighed og død hos hiv-smittede personer. Vaccination kan effektivt forebygge pneumokok-sygdom hos ikke HIV-smittede, hvorimod effekten af pneumokok-vaccine af HIV-smittede er tvivlsom som følge af deres nedsatte immunkompetence. Vaccine-adjuvanser øger antigen-specifikt immunrespons gennem fysisk lokalisering og forbedret antigenpræsentation samt ved provokation af inflammatorisk eller medfødt immunrespons. Intracellulære innate TLR9-receptorer detekterer u-methyleret CPG dinukleotider, der er almindelige i genomet hos de fleste bakterier og DNA vira. Dyre-eksperimentelle studier har vist, at TLR9-agonist adjuveret pneumokok-vaccination inducerer et kraftigere antistofrespons end pneumokokvaccination alene. Vi har derfor etableret et randomiseret klinisk kontrolleret forsøg, der tester pneumokokvaccine med eller uden TLR9-agonist til HIV-smittede. Effekt målet er antistof-respons, der korrelere godt til beskyttelsesgraden mod pneumokok-infektion. Primære formål: At sammenligne andelen af patienter med højt kvantitativt antistofrespons på dag 270 mellem grupperne, der får hhv. pneumokok-vaccine+cpg og pneumokokvaccine alene. Højt kvantitativt antistofrespons defineres som 2-fold stigning og IgG niveauer 1 µg/ml for mindst 5 af 7 pneumokokserotyper i vaccinen. Sekundære formål: At analysere funktionelt antistofrespons på pneumokok-vaccination +/- CpG. At vurdere sikkerhed og tolerancen i form af antal og intensitet af utilsigtede hændelser (AE) og alvorlige utilsigtede hændelser (SAE). Substudie Humoralt og cellulært immunrespons på pneumokok-vaccination hos HAART-behandlede og HAART-naive hiv-smittede personer : At sammenligne kvantitativt og funktionelt antistofrespons efter pneumokok-vaccination mellem HAART og ikke-haart-behandlede, herunder også forskelle i IgG-subtype differentiering. At analysere forsøgspersonernes cellulære cytokinrespons på antigenstimulation. Kvantitativ koncentrations-bestemmelse af serotypespecifikt IgG måles i ét batch efter WHO standarder i samarbejde med Statens Serum Institut (ABMP ved Helle B. Konradsen); 2) I et flowcytometrisk assay måles opsonofagocytotær aktivitet (OPA), funktionel aktivitet, som er antistoffernes evne til at mediere fagocytose i et assay med en særlig leukocytcelle-linje. IIa - Målemetoder: 1) IgG subtyper bestemmes kvantitativt for serotyperne 6b og 14 med ELISA i afdelingens forskningslaboratorium (se Prælimenære resultater ) med FDA-standard serum som kontrol. Murint antihumant IgG1 og IgG2 tilsættes efterfulgt af goat anti-mouse IgG-AP. OD måles spektrofotometrisk med p- nitrophenol nm. 2) Antigenstimulation af PBMC er sker med varmeinaktiverede pneumokokstammer, Th1 og Th2-specifikke antigener i thymidinproliferationsassays i afdelingens laboratorium. Cellemediet høstes og cytokinprofilerne måles med Luminex på Dec 2007 Jan HIV-patienter inviteret per brev 97 deltagere randomiseret 1:1 til pneumokokvacciner +/- CPG 7909 (77 HAART behandlede og 20 HAART naive) 1. Prevenar vaccination +/- CPG Prevenar vaccination +/- CPG Vaccination (Pneumo Novum) 5. og afsluttende besøg Screening Dag 0 Efter 90 dage Efter 270 dage Efter 300 dage Institut for Medicinsk Mikrobiologi og Immunologi, Århus Universitet (ved Søren Paludan). Styrkeberegninger: Antagelserne til styrkeberegningen til hovedstudiet (Ia) baseres forsøget med CPG 7909 adjuveret hepatitis B-vaccination (hvor 37% flere opnåede beskyttelse i CPG-gruppen) og på et fransk pneumokokvaccinestudie af hiv-smittede. I dette var 30% i interventionsgruppen vaccine high-responders (se punkt Ia) 20 uger efter anden pneumokok-vaccine. Hvis 30% af kontrolgruppen og 60% af eksperimentelgruppen (CpG 7909) på dag 270 er vaccine high-responders kræves 42 personer i hver gruppe for at forskellen bliver signifikant (α=0,05 og test-styrke 0,80). Forventet dropout er 10 % og målet var at inkludere mindst 94 forsøgspersoner i studiet

19 Forskningsprojekter > Vacciner Forskningsprojekter > Vacciner Resultaterne kan på sigt blandt andet føre til ændrede vaccinationsstrategier og hjælpe i den kliniske beslutningsproces omkring det optimale vaccinationstidspunkt for nysmittede hiv-patienter, hvorved sygdom og død som følge af blandt andet pneumokok-sygdom kan forebygges. Herudover vil projektet kunne bidrage med væsentlig ny viden til brug for udvikling af andre vaccinetyper til immunsvækkede. Ole Søgaard Immunologisk respons blandt HAART og ikke-haart behandlede hiv-smittede individer efter immunisering med konjugeret pneumokokvaccine +/- CpG 7909 adjuvant Lungebetændelse er en alvorlig og hyppig forekommende sygdom, som er forbundet med høj dødelighed, sygelighed og betydelige sundhedsudgifter. Småbørn, ældre og hiv-smittede har væsentligt større risiko for at udvikle lungebetændelse, idet disse grupper generelt har et dårligere immunforsvar. Introduktionen af hiv-behandling (HAART) i Danmark i har ført til et fald i forekomsten af de såkaldte opportunistiske infektioner hos hiv-smittede og dermed også forekomsten af aids. HAART-behandling medfører en delvis genopbygning af immunforsvaret og mængden af CD4-celler stiger. Trods forbedringen af prognosen blandt hiv-smittede ser man stadig hos selv de mest velbehandlede hiv-smittede med høje CD4 tal, en øget sygelighed og dødelighed i forhold til baggrundsbefolkningen. Pneumokok-bakterier er den hyppigste årsag til lungebetændelse og blodforgiftning blandt hiv-smittede. Vaccinationer mod disse infektioner er en vigtig faktor i behandlingen af disse patienter og Statens Serum Institut anbefaler at vaccinere højrisikogrupper, som for eksempel hiv-smittede, med en pneumokokvaccine (PPV) som har været anvendt i mange år. Desværre har denne vaccine i flere studier vist sig at have ringe forebyggende effekt på grund af hiv-smittedes nedsatte immunforsvar. En ny pneumokokvaccine (PCV7) blev i 2000 indført i USA til vaccination af spædbørn og har bidraget til faldet i forekomsten af alvorlig pneumokoksygdom, som for eksempel meningitis, hos børn. Denne vaccine er fra oktober 2007 også indført i det danske børnevaccinationsprogram. Nyere studier har vist en bedre effekt af vaccination hos hiv-smittede voksne og børn, hvis man kombinerer de to vacciner med nogle måneders mellemrum. Dog er effekten af HAART-behandling på vaccinations-respons blandt de vaccinerede ikke blevet undersøgt endnu. For at øge vaccinens virkning tilsættes en ny type adjuvant til halvdelen af patienternes vacciner. Adjuvanten aktiverer Toll-Like Receptor (TLR9), som er en del af det medfødte immunsystem og dette påvirker produktionen og fordelingen af bestemte antistoffer og generel aktivering af immunsystemet. Dette er vigtigt i forhold til evnen til at bekæmpe bakterietyper som pneumokokker. Når man sammenligner behandlede og ubehandlede hivsmittede med ens CD4-tal, er der observeret en forskel i sygeligheden hos de to grupper. Det tyder derfor på, at HAART-behandling har en vigtig effekt på immunforsvaret, udover at øge CD4-tallet blandt andet ved at påvirke hvilke signalstoffer cellerne producerer. Vi ønsker derfor at undersøge forskelle i immunforsvarets respons hos HAART og ikke-haart behandlede hiv-smittede ved at måle diverse antistoffer og signalmolekyler efter vaccination med pneumokokvaccine, med eller uden en adjuvant. et med dette studie er at undersøge immunsystemets reaktion hos hiv-smittede på vaccination mod pneumokok-bakterier. Primær fokus bliver at sammenligne vaccinerespons hos behandlede og ubehandlede patienter med sammenlignelig immunstatus. r Projektet er et substudie i et større vaccinationsstudie omhandlende pneumokokvaccination af hiv-smittede personer, og prøvemateriale stammer herfra. Ca. 20 ubehandlede og 20 HAART-behandlede personer med sammenlignelige demografiske data og CD4-tal indgår i studiet. Der laves analyser før vaccination, efter første vaccination og efter anden vaccination. Til projektet vil der blive brugt et antal cellebiologiskeog molekylæbiologiske metoder, herunder: Isolering af humane perifere blod mononucleære celler (PBMC er) (22,23), flow cytometrisk opsonofagocytært assay, ELISA (23), Luminex (22) og lymfocytproliferations-assay baseret på flowcytometri (24). 1) Funktionelt assay af serum antistoffer. Funktionel aktivitet af serumantistoffer bestemmes ved et flowcytometrisk opsonofagocytært assay. Dette sker som led i hovedstudiet og udføres af Flow Applications Inc., Ill, USA. 2) IgG subtyper. Samlede IgG respons for de syv pneumokok serotyper bestemmes i samarbejde med Statens Serum Institut som af hovedstudiet. Kvantificering af IgG subtyper (IgG1 og IgG2) foretages med ELISA gennem antigen (23-valent pnemokok vaccine, Pneumovax II). Test og kontrol sera tilsættes i fortyndinger. Detektion foretages med murint anti-human IgG1 og IgG2 fulgt af ged anti-mus-igg-ap. Farvereaktion med p-nitrophenol phosphate måles spektrofotometrisk ved 450 nm. 3) Celle immunitet (cytokine response). PBMC er oprenses fra blod med Ficoll gradient centrifugering. Celler sættes op i bakker og stimuleres med kapsulære antigener fra den konjugerede vaccine, adjuvanten eller kombinationen af de to. Efter 24 timer høstes cellesupernatanter til cytokinmålinger med Luminex (Biorad and Biosource) og ELISA (BD Biosciences og R&D Systems). Primære output er IFN-g, IL-4 og IFN-a Sekundære output: TNF-a, IL-12, IL-10, IL-1b, IL-6 og IL-2. 4) Cellulær immunitet (lymfocytproliferationsassay). PBMC oprenses fra blod, sætte på 96-hulsplader og stimuleres med vaccinen, medie som negativ kontrol og phytohæmaglutinin (PHA) og tenatus toxin (TT) som positiv kontrol. Herefter farves cellene med CFSE. Efter 5 dage inkuberes med anti-cd4-pe, anti-cd8-apc og anti-cd19-pe og der udføres flow cytometrisk analyse (CFSE Ex/Em: 492/517 nm; 488 nm excitation source). Pearsons korrelations koefficient og Mann-Whitney rank sum test bruges til statistiske analyser af data. Analyserne af varians (ANOVA) beregnes for at bestemme den statistiske forskel for middel-værdierne i vaccinationsgrupperne. Antages en forskel (δ) i GMC på 0,5, med en standard variation (σ) på 0,7, α: 0,05 og power 0,80 kræves mindst 17 personer i hver gruppe for at forskellen i antistof-subtyper bliver signifikant (for eksempel IgG1). Større indblik i forskelle i det immunologiske respons mellem hiv-smittede i og uden behandling efter en vaccination vil give en bedre basal immunologisk forståelse af de ikke CD4-tals relaterede effekter af HAART-behandling. Dette kan på sigt blandt andet føre til ændrede vaccinationsstrategier og hjælpe i den kliniske beslutningsproces omkring det optimale vaccinationstidspunkt for nysmittede hiv-patienter. Rasmus Offersen 36 37

20 Forskningsprojekter > Vacciner Forskningsprojekter > Vacciner Toxoplasma gondii anvendt som model til studier af beskyttende immunitet overfor kronisk intracellulære infektioner som f.eks. hepatitis B og C, HIV, tuberkulose og Leishmaniasis Udvikling af forebyggende vacciner mod de væsentligste infektionssgydomme som f.eks. HIV og hepatitis er en af de største udfordringer for verdenssundheden i øjeblikket. Denne udfordring forstærkes af manglen på gode forsøgsmodeller, der kan afdække samspillet mellem vaccine og immunforsvar inden vaccinerne afprøves på mennesker. Vi har gennem adskillige år arbejdet med en mikroorganisme, Toxoplasma gondii, som giver en kronisk intracellulær infektion hos mennesket, men som også kan inficere mus, hvor den skaber en infektion som den, der ses hos mennesket. Mikroorganismen danner cyster, som indeholder adskillige T. gondii parasitter, og som kan visualiseres under mikroskop. Således haves en model hvor infektionsgraden og beskyttelsesgraden af en vaccine mod en intracellulær mikroorganisme let kan studeres. At vurdere det humorale og cellulære immunrespons ved såvel forebyggende som terapeutisk vaccination af mus mod Toxoplasma gondii. Vi har tidligere vist, at T.gondii micronem proteiner, i særdeleshed MIC3 og bradyzoite antigen leveret i form af en plasmid vektor giver god beskyttelse mod cystedannende T.gondii hos mus. Vi har også fyndet, at bradyzoitspecifikke antigener, BAG1 and MAG giver nogen grad af beskyttelse. De vacciner, vi hidtil har anvendt har været plasmid-vektorer, hvor vaccinen har været givet som et gen-konstrukt og proteinet eksprimeret af værtscellerne. Vi vil fortsætte arbejdet med disse lovende antigener. Transfektion: Vi vil anvende et nyt ikke-viralt chitosanbaseret nanopartikelsystem til slimhinde-applikation udviklet af inano ved Aarhus Universitet. Det er en bionedbrydelig og bio-kompatibel polymer, hvis egenskaber er omfattende undersøgt mht. slimhindeapplikation af vacciner og DNA-baserede polyplexer. Vores system er baseret på entropi-dreven selv-fusionering af anioniske plasmider med kationisk chitosan, så der dannes nanopartikler in nanoscale-området. Chitosansystemet vil blive anvendt til at levere plasmider, der koder for T.gondii antigener og vil blive anvendt til slimhindeimmunisering (peroralt og nasalt) eller in vitro transfektion af dendrit-celler mhp. efterfølgende immunisering af mus med disse dendritceller indeholdende T. gondii antigener. Forsøgsdyr: BALBc mus vil blive anvendt. Dyreforsøgstilladelse foreligger, approval J. nr. 2005/ ). Vacciner: Vi vil anvende plasmid-konstrukter indholdende T.gondii proteiner, herunder MIC2-MIC3-SAG1 chimera (EC2) og GRA3-GRA7-M2AP chimera (EC3). Vi har udviklet et svækket adenovirus konstrukt med disse antiger og vist, at HEK293 celler kan inficeres in vitro med AdEC3- myc (unpubliserede data). Vi har yderligere inkorporeret plasmid EC3 i chitosanpartikler. Vi vil anvende dendritceller fra indavlede BALBc mus, og transfektere dendritcellerne med enkelte og chimere konstrukter, herunder gener kodende for MIC2a, MIC2b, MIC3, MIC4, M2AP proteiner. Der vil blive opstillet forsøg, der dels påviser vaccinens effekt mht at undgå infektion (preventiv effekt) og dels påviser vaccinens effekt mht. at reducere infektionsgraden (terapeutisk effekt) T. gondii specific antibodies: Dyrene vil blive undersøgt for specifikke antistoffer mod rekombinante proteiner, der repræsentere de antigener, der har været anvendt i de forskellige eksperimenter. Vi vil analysere for IgG1 og IgG2a (Pharmingen, CA, USA) og evaluere et Th1 og et Th2 response. T celle respons: Med anvendelse af peptidbibliotekerne for overlappende 15-mer peptider af de antigener, der blev inkluderet i vaccinekonstrukterne tester vi T-cellerne i proliferationsassays og i ELI-spot assays. ELI-spots test vil blive udført i triplikat med IFN-gamma, IL2, IL4, IL10 og IL12 fra miltceller. T. gondii vaccine-modellen vil kunne give væsentlig ny viden om vaccine-effekt ved kronisk intracellullære infektioner. Eskild Petersen HIV & Rejse HIV-smittede lever nu længere takket være effektiv antiretroviral behandling. En nylig publiceret undersøgelse har vist at en 25-årig dansk HIV-patient har en forventet levetid på næsten 40 år. Som følge af længere overlevelse og bedre livskvalitet rejser HIV-smittede også mere. Der er dog en række særlige forhold, der gør sig gældende ved at rejse til udlandet, når man er HIV-smittet, og dette afspejler sig i rejserådgivning og vaccinationer, som oftest har ringere effekt hos HIV-smittede. En enkelt undersøgelse har vist at mindre end halvdelen af HIVsmittede søger rejserådgivning før afrejsen og de der gør, oplyser ofte ikke i forbindelse med denne at de er HIV-smittede. Det er ikke muligt at give korrekte vaccinations anbefalinger og rejserådgivning til en HIV-patient uden at kende dennes aktuelle CD4+-celletal og uden specialviden. De fleste rejsende HIV-patienter har derfor formentlig ikke fået en sufficient rejserådgivning forud for afrejsen. Det kan være besværligt at medbringe, opbevare og tage sin HIV-medicin i forbindelse udlandsophold. Enkelte undersøgelser har vist at en del HIV-patienter af forskellige årsager ophører med tage medicinen enten før eller under rejsen og at adherence ofte er dårligere under rejsen, med risiko for resistensudvikling og behandlingssvigt. Adfærd under udlandsophold har også stor indflydelse på risikoen for at få helbredsmæssige problemer. En spørgeskemaundersøgelse blandt Canadiske HIV-patienter viste at 23,3 % havde haft seksuel kontakt med ny partner under udlandsophold og kun 58,1 % anvendte konsekvent kondom. at belyse danske HIV-patienters rejsevaner. at vurdere hvor stor andel af HIV-patienter der får sufficient rejserådgivning. at undersøge hvor mange HIV-patienter der oplever rejse- eller HIV-relaterede helbredsproblemer i forbindelse med udlandsophold. Desuden vil undersøgelsen søge at klarlægge Om HIV-infektion har indflydelse på beslutningen om at tage på udlandsrejse og valg af rejsemål. Hvorvidt HIV-patienter i behandling med cart oplever problemer med at medbringe, opbevare og tage medicinen med deraf følgende dårligere adherence i relation til udlandsophold. I hvilket omfang HIV-patienter har risikoadfærd, herunder seksuel kontakt, under udlandsophold. Om HIV-patienter oplever problemer omkring indrejse- og opholdstilladelse. Hvor stor en andel af HIV-patienter der rejser til USA har søgt og fået VISA Hvor stor en andel af HIV-patienter der har tegnet dækkende rejseforsikring i forbindelse med udlandsophold. Om HIV-patienter er blevet direkte fejlbehandlet i forbindelse med rejserådgivning, fx fået vaccinationer der er kontraindicerede eller medicin der har potentielt farlige interaktioner med cart. Om der er prædiktive faktorer for hvilke HIV-patienter der ikke søger rejserådgivning, har dårlige adherence med cart, har risikoadfærd og/eller oplever helbredsproblemer. r Undersøgelsen udføres som en spørgeskemaundersøgelse under Den Danske HIV-kohorte (DHK). Det betyder at alle centre i Danmark, som undersøger og behandler HIV-patienter, deltager i undersøgelsen. Undersøgelsen er således landsdækkende og det forventes at > 90 % af HIV-patienter i Danmark vil få udleveret spørgeskemaet. Der forventes at % af HIV-patienterne vil respondere på undersøgelsen svarende til et antal på omkring 38 39