FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 Ready-to-Use (Dako Omnis) Kode GA084. Tilsigtet anvendelse

Transkript

1 FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 Ready-to-Use (Dako Omnis) Kode GA084 Tilsigtet anvendelse Synonymer for antigen Resumé og forklaring Medfølgende reagens Til in vitro-diagnostisk brug. FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1, Ready-to-Use (Dako Omnis), er beregnet til brug ved immunhistokemi med visualiseringssættet EnVision FLEX+ visualiseringssystemet sammen med Dako Omnis-instrumentet til semi-kvantitativ påvisning af human østrogenreceptor i formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit af humane brystkarcinomer. Dette antistof binder østrogenreceptor α-positive celler og er nyttigt ved vurdering af status for østrogenreceptor i humane brystkarcinomer. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser med anvendelse af korrekte kontroller og evalueres i relation til patientens kliniske forhistorie og andre diagnostiske analyser udført af en certificeret patolog. Dette antistof er beregnet til at blive anvendt efter den primære diagnose af tumor er foretaget ved konventionel histopatologi ved hjælp af ikke-immunologiske farvninger. ER α. Steroidreceptorer udviser en høj affinitet og specificitet over for deres ligander. Den humane østrogenreceptor (ER) er et dimert protein på 65 kda, der primært findes på cellekernernes membran, og som tilhører en klasse af transagerende proteiner, der stimulerer transkription ved at binde sig til specifikke DNA-elementer, der også kendes som hormonresponselementer. Ved at binde østrogen induceres ER til at stimulere gentranskription, hvorfor den også er kendt som en inducerbar enhancer-faktor (1, 2). Tidligere undersøgelser har vist, at ER-status er positivt korreleret med ubehandlet resultat (dvs. prognostisk for veldifferentieret invasiv brystkræft) og med respons over for antihormonel behandling, f.eks. tamoxifen (2). Østrogener har vist sig fortrinsvis at koncentrere sig i østrogenmålorganerne i dyr og i human brystkræft, og det er veldokumenteret, at østrogenernes mitogene effekt medieres af ER. Undersøgelser af de biologiske mekanismer bag væksten af brystkræft har vist, at væksthastigheden afhænger af tilstedeværelsen af østrogen eller progesteron eller begge i de fleste tilfælde af brystkræft (2). Derfor betragtes østrogenreceptorstatus i brystkarcinomer for at være en valideret prognostisk og prædiktiv faktor for håndteringen af patienter i antihormonel behandling (2-4). Som en hjælp til behandling af brystkræft anbefaler American Society of Clinical Oncology og College of American Pathologists (ASCO/CAP) i sine retningslinjer, at alle invasive brystkarcinomer og recidivtilfælde testes for ER-receptorstatus med en valideret ER-immunhistokemianalyse (3) såsom ER/PR pharmdx-sættet. Bestemmelse af østrogenreceptorstatus i brystkarcinomer ved hjælp af anti-erα, Clone EP1 har vist med ER-komponenten i det validerede ER/PR pharmdx-sæt (5). Se Dakos General Instructions for Immunohistochemical Staining (Generelle instruktioner vedrørende immunhistokemisk farvning) eller visualiseringssystemets vejledning om IHC-procedurer. Brugsklart monoklonalt kaninantistof leveres i væskeform i en buffer, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. Klon: EP1. Isotype: Kanin IgG. Immunogen Rekombinant protein svarende til ER α-aminosyrer Specificitet Forholdsregler I Western-blotting af MCF7-cellelysater mærker antistoffet et større bånd på ca. 67 kda, svarende til den forventede molekylvægt for ER α. Der blev ikke observeret krydsreaktivitet med ER β. 1. Til in vitro-diagnostisk brug 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Dette produkt indeholder natriumazid (NaN 3), et kemikalie, som er meget giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb. 4. Som med alle produkter, der er afledt fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 5. Brug passende personlige værnemidler for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. 6. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal, national og EU-retlig lovgivning. ( ) P04398DK_02_GA084/ s. 1/5

2 Opbevaring Oversigt over farvningsprotokol* Klargøring af præparater Farvningsprocedure Kvalitetskontrol Opbevares ved 2-8 C. Låget skal være lukket under opbevaring. Må ikke anvendes efter den udløbsdato, der er trykt på flasken. Holdbarhed i instrumentet er 80 timer. Antal dage i instrumentet spores af Dako Omnis-softwaren. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end de specificerede, skal forholdene verificeres af brugeren. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Der bør derfor køres positive og negative kontroller samtidigt med patientpræparater. Kontakt teknisk support hos Dako, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med antistoffet. Trin Reagens Protokol Afparaffinering Clearify (kode GC810) Standard Forbehandling EnVision FLEX, High ph (kode GV804) 30 min. varmeinduceret epitop-retrieval Primært antistof Ready-to-Use (kode GA084) 10 min. inkubation Negative Control FLEX Negative Control, Rabbit (kode GA600) 10 min. inkubation Reagent** Visualisering EnVision FLEX (kode GV800) Blok: 3 min.; Polymer: 20 min.; Kromogen: 5 min. Kontrastfarve Hematoxylin (kode GC808) 3 min. inkubation Montering Ikke-vandig permanent montering påkrævet Dehydrering, rensning og montering skal udføres efter udtagning Kvalitetskontrol Væv Farvningsmønster Kontrolvæv Brystkarcinom eller benign cervix Nukleær farvning * Brugeren skal altid læse indlægssedlen til de anvendte reagenser og læse i brugervejledningerne til Dako Omnis for at få detaljerede oplysninger. ** Farvningstrinnene og inkubationstiderne for det negative kontrolreagens bør være identiske med dem for Human Estrogen Receptor α, Clone EP1 (GA084). Hvis du vil oprette en brugerdefineret protokol ud fra ER EP1-protokollen, henvises til den avancerede brugervejledning til Dako Omnis. Paraffinsnit: Antistoffet kan anvendes til mærkning af formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Vævspræparaterne skal skæres i snit med en tykkelse på 4 µm. Det tilrådes at anvende FLEX IHC Microscope Slides, kode K8020, så vævssnittene hænger bedre fast på objektglassene. Afparaffinering, target retrieval, immunhistokemisk farvning og kontrastfarvning udføres på Dako Omnis. Farvningstrinnene og inkubationstiderne er forprogrammeret i softwaren til Dako Omnis. Hvis protokollen ikke er tilgængelig i Dako Omnis-systemet, kan den downloades fra Dako Omnis Protocol Update (Opdatering af Dako Omnis-protokol) på Se den grundlæggende brugervejledning til Dako Omnis for detaljerede anvisninger om isætning af objektglas og reagenser. Dako Omnis sikrer, at vævssnittene ikke udtørrer under forbehandlingen eller under den efterfølgende immunhistokemiske farvningsprocedure. Forbehandling: Afparaffinering af FFPE-vævssnit udføres ved hjælp af Clearify, kode GC810. Target retrieval med varmeinduceret epitop-retrieval (HIER) vha. fortyndet EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (Dako Omnis), kode GV804, anbefales. Visualisering: Det anbefalede visualiseringssystem er EnVision FLEX, High ph (Dako Omnis), kode GV800. Kontrastfarvning: Den anbefalede kontrastfarve er Hematoxylin (Dako Omnis), kode GC808. Montering: Efter farvning på Dako Omnis skal snittene dehydreres, renses og monteres ved hjælp af en metode med permanent montering. Positivt kontrolvæv: Der skal udføres positive og negative kontroller samtidigt ved hjælp af den samme protokol som patientprøverne. Brystkarcinomvæv med neoplastiske celler, som viser en svag til moderat farvningsreaktion, anbefales som positivt kontrolvæv. Som alternativ kan der anvendes benign cervix. Undersøgelser af formalinfikseret, paraffinindstøbt cervix har vist cykliske variationer i østrogenreceptorekspression (6). Cellerne/strukturerne skal vise reaktionsmønstre som beskrevet for dette væv i afsnittet "Resultatkendetegn", tabel 1. Det anbefalede negative kontrolreagens er FLEX Universal Negative Control, Rabbit (Dako Omnis), kode GA600. Positivt kontrolvæv skal fikseres, behandles og indstøbes på samme måde som patientprøverne. Positive vævskontroller kan være tegn på, at de korrekte vævsklargøringsprocedurer og farvningsprotokoller anvendes. Der skal medtages én prøve med positivt kontrolvæv i hver farvningskørsel. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede patientpræparater betragtes som ugyldige, og analysen skal gentages. I retningslinjerne fra ASCO/CAP foreslås det, at det eksterne positive kontrolvæv placeres på samme objektglas (ekstern kontrol på objektglas) som patientvævet (3). Negativt kontrolvæv: Colonepitel anbefales som negativt kontrolvæv. Endotel i vævsnit fra cervix eller brystkarcinom kan også anvendes. Således kan endotel i væv fra brystkarcinom og cervix, anvendt som positivt kontrolvæv, anvendes som negativt kontrol væv. Forskellige celletyper, der findes i de fleste vævssnit, kan bruges som interne, negative kontrolsteder. De interne negative kontrolsteder skal verificeres af brugeren. Cellerne/strukturerne skal vise reaktionsmønstre som beskrevet for dette væv i afsnittet "Resultatkendetegn", tabel 1. Negative kontrolvæv skal fikseres, behandles og indstøbes på samme måde som patientprøverne. Medtag et enkelt negativt kontrolvæv i hver farvningskørsel for at verificere specificiteten af det primære antistof og angive uønsket krydsreaktivitet til celler/cellebestanddele. Hvis det negative kontrolvæv udviser specifik farvning, skal resultaterne fra patientpræparaterne betragtes som ugyldige, og analysen skal gentages. Negativt kontrolreagens: Det anbefalede negative kontrolreagens er FLEX Universal Negative Control, Rabbit (Dako Omnis), kode GA600. Brug det medfølgende negative kontrolreagens i stedet for det primære antistof på et vævssnit af hvert patientpræparat med henblik på at evaluere non-specifik farvning og muliggøre en bedre fortolkning af specifik farvning på antigenstedet. Der skal køres negativt kontrolreagens samtidigt ved hjælp af den samme protokol som patientprøverne. ( ) P04398DK_02_GA084/ s. 2/5

3 Fortolkning af farvning Produktspecifik begrænsning Resultatkendetegn Det cellulære farvningsmønster er nukleært. Cytoplasmisk mærkning, hvis det observeres, skal anses for at være ikke-specifik. Et positivt resultat defineres som nukleær farvning i 1% af tumorcellerne (7). Dette stemmer overens med ASCO/CAP's anbefalede afskæringsværdi på 1% af positive tumorceller ved positiv vurdering (3). 1. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Præparaterne skal farves inden 2 måneder efter monteringen af vævene på objektglas, når de opbevares ved stuetemperatur (8). 2. Stromale celler kan udvise positiv farvning med antistoffet FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 og må ikke fortolkes eller tælles som ER-farvede tumorceller. 3. For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver ER-proteinet target-retrieval, når vævene fikseres (neutralt bufferet formalin) og paraffinindstøbes rutinemæssigt. 4. Brug af FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 på væv med andre fiksativer end formalin er ikke blevet valideret. Normalt væv: Tabel 1 indeholder en oversigt over Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1- immunreaktivitet på det anbefalede panel af normale væv. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet på Dako Omnis i henhold til vejledningen på indlægssedlen. Der blev ikke observeret cytoplasmisk farvning i nogen af vævene. Der blev af og til observeret svag, non-specifik baggrundsfarvning i spytkirtlen (1/3), perifer nerve (1/3) og tyndtarmen (1/3). Tabel 1: Oversigt over reaktivitet i normalt væv (8) Vævstype Positiv farvning af (antal analyserede) vævselementer Vævstype (antal analyserede) Positiv farvning af vævselementer Binyre (3) 0/3 Nerve, perifert (3) 0/3 Bryst (3) 3/3 epitelceller (<5-80%) Nyre (3) 0/3 Cerebellum (3) 0/3 Oesophagus (3) 0/3 Cerebrum (3) 0/3 Ovarie (3) 3/3 stromale celler (10-25%) 1/3 epitelceller (50%) Cervix (3) 3/3 epitelceller (15->80%) Pancreas (3) 1/3 stromale celler (<5%) 3/3 stromale celler (50-80%) Colon (3) 0/3 Placenta (3) 0/3 Endometrium (3) 3/3 epitelceller (>80->90%) 2/3 stromale celler (>90%) 2/3 muskelceller (>90%) Prostata (3) 3/3 epitelceller (<5-10%) Hjerte (3) 0/3 Rygmarv (3) 0/3 Hud (3) 1/3 epitelceller (5%) Salpinx (3) 3/3 epitelceller (80-90%) 3/3 stromale celler (60-90%) Hypofysen (3) 3/3 hypofyseceller (510%) Spytkirtel (3) 0/3 Knoglemarv (3) 0/3 Testis (3) 0/3 Lever (3) 0/3 Thyroidea (3) 0/3 Lunge (3) 0/3 Tonsil (3) 1/3 epitelceller (1%) Lymfeknude (3) 0/3 Tyndtarm (3) 0/3 Mavesæk (3) 0/3 Urinblære (3) 1/3 epitelceller (5%) 1/3 stromale celler (5%) Milt (3) 0/3 Urinleder (3) 0/3 Muskel, skelet (3) 0/3 Uterus (3) 3/3 epitelceller (25-100%) 3/3 stromale celler (25->90%) 3/3 muskelceller (15->90%) Unormalt væv: Sammenlignende undersøgelser af Anti-ER α, Clone EP1 og Anti-ER α, Clone SP1 og ERkomponenten i ER/PR pharmdx-sættet (cocktail af monoklonalt museantistof klon 1D5 og ER-2-123) har vist en høj grad af (~95%) mellem Clone EP1, Clone SP1 og ER-komponenten i ER/PR pharmdxsættet (5). For Clone EP1 og Clone SP1Et blev der anvendt et cut-off-punkt på mere end 1% positive celler til at bestemme positiv/negativ status. For ER-komponenten i ER/PR pharmdx-sættet var cut-off-punktet for positivitet i med Allred-scoren (5). Metodesammenligning (9): Analyse med Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1, Readyto-Use (Dako Omnis), kode GA084, blev udført med EnVision FLEX på Dako Omnis-platformen og scoret i henhold til retningslinjerne fra ASCO/CAP ( 1% cut-off) (3). Analyse med Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1, Ready-to-Use (Link), kode IR084, blev udført med EnVision FLEX på Autostainer Link 48-platformen og scoret i henhold til retningslinjerne fra ASCO/CAP (3). Metodesammenligningsdata vises i tabel 2. Når ASCO/CAP's retningslinjer for scoring blev anvendt, var Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1, Ready-to-Use (Dako Omnis), kode GA084, i høj grad overensstemmende med Monoclonal Rabbit Anti- Human Estrogen Receptor α, Clone EP1, Ready-to-Use (Link), kode IR084, og viste værdier for positiv, negativ og samlet på hhv. 100%, 91,9% og 95,8%. ( ) P04398DK_02_GA084/ s. 3/5

4 Tabel 2: Overensstemmelse mellem Anti-ER α, Clone EP1 (Dako Omnis), kode GA084 og Anti-ER α, Clone EP1 (Link), kode IR084 Anti-ER α, Clone EP1 (Link), kode IR084 Positiv Negativ I alt Positiv Negativ Anti-ER α, Clone EP1 (Dako Omnis), kode GA084 I alt Procentdel positiv = 114/114 = 100% (95% LL CI 1 : 96,7) Procentdel negativ = 114/124 = 91,9% (95% LL CI 1 : 85,8) Procentdel samlet = 228/238 = 95,8% (95% LL CI 1 : 92,4) Reproducerbarhed mellem kørsler, laboratorier og observatører (10): Analyse for reproducerbarhed af Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1 blev udført på tre analyselaboratorier på fem ikke på hinanden følgende dage med 20 unikke brystkræftpræparater og scoret i henhold til retningslinjerne fra ASCO/CAP ( 1% cut-off) (3), i alt 300 evalueringer. Analysens med hensyn til procentdelen af samlet reproducerbarhed mellem kørsler var 97,5% (95% LL CI 1 : 94,7). I tabel 3 vises analysens reproducerbarhed mellem laboratorier. Den positive, negative og samlede procentdel af på hhv. 91,7%, 98,2% og 94,3%, understøtter de meget reproducerbare resultater for ER, Clone EP1-analysen, når den anvendes til at fastlægge status for ER i et klinisk miljø. Tabel 3: Reproducerbarhed mellem laboratorier Procentdel samlet Procentdel positiv Procentdel negativ Reproducerbarhed mellem tre laboratorier 94,3% 91,7% 98,2% Procentdel positiv = 91,7% (95% LL CI 1 : 86,5) Procentdel negativ = 98,2% (95% LL CI 1 : 93,7) Samlet procentdel = 94,3% (95% LL CI 1 : 90,9) Brystkræftpræparater farvet med Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 på tre testlaboratorier blev evalueret af tre patologer i med ASCO/CAP's retningslinjer ( 1% cut-off) (3). Der blev udført i alt 900 vurderinger (300 pr. patolog). I tabel 4 vises reproducerbarheden mellem observatører for de tre patologer. Den positive, negative og samlede procentdel af på hhv. 98,1%, 98,8% og 98,3% understøtter en høj grad af mellem observatørerne. Tabel 4. Reproducerbarhed mellem observatører Procentdel samlet Procentdel positiv Procentdel negativ Reproducerbarhed mellem tre observatører 98,3% 98,1% 98,8% Procentdel positiv = 98,1% (95% LL CI 1 : 96,0) Procentdel negativ = 98,8% (95% LL CI 1 : 96,4) Samlet procentdel = 98,3% (95% LL CI 1 : 97,0) ( ) P04398DK_02_GA084/ s. 4/5

5 Referencer 1. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51: Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. Diseases of the Breast. Harris et al. eds., Lippincott Williams & Wilkins 2000; Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134: Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists Consensus Statement Arch Pathol Lab Med 2000;124: Badve S, Vladislav IT, Spaulding B, Strickland A, Hernandez S, Bird-Turner L, et al. EP1: a novel rabbit monoclonal antibody for detection of oestrogen receptor α. J Clin Pathol 2013;66: Snijders MP, de Goeij AF, Debets-Te Baerts MJ, Rousch MJ, Koudstaal J, Bosman FT. Immunocytochemical analysis of oestrogen receptors and progesterone receptors in the human uterus throughout the menstrual cycle and after menopause. J Reprod Fertil. 1992; 94: Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing accuracy. Adv Anat Pathol 2005;12:10-9. Review. 8. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( )- CLSI, 940 West Valley Road, Suite Wayne, PA USA Method comparison study of FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor, Clone EP1, Readyto-Use (Dako Omnis) on Breast Cancer Specimens. Dako in-house documentation D Reproducibility study of FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor, Clone EP1, Ready-to-Use (Dako Omnis) on Breast Cancer Specimens. Dako in-house documentation D Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 has been created by Epitomics Inc., using Epitomics proprietary rabbit monoclonal antibody technology covered under Patent Nos. 5,675,063 and 7,402,409. Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Producent In vitro-diagnostisk medicinsk udstyr Se brugsanvisningen Batchkode Anvendes inden Udgave 02/16 Produceret af: Dako North America, Inc. Fremstillet for: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Fax ( ) P04398DK_02_GA084/ s. 5/5